JP2674753B2 - 新規基質ペプチド - Google Patents
新規基質ペプチドInfo
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
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- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
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Description
【発明の詳細な説明】
＜産業上の利用分野＞
本発明は新規ペプチドに関する。更に詳細には、本発
明は、５−８個のアミノ酸残基を有し、ミリストイル化
酵素の基質として有用なユニークなペプチドに関する。 ＜背景技術＞ 真核生物の特定の蛋白質での脂肪酸アシル化はよく知
られた工程であり、かかる工程は２つに大別することが
できる。即ち、１つは、遺伝子の翻訳後に恐らくゴルジ
体においてパルミテート（C16）が、エステル又はチオ
エステル結合を介して膜蛋白質に結合する工程である。
他の１つは、蛋白質生合成の初期の段階において、ミリ
ステート（C14）がアミド結合を介して溶解性の膜蛋白
質に共有結合する工程である。Ｎ−ミリストイル化蛋白
質においては、アミノ末端グリシン残基がアシル化部位
であることが知られている〔Aitkinら、FEBS Lett.15
0、314−318（1982）;Schultzら、Science227、427−42
9（1985）;Carrら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA79、6128−
6131（1982）;Ozolsら、J.Biol.Chem.259、13349−1335
4（1984）；及びHendersonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
80、339−343（1983）〕。 蛋白質のＮ−ミリストイル化については、その機能が
ようやく理解され始めたところである。公知の４つのＮ
−ミリストイル化蛋白質として、p60src,サイクリツクA
MP依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニツト、カルシ
ノイリンＢ−サブユニツト及びマウス白血病ウイルス発
癌遺伝子gag−abl融合蛋白質があり、これらは、プロテ
インキナーゼあるいは細胞の生合成経路を調節するホス
ホプロテインホスフアターゼ（カルシノイリン）の調節
因子のいずれかである。p60v-srcについては、膜に結合
してその細胞形質転換能を発現するためには、ミリスト
イル化が必要であることが示されている〔Crossら、Mol
ec.Cell.Biol.4,1834−1842（1984）;Kampsら、Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA82、4625−4628（1985）〕。 ペプチド合成法により慣用的に合成することのできる
比較的短い合成ペプチドの開発は、同定する上で非常に
好ましく、また脂肪酸アシル化における酵素活性の調節
を研究する上でも非常に望ましい。このようなペプチド
は、酵母及び哺乳動物細胞のミリストイル化酵素の基質
として提供されている。またこれら合成ペプチドは、天
然基質の極めて特異的な競争的抑制因子として提供され
ることもできる。 ミリストイル化反応は以下の如くに表わすことができ
る。 ＜発明の要旨＞ 本発明によれば、以下に示すアミノ酸配列からなる群
より選ばれたアミノ酸配列を有する、ミリストイル化酸
素の基質ペプチド又はその生理学的に許容し得るアミド
誘導体もしくは塩誘導体が提供される。 （ここでＲはAla,Asn,Gln又はSer; ＳはAla,Arg,Gln,Glu,Phe又はSer; ＴはAla又はLys; ＷはAla又はSer; ＸはAla,Tyr,又はLys; ＹはArg又はPro; ＺはArg,Leu又はLysを表わし、 但しＳ−Ｔ−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚが Ala−Ala−Ala−Ala−Arg−ArgであるときＲはAsnでな
い。）。 これら基質ペプチドの例としては、例えば、Gly−Asn
−Ala−Ala−Serなどのペンタペプチド;Gly−Asn−Ala
−Ala−Ala−Alaなどのヘキサペプチド;Gly−Asn−Ala
−Ala−Ala−Ala−Argなどのヘプタペプチド； （ＲはGln又はSerを示す）， （ＲはAla又はAsn、ＳはArg,Gln又はPheを示す）， Gly−Asn−Glu−Ala−Ala−Ala−Arg−Arg, Gly−Asn−Glu−Ala−Ser−Thy−Pro−Leu, Gly−Ser−Ser−Lys−Ser−Lys−Pro−Lysなどのオクタ
ペプチドが挙げられる。 これらペプチドのアミド誘導体としては、カルボキシ
アミドが挙げられ、塩誘導体としてはHCl塩が挙げられ
る。 ＜発明の詳細な記述＞ 本発明の新規ペプチドは、慣用的なペプチド合成法を
適当に採用することにより合成することができる。しか
して、ペプチド鎖に構成アミノ酸を、目的とする配列で
付加して行く一連の縮合反応によつて、最終的に目的と
するペプチド鎖を調製することができる。核縮の試薬、
即ち、カルボベンジルオキシ基、ｔ−ブトキシカルボニ
ル（BOC）基などのＮ−保護基；ジシクロヘキシルカル
ボジイミド、カルボニルジイミダゾールなどの縮合剤;N
−ヒドロキシフタルイミドのエステル、Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミドのエステルなどの活性エステル；トリフ
ルオロ酢酸、HClジオキサン溶液、ボロントリス（トリ
フルオロアセテート）、シアノゲンブロマイドなどの開
裂剤等の各種試薬を使用することはペプチド合成法では
よく知られたことであり、また単離体と溶液中で反応さ
せること、あるいは中間体の精製法もよく知られた事項
である。 本発明のペプチドは、好ましくはよく知られたMerrif
ieldの固相支持法〔Merrifield,J.Amer.Chem.Soc.85、2
149−54（1963）;Science150、178−85（1965）〕によ
り調製することができる。この方法は、同様の化学反応
及び典型的なペプチド合成に用いる保護基を何回も使用
する方法ではあるが、この方法によれば、通常架橋ポリ
スチレン、スチレンジビニルベンゼンコポリマーなどの
固相支持体にそのカルボキシ末端が固定されたペプチド
鎖が得られる。この方法では、各工程における過剰な試
薬を、単にポリマーを洗浄するだけで除去しているた
め、多くの操作が簡略化されている。 慣用的なMerrifieldのペプチド合成法の反応工程を以
下に説明する。 I.クロロメチル化工程（ペプチドを結合させるための活
性基を付与する工程） （ここで、PSはポリスチレン残基を示す） II.エステル化工程（ｔ−BOCで保護された第１のアミノ
酸（R1）トリエチルアンモニウム塩との反応III.ペプチド形成工程（ジシクロカルボジイミド使用） この工程IIIに続いて、例えば25％トリフルオロ酢酸
メチレンクロライド溶液などの処理によるｔ−BOCの脱
保護が行なわれ、次いで過剰のトリエチルアミン処理に
よりＮ−末端アミノ基が遊離化され、これにより、次の
保護されたアミノ酸（R2）の活性化カルボキシル基との
反応が可能とある。最終工程においては、例えば無水HF
アニソール溶液による処理により、完成されたペプチド
をPS樹脂から脱離せしめる。 確立された固相合成法についての更に詳細な技術事項
については、StewartとYoungの論文“固相ペプチド合成
法”、W.H.Freeman ＆ Co.,San Francisco,1969;Merrif
ieldの総説Advances in Enzymology 32,pp.221−296,F.
F.Nold,Ed.,Interscience Publishers,New York,1969;
及び文献EricksonとMerrifield,The proteins,Vol.2,p.
255 et seq.（ed.NeurathとHill）,Academic Press,New
York,1976などを参照することができる。 本発明の好ましい基質ペプチドとしては、 Gly−Asn−Phe−Ala−Ala−Ala−Arg−Arg, Gly−Gln−Ala−Ala−Ala−Ala−Arg−Arg, Gly−Ser−Ser−Lys−Ser−Lys−Pro−Lys などが挙げられる。これらのすべてのオクタペプチド
は、0.04mM−0.07mMのKm値を有している。 これらペプチドのカルボキシ末端がカルボキサミドの
形態にあるもの、例えば、 Gly−Asn−Phe−Ala−Ala−Ala−Arg−Ag−NH2 は、カルボキシレートの形態にあるものよりも好まし
い。 後者のオクタペプチドは、牛心筋のcAMP依存プロテイ
ンキナーゼの６個のアミノ末端残基のうち５個（３番目
の位置のAlaの代わりにPheがある）を含んでおり、これ
に続いて２つのアルギニン残基を有している。かかるア
ルギニン残基は、Carrによつて報告された〔Proc.Natl.
Acad.Sci.USA79,6128−6131（1982）〕Ｎ−末端ヘプタ
ペプチド配列のリシン残基に代わるものに相当する。Ca
rrのヘプタペプチドは、天然の蛋白質のシアノゲンブロ
マイド開裂断片を分解して生じる、ブロツクされたトリ
プシン断片として得られたものである。内因性の蛋白質
は、すでにミリストイル化されているため、かかるペプ
チドをin vitroでアシルアクセプターとして使用するこ
とはできない。 TowlerとGlaserによつて報告された、Gly−Asn−Ala
−Ala−Ala−Ala−Arg−Argの合成オクタペプチド〔Pro
c.Natl.Acad.Sci.83,2812−2816（1986）〕を、本発明
では標準コントロールペプチドとして使用して、ミリス
チン酸を、このあるいは他のペプチドのアミノ末端グリ
シンに移動せしめるユニークな酵素活性の同定を行なつ
た。ミリストイル化酵素に対する新規ペプチドの基質活
性は、Saccharomyces cerevisiaeのＮ−ミリストイルグ
リシルペプチドシンセターゼ（Ｎ−ミリストイルトラン
スフエラーゼ）によつて証明することができる。〔3H〕
−ミリスチン酸のアクセプターペプチドへの移動を測定
するin vitroアツセイ法により、酵素活性を測定した。
移動反応は、アデノシントリホスフエート（ATP）とコ
エンザイムＡ（CoA）に依存している。高速液体クロマ
トグラフイーで、化学的に合成したミリストイルペプチ
ド標準物質と共に溶出せしめることによつて、酵素生成
物を同定した。酵素反応生成物と化学的に合成した標準
物質とは同一であり、グリシンに共有結合したミリステ
ートを含んでいることを証明するために、HPLCで生成し
た標準物質と酵素生成物とをともにプロナーゼで消化
し、逆相HPLCで分析した。両者とも、Ｍ−ミリストイル
化グリシンを含んでいた。本発明のペプチドへのアシル
ドナーとしてのミリストイルCoAに対して、ミリストイ
ルグリシルペプチドシンセターゼ酵素は極めて高い特異
性を有している。ペプチドのＮ−末端アミノ酸の１番目
の位置のグリシンは、この目的のための基質活性に対し
て臨界的であり、１番目の位置にアラニンを有するペプ
チドは、この酵素に対する基質として機能しない。また
２番目の位置のＬ−アスパラギンをアスパラギン酸、チ
ロシン、フエニルアラニンあるいはＤ−アスパラギステ
レオアイソマーに置換した場合には、不活性な基質とな
ることも判つた。同様に、Ｎ−末端グリシンを有する短
いペプチドあるいは長いペプチドもテストした所、不活
性であつた。即ち、以下に示す如きペプチドも不活性な
基質であつた。 Gly−Asn, Gly−Pro−Arg−Pro, Gly−Ser−Ser−Lys−Ser−Pro−Lys−Arg−Pro−Ser。 この最後のペプチドは、基質として使用することができ
なかつた。またこれらすべては、活性ペプチドGly−Asn
−Ala−Ala−Ala−Ala−Arg−Argのミリストイル化を起
こすことが出来なかつた。 Saccharomyces cerevisiaeのプロテアーゼ欠損株JR15
3〔Hemmingsら、Pro.Natl.Acad.Sci.USA78,435−439（1
981）〕を、Ｎ−ミリストイルグリシルペプチドシンセ
ターゼの原料として用いて、オクタペプチドのアシル化
を証明した。この酵母を〔3H〕ミリスチン酸でラベル化
し、細胞を溶解し次いでドデシル硫酸ナトリウムポリア
クリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）で細胞蛋白質
を分析した所、この株は内因性のＮ−ミリストイル化蛋
白質を有していることが判つた。プロナーゼで消化し、
分離し次いで逆相HPLCで分析することにより、Ｎ−
〔3H〕ミリストイル化グリシンを、ラベル化した内因性
のアシル化蛋白質から単離することができた。 BC3Hl細胞〔Schubertらの報告したマウス筋肉セルラ
イン（J.Cell.Biol.61,398−413（1974）〕を用いて、
同様にして、より高度な真核生物の細胞内に存在するＮ
−ミリストイル化酵素によるオクタペプチドのアシル化
を証明した。 以下に、本発明を実施例を用いて更に詳細に説明する
が、本発明はこれら実施例になんら限定されるものでは
ない。 実施例１ 本明細書に示す全てのペプチドは、比較基質である標
準コントロールペプチドの以下に記載した製造方法に、
本質的に従つて調製した。 A.Gly−Asn−Ala−Ala−Ala−Ala−Arg−Arg−NH2の合
成 Merrifieldの方法〔R.B.Merrifield,J.Amer.Chem.So
c.,85,2149−2154（1963）〕に従い、樹脂1g当り0.35ml
のアミノ基を置換基として有するｐ−メチルベンズヒド
リルアミン上にペプチドを合成した。BOCで保護したア
ミノ酸を用い、このアミノ酸とジシクロヘキシルカルボ
ジイミドとを2:1の割合でジクロロメタン中で15分間混
合して対称性の無水物を形成した。溶媒を減圧下に留去
し、無水物をジメチルホルムアミドに再溶解して、樹脂
と混合し、次いで１時間激しく撹拌した。アスパラギン
との反応では（グルタミン、アルギニンの場合も同
様）、等モル（アミノ酸に基づく）のヒドロキシベンゾ
トリアゾールを反応混合物中に加えた。BOC保護基を、5
0％トリフルオロ酢酸（TFA）のジクロロメタン溶液を用
いて脱離せしめ、アミノ酸との縮合反応を行なう前に、
10％ジイソプロピルエチルアミンのジメチルホルムアミ
ド溶液で中和した。 ペプチドを樹脂から脱離せしめ、液体HF/アニソール
（9:1,v/v）を用いて０℃で１時間で脱保護せしめた。
粗ペプチドを、50％酢酸水溶液で樹脂から抽出し、凍結
乾燥した。 B.精製 粗ペプチドを水に溶解し、Waters μ−Bondapak C18
カラム（19mm×150mm）に付し、０−15％アセトニトリ
ル（0.05％TFA）の水溶液（0.05％TFA）の勾配で、流速
9ml/minで15分間溶出せしめた。生成物を含む画分を集
めて、凍結乾燥し、ペプチドの同定及び純度測定を、ア
ミノ酸分析、HPLCにより行なつた。 実施例２ 電気泳動分析用の酵母蛋白質のラベル化及び抽出 酵母（S.cerevisiae株JR153,交配型alpha,trpl,prdl,
prcl,pep4−３）を、ロータリーシエーカーのYPO培地
（１％酵母抽出物、２％バクトペプトン、２％デキスト
ロース蒸留水溶液）中で30℃で生育せしめて、光学密度
が660nmで１−３となるようにした。酵母培養液の15ml
アリコートを、〔3H〕脂肪酸1mCiのエタノール溶液μ
を加えて同様の条件下で30分間ラベル化した。ラベル化
反応の終りに、培養液を氷で５分間冷却し、４℃で7600
xgで10分間遠心して細胞をペレツト化した。次いで細胞
を、10mM NaN3の140mM NaCl/10mMホスフエート溶液（pH
7.2）1mlに再懸濁せしめ、ポリプロピレン製の円椎状の
1.5ml遠心チユーブに移し、４℃で上記したと同様にし
て遠心して細胞を集めた。上清液を捨て、細胞を、5mM
Tris（pH7.4）、3mMジスレイトール、１％SDS及び1mMフ
エニルメチルスルホニルフルオライドを含む溶液100μ
に懸濁し、氷で冷却しながら、30秒間の渦動を６回行
ない、細胞１個と等容量の0.5mmガラスビーズで細胞を
崩壊した。テーブルトップ（table top）Eppendorf遠心
機で8000xgで30秒間遠心して細胞の破片を除いた。次い
で、上清液を、8mM Tris（pH8.0）125μ中で、室温下
１時間、20mMヨードアセトアミドによりアルキル化し
た。20μアリコートを取り、慣用的SDS−PAGE及びOls
onら,J.Biol.Chem.259,5364−5367（1984）に記載され
たと本質的に同様のフルオログラフイー法により分析し
た。 〔3H〕脂肪酸の蛋白質への結合分析 還元され且つアルキル化された、〔3H〕脂肪酸ラベル
化蛋白質20μを、新たに調整した4Mヒドロキシルアミ
ン/20mMグリシン（pH10）７μで処理した。23℃で４
時間処理後、電気泳動用及び上記したフルオログラフイ
ー用にサンプルを調整した。 JR 153の20,000ダルトンのアシル蛋白質への、〔3H〕
ミリスチン酸のヒドロキシルアミン安定化結合を測定す
るため、脂肪酸を加える前にセルレニン２μg/mlで15分
間細胞を処理する以外は前記したと同様にして培養液を
ラベル化した。セルレニンは、酵母の脂肪酸合成の抑制
因子として知られたものであり、JR153の特定のアシル
蛋白質のラベル化を数倍に促進するものである。次いで
細胞蛋白質を調製し、前記したと同様にしてSDS12％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。この
時、サンプルレーンに隣接して、あらかじめ発色した分
子量標準蛋白質を同時に電気泳動に付した。電気泳動
後、20,000ダルトンの分子量領域における、未乾燥ゲル
サンプルレーンから、2mmのゲルスライスを切り出し
た。ゲルスライスを、10％メタノール水溶液0.5mlで素
早くリンスし、次いで、Labquakeミキサー（Labindustr
ies,Berkley,CA）で混合しながら50mM重炭酸アンモニウ
ム1ml中で、37℃で72時間、プロナーゼＥ（Sigma,St.Lo
uis,MO）1mgを用いてそれぞれ消化した。微生物の生育
を抑えるために、消化１検体当り、１μのトルエンを
加えた。24時間後に、新たなプロナーゼE1mgを加えた。
消化後、それぞれの消化体のアリコートについて放射活
性を測定した。放射活性を有するスライスから消化体を
除き、ゲルスライスを0.1％SDS500μで１回リンス
し、消化体とリンス液とを合わせ、4NHCl40μでpH1−
２とした。酸性化された溶液を、クロロホルム−メタノ
ール（2:1,v/v）1.5mlで２回抽出した。有機層を集め
て、クロロホルム−メタノール−0.01NHCl（1:10:10,v/
v/v）で１回洗浄し、有機層を窒素気流で乾燥した。得
られる残渣を、50％メタノール−50％HPLCバツフア−Ａ
（後記参照）に再溶解した。抽出操作後に、もとの蛋白
質消化体の放射活性の97％が回収された。サンプルを、
Waters μ−Bondapak C18カラムを用いた逆相HPFLに付
し、バツフア−Ａとして0.1％トリフルオロ酢酸/0.05％
トリエチルアミン水溶液、バツフア−Ｂとして0.1％ト
リフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液を用い１分間当り
１％のアセトニトリル量が上昇する勾配で流速1ml/min
で溶出せしめた。１分間のフラクシヨンを集め、液体シ
ンチレーシヨンカウンターで放射活性を測定した。ミリ
ストイル−〔3H〕グリシン標準物質は、TowlerとGlase
r,Biochemistry25,878−884（1986）に記載されたと本
質的に同様の方法により合成し前記した如くにしてHPLC
で分析した。 脂肪酸アシル化ペプチド標準物質の合成 放射活性を有する対称性のミリスチン酸あるいはパル
ミチン酸の無水物と、Gly−Asn−Ala−Ala−Ala−Ala−
Arg−Argとをピリジン中で反応せしめてアシル化ペプチ
ド標準物質の合成を行つた。〔3H〕脂肪酸100mCiを、そ
れぞれの脂肪酸クロライド４μで処理し、次いでそれ
ぞれの非放射活性脂肪酸4.8mgを含むピリジン150μ中
に懸濁せしめた。23℃で60分間反応を進行せしめた。次
いで、この溶液の65μを、Gly−Asn−Ala−Ala−Ala
−Ala−Arg−Arg400−500μｇに加えた。Labquakeミキ
サーで混合しながら、反応を１晩進行せしめた。次い
で、ピリジンを減圧下に留去し、得られる残渣を石油エ
ーテル0.3mlで２回抽出し、50％メタノール水溶液400μ
に再溶解した。反応生成物を精製し、前記したと同様
にして逆相HPLCで分析した。化学合成標準物質と酵素生
成物とは、いずれもプロナーゼＥで消化された。またこ
れらを、前記したと同様にして20,000ダルトンのアシル
化蛋白質について逆相HPLCで分析した。但しこの場合消
化を完全に行なうためにはロナーゼ200μｇで十分であ
つた。 Ｎ−ミリストイルグリシルペプチドシンセターゼ活性分
析用の酵母抽出物の調製 酵母培養物を、前記したと同様にして生育せしめて、
660nmでのO.D.を１−３とした。培養液40mlを、４℃で7
600xgで10分間遠心して細胞を集めた。上清液をデカン
テーシヨンし次いで、冷却した10m Tris（pH7.4）1mlに
細胞ペレツトをピペツトで移し、次いでポリプロピレン
製の円錐状の1.5ml遠心チューブに移して４℃で7600xg
で10分間遠心して、細胞を再びペレツト化した。次いで
細胞を、コールドアツセイ溶解バツフアー〔10mM Tris
（pH7.4）,1mMジチオスレイトール、0.1mMエチレングリ
コール−ビス（β−アミノエチルエーテル）N,N,N′,
N′−テトラ酢酸（EGTA）及び10μg/mlアプロチニン〕4
00μにピペツトで移して再懸濁せしめた。0.5mmガラ
スビーズ約400μを、再懸濁した細胞に加え、前記し
た放射活性ラベル化細胞の崩壊の時と同様にして渦動せ
しめて細胞を溶解した。ビーズが静置後、溶解物を集
め、細胞の破片を、４℃で1000xgで10分間遠心して除い
た。次いで上清液を、Beckman75Tiローター中で、４℃
で45,000rpmで30分間遠心した。上清液を除き、粗膜ペ
レツトを、コールドアツセイ溶解バツフアー400μに
ピペツトで移して再懸濁した。３つの細胞フラクシヨン
のアリコートについて、すぐに分析するかあるいは−60
℃で保存した。粗膜ペレツトの活性は、−60℃で少なく
とも３ケ月間安定であつた。蛋白質はPetersonの方法
〔Anal.Biochem.83,346−356（1977）〕により測定し
た。 Ｎ−ミリストイルグリシルペプチドシンセターゼ活性の
分析 以下の如くにして、〔3H〕脂肪酸アシル化CoAを酵素
的に合成し、インキユベーシヨン体に加えた。アシルCo
Aシンセターゼ反応は以下のものから構成される（アツ
セイチユーブ１個当り）。即ち、〔3H〕ミリスチン酸0.
5μ Ci;2Xアツセイバツフアー〔20mM Tris（pH7.4）,2m
Mジチオスレイトール,10mM MgCl2,0.2mM EGTA〕25μ
;5mM ATP蒸留水溶液５μ（NaOHでpH0.7に調整）;20
mMリチウムCoAの蒸留水溶液2.5μ;Pseudomonasアシル
CoAシンセターゼ1mU/μの50mM N−２−ヒドロキシエ
チルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸溶液（pH
7.3）15μ；及び蒸留水2.5μから構成される。反応
を30℃で20分間進行せしめた。Hosakaらの方法〔Meth.E
nzymol.71,325−333（1981）〕の変法により測定した
所、典型的には〔3H〕の脂肪酸の40％−50％が、この方
法によりそのCoAエステルに変換された。この変法は、6
NHClでpH2.0に酸性化し、５倍容量のヘプトンで６回抽
出後に、反応液中に残存する放射活性を測定して分析す
る方法である。この反応液50μを、アツセイ抽出バツ
フアー（前記参照）40μ及び1mM−Gly−Asn−Ala−Al
a−Ala−Ala−Arg−Arg10μを含むチユーブに加え
た。チユーブ１個当り酵母細胞抽出物10μ（典型的に
は蛋白質50μｇ）を加えて30℃で10分間インキユベーシ
ヨンしてアツセイを開始した。１チユーブ当りメタノー
ル110μ及び100％トリクロロ酢酸（w/v）10μを加
えて氷で10分間冷却してアツセイを終止した。沈澱した
蛋白質を、テーブルトツプEpendorf遠心機で8000xgで３
分間遠心して除いた（この条件下では、合成〔3H〕ミリ
ストイルペプチドあるいは〔3H〕パルミトイルペプチド
の95％は、アツセイ混合物に加えた時溶解したままであ
る）。上清液50μを、メタノール75μ及びHPLCバツ
フアーA75μと混合し、30cm Waters μ Bondapak C18
のカラムの3.9mm及び前記したと同じHPLCバツフアーを
用いて逆相HPLCにより分析した。35％アセトニトリルで
溶出をスタートし、次いで１分間当り１％のアセトニト
リル量が上昇する勾配で溶出せしめた。１分間のフラク
シヨンを集め、それぞれのフラクシヨンの放射活性を、
液体シンチレーシヨンカウンターで測定した。〔3H〕−
ミリストイル−Gly−Asn−Ala−Ala−Ala−Ala−Arg−A
rgは24分後に溶出し、〔3H〕パルミトイル−Gly−Asn−
Ala−Ala−Ala−Ala−Arg−Argは30分後に溶出した。 結果 前述した如くにして調整した〔3H〕−ミリストイルグ
リシルペプチド及び〔3H〕パルミトイルグリシルペプチ
ドの化学合成標準物質は、サンプルの分析と同様の条件
下で、逆相HPLCカラムから、それぞれ59％アセトニトリ
ル、65％アセトニトリルの時に溶出した。細胞溶解調製
物は、粗膜フラクシヨンと溶解フラクシヨンに分別さ
れ、Ｎ−ミリストイルグリシルペプチドシンセターゼ活
性は、粗膜フラクシヨンと溶解フラクシヨンの両者で検
出された。全比活性、溶解フラクシヨンの比活性及び膜
フラクシヨンの比活性は、それぞれ10分間アツセイでの
蛋白質１μｇ当り、1410,1320,2260dpnであつた。最初
の反応速度から判断して、活性の65％は粗膜フラクシヨ
ン中に存在しているものと考えられる。 酵素反応生成物と化学的に合成した標準物質〔3H〕−
ミリストイルペプチドは、同じであり、グリシンに共有
結合したミリステートを有していることが、前記した逆
相HPLCで分析した時に証明された。 ペプチド基質に対するＮ−ミリストイルグリシンペプ
チドの特異性を証明するために、他のグリシルペプチド
がGly−Asn−Ala−Ala−Ala−Ala−Arg−Argのアシル化
を競争的に抑制する能力を調べた。下記する表Ｉのテス
ト１から明らかなように、1mMジペプチド、1mMテトラペ
プチド、1mMデカペプチドのいずれも、18μＭペプチド
のミリストイル化に対して何んらの効果も及ぼさなかつ
た（約1/8のKm値）。しかして、Ｎ−ミリストイルグリ
シルペプチドシンセターゼは、オクタペプチド基質に対
して特異性を示すことが判る。 酵母からの粗膜フラクシヨンを用いて上記表Ｉの如く
変化せしめて、前記した如くにしてアツセイを行なつ
た。テスト１では、アツセイのATP及びCoAに対する依存
性を、外因性の脂肪酸CoAリガーゼの非存在下にテスト
した。テスト２では、酵母の酵素は熱に不安定であるこ
とが証明されており、テスト３では、Ｎ−末端グリシン
を含む他のペプチドでは反応は抑制されないことが証明
されている。このテストでは、可能な抑制効果を最大限
に発揮せしめるために、通常用いる90μＭではなく18μ
Ｍのペプチド基質を用いて測定した。 実施例３ 実施例１と本質的に同様にして、Merrifieldの固相法
により、本発明の他のペプチドを合成し次いで酵母（S.
cerevisiae株JR153）のミリストイル化酵素に対する基
質としての活性をテストした。アツセイチユーブ１個当
り〔3H〕−ミリスチン酸１μ Ciを用いる以外は、実施
例２のアツセイ条件と同様にして、酵素に対するペプチ
ド基質の特異性をテストした。本実施例で用いた酵母の
酵素は、酵母の培養細胞の粗ホモジエネートを51−70％
（NH4）2SO4で分別し、BEAE−セフアロース CL−6B
（フアルマシヤ）を用いたイオン交換カラムクロマトグ
ラフイー次いでCoA−アガロースアフイテイーマトリツ
クス（フアルマシア）を用いたアフイニテイークロマト
グラフイーで部分精製して得たものである。ペプチドは
表IIに示すように、それぞれの動力学的データKm,Vmax
により特徴付けを行なつた。 ＊：標準コントロールオクタペプチドのVmaxは、部分精
製した酵母の酵素1mg当りの１分間に形成されるミリス
トイル化ペプチドの量2840pmolであつた。 実施例４ BC3Hlマウスの筋肉細胞から得たミリストイル化酵素
に対するオクタペプチド基質特異性を、実施例２と類似
の方法により、いくつかのオクタペプチドについてテス
トした。このマウス筋肉細胞は、Olsonら、J.Biol.Che
m.258,2644−2652（1983）に記載されたと本質的に同様
の方法により培養した。酵素のアツセイは、マウス筋肉
細胞から得た、核のない上清液のフラクシヨンを用いて
実施した。トリクロロ酢酸−メタノールアツセイ上清液
の50μについて、実施例２と本質的に同様にしてHPLC
で分析した。表IIIでは、このテストにおけるオクタペ
プチド基質の特異性が示されている。 表IIIの標準コントロールペプチド（＊印を付けた）
及び最後のオクタペプチドは、他の３つのオクタペプチ
ドに比べて極めて高い活性を示した。他の３つのオクタ
ペプチドは、バツクグランドDPM（１分間当りの分解
量）に比べて本質的に不活性であつた。 本明細書に用いたアミノ酸の略号は以下に示す意味を
有する。 本明細書の記述から、本発明の精神及び範囲内での例
は、当業者にとつて明らかであろう。そしてかかる例
も、本明細書の特許請求の範囲内のものである。しかし
て、本明細書に記載した如き、ミリストイル化酵素に対
する基質としての生物学的活性に不利な、あるいは決定
的な影響を及ぼさない限り、個々のアミノ酸及び／又は
ペプチドの長さを変えることは任意であり、これらの変
化したものも、本明細書の特許請求の範囲内のものであ
る。
明は、５−８個のアミノ酸残基を有し、ミリストイル化
酵素の基質として有用なユニークなペプチドに関する。 ＜背景技術＞ 真核生物の特定の蛋白質での脂肪酸アシル化はよく知
られた工程であり、かかる工程は２つに大別することが
できる。即ち、１つは、遺伝子の翻訳後に恐らくゴルジ
体においてパルミテート（C16）が、エステル又はチオ
エステル結合を介して膜蛋白質に結合する工程である。
他の１つは、蛋白質生合成の初期の段階において、ミリ
ステート（C14）がアミド結合を介して溶解性の膜蛋白
質に共有結合する工程である。Ｎ−ミリストイル化蛋白
質においては、アミノ末端グリシン残基がアシル化部位
であることが知られている〔Aitkinら、FEBS Lett.15
0、314−318（1982）;Schultzら、Science227、427−42
9（1985）;Carrら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA79、6128−
6131（1982）;Ozolsら、J.Biol.Chem.259、13349−1335
4（1984）；及びHendersonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
80、339−343（1983）〕。 蛋白質のＮ−ミリストイル化については、その機能が
ようやく理解され始めたところである。公知の４つのＮ
−ミリストイル化蛋白質として、p60src,サイクリツクA
MP依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニツト、カルシ
ノイリンＢ−サブユニツト及びマウス白血病ウイルス発
癌遺伝子gag−abl融合蛋白質があり、これらは、プロテ
インキナーゼあるいは細胞の生合成経路を調節するホス
ホプロテインホスフアターゼ（カルシノイリン）の調節
因子のいずれかである。p60v-srcについては、膜に結合
してその細胞形質転換能を発現するためには、ミリスト
イル化が必要であることが示されている〔Crossら、Mol
ec.Cell.Biol.4,1834−1842（1984）;Kampsら、Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA82、4625−4628（1985）〕。 ペプチド合成法により慣用的に合成することのできる
比較的短い合成ペプチドの開発は、同定する上で非常に
好ましく、また脂肪酸アシル化における酵素活性の調節
を研究する上でも非常に望ましい。このようなペプチド
は、酵母及び哺乳動物細胞のミリストイル化酵素の基質
として提供されている。またこれら合成ペプチドは、天
然基質の極めて特異的な競争的抑制因子として提供され
ることもできる。 ミリストイル化反応は以下の如くに表わすことができ
る。 ＜発明の要旨＞ 本発明によれば、以下に示すアミノ酸配列からなる群
より選ばれたアミノ酸配列を有する、ミリストイル化酸
素の基質ペプチド又はその生理学的に許容し得るアミド
誘導体もしくは塩誘導体が提供される。 （ここでＲはAla,Asn,Gln又はSer; ＳはAla,Arg,Gln,Glu,Phe又はSer; ＴはAla又はLys; ＷはAla又はSer; ＸはAla,Tyr,又はLys; ＹはArg又はPro; ＺはArg,Leu又はLysを表わし、 但しＳ−Ｔ−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚが Ala−Ala−Ala−Ala−Arg−ArgであるときＲはAsnでな
い。）。 これら基質ペプチドの例としては、例えば、Gly−Asn
−Ala−Ala−Serなどのペンタペプチド;Gly−Asn−Ala
−Ala−Ala−Alaなどのヘキサペプチド;Gly−Asn−Ala
−Ala−Ala−Ala−Argなどのヘプタペプチド； （ＲはGln又はSerを示す）， （ＲはAla又はAsn、ＳはArg,Gln又はPheを示す）， Gly−Asn−Glu−Ala−Ala−Ala−Arg−Arg, Gly−Asn−Glu−Ala−Ser−Thy−Pro−Leu, Gly−Ser−Ser−Lys−Ser−Lys−Pro−Lysなどのオクタ
ペプチドが挙げられる。 これらペプチドのアミド誘導体としては、カルボキシ
アミドが挙げられ、塩誘導体としてはHCl塩が挙げられ
る。 ＜発明の詳細な記述＞ 本発明の新規ペプチドは、慣用的なペプチド合成法を
適当に採用することにより合成することができる。しか
して、ペプチド鎖に構成アミノ酸を、目的とする配列で
付加して行く一連の縮合反応によつて、最終的に目的と
するペプチド鎖を調製することができる。核縮の試薬、
即ち、カルボベンジルオキシ基、ｔ−ブトキシカルボニ
ル（BOC）基などのＮ−保護基；ジシクロヘキシルカル
ボジイミド、カルボニルジイミダゾールなどの縮合剤;N
−ヒドロキシフタルイミドのエステル、Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミドのエステルなどの活性エステル；トリフ
ルオロ酢酸、HClジオキサン溶液、ボロントリス（トリ
フルオロアセテート）、シアノゲンブロマイドなどの開
裂剤等の各種試薬を使用することはペプチド合成法では
よく知られたことであり、また単離体と溶液中で反応さ
せること、あるいは中間体の精製法もよく知られた事項
である。 本発明のペプチドは、好ましくはよく知られたMerrif
ieldの固相支持法〔Merrifield,J.Amer.Chem.Soc.85、2
149−54（1963）;Science150、178−85（1965）〕によ
り調製することができる。この方法は、同様の化学反応
及び典型的なペプチド合成に用いる保護基を何回も使用
する方法ではあるが、この方法によれば、通常架橋ポリ
スチレン、スチレンジビニルベンゼンコポリマーなどの
固相支持体にそのカルボキシ末端が固定されたペプチド
鎖が得られる。この方法では、各工程における過剰な試
薬を、単にポリマーを洗浄するだけで除去しているた
め、多くの操作が簡略化されている。 慣用的なMerrifieldのペプチド合成法の反応工程を以
下に説明する。 I.クロロメチル化工程（ペプチドを結合させるための活
性基を付与する工程） （ここで、PSはポリスチレン残基を示す） II.エステル化工程（ｔ−BOCで保護された第１のアミノ
酸（R1）トリエチルアンモニウム塩との反応III.ペプチド形成工程（ジシクロカルボジイミド使用） この工程IIIに続いて、例えば25％トリフルオロ酢酸
メチレンクロライド溶液などの処理によるｔ−BOCの脱
保護が行なわれ、次いで過剰のトリエチルアミン処理に
よりＮ−末端アミノ基が遊離化され、これにより、次の
保護されたアミノ酸（R2）の活性化カルボキシル基との
反応が可能とある。最終工程においては、例えば無水HF
アニソール溶液による処理により、完成されたペプチド
をPS樹脂から脱離せしめる。 確立された固相合成法についての更に詳細な技術事項
については、StewartとYoungの論文“固相ペプチド合成
法”、W.H.Freeman ＆ Co.,San Francisco,1969;Merrif
ieldの総説Advances in Enzymology 32,pp.221−296,F.
F.Nold,Ed.,Interscience Publishers,New York,1969;
及び文献EricksonとMerrifield,The proteins,Vol.2,p.
255 et seq.（ed.NeurathとHill）,Academic Press,New
York,1976などを参照することができる。 本発明の好ましい基質ペプチドとしては、 Gly−Asn−Phe−Ala−Ala−Ala−Arg−Arg, Gly−Gln−Ala−Ala−Ala−Ala−Arg−Arg, Gly−Ser−Ser−Lys−Ser−Lys−Pro−Lys などが挙げられる。これらのすべてのオクタペプチド
は、0.04mM−0.07mMのKm値を有している。 これらペプチドのカルボキシ末端がカルボキサミドの
形態にあるもの、例えば、 Gly−Asn−Phe−Ala−Ala−Ala−Arg−Ag−NH2 は、カルボキシレートの形態にあるものよりも好まし
い。 後者のオクタペプチドは、牛心筋のcAMP依存プロテイ
ンキナーゼの６個のアミノ末端残基のうち５個（３番目
の位置のAlaの代わりにPheがある）を含んでおり、これ
に続いて２つのアルギニン残基を有している。かかるア
ルギニン残基は、Carrによつて報告された〔Proc.Natl.
Acad.Sci.USA79,6128−6131（1982）〕Ｎ−末端ヘプタ
ペプチド配列のリシン残基に代わるものに相当する。Ca
rrのヘプタペプチドは、天然の蛋白質のシアノゲンブロ
マイド開裂断片を分解して生じる、ブロツクされたトリ
プシン断片として得られたものである。内因性の蛋白質
は、すでにミリストイル化されているため、かかるペプ
チドをin vitroでアシルアクセプターとして使用するこ
とはできない。 TowlerとGlaserによつて報告された、Gly−Asn−Ala
−Ala−Ala−Ala−Arg−Argの合成オクタペプチド〔Pro
c.Natl.Acad.Sci.83,2812−2816（1986）〕を、本発明
では標準コントロールペプチドとして使用して、ミリス
チン酸を、このあるいは他のペプチドのアミノ末端グリ
シンに移動せしめるユニークな酵素活性の同定を行なつ
た。ミリストイル化酵素に対する新規ペプチドの基質活
性は、Saccharomyces cerevisiaeのＮ−ミリストイルグ
リシルペプチドシンセターゼ（Ｎ−ミリストイルトラン
スフエラーゼ）によつて証明することができる。〔3H〕
−ミリスチン酸のアクセプターペプチドへの移動を測定
するin vitroアツセイ法により、酵素活性を測定した。
移動反応は、アデノシントリホスフエート（ATP）とコ
エンザイムＡ（CoA）に依存している。高速液体クロマ
トグラフイーで、化学的に合成したミリストイルペプチ
ド標準物質と共に溶出せしめることによつて、酵素生成
物を同定した。酵素反応生成物と化学的に合成した標準
物質とは同一であり、グリシンに共有結合したミリステ
ートを含んでいることを証明するために、HPLCで生成し
た標準物質と酵素生成物とをともにプロナーゼで消化
し、逆相HPLCで分析した。両者とも、Ｍ−ミリストイル
化グリシンを含んでいた。本発明のペプチドへのアシル
ドナーとしてのミリストイルCoAに対して、ミリストイ
ルグリシルペプチドシンセターゼ酵素は極めて高い特異
性を有している。ペプチドのＮ−末端アミノ酸の１番目
の位置のグリシンは、この目的のための基質活性に対し
て臨界的であり、１番目の位置にアラニンを有するペプ
チドは、この酵素に対する基質として機能しない。また
２番目の位置のＬ−アスパラギンをアスパラギン酸、チ
ロシン、フエニルアラニンあるいはＤ−アスパラギステ
レオアイソマーに置換した場合には、不活性な基質とな
ることも判つた。同様に、Ｎ−末端グリシンを有する短
いペプチドあるいは長いペプチドもテストした所、不活
性であつた。即ち、以下に示す如きペプチドも不活性な
基質であつた。 Gly−Asn, Gly−Pro−Arg−Pro, Gly−Ser−Ser−Lys−Ser−Pro−Lys−Arg−Pro−Ser。 この最後のペプチドは、基質として使用することができ
なかつた。またこれらすべては、活性ペプチドGly−Asn
−Ala−Ala−Ala−Ala−Arg−Argのミリストイル化を起
こすことが出来なかつた。 Saccharomyces cerevisiaeのプロテアーゼ欠損株JR15
3〔Hemmingsら、Pro.Natl.Acad.Sci.USA78,435−439（1
981）〕を、Ｎ−ミリストイルグリシルペプチドシンセ
ターゼの原料として用いて、オクタペプチドのアシル化
を証明した。この酵母を〔3H〕ミリスチン酸でラベル化
し、細胞を溶解し次いでドデシル硫酸ナトリウムポリア
クリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）で細胞蛋白質
を分析した所、この株は内因性のＮ−ミリストイル化蛋
白質を有していることが判つた。プロナーゼで消化し、
分離し次いで逆相HPLCで分析することにより、Ｎ−
〔3H〕ミリストイル化グリシンを、ラベル化した内因性
のアシル化蛋白質から単離することができた。 BC3Hl細胞〔Schubertらの報告したマウス筋肉セルラ
イン（J.Cell.Biol.61,398−413（1974）〕を用いて、
同様にして、より高度な真核生物の細胞内に存在するＮ
−ミリストイル化酵素によるオクタペプチドのアシル化
を証明した。 以下に、本発明を実施例を用いて更に詳細に説明する
が、本発明はこれら実施例になんら限定されるものでは
ない。 実施例１ 本明細書に示す全てのペプチドは、比較基質である標
準コントロールペプチドの以下に記載した製造方法に、
本質的に従つて調製した。 A.Gly−Asn−Ala−Ala−Ala−Ala−Arg−Arg−NH2の合
成 Merrifieldの方法〔R.B.Merrifield,J.Amer.Chem.So
c.,85,2149−2154（1963）〕に従い、樹脂1g当り0.35ml
のアミノ基を置換基として有するｐ−メチルベンズヒド
リルアミン上にペプチドを合成した。BOCで保護したア
ミノ酸を用い、このアミノ酸とジシクロヘキシルカルボ
ジイミドとを2:1の割合でジクロロメタン中で15分間混
合して対称性の無水物を形成した。溶媒を減圧下に留去
し、無水物をジメチルホルムアミドに再溶解して、樹脂
と混合し、次いで１時間激しく撹拌した。アスパラギン
との反応では（グルタミン、アルギニンの場合も同
様）、等モル（アミノ酸に基づく）のヒドロキシベンゾ
トリアゾールを反応混合物中に加えた。BOC保護基を、5
0％トリフルオロ酢酸（TFA）のジクロロメタン溶液を用
いて脱離せしめ、アミノ酸との縮合反応を行なう前に、
10％ジイソプロピルエチルアミンのジメチルホルムアミ
ド溶液で中和した。 ペプチドを樹脂から脱離せしめ、液体HF/アニソール
（9:1,v/v）を用いて０℃で１時間で脱保護せしめた。
粗ペプチドを、50％酢酸水溶液で樹脂から抽出し、凍結
乾燥した。 B.精製 粗ペプチドを水に溶解し、Waters μ−Bondapak C18
カラム（19mm×150mm）に付し、０−15％アセトニトリ
ル（0.05％TFA）の水溶液（0.05％TFA）の勾配で、流速
9ml/minで15分間溶出せしめた。生成物を含む画分を集
めて、凍結乾燥し、ペプチドの同定及び純度測定を、ア
ミノ酸分析、HPLCにより行なつた。 実施例２ 電気泳動分析用の酵母蛋白質のラベル化及び抽出 酵母（S.cerevisiae株JR153,交配型alpha,trpl,prdl,
prcl,pep4−３）を、ロータリーシエーカーのYPO培地
（１％酵母抽出物、２％バクトペプトン、２％デキスト
ロース蒸留水溶液）中で30℃で生育せしめて、光学密度
が660nmで１−３となるようにした。酵母培養液の15ml
アリコートを、〔3H〕脂肪酸1mCiのエタノール溶液μ
を加えて同様の条件下で30分間ラベル化した。ラベル化
反応の終りに、培養液を氷で５分間冷却し、４℃で7600
xgで10分間遠心して細胞をペレツト化した。次いで細胞
を、10mM NaN3の140mM NaCl/10mMホスフエート溶液（pH
7.2）1mlに再懸濁せしめ、ポリプロピレン製の円椎状の
1.5ml遠心チユーブに移し、４℃で上記したと同様にし
て遠心して細胞を集めた。上清液を捨て、細胞を、5mM
Tris（pH7.4）、3mMジスレイトール、１％SDS及び1mMフ
エニルメチルスルホニルフルオライドを含む溶液100μ
に懸濁し、氷で冷却しながら、30秒間の渦動を６回行
ない、細胞１個と等容量の0.5mmガラスビーズで細胞を
崩壊した。テーブルトップ（table top）Eppendorf遠心
機で8000xgで30秒間遠心して細胞の破片を除いた。次い
で、上清液を、8mM Tris（pH8.0）125μ中で、室温下
１時間、20mMヨードアセトアミドによりアルキル化し
た。20μアリコートを取り、慣用的SDS−PAGE及びOls
onら,J.Biol.Chem.259,5364−5367（1984）に記載され
たと本質的に同様のフルオログラフイー法により分析し
た。 〔3H〕脂肪酸の蛋白質への結合分析 還元され且つアルキル化された、〔3H〕脂肪酸ラベル
化蛋白質20μを、新たに調整した4Mヒドロキシルアミ
ン/20mMグリシン（pH10）７μで処理した。23℃で４
時間処理後、電気泳動用及び上記したフルオログラフイ
ー用にサンプルを調整した。 JR 153の20,000ダルトンのアシル蛋白質への、〔3H〕
ミリスチン酸のヒドロキシルアミン安定化結合を測定す
るため、脂肪酸を加える前にセルレニン２μg/mlで15分
間細胞を処理する以外は前記したと同様にして培養液を
ラベル化した。セルレニンは、酵母の脂肪酸合成の抑制
因子として知られたものであり、JR153の特定のアシル
蛋白質のラベル化を数倍に促進するものである。次いで
細胞蛋白質を調製し、前記したと同様にしてSDS12％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。この
時、サンプルレーンに隣接して、あらかじめ発色した分
子量標準蛋白質を同時に電気泳動に付した。電気泳動
後、20,000ダルトンの分子量領域における、未乾燥ゲル
サンプルレーンから、2mmのゲルスライスを切り出し
た。ゲルスライスを、10％メタノール水溶液0.5mlで素
早くリンスし、次いで、Labquakeミキサー（Labindustr
ies,Berkley,CA）で混合しながら50mM重炭酸アンモニウ
ム1ml中で、37℃で72時間、プロナーゼＥ（Sigma,St.Lo
uis,MO）1mgを用いてそれぞれ消化した。微生物の生育
を抑えるために、消化１検体当り、１μのトルエンを
加えた。24時間後に、新たなプロナーゼE1mgを加えた。
消化後、それぞれの消化体のアリコートについて放射活
性を測定した。放射活性を有するスライスから消化体を
除き、ゲルスライスを0.1％SDS500μで１回リンス
し、消化体とリンス液とを合わせ、4NHCl40μでpH1−
２とした。酸性化された溶液を、クロロホルム−メタノ
ール（2:1,v/v）1.5mlで２回抽出した。有機層を集め
て、クロロホルム−メタノール−0.01NHCl（1:10:10,v/
v/v）で１回洗浄し、有機層を窒素気流で乾燥した。得
られる残渣を、50％メタノール−50％HPLCバツフア−Ａ
（後記参照）に再溶解した。抽出操作後に、もとの蛋白
質消化体の放射活性の97％が回収された。サンプルを、
Waters μ−Bondapak C18カラムを用いた逆相HPFLに付
し、バツフア−Ａとして0.1％トリフルオロ酢酸/0.05％
トリエチルアミン水溶液、バツフア−Ｂとして0.1％ト
リフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液を用い１分間当り
１％のアセトニトリル量が上昇する勾配で流速1ml/min
で溶出せしめた。１分間のフラクシヨンを集め、液体シ
ンチレーシヨンカウンターで放射活性を測定した。ミリ
ストイル−〔3H〕グリシン標準物質は、TowlerとGlase
r,Biochemistry25,878−884（1986）に記載されたと本
質的に同様の方法により合成し前記した如くにしてHPLC
で分析した。 脂肪酸アシル化ペプチド標準物質の合成 放射活性を有する対称性のミリスチン酸あるいはパル
ミチン酸の無水物と、Gly−Asn−Ala−Ala−Ala−Ala−
Arg−Argとをピリジン中で反応せしめてアシル化ペプチ
ド標準物質の合成を行つた。〔3H〕脂肪酸100mCiを、そ
れぞれの脂肪酸クロライド４μで処理し、次いでそれ
ぞれの非放射活性脂肪酸4.8mgを含むピリジン150μ中
に懸濁せしめた。23℃で60分間反応を進行せしめた。次
いで、この溶液の65μを、Gly−Asn−Ala−Ala−Ala
−Ala−Arg−Arg400−500μｇに加えた。Labquakeミキ
サーで混合しながら、反応を１晩進行せしめた。次い
で、ピリジンを減圧下に留去し、得られる残渣を石油エ
ーテル0.3mlで２回抽出し、50％メタノール水溶液400μ
に再溶解した。反応生成物を精製し、前記したと同様
にして逆相HPLCで分析した。化学合成標準物質と酵素生
成物とは、いずれもプロナーゼＥで消化された。またこ
れらを、前記したと同様にして20,000ダルトンのアシル
化蛋白質について逆相HPLCで分析した。但しこの場合消
化を完全に行なうためにはロナーゼ200μｇで十分であ
つた。 Ｎ−ミリストイルグリシルペプチドシンセターゼ活性分
析用の酵母抽出物の調製 酵母培養物を、前記したと同様にして生育せしめて、
660nmでのO.D.を１−３とした。培養液40mlを、４℃で7
600xgで10分間遠心して細胞を集めた。上清液をデカン
テーシヨンし次いで、冷却した10m Tris（pH7.4）1mlに
細胞ペレツトをピペツトで移し、次いでポリプロピレン
製の円錐状の1.5ml遠心チューブに移して４℃で7600xg
で10分間遠心して、細胞を再びペレツト化した。次いで
細胞を、コールドアツセイ溶解バツフアー〔10mM Tris
（pH7.4）,1mMジチオスレイトール、0.1mMエチレングリ
コール−ビス（β−アミノエチルエーテル）N,N,N′,
N′−テトラ酢酸（EGTA）及び10μg/mlアプロチニン〕4
00μにピペツトで移して再懸濁せしめた。0.5mmガラ
スビーズ約400μを、再懸濁した細胞に加え、前記し
た放射活性ラベル化細胞の崩壊の時と同様にして渦動せ
しめて細胞を溶解した。ビーズが静置後、溶解物を集
め、細胞の破片を、４℃で1000xgで10分間遠心して除い
た。次いで上清液を、Beckman75Tiローター中で、４℃
で45,000rpmで30分間遠心した。上清液を除き、粗膜ペ
レツトを、コールドアツセイ溶解バツフアー400μに
ピペツトで移して再懸濁した。３つの細胞フラクシヨン
のアリコートについて、すぐに分析するかあるいは−60
℃で保存した。粗膜ペレツトの活性は、−60℃で少なく
とも３ケ月間安定であつた。蛋白質はPetersonの方法
〔Anal.Biochem.83,346−356（1977）〕により測定し
た。 Ｎ−ミリストイルグリシルペプチドシンセターゼ活性の
分析 以下の如くにして、〔3H〕脂肪酸アシル化CoAを酵素
的に合成し、インキユベーシヨン体に加えた。アシルCo
Aシンセターゼ反応は以下のものから構成される（アツ
セイチユーブ１個当り）。即ち、〔3H〕ミリスチン酸0.
5μ Ci;2Xアツセイバツフアー〔20mM Tris（pH7.4）,2m
Mジチオスレイトール,10mM MgCl2,0.2mM EGTA〕25μ
;5mM ATP蒸留水溶液５μ（NaOHでpH0.7に調整）;20
mMリチウムCoAの蒸留水溶液2.5μ;Pseudomonasアシル
CoAシンセターゼ1mU/μの50mM N−２−ヒドロキシエ
チルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸溶液（pH
7.3）15μ；及び蒸留水2.5μから構成される。反応
を30℃で20分間進行せしめた。Hosakaらの方法〔Meth.E
nzymol.71,325−333（1981）〕の変法により測定した
所、典型的には〔3H〕の脂肪酸の40％−50％が、この方
法によりそのCoAエステルに変換された。この変法は、6
NHClでpH2.0に酸性化し、５倍容量のヘプトンで６回抽
出後に、反応液中に残存する放射活性を測定して分析す
る方法である。この反応液50μを、アツセイ抽出バツ
フアー（前記参照）40μ及び1mM−Gly−Asn−Ala−Al
a−Ala−Ala−Arg−Arg10μを含むチユーブに加え
た。チユーブ１個当り酵母細胞抽出物10μ（典型的に
は蛋白質50μｇ）を加えて30℃で10分間インキユベーシ
ヨンしてアツセイを開始した。１チユーブ当りメタノー
ル110μ及び100％トリクロロ酢酸（w/v）10μを加
えて氷で10分間冷却してアツセイを終止した。沈澱した
蛋白質を、テーブルトツプEpendorf遠心機で8000xgで３
分間遠心して除いた（この条件下では、合成〔3H〕ミリ
ストイルペプチドあるいは〔3H〕パルミトイルペプチド
の95％は、アツセイ混合物に加えた時溶解したままであ
る）。上清液50μを、メタノール75μ及びHPLCバツ
フアーA75μと混合し、30cm Waters μ Bondapak C18
のカラムの3.9mm及び前記したと同じHPLCバツフアーを
用いて逆相HPLCにより分析した。35％アセトニトリルで
溶出をスタートし、次いで１分間当り１％のアセトニト
リル量が上昇する勾配で溶出せしめた。１分間のフラク
シヨンを集め、それぞれのフラクシヨンの放射活性を、
液体シンチレーシヨンカウンターで測定した。〔3H〕−
ミリストイル−Gly−Asn−Ala−Ala−Ala−Ala−Arg−A
rgは24分後に溶出し、〔3H〕パルミトイル−Gly−Asn−
Ala−Ala−Ala−Ala−Arg−Argは30分後に溶出した。 結果 前述した如くにして調整した〔3H〕−ミリストイルグ
リシルペプチド及び〔3H〕パルミトイルグリシルペプチ
ドの化学合成標準物質は、サンプルの分析と同様の条件
下で、逆相HPLCカラムから、それぞれ59％アセトニトリ
ル、65％アセトニトリルの時に溶出した。細胞溶解調製
物は、粗膜フラクシヨンと溶解フラクシヨンに分別さ
れ、Ｎ−ミリストイルグリシルペプチドシンセターゼ活
性は、粗膜フラクシヨンと溶解フラクシヨンの両者で検
出された。全比活性、溶解フラクシヨンの比活性及び膜
フラクシヨンの比活性は、それぞれ10分間アツセイでの
蛋白質１μｇ当り、1410,1320,2260dpnであつた。最初
の反応速度から判断して、活性の65％は粗膜フラクシヨ
ン中に存在しているものと考えられる。 酵素反応生成物と化学的に合成した標準物質〔3H〕−
ミリストイルペプチドは、同じであり、グリシンに共有
結合したミリステートを有していることが、前記した逆
相HPLCで分析した時に証明された。 ペプチド基質に対するＮ−ミリストイルグリシンペプ
チドの特異性を証明するために、他のグリシルペプチド
がGly−Asn−Ala−Ala−Ala−Ala−Arg−Argのアシル化
を競争的に抑制する能力を調べた。下記する表Ｉのテス
ト１から明らかなように、1mMジペプチド、1mMテトラペ
プチド、1mMデカペプチドのいずれも、18μＭペプチド
のミリストイル化に対して何んらの効果も及ぼさなかつ
た（約1/8のKm値）。しかして、Ｎ−ミリストイルグリ
シルペプチドシンセターゼは、オクタペプチド基質に対
して特異性を示すことが判る。 酵母からの粗膜フラクシヨンを用いて上記表Ｉの如く
変化せしめて、前記した如くにしてアツセイを行なつ
た。テスト１では、アツセイのATP及びCoAに対する依存
性を、外因性の脂肪酸CoAリガーゼの非存在下にテスト
した。テスト２では、酵母の酵素は熱に不安定であるこ
とが証明されており、テスト３では、Ｎ−末端グリシン
を含む他のペプチドでは反応は抑制されないことが証明
されている。このテストでは、可能な抑制効果を最大限
に発揮せしめるために、通常用いる90μＭではなく18μ
Ｍのペプチド基質を用いて測定した。 実施例３ 実施例１と本質的に同様にして、Merrifieldの固相法
により、本発明の他のペプチドを合成し次いで酵母（S.
cerevisiae株JR153）のミリストイル化酵素に対する基
質としての活性をテストした。アツセイチユーブ１個当
り〔3H〕−ミリスチン酸１μ Ciを用いる以外は、実施
例２のアツセイ条件と同様にして、酵素に対するペプチ
ド基質の特異性をテストした。本実施例で用いた酵母の
酵素は、酵母の培養細胞の粗ホモジエネートを51−70％
（NH4）2SO4で分別し、BEAE−セフアロース CL−6B
（フアルマシヤ）を用いたイオン交換カラムクロマトグ
ラフイー次いでCoA−アガロースアフイテイーマトリツ
クス（フアルマシア）を用いたアフイニテイークロマト
グラフイーで部分精製して得たものである。ペプチドは
表IIに示すように、それぞれの動力学的データKm,Vmax
により特徴付けを行なつた。 ＊：標準コントロールオクタペプチドのVmaxは、部分精
製した酵母の酵素1mg当りの１分間に形成されるミリス
トイル化ペプチドの量2840pmolであつた。 実施例４ BC3Hlマウスの筋肉細胞から得たミリストイル化酵素
に対するオクタペプチド基質特異性を、実施例２と類似
の方法により、いくつかのオクタペプチドについてテス
トした。このマウス筋肉細胞は、Olsonら、J.Biol.Che
m.258,2644−2652（1983）に記載されたと本質的に同様
の方法により培養した。酵素のアツセイは、マウス筋肉
細胞から得た、核のない上清液のフラクシヨンを用いて
実施した。トリクロロ酢酸−メタノールアツセイ上清液
の50μについて、実施例２と本質的に同様にしてHPLC
で分析した。表IIIでは、このテストにおけるオクタペ
プチド基質の特異性が示されている。 表IIIの標準コントロールペプチド（＊印を付けた）
及び最後のオクタペプチドは、他の３つのオクタペプチ
ドに比べて極めて高い活性を示した。他の３つのオクタ
ペプチドは、バツクグランドDPM（１分間当りの分解
量）に比べて本質的に不活性であつた。 本明細書に用いたアミノ酸の略号は以下に示す意味を
有する。 本明細書の記述から、本発明の精神及び範囲内での例
は、当業者にとつて明らかであろう。そしてかかる例
も、本明細書の特許請求の範囲内のものである。しかし
て、本明細書に記載した如き、ミリストイル化酵素に対
する基質としての生物学的活性に不利な、あるいは決定
的な影響を及ぼさない限り、個々のアミノ酸及び／又は
ペプチドの長さを変えることは任意であり、これらの変
化したものも、本明細書の特許請求の範囲内のものであ
る。
フロントページの続き
(72)発明者 ドウワイト アーノルド トウラー
アメリカ合衆国 ミズーリ州，セント
ルイス，アパートメント 102，ラクレ
ーデ 4545
(56)参考文献 Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．43
（３），509−519 （1974)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．以下に示すアミノ酸配列からなる群より選ばれたア
ミノ酸配列を有する、ミリストイル化酵素の基質ペプチ
ド又はその生理学的に許容し得るアミド誘導体もしくは
塩誘導体： Gly−Asn−Ala−Ala−Ser; Gly−Asn−Ala−Ala−Ala−Ala; Gly−Asn−Ala−Ala−Ala−Ala−Arg; （ここでＲはGln又はSerを表わす） （ここでＲはAla又はAsnを表わし、ＳはArg,Gln又はPhe
を表わす） 及び Gly−Asn−Glu−Ala−Ala−Ala−Arg−Arg. ２．以下に示すアミノ酸配列を有する特許請求の範囲第
１項記載の基質ペプチド： Gly−Ｒ−Ala−Ala−Ala−Ala−Arg−Arg （ここでＲはGln又はSerを表わす）。 ３．ＲがSerである特許請求の範囲第２項記載の基質ペ
プチド。 ４．ＲがGlnである特許請求の範囲第２項記載の基質ペ
プチド。 ５．以下に示すアミノ酸配列を有する特許請求の範囲第
１項記載の基質ペプチド： Gly−Asn−Glu−Ala−Ala−Ala−Arg−Arg. ６．以下に示すアミノ酸配列を有する特許請求の範囲第
１項記載の基質ペプチド： Gly−Ｒ−Ｓ−Ala−Ala−Ala−Arg−Arg （ここでＲはAla又はAsn、ＳはArg,Gln又はPheを表わ
す）。 ７．ＲがAsnであり、ＳがPheである特許請求の範囲第６
項記載の基質ペプチド。 ８．アミノ酸配列Gly−Asn−Ala−Ala−Ala−Alaを有す
る特許請求の範囲第１項記載の基質ペプチド。 ９．アミノ酸配列Gly−Asn−Ala−Ala−Serを有する特
許請求の範囲第１項記載の基質ペプチド。 １０．以下に示すアミノ酸配列からなる群より選ばれた
アミノ酸配列を有する、ミリストイル化酵素の基質ペプ
チド又はその生理学的に許容し得るアミド誘導体もしく
は塩誘導体の製造法であって、 固相樹脂上で以下に示したアミノ酸配列中のアミノ酸を
順次縮合させて、固相樹脂にそのカルボキシ末端が固定
された以下に示したアミノ酸配列のペプチドを合成し、
次いで固相樹脂からそのペプチドを開裂させてペプチド
を得る、上記製造法： Gly−Asn−Ala−Ala−Ser; Gly−Asn−Ala−Ala−Ala−Ala; Gly−Asn−Ala−Ala−Ala−Ala−Arg; （ここでＲはGln又はSerを表わす） （ここでＲはAla又はAsnを表わし、ＳはArg,Gln又はPhe
を表わす） 及び Gly−Asn−Glu−Ala−Ala−Ala−Arg−Arg.
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