Hintergrund der Erfindung
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Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von
N-myristoyliertem Protein und insbesondere die Co-Expression von
N-Myristoyltransferase (NMT) und deren Proteinsubstraten in E.
coli.
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Die Fettsäureacylierung von spezifischen eukaryontischen
Proteinen ist ein wohlbekanntes Verfahren, das praktischerweise
in zwei Kategorien unterteilt werden kann. Einerseits wird
Palmitat (C16:0) über eine Ester- oder Thioesterbindung
posttranslatorisch an Membranproteine gebunden.
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Anderseits ist es bekannt, daß Myristat (C14:0) an lösliche
und Membranproteine über eine Amidbindung kovalent gebunden
wird. Man nimmt an, daß dies ein co-translatorischer Vorgang
ist. Es ist bekannt, daß in den N-myristoylierten Proteinen
Amino-terminale Glycinreste die Stelle der Acylierung sind.
Myristoyl CoA: Protein-N-Myristoyltransferase (NMT, E.C.
2.3.1.97) katalysiert diese co-translatorische Modifikation. Das
NMT-Struktur-Gen (NMT1) wurde unlängst aus Saccharomyces
cerevisiae kloniert. vgl. Duronio et al., Science 243, 796-800
(1989). Dieses Gen codiert für ein Polypeptid mit 455
Aminosäuren (Mr=52.837).
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Eine Vielfalt von Virus- und Zellproteinen erwiesen sich als
so durch die kovalente Bindung von Myristat, das durch eine Amid
bindung an seinen Amino-Termini an Glycin gebunden ist,
modifiziert. Eine solche Modifikation ist für die volle Expression der
biologischen Funktion einiger N-myristoylierten Proteine
wesentlich. Ein Beispiel für ein sehr gründlich untersuchtes
myristoyliertes Protein ist das transformierende Protein des Rous-
Sarcoma-Virus p60v-src. Ohne die kovalente Bindung des Myristats
an sein N-terminales Glycin kann das Protein Zellen nicht
transformieren, obwohl seine Tyrosinkinase-Aktivität intakt bleibt.
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Die Myristoylierungsreaktion kann folgendermaßen dargestellt
werden:
Myristoylierendes Enzym
Protein
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Weitere Hintergrundinformation über die obige Protein-
Fettsäureacylierung ist unter Bezugnahme auf die folgenden
Artikel von Wissenschaftlern, die mit der Washington University
School of Medicine verbunden sind, erhältlich:
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Towler und Glaser, Biochemistry 25, 878-84 (1986);
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Towler und Glaser, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 2812-2816
(1986);
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Towler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2708-2712
(1987);
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Towler et al. J. Biol. Chem. 262, 1030-1036 (1987);
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Towler et al., Ann. Rev. Biochem. 57, 69-99 (1988);
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Heuckeroth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8795-8799
(1988); und
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Heuckeroth und Gordon, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 5262-
5266 (1989).
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Unike synthetische Peptide mit relativ kurzen
Aminosäuresequenzen, die als Substrate für myristoylierende Enzyme
geeignet sind, sind in den U.S. Patenten Nr. 4,740,588 und
4,778,878 beschrieben. Beispiele für solche Peptide sind
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Gly-Asn-Ala-Ala-Ala-Ala-Arg-Arg
und
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Gly-Asn-Ala-Ala-Ser-Tyr-Arg-Arg.
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Bestimmte andere unike synthetische Peptide sind Inhibitoren
myristoylierender Enzyme, wie in den U.S. Patenten Nr. 4,709,012
und 4,778,877 beschrieben. In Heuckeroth et al., supra;
Heuckeroth und Gordon, supra; Bryant et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 86, 8655-8659 (1989); und Mumby et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87, 728-732 (1990) sind neue
Fettsäure-Analogsubstrate für myristoylierende Enzyme beschrieben, die als
antivirale, antifungale und antineoplastische Mittel potentiell
verwendbar sind. Diese Substratverbindungen sind Mono- und
Diheteroatom-substituierte Fettsäure-Analoge, bei welchen die
Heteroatome Sauerstoff und/oder Schwefel sind, welche Methylen
(-CH&sub2;-)-Gruppen in den Kohlenstoffpositionen 4 bis 13 in der
Fettsäurekette von C&sub1;&sub3;-C&sub1;&sub4;-Fettsäuren ersetzen. Beispiele für
solche Fettsäure-Analoge sind:
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11-Oxamyristinsäure
und
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13-Oxamyristinsäure.
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Die CoA-Ester dieser Fettsäure-Analoge sind Substrate für
NMT und werden selektiv auf Untergruppen von Zell- oder Virus-N-
Myristoylproteinen transferiert, wo sie die Proteinfunktion
ändern können.
Kurze Beschreibung der Erfindung
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Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein neues Verfahren zur
Co-Expression von N-Myristoyl-Transferase (NMT, E.C. 2.3.1.97)
und ihrer Proteinsubstrate in E. coli vorgesehen. Unter
Verwendung eines Doppelplasmidsystems kann die N-Myristoylierung eines
Säuger-Proteins in E. coli durch gleichzeitige Expression eines
NMT-Gens und einer für das Protein codierenden cDNA
rekonstituiert werden.
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Das neue Verfahren der vorliegenden Erfindung sieht ein
neues System zur Untersuchung der Substraterfordernisse und der
biologischen Wirkungen der N-Myristoylierung von Protein sowie
des Verhältnisses von NMT-Struktur/Aktivität vor. Zur
Veranschaulichung der Erfindung führt die Expression des Hefe-NMT1-
Gens in E. coli, einem Bakterium, das keine endogene
NMT-Aktivität besitzt, zur Produktion des intakten 53 kDa
NMT-Polypeptids sowie eines fragmentierten Polypeptids, das aus der
proteolytischen Entfernung seiner NH&sub2;-terminalen 39 Aminosäuren
stammt. Jede mittels E. coli synthetisierte NMT-Spezies hat
Fettsäure und Peptidsubstrat-Spezifitäten, die von jenen nicht
unterscheidbar sind, die aus NMT von S. cerevisiae stammen, wie
mittels einer in vitro-Untersuchung der Enzymaktivität
beurteilt, was darauf hinweist, daß die NH&sub2;-terminale Domäne dieses
Enzyms für seine katalytische Aktivität nicht notwendig ist.
Unter Verwendung eines Doppelplasmidsystems wurde die
N-Myristoylierung eines Säugerproteins in E. coli durch gleichzeitige
Expression des Hefe-NMT1-Gens und einer Mäuse-cDNA, die für die
katalytische (C) Untereinheit der cAMP-abhängigen Proteinkinase
(PK-A) codiert, rekonstituiert.
Stoffwechselmarkierungsuntersuchungen zeigten an, daß die Fettsäurespezifität der N-
Myristoylierung in diesem System erhalten blieb.
[³H]Myristinsäure war wirksam an den Gly¹-Rest der C-Untereinheit gebunden,
[³H]Palmitat jedoch nicht.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde auch festgestellt,
daß [³H]10-(Propoxy)-decansäure, ein Heteroatom-hältiges
Analoges der Myristinsäure mit verringerter Hydrophobie, jedoch
ähnlicher Kettenlänge, ein wirksames Alternativsubstrat für NMT
war, welches in die C-Untereinheit von PK-A eingebaut werden
konnte.
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Von Bryant et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 8655-8659
(1989) wurde kürzlich gezeigt, daß solche Heteroatom-hältige
Analoge der Myristinsäure die Replikation bestimmter Retroviren,
welche von der Bindung einer Myristoylgruppe an ihre gag-
Polyprotein-Prekursoren (z.B. den Pr55gag des HI-Virus 1; HIV-I)
abhängen, inhibieren.
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Ein großer Vorteil des hierin definierten bakteriellen
Systems gegenüber eukaryontischen Systemen ist das
Nichtvorhandensein von endogener NMT und Substraten, was einen direkteren
Weg zur Herstellung myristoylierter, analog substituierter und
nicht-myristoylierter Formen eines gegebenen Proteins zum
Vergleich ihrer strukturellen und funktionalen Eigenschaften
ergibt. Das vorliegende Verfahren erleichtert das Screenen von
Enzyminhibitoren sowie von alternativen NMT-Substraten, wie
Heteroatom-hältigen Analogen, auf ihre Einbaubarkeit in ein
spezifisches Ziel-Protein. Schließlich ist das vorliegende
Verfahren auch zur erneuten Testung anderer eukaryontischer
Proteinmodifikationen in E. coli geeignet, so daß
Struktur/Aktivitäts-Verhältnisse modifizierender Enzyme und ihrer Substrate
leichter bestimmt werden können.
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Zur Produktion von Hefe-NMT1 in E. coli kann das NMT1-Gen in
einen geeigneten Plasmid-Expressionsvektor, wie z.B. pMON5840,
kloniert werden. Dieses Plasmid ist eine Variante von pMON5515,
welche außer einer irrelevanten Sequenz den recA-Promotor
(PrecA) und die Ribosomen-Bindungsstelle, welche von der
Bakteriophagen-T7-Phagen-Gen 10-Leader-RNA (g10-L RBS)
hergeleitet ist, enthält und für eine verbesserte Expression von
Fremdgenen
in E. coli geeignet ist, wie weiters von Olins et al.,
Gene 73, 227-235 (1988); Olins und Rangwala, J. Biol. Chem. 264,
16973-16976 (1989) beschrieben ist. Der recA-Promotor in
pMON5840 wird als das HpaII-Fragment erhalten und entspricht den
Nucleotiden 63-210 der von Horii et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 77, 313-317 (1980) veröffentlichten Sequenz. Das Hefe-NMT1-
Gen kann in den Stammvektor ligiert werden, welcher dann zur
Expression der NMT mittels herkömmlicher Vorgangsweise verwendet
werden kann.
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Insbesondere befindet sich das Hefe-NMT1-Gen hinter dem
g10-L durch gentechnische Herstellung einer NcoI-Stelle an
seinem Initiator-Met-Codon und Subklonieren der DNA in pMON5840.
Die NMT-Transkription wird dadurch unter die Steuerung des E.
coli recA-Promotors gestellt, welcher sich vor der g10-L-Sequenz
in pMON5840 befindet. E. coli-JM101-Zellen, die dieses
rekombinante Plasmid tragen, werden bis zur mid-log Phase gezüchtet und
dann mit Naladixinsäure behandelt, um den recA-Promotor zu
induzieren.
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Unter Verwendung des vorhergehenden Plasmidsystems wurde NMT
nachfolgend 750-fach durch sequentielle Ammoniumsulfat-
Fraktionierung, DEAE-Sepharose CL-6B und
CoA-Agarose-Affinitätschromatographie der Zellysate gereinigt. Unter Verwendung
einer gekoppelten in vitro-Untersuchung auf NMT-Aktivität
[Towler und Glaser, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 2812-2816
(1986)] wurde festgestellt, daß die von E. coli stammende,
teilweise gereinigte NMT Km und Vmax-Werte für verschiedene
Peptidsubstrate zeigte, die mit jenen eines teilweise
gereinigten NMT-Präparats aus Hefe beinahe identisch waren.
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Ein Doppelplasmid-System wurde zur Co-Expression des Hefe-
NMT1-Gens und einer für die katalytische Mäuse-Cα-Untereinheit
von cAMP-abhängiger Protein-Kinase (PK-A) codierenden cDNA (Cα)
in E. coli, von Uhler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83,
1300-1304 (1986) beschrieben, verwendet. Ein Plasmid wurde durch
Klonieren des 1,9 kb NcoI/HindIII- NMT1-Fragments in pMON5839,
welches ein Derivat von pACY177 ist, das das Kanamycin-
Resistenz-Gen und den p15A-Replikationsursprung enthält,
konstruiert. Ein weiteres Plasmid wurde durch Klonieren einer
1,8 kb NdeI/KpnI-Cα-cDNA- in pMON2670, das das Ampicillin-
Resistenz-Gen und den ColE1-Replikationsursprung enthielt,
konstruiert.
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Die Co-Expression von NMT und ihren Protein-Substraten in E.
coli kann so die Analyse der
NMT-Struktur/Aktivitäts-Verhältnisse erleichtern, zur Identifizierung struktureller
Charakteristika ihrer Proteinsubstrate, die zur N-Myristoylierung notwendig
sind, beitragen und Einblicke hinsichtlich der Rolle des
Myristoylanteils in der Funktion individueller N-Myristoyl-Proteine
geben. Die Wirkung der Modifizierung spezifischer N-Myristoyl-
Proteine mit Heteroatom-hältigen Analogen von Myristat kann nun
direkt durch Vergleichsstudien von durch E. coli synthetisierte
nichtacylierte, myristoylierte und analog substituierte Spezies
beurteilt werden. Mutierte Stämme von E. coli, bei welchen der
Metabolismus von Fettsäuren defizient ist [Silbert, Ann. Rev.
Biochem. 44, 315-339 (1975); Nunn et al., J. Biol. Chem. 261,
167-171 (1986)], können bei diesen Untersuchungen besonders
geeignet sein, indem sie die Fähigkeit zur Abgabe exogener
Fettsäuren und ihrer Analoge an den Acylierungsapparat
verbessern. Schließlich kann angesichts der Beobachtung [Heuckeroth et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8795-8799 (1988)], daß die
Acyl-CoA-Bindung an NMT die Affinität des Enzyms für
verschiedene Peptidsubstrate beeinflußt, die Co-Expression von NMT und
ihrer Proteinsubstrate in E. coli eine gute funktionelle
Untersuchung zum Screenen der relativen Effizienz des Einbaus
verschiedener Analoge in ein gegebenes Ziel-Protein bieten. In
diesem Sinn kann das hierin definierte N-Myristoylierungssystem
zur Identifikation nützlicher Antitumor- oder antiviraler
Arzneistoffe beitragen.
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Die voranstehenden Stamm-Plasmidvektoren pMON2670 und
pMON5840, jeweils in E. coli JM101, sind bei der American Type
Culture Collection, Rockville, Maryland, unter den
Akzessionsnummern ATCC 68218 bzw. ATCC 68220 hinterlegt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Obgleich die Beschreibung mit Patentansprüchen endet, die
den Gegenstand, der als die vorliegende Erfindung angesehen
wird, besonders herausstreichen und genau beanspruchen, wird
angenommen, daß die Erfindung aus der folgenden detaillierten
Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung in
Verbindung mit den beigefügten zeichnungen besser verstanden
wird, worin:
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Fig. 1 in fünf Abbildungen A, B, C, D und E, die
N-Myristoylierung der in E. coli synthetisierten, Mäuse-cAMP-
abhängigen katalytischen (C) Proteinkinase-Untereinheit in einer
illustrativen Ausführungsform der Erfindung zeigt;
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Fig. 1A (Abbildung A) eine schematische Darstellung von
Plasmidkonstrukten zur Expression von NMT1 und Cα DNAs in E.
coli ist;
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Fig. 1B, 1C und 1D (Abbildungen B, C und D) Gel-Muster
zeigen, in welchen Lysate aus E. coli-Transformanten hergestellt
wurden, die verschiedene Kombiantionen von Plasmiden enthielten,
nach Markierung mit exogen zugesetztem [³H]Myristat (Abbildung
B), [³H]Palmitat (Abbildung C) oder [³H]10-(Propoxy)-decanoat
(Abbildung D).
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Die [³H]Lysatproteine wurden dann SDS-PAGE und einer
Fluorographie unterzogen. Der Pfeil zeigt die Position der Wanderung
der gereinigten Mäuse-C-Untereinheit an. Die fluorographische
Belichtungszeit für die Gele, die in den Abbildungen B und C
gezeigt sind, betrug 4 Tage, wogegen das in Abbildung D gezeigte
Gel 15 Tage lang belichtet wurde. Bahn 1: E. coli-Stamm JM101
ohne Plasmide; Bahn 2: JM101 plus Stamm-Vektoren; Bahn 3: JM101
plus rekombinante NMT1- und Cα-enthaltende Plasmide, ohne
Induktion; Bahn 4: JM101 plus NMT1- und Cα-Plasmide nach
Induktion; Bahn 5: JM101 plus NMT1- und mutierte Ala² Cα-
Plasmide nach Induktion; Bahn 6: JM101 plus NMT1- und
Stammvektor ohne Cα-Insert nach Induktion; Bahn 7: JM101 plus Cα und
Stamm-Vektor ohne NMT1-Insert nach Induktion;
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Fig. 1E (Abbildung E) eine Western Blot-Analyse von E. coli-
Lysaten, die die Wildtyp-Gly²-C-Untereinheit oder die mutierte
Ala²-C-Untereinheit enthalten, zeigt. Die Blots wurden mit einem
Kaninchen-anti-Maus-C-Untereinheit-Serum als Sonde untersucht;
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Fig. 2 eine schematische Darstellung der
Stammplasmidvektoren, pMON5840, pMON2670 und pMON5839 ist, die für die
Konstruktion der Expressionsplasmide für die in Fig. 1 beschriebenen
NMT1- und Cα-Gene verwendet wurden.
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Zur genaueren Veranschaulichung der Erfindung wurde die
folgende beispielhafte präparative Laborarbeit durchgeführt.
BEISPIELE
MATERIALIEN UND METHODEN
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Stamm-Expressionsvektoren, die für die Erzeugung von NMT-1
und Cα in E. coli verwendet wurden.
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Zwei Plasmide, die den
ColE1-Replikationsursprung trugen, pMON2670 und pMON5840, wie
schematisch in Fig. 2 dargestellt, wurden in diesem Beispiel
verwendet. E. coli-JM101-Stämme, die diese Plasmide
beinhalteten, sind bei der ATCC hinterlegt und sind unter den
Akzessionsnummern ATCC 68218 bzw. ATCC 68220 erhältlich. Kurz gesagt
basieren die Plasmide auf dem von Olins et al., Gene 73, 227-235
(1988) beschriebenen Plasmid pMON5515 und bestehen aus einem
Ampicillin-Resistenz-Marker (AMPr) und dem ColE1-Replikon (ori-
ColE1), dem durch Nalidixinsäure induzierbaren E. coli-recA-
Promotor und der G10-L-Ribosomenbindungsstelle. Außerdem trägt
pMON2670 einen T7-Transkriptionsterminator (T7 ter.), während
pMON5840 den Einzelstrang-Replikationsursprung (ori-F1) des F1-
Phagen [Dente et al., Nucleic Acids Res. 11, 1645 (1983)]
enthält, der auch als Transkriptionsterminator wirkt. Die beiden
Plasmide enthalten auch irrelevante Codierregionen (für
pMON2670, einen Teil des Human-proANF-Gens, proANF; für
pMON5840, einen Teil des Human-Interleukin-1-Gens, hIL-1) nach
der G10-L-Ribosomenbindungsstelle. Unike NcoI, NdeI und HindIII-
Restriktionsstellen gestatteten das leichte Entfernen der
irrelevanten Codierregionen.
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Für die Doppelplasmidexpression von NMT1 in E. coli wurde
ein Plasmidvektor basierend auf pACYC177 [Chang und Cohen, J.
Bacteriol. 134, 1141-1156 (1978)] verwendet, wie schematisch in
Fig. 2 veranschaulicht. Ein dieses Plasmid beinhaltender E.
coli-JM101-Stamm, nämlich das Plasmid pMON5839, enthält den
p15A-Replikationsursprung (orip15A) und ein
Kanamycin-Resistenz-Gen (KANr) als selektierbaren Marker. Das Plasmid enthält den
induzierbaren tac-Promotor (Ptac) [De Boer et al., DNA 2 , 213-
235 (1988)] und einen Transkriptions-Terminator, der von Phagen-
P22-Sequenzen (P22 ter.) stammt. Das Plasmid enthält auch eine
irrelevante Codierregion (ein bakterielles Chloramphenicol-
Acetyl-Transferase-Gen, cat) nach der
g10-L-Ribosomenbindungsstelle, welche einfach durch Spaltung mit NcoI und HindIII
entfernt werden konnte.
Expression von S. cerevisiae-NMT in E. coli.
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Eine 780-
Basenpaar-Region (die Nucleotide 213 bis 993) des 2,1
Kilobasen(kb)-Bam HI/HindIII-S. cerevisiae-NMT1-genomischen
Fragments [Duronio et al., Science 245, 796-800 (1989)] wurde
unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion [Saiki et al.,
Science 239, 487-491 (1988)] und eines mutagenen Oligonucleotids
(5'CGGTAGTAAACGGA-TCCATACCATGGCAGAAGAGGATAAAGCGA-AAAAAT3')
amplifiziert. Dies ermöglichte die Einführung einer NcoI-
Restriktionsenzymstelle am Initiator-ATG-Codon von NMT1. Die
neue NcoI-Stelle änderte auch das Codon zwei der NMT1 von einem
Serin zu einem Alanin. Die Amplifikationsprodukte wurden in
pBB105 (Duronio et al., supra) zurück-subkloniert, um das
geänderte NMT1-Allel zu erzeugen. Die NcoI-Stelle ermöglichte
die Verbindung des NMT1-Gens mit dem E. coli recA-Promotor
[Horii et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 313-317 (1980)]
und ein Translations-Enhancer-Element, erhalten vom Phagen-T7
(g10-L in Fig. 1A). Dies wurde durch Ligieren des neu erzeugten
1,9 kb NcoI/HindIII-Fragments in NcoI/HindIII-verdautes
pMON5840, voranstehend beschrieben, erreicht. Das resultierende
Plasmid (pBB125) wurde zur Transformation von E. coli-Stamm
JM101 [Messing, Recombinant DNA Tech. Bull. 2, 45-48 (1979)]
verwendet. Die Transformanten wurden bei 37ºC in LB-Nährlösung +
100µg/ml Ampicillin bis zu einem OD&sub6;&sub0;&sub0; von 1,0 geschüttelt. Der
recA-Promotor wurde durch Zugabe von Nalidixinsäure bis zu einer
Endkonzentration von 50µg/ml [Feinstein et al., Nuc. Acids Res.
11, 2927-2941 (1983)] induziert. Nach einer 15-20minütigen
Inkubation bei 37ºC wurden die Zellen durch Zentrifugation
geerntet und unter Druck (2000psi) mit einer Power Laboratory
Press (American Instrument Co.) aufgebrochen. Die NMT-Spezies
wurden, wie nachstehend beschrieben, gereinigt.
Plasmide zur Co-Expression von NMT1 und Cα in E. coli.
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pBB131 wurde durch Klonieren des 1,9 kb NcoI/HindIII-NMT1-
Fragments in pMON5839, einem Derivat von pACYC177 [Chang und
Cohen, J. Bact. 134, 1141-1156 (1978)], konstruiert. Cα-cDNAs,
die für die katalytische Untereinheit von PK-A codieren [Uhler
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1300-1304 (1986)] wurden
als 1,8 kb NdeI/KpnI-Fragmente in pMON2670, voranstehend und von
Li et al., J. Biol. Chem. 262, 13773-13779 (1987) beschrieben,
kloniert. pBB132 enthält die Wildtyp-Cα-cDNA (aus g. Stanley
McKnight), die ein Gly an der Position 2 ihres primären
Translationsprodukts (der Initiator Met besetzt die Position 1)
spezifiziert. Eine mutierte Cα-cDNA mit einem Ala an der
Position 2 wurde mittels stellengerichteter Oligonucleotid-
Mutagenese unter Verwendung eines modifizierten Verfahrens von
Zoller und Smith, Nuc. Acids Res. 10, 6487-6500 (1982) erzeugt.
Eine Uracil enthaltende Einzelstrang-Matrize wurde aus dem
Phagemid pUC119/Cα in RZ1032-Zellen [Kunkel, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 32, 488-492 (1985)] hergestellt, und die Gly² T Ala²-
Mutagenese wurde mit dem Oligomer 5'-CATATGGCCAACGCCGCC-3'
durchgeführt. Die Mutätion wurde durch Didesoxynucleotid-
Sequenzierung [Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74,
5463-5467 (1977)] bestätigt. pBB131 (NMT1) und pBB132 (Gly²-Cα)
oder pBB133 (Ala²-Cα) wurden zur Transformation von E. coli-
Stamm JM101 verwendet. Die Restriktionsanalyse von Plasmid-DNA
bestätigte die Identität der Konstrukte innerhalb
Ampicillin/Kanamycin-resistenter E. coli-Doppeltransformanten.
[³H]Fettsäure-Markierung von in E. coli erzeugter PK-A C-
Unterheinheit.
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Vier ml-Kulturen der Doppeltransformanten wurden
bei 37ºC bis zu einer OD&sub6;&sub0;&sub0; von 0,5 in LB-Nährlösung + 100µg/ml
Ampicillin und 100µg/ml Kanamycinsulfat geschüttelt. Isopropyl-
β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) wurde dann bis zu einer
Endkonzentration von 1 mM zugegeben, um die NMT-Produktion zu
induzieren (vgl. Ergebnisse, nachstehend). Wenn die Kulturen OD&sub6;&sub0;&sub0; =
1,0 erreichten (etwa 40 min später), wurde Nalidixinsäure bis zu
einer Endkonzentration von 50µg/ml zugegeben, um die Produktion
der C-Untereinheit zu induzieren (vgl. Ergebnisse, nachstehend).
[³H]Myristat (New England Nuclear; 39,3 Ci/mmol, 113 µCi
zugesetzt pro ml Kultur), [³H]Palmitat (New England Nuclear; 30
Ci/mmol, 143 µCi/ml) oder [³H]10-(Propoxy)-decanoat [Heuckeroth
und Gordon, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 5262-5266 (1989)]
(31,7 Ci/mmol, 800 µCi/ml) wurden gleichzeitig mit der
Nalidixinsäure zugegeben. Die Kulturen wurden weitere 20 min lang
bei 37ºC geschüttelt, und die Zellen wurden durch Zentrifugation
geerntet. Die Lysate wurden durch lüminütiges Kochen von im
Pellet enthaltener E. coli in 40µl einer Lösung von 125 mM Tris,
pH 8,0, 4% SDS, 20% Glycerin, 10% β-Mercaptoethanol und 0,2 M
Dithiothreit hergestellt. Der Zellabfall wurde durch
Zentrifugation entfernt, und 15 µl Aliquots des Überstands wurden SDS-
PAGE [Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970)] und nachfolgender
Fluorographie unter Verwendung von EN³HANCE (New England
Nuclear)-Autoradiographie-Enhancer unterzogen. Für die Western-
Blot-Analysen wurden 50 µg der reduzierten und denaturierten
Lysatproteine, hergestellt aus unmarkierter E. coli, welche die
Gly²-C-Untereinheit oder die Ala²-C-Untereinheit erzeugt, durch
SDS-PAGE getrennt, auf Nitrocellulose elektrogeblottet
[Burnette, Anal. Biochem. 112, 195-230 (1981)], und die Filter
wurden mit polyklonalen, monospezifischen Kaninchenantisera,
gezüchtet gegen gereinigte Mäuse-C-Untereinheit, als Sonden
untersucht. Die Antigen-Antikörper-Komplexe wurden mit ¹²&sup5;I-
Protein-A [Burnette, supra] sichtbar gemacht.
In vitro-System zur Untersuchung auf NMT-Aktivität.
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Zur
Beurteilung der Peptid- und Acyl-CoA-Substrat-Spezifitäten von
von E. coli stammender S. cerevisiae-NMT wurden rohe Lysate oder
teilgereinigte Enzympräparationen zu einem gekoppelten in-vitro
Untersuchungssystem [Towler und Glaser, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 83, 2812-2816 (1986)] zugegeben. Der erste Schritt dieser
Untersuchung umfaßt die enzymatische Umwandlung von radioaktiv
markierten Fettsäuren in ihre CoA-Thioester mittels Pseudomonas-
Acyl-CoA-Ligase. Diese Ligase ist für Fettsäuresubstrate
weitgehend unspezifisch [Shimizu et al., Anal. Biochem. 107,
193-198 (1980)]. Octapeptid-Substrate und NMT wurden dann zur
Erzeugung von Acylpeptiden zugegeben. Die Acylpeptide wurden aus
der Reaktionsmischung durch Trichloressigsäure/Methanol-Fällung
und C&sub1;&sub8;-Reversphasen-HPLC unter Verwendung eines linearen
Gradienten von Acetonitril in Wasser gereinigt [Towler und
Glaser, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 2812-2816 (1986)].
ERGEBNISSE
In E. coli erzeugte S. cerevisiae-NMT hat eine Substrat-
Spezifität ähnlich jener des authentischen Hefeenzyms.
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Das S.
cerevisiae-NMT1-Gen codiert für ein Protein von 455 Aminosäuren
mit einem berechneten Mr von 52.837, das für das vegetative
Zellwachstum wesentlich ist [Duronio et al., Science 245, 796-
800 (1989)]. Das Polypeptid hat keine identifizierbare
signifikante Primärsequenzhomologie mit irgendeinem in derzeit
verfügbaren Databasen eingetragenen Protein (Duronio et al., ibid.).
Eine sechsschrittige 11.000fache Reinigung unter Verwendung 4
verschiedener chromatographischer Matrizen war notwendig, um ein
apparent homogenes Enzympräparat von dieser Hefe zu erhalten
[Towler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2708-2712
(1987)]. E. coli-Lysate enthalten keine nachweisbare NMT-
Aktivität, wie durch eine empfindliche in vitro-Untersuchung
[Towler und Glaser, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 2812-2816
(1986)] für das Enzym beurteilt. So bietet die Expression von
Hefe-NMT in diesem Prokaryont eine Möglichkeit zum Erhalt großer
Mengen von Wildtyp- (oder mutiertem) Protein, dessen Aktivität
in Abwesenheit jeglicher endogener Myristoyltransferasen
gemessen werden konnte.
-
Die Expression von S. cerevisiae-NMT in E. coli wurde unter
Verwendung von pMON-Plasmid-Vektoren erreicht. Diese Vektoren
enthalten induzierbare Promotoren, die mit einem Translations-
"Enhancer" verschmolzen sind, der aus dem Gen 10-Leader-Bereich
(g10-L) des Bakteriophagen T7 stammt [Olins et al., Gene 73,
227-235 (1988)]. Das Hefe-NMT1-Gen wurde unmittelbar nach dem
g10-L placiert, indem eine NcoI-Stelle an ihrem Initiator-Met-
Codon auf gentechnischem Weg hergestellt wurde und die DNA in
pMON5840 subkloniert wurde. Die NMT1-Transkription wurde dadurch
unter die Steuerung des E. coli-recA-Promoters gestellt [Horii
et al., supra, Olins et al., supra], der sich vor dem g10-L in
pMON5840 befindet. E. coli Stamm JM101, die dieses rekombinante
Plasmid trug, wurde bis zur mittel-log-Phase gezüchtet und
danach mit Nalidixinsäure behandelt, um den recA-Promotor zu
induzieren [Feinstein et al., Nuc. Acids Res. 11, 2927-2941
(1983)]. Die NMT wurde danach 750fach durch sequentielle
Ammoniumsulfatfraktionierung, DEAE-Sepharose CL-6b, und CoA-
Agarose-Affinitäts-Säulenchromatographie von induzierten
Zelllysaten [Towler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2708-2712
(1987)] gereinigt. Unter Verwendung der oben beschriebenen
gekoppelten in vitro-Untersuchung auf NMT-Aktivität wurde
bestimmt, daß die teilgereinigte, von E. coli stammende Hefe-NMT
für eine Vielfalt von Octapeptid-Substraten Km- und Vmax-Werte
zeigte, die mit jenen fast identisch waren, die mit einem
teilgereinigten NMT-Präparat aus S. cerevisiae [Towler et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 84, 2708-2712 (1987)] gemessen wurden.
(Vgl. nachstehende Tabelle I). Beispielsweise reduzierte die
Einführung eines Serin-Rests an der Position 5 einer "Stamm"-
Octapeptid-GNAAAARR-NH&sub2;, erhalten aus der NH&sub2;-terminalen Sequenz
der C-Untereinheit von PK-A, ihren apparenten Km über 100-fach
bei beiden NMT-Präparaten. Ein NH&sub2;-terminales Gly ist absolut
notwendig. Die Substitution eines Gly¹-Restes durch Ala¹
wandelte das Peptid in ein inaktives Substrat um (Tabelle I).
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Die Zugabe eines NH&sub2;-terminalen Met-Rests erzeugte auch ein
inaktives Peptid, was anzeigt, daß teilgereinigte Hefe-NMT aus
E. coli, wie aus S. cerevisiae isolierte NMT (Towler et al.,
ibid.), keine zugehörige Methionylaminpeptidase-Aktivität
besitzt.
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Um zu bestätigen, daß E. coli eine intakte Hefe-NMT
erzeugte, wurden Proteine, die aus der CoA-Agarose-Säule mit 100mM KCl
eluiert worden waren, durch SDS-PAGE getrennt und auf eine
Polyvinyliden-Difluorid-Membran (Millipore Corp.) transferiert.
Ein 53 kDa-Polypeptid, entsprechend der Masse der 455-Reste-
Hefe-NMT [Duronio et al., Science 245, 796-800 (1989)] wurde aus
dieser Membran herausgeschnitten und einem Edman-Abbau unter
Verwendung eines Gasphasen-Sequenzierers von Applied Biosystems,
Modell 470A, unterzogen. Die NH&sub2;-terminale Sequenz zeigte an,
daß das 53 kDa-Polypeptid intakte Hefe-NMT darstellte.
-
Zum Erhalt eines homogenen Präparats des Enzyms wurde aus E.
coli erzeugte NMT mittels Mono S-Fast Protein Liquid
Chromatography (FPLC) weiter gereinigt. Färbung des SDS-PAGE-
Gels des 250 mM NaCl-Eluats einer Mono-S-Säule mittels
Coomassie-Blau [Towler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,
2708-2712 (1987)] zeigte eine zusätzliche Bande von 45 kDa,
welche gemeinsam mit NMT-katalytischer Aktivität eluierte.
Edman-Abbau des 45 kDa-Polypeptids zeigte, daß ihm die 39 NH&sub2;-
terminalen Reste von NMT fehlten, was darauf hinweist, daß Teile
der Polypeptidkette, wie die Lys³&sup9;-Phe&sup4;&sup0;-bindung, für Proteolyse
anfällig sind und entweder während der Reinigung oder kurz nach
der Synthese in E. coli schnell verloren gehen.
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Die Mono-S-gereinigte 45 kDa-NMT-Spezies behielt die
Fähigkeit, leicht zwischen Myristoyl-CoA und Palmitoyl-CoA zu
unterscheiden, bei und zeigte die 100fache Reduktion in apparentem Km
für Ser&sup5;-substituiertes GNAAAARR-NH&sub2; (Tabelle I). Das
proteolytische 45 kDa-Fragment scheint eine katalytische Kerndomäne
beizubehalten. Die Rolle der fehlenden 39 Aminosäuren bleibt
unbekannt, doch könnten sie für (wesentliche) Wechselwirkungen
von NMT mit zusätzlichen Faktoren innerhalb der Hefe oder für
ihr richtiges intrazelluläres Targeting notwendig sein. Die
Feststellung, ob eine gentechnisch hergestellte 45 kDa-NMT den
lebensunfähigen Nmt&supmin;Phänotyp von S. cerevisiae retten könnte
(Duronio et al., supra) sollten es gestatten, sich diesen Fragen
zuzuwenden zu beginnen. Da von E. coli stammende NMT kinetische
Eigenschaften hat, die jenen der von Hefe stammenden NMT sehr
ähnlich sind, kann man auch den Schluß ziehen, daß die
Peptid- und Fettacyl-CoA-Substrat-Spezifitäten des Enzyms weder von
einer eukaryontischen Proteinmodifikation, noch von zusätzlichen
Hefe-spezifischen Faktoren abhängig sind.
Rekonstitution der Protein-N-Myristoylierung in E. coli.
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Die
in Tabelle I beschriebenen Daten zeigten an, daß die Expression
von Hefe-NMT in E. coli ein Enzym ergab, das richtig gefaltet
war, indem seine Substrat-Spezifitäten großteils von jenen der
aus S. cerevisiae isolierten NMT nicht unterscheidbar waren. Da
es in E. coli keine endogene NMT-Aktivität gibt, zeigten die
hierin angeführten Ergebnisse die Möglichkeit auf, daß die Co-
Expression von Hefe-NMT und einem eukaryontischen
Proteinsubstrat in E. coli die Reproduktion einer Proteinmodifikätion, die
offensichtlich ausschließlich eukaryontisch ist, in einem
Prokaryont gestatten würde.
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Die cAMP-abhängige Proteinkinase (PK-A) war eine der am
frühesten entdeckten Proteinkinasen und auch eine der
biochemisch am besten verstandenen [Taylor, J. Biol. Chem. 264, 8445-
8446 (1989)]. Die Kinase spielt eine Rolle bei der Regulierung
des Zellwachstums und des Metabolismus, und seine katalytische
(C) Untereinheit war das erste Protein, von welchem gezeigt
wurde, daß es N-myristolyiert war [Carr et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 79, 6128-6131 (1982)]. Die Expression einer cDNA-
(Cα), welche für die Mäuse-C-Untereinheit codiert [Uhler et al.,
supra], in E. coli führte zur Isolierung einer löslichen und
aktiven Form des Proteins [Slice und Taylor, J. Biol. Chem.,
264, 20940-20946 (1989)], welchem Myristat am NH&sub2;-terminalen Gly
fehlte. Nachdem gezeigt worden war, daß ein vom NH&sub2;-Terminus der
Mäuse-C-Untereinheit stammendes Octapeptid ein gutes Substrat
für die intakte (und fragmentierte), von E. coli stammende Hefe-
NMT in vitro war (Tabelle 1), entschied man sich, die
C-Untereinheit als beispielhaftes Protein für die Rekonstitutionstests
in vivo zu verwenden. Das in Fig. 1A skizzierte
Doppelplasmidsystem wurde zur Co-Expression des Hefe-NMT1-Gens und der Cα-
cDNA benützt. Die Vektoren wurden so konstruiert, daß jeder (i)
gleichzeitig als stabiles episomales Plasmid erhalten bleiben
konnte und (ii) die unabhängige Induktion der Transkription
ihrer Fremd-DNA- Sequenzen fördern konnte. Die Expression von
NMT1 wurde unter die Steuerung des
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)-induzierbaren tac [DeBoer et al., DNA 2, 231-
235 (1983)]-Promotor und die g10-L-Ribosomenbindungsstelle
[Olins et al., Gene 73, 227-235 (1988)], die in einem Plasmid
auf Basis von pACYC177 (Messing, supra) enthalten war, gestellt.
Dieses Plasmid inkludiert den p15A-Replikationsursprung und ein
Kanamycin-Resistenz-Gen. Die Expression von zwei Cα-cDNAs wurde
unter die Steuerung des recA-Promotors [Horii et al., supra] und
des g10-L gestellt, der in einem Plasmid vorhanden war, welches
das Ampicillin-Resistenz-Gen und den ColE1-Replikationsursprung
enthielt. Eine dieser cDNAs codierte für die Wildtyp-40 kDa-C-
Untereinheit von PK-A (Gly²), während die andere eine Variante
erzeugte, die eine Substitution von Gly² durch Ala² aufwies.
Diese mutierte C-Untereinheit sollte kein Substrat für NMT sein
(Tabelle I).
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Paarweise Kombinationen der Stammvektoren und ihrer
NMT1- und Cα-enthaltenden rekombinanten Derivate wurden in E. coli
Stamm JM101 co-transfektiert, wo sie durch Ampicillin- und
Kanamycin-Selektion beibehalten wurden. [³H]Myristat wurde
verwendet, um Kulturen von logarithmisch wachsenden Zellen
während sequentieller Expression von Hefe-NMT1 gefolgt von Cα zu
markieren. Aus den Kulturen hergestellte Lysate wurden SDS-PAGE
und Fluorographie unterzogen, um den Einbau von radioaktiv
markierter Fettsäure in Protein zu untersuchen. Sobald die
NMT1- und die Wildtyp-Cα-Sequenzen in E. coli co-exprimiert worden
waren, wurde ein 40 kDa-Protein metabolisch nach Zugabe von
[³H]Myristinsäure zum Kulturmedium (Bahn 4 der Fig. 1B)
markiert. Dieses Protein wanderte gemeinsam mit gereinigten
Standards der C-Untereinheit. Die Markierung des 40 kDa-Proteins
war absolut abhängig vom Vorhandensein von sowohl NMT1 als auch
Wildtyp-Ca. E. coli, die NMT1 exprimierte, welcher jedoch Cα
fehlte, und E. coli, welcher NMT1 fehlte, die jedoch Cα
exprimierte, konnten beide nicht das 40 kDa-Protein mit
[³H]Fettsäure (Bahnen 6 bzw. 7 der Abbildung B) markieren.
Außerdem war das 40 kDa-Protein nicht markiert in Zellen, die
NMT1 und die mutierte Cα-cDNA, die für die Ala²-substituierte C-
Untereinheit codiert (Bahn 5 der Abbildung B) exprimierten.
Western-Blot-Analyse unter Verwendung polyklonaler Kaninchen-
Antisera, die gegen die C-Untereinheit von Mäuse-PK-A gezüchtet
worden waren, bestätigte das Vorhandensein äquivalenter Mengen
von Gly²- und Ala²-40 kDa-Proteinen in Lysaten, die aus E. coli,
Stamm JM101, enthaltend die Wildtyp- bzw. mutierten
Cα-rekombinanten Plasmide (Fig. 1E) hergestellt worden waren. Die
Produktionsmenge der zwei C-Untereinheiten wurde auf 0,1% des gesamten
E. coli-Proteins, auf Basis der Signalintensitäten der
gereinigten Standards der C-Untereinheit, die in den Western Blots
inkludiert waren, geschätzt. Die NMT stellte etwa 0,2% der E.
coli-Proteine nach der Induktion dar. Dieser Wert wurde aus den
NMT-Aktivitäten in rohen Lysaten und der spezifischen Aktivität
des gereinigten Hefe-NMT berechnet [Towler et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84, 2708-2712 (1987)]. Die Co-Expression von NMT1
und Cα hatte keine schädliche Wirkung auf die Wachstumskinetik
von E. coli während der Induktionsperiode.
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Das mit [³H]Myristat markierte 40 kDA-Protein wurde aus
einem SDS-Polyacrylamidgel herausgeschnitten und mit Pronase E
verdaut, um die Natur der Fettacyl-Protein-Bindung zu
untersuchen. Ein markiertes Produkt wurde erzeugt, welches bei C&sub1;&sub8;-
Reversphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)
[Heuckeroth und Gordon, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 5262-5266
(1989)] mit dem chemisch synthetisierten [³H]Myristoylglycin-
Standard [Towler und Glaser, Biochemistry 25, 878-884 (1986)]
mitwanderte. Zusammen bestärkten diese Daten die
Schlußfolgerung, daß (i) die C-Untereinheit von PK-A auf Gly²-abhängige
Weise nur in Hefe-NMT-erzeugenden E. coli-Zellen myristoyliert
werden kann, und daß (ii) die endogene Methionylaminopeptidase-
Aktivität von E. coli [Sherman et al., Bioessays 3, 27-31
(1985)] das Initiator-Met der C-Untereinheit entfernen kann,
wodurch sein Gly²-Rest für den NMT-katalysierten Transfer von
Myristat freigelegt wird. Dieses letztere Ergebnis bestätigt
frühere Ergebnisse, die die NH&sub2;-terminale Sequenz der in E. coli
synthetisierten C-Untereinheit als Gly-Asn-Ala-Ala... (Slice und
Taylor, supra) identifizierten.
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Es wurde berechnet, daß die Gesamteffizienz der
NMT-katalysierten Bindung des Myristoyl-Teils an die C-Untereinheit in E.
coli praktisch 100% betrug, indem die folgenden drei Parameter
gemessen wurden: (1) die Konzentration der C- Untereinheit in E.
coli-Lysaten aus der Western-Blot- Hybridisierungsanalyse;
(2) die Menge an [³H]-Myristat, das in das Protein eingebaut
ist, nach dem Herausschneiden von Banden aus
SDS-Polyacrylamidgelen, die eine bekannte Menge an E. coli-Lysatproteinen
enthalten; und (3) die endgültige spezifische Aktivität der
[³H]-Myristinsäure in E. coli² nach der Markierung (13µmCi/nmol)
[Silbert et al., Biochemistry 12, 164-171 (1973)].
Die Rekonstitution der Protein N-Myristoylierung in E. coli
ist für C¹&sup4;-Fettsäuren spezifisch.
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10-(Propoxy)-decansäure (11-
Oxamyristinsäure) ist ein Analoges der Myristinsäure, das eine
ähnliche Kettenlänge, jedoch eine verringerte Hydrophobie (der
Decansäure vergleichbar) aufweist, weil eine Methylengruppe an
der Position 11 der Kohlenwasserstoffkette durch ein
Sauerstoffatom substituiert ist [Heuckeroth et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 85, 8795-8799 (1988)]. Wenn 11-Oxamyristat in vivo in
p60v-src eingebaut wird, bewirkt es eine bedeutende Umverteilung
des Proteins aus der Membran in Cytosol-Fraktionen [Heuckeroth
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 5262-5266 (1989)].
Stoffwechselmarkierungstests analog zu jenen, die oben mit
[³H]Myristinsäure beschrieben sind, deuteten darauf hin, daß die
C-Untereinheit auch auf Gly²-abhängige Weise markiert werden konnte,
wenn exogenes [³H]11-Oxamyristat oder [³H]Palmitat zu
NMT-erzeugenden E. coli-Zellen zugegeben wurde (Abbildung D bzw. C in
Fig. 1). Frühere Untersuchungen legten nahe, daß Palmitat vor
dem Einbau in N-Myristoyl-Proteine metabolisch in Myristat
umgewandelt werden muß [Heuckeroth et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 85, 8795-8799 (1988); Towler und Glaser, Biochemistry
25, 878-884 (1980); Olson et al., J. Biol. Chem. 260, 3784-3790
(1984)]. Pronase E-Verdau der [³H]Palmitat-markierten
C-Untereinheit ergab ein Produkt, welches bei C&sub1;&sub8;-Reversphasen-HPLC mit
[³H]Myristoylglycin mitwanderte. So bestätigt die gekoppelte E-
coli-Expression die bemerkenswerte Spezifität für die Fettacyl-
CoA-Kettenlänge, die in S. cerevisiae- und Säuger-Zellen
beobachtet wurde.
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Mindestens zwei Proteine von etwa 45 und 55 kDa
inkorporierten alle drei exogen zugesetzten [³H]Fettsäuren in E. coli-
Stämmen, die Hefe-NMT exprimierten (Bahnen 3-6 in den
Abbildungen B-D der Fig. 1). Zellen ohne Plasmide (Bahn 1) oder
Zellen, die den Stammvektor ohne NMT1 trugen (Bahn 2) bauten
keine Markierung in diese Proteine ein. Da das apparente Mr
dieser Proteine den beiden Formen der in E. coli erzeugten NMT
auffallend ähnlich ist, wurde die Natur der
Protein-[³H]Fettsäure-Verbindung untersucht. Pronase-E-Verdau dieser Proteine,
die entweder mit [³H]Myristat oder mit [³H]Palmitat markiert
waren, ergab ein Produkt, das bei C&sub1;&sub8;-Reversphasen-HPLC mit
[³H]Myristoylglycin mitwanderte. Die Tatsache, daß
Myristoylglycin nachgewiesen würde, zusammen mit der Beobachtung, daß
weder intakte Hefe-NMT, noch ihre proteolytisch verarbeitete 45
kDa-Form ein Gly an ihrem NH&sub2;-Terminus enthält, unterstützte die
Schlußfolgerung, daß diese [³H]Proteine nicht aus der
N-Myristoylierung von NMT selbst entstehen, sondern aus der
N-Myristoylierung endogener E. coli-Proteine. Man kann die Möglichkeit
jedoch nicht ausschalten, daß ein Teil der Bandenintensitäten
aus einer engen, nicht-kovalenten Bindung der [³H]Fettsäuren mit
NMT-Spezies entsteht. Eine Durchsuchung [Towler et al., J. Biol.
Chem. 263, 1784-1790 (1988); Devereux et al., Nuc. Acids Res.
12, 387-395 (1984)] der NBRF-Protein-Datenbank (Release 19,0)
auf E. coli-Proteinsequenzen, die mit MetGly... beginnen und
daher durch NMT acyliert sein könnten, ergab keine mit dem
entsprechenden Molekulargewicht. Selbst bei diesen beiden
"endogenen" Proteinsubstraten ist ein Hauptvorteil des
bakteriellen Systems gegenüber eukaryontischen Systemen das Fehlen
von sowohl endogener NMT-Aktität als auch Substraten Das Testen
alternativer Substrate für NMT, wie Heteroatom-enthaltender
Analoge, wird nun viel einfacher als bei eukaryontischen Zellen.
TABELLE I
Peptid- und Acyl-CoA-Substrat-Spezifitäten von von E. coli-
stammender S. cerevisiae-NMT
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Die in der voranstehenden Tabelle I gezeigten Peptid-Km- und
Vmax-Werte sind Durchschnittswerte, die aus 4- oder 5-Punkt-
Lineweaver-Burke-Diagrammen erhalten wurden. Diese Diagramme
wurden unter Verwendung von Daten, die in mindestens drei
unabhängigen in vitro-NMT-Untersuchungen erhalten worden waren,
erstellt. Unterschiedliche Peptidkonzentrationen wurden mit 15
µM Myristat untersucht, um die Peptid-Km- und Vmax-Werte zu
bestimmen. Fettacyl-CoA-Km- und Vmax-Werte wurden auf ähnliche
Weise erhalten, äußer daß unterschiedliche
Fettsäurekonzentrationen mit 60 µM GNAAAARR (d.h. Peptid bei seiner Km-
Konzentration) verwendet wurden. Die Hefe-NMT stammte aus einem
570fach gereinigten Präparat [Towler et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 84, 2708-2712 (1987)]. Die synthetischen
Peptidsubstrate sind durch ihren herkömmlichen einbuchstabigen
Aminosäure-Code dargestellt. Die Vmax-Werte sind Prozent von jenen,
die erhalten wurden, wenn GNAAAARR und Myristoyl-CoA als
Peptid- bzw. Acyl-CoA-Substrat verwendet wurden. (--) zeigt an, daß die
Menge an Enzym, die zur genauen Bestimmung des Km notwendig war,
übermäßig groß war. Peptide mit der Bezeichnung "kein Substrat"
hatten Vmax < 1%. ND = nicht bestimmt.
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Verschiedene andere Beispiele sind für den Fachmann nach
Lesen der vorliegenden Offenbarung offnsichtlich, ohne vom Geist
und Umfang der Erfindung abzuweichen. Alle solchen anderen
Beispiele sollen im Umfang der beigefügten Ansprüche eingeschlossen
sein.