DE69737432T2

DE69737432T2 - Farnesyl Diphosphat Synthase

Info

Publication number: DE69737432T2
Application number: DE69737432T
Authority: DE
Inventors: Hiroyuki Toyata shi Nakane; Chikara Ohto; Shinichi Aobu-ku Sendai-shi Ohnuma; Kazutake Sendai-shi HIROOKA; Tokuzo Sendai-shi NISHINO
Original assignee: Toyota Motor Corp
Current assignee: Toyota Motor Corp
Priority date: 1996-07-24
Filing date: 1997-07-16
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2017-07-17
Also published as: JPH1033184A; EP0821065A3; CA2210753C; US5935832A; EP0821065B1; EP0821065A2; KR100252529B1; TW472084B; CN1182132A; JP3379344B2; CA2210753A1; CN1165621C; KR980009456A; DE69737432D1; USRE43425E1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neuartiges mutiertes Enzym, welches lineare Prenyldiphosphate synthetisiert, die Vorläufer von Verbindungen sind, die für Organismen wichtig sind, wie etwa Steroide, Ubichinone, Dolichole, Carotinoide, prenylierte Proteine, tierische Hormone, pflanzliche Hormone und Ähnliche; ein das Enzym codierendes genetisches System; und ein Verfahren für die Herstellung und die Verwendung des Enzyms.
2. Verwandter Stand der Technik
Von den Substanzen mit wichtigen Funktionen in Organismen werden viele unter Verwendung von Isopren (2-Methyl-1,3-butadien) als eine Baueinheit biologisch synthetisiert. Diese Verbindungen sind so genannte Isoprenoide, Terpenoide oder Terpene, und werden in Abhängigkeit von der Anzahl der Kohlenstoffatome in Hemiterpene (C5), Monoterpene (C10), Sesquiterpene (C15), Diterpene (C20), Sesterterpene (C25), Triterpene (C30), Tetraterpene (C40), usw. klassifiziert. Die tatsächliche Biosynthese beginnt mit dem Mevalonatweg durch welchen Mevalonsäure-5-diphosphat synthetisiert wird, gefolgt durch die Synthese von Isopentenyldiphosphat (IPP), welches eine aktive Isopreneinheit.
Hinsichtlich der Identität der Isopreneinheit, die als ein Vorläufer vorgeschlagen wurde, wurde Isopentenyldiphosphat gefunden, die so genannte aktive Isopreneinheit. Dimethylallyldiphosphat (DMAPP), ein Isomer von Isopentenyldiphosphat, das als ein Substrat in der Synthese von Isopentenyladenin verwendet wird, welches als Cytokinin, eines der Pflanzenhormone, bekannt ist, ist ebenfalls dafür bekannt, dass es eine Kondensationsreaktion mit Isopentenyldiphosphat unterläuft, um kettenförmige aktive Isoprenoide zu synthetisieren, wie etwa Geranyldiphosphat (GPP), Neryldiphosphat, Farnesyldiphosphat (FPP), Geranylgeranyldiphosphat (GGPP), Geranylfarnesyldiphosphat (GFPP), Hexaprenyldiphosphat (HexPP), Heptaprenyldiphosphat (HepPP), usw.
Es gibt Kondensationsreaktionen vom Z-Typ und vom E-Typ. Geranyldiphosphat ist ein Produkt der Kondensation vom E-Typ, und Neryldiphosphat ist ein Produkt der Kondensation vom Z-Typ. Obwohl der gesamte E-Typ als die aktive Form bei Farnesyldiphosphat und Geranylgeranyldiphosphat angesehen wird, führt die Kondensation vom Z-Typ zur Synthese vom Naturkautschuk, Dolicholen, Bactoprenolen (Undecaprenolen) und verschiedenen, in Pflanzen gefunden Polyprenolen. Es wird angenommen, dass sie der Kondensationsreaktion unter Verwendung der Phosphatesterbindungsenergie des Pyrophosphats und des in dem Molekül vorhandenen Kohlenstoffgrundgerüsts unterzogen werden, und dass sie Pyrophosphat als das Nebenprodukt der Reaktion erzeugen.
Farnesyldiphosphat oder Geranylgeranyldiphosphat dienen als ein Reaktionssubstrat, die zu der Synthese von prenylierten Proteinen (aus Farnesyldiphosphat oder Geranylgeranyldiphosphat), repräsentiert durch G-Proteine, führen, die wichtig im Mechanismus der Signaltransduktion in der Zelle sind; von Zellmembranlipiden (aus Geranylgeranyldiphosphat) der Archaebakterien; von Squalen (aus Farnesyldiphosphat), welches ein Vorläufer von Steroiden ist; und von Phytoen (aus Geranylgeranyldiphosphat), welches ein Vorläufer von Carotenoiden ist. Prenyldiphosphate aus Hexaprenyldiphosphat bzw. Heptaprenyldiphosphat mit sechs bzw. sieben Isopreneinheiten bis Prenyldiphosphate mit zehn Isopreneinheiten dienen als die Vorläufer der Synthese von Ubichinon und Menachinon (Vitamin K2), das im Elektronentransportsystem arbeitet.
Außerdem wird über die Biosynthese dieser aktiven Form der Isoprenoide eine unermessliche Anzahl von lebenswichtigen Verbindungen synthetisiert. Um nur einige zu nennen, sind da Cytokinine, die Pflanzenhormone sind, und Isopentenyl-Adenosin-modifizierte tRNA, die Hemiterpene als ihre Synthesevorläufer verwenden, Geraniole und das Isomer Nerol, die zu den Monoterpenen gehören, sind Hauptbestandteile des Rosenölparfüms, und ein Kampferbaumextraktes, Kampfer, welches ein Insektizid ist. Sesquihormone enthalten Juvenilhormone von Insekten, Diterpene umfassen das Pflanzenhormon Gibberellin, Duftspurpheromone von Insekten und Retinole und Retinale, die als Vorläufer für die Sehpigmente dienen, Bindungskomponenten der Purpurmembranproteine von stark halophilen Archaebakterien und Vitamin A.
Außerdem wurde unter Verwendung von Squalen, einem Triterpen, eine große Vielfalt von Steroidverbindungen synthetisiert, einschließlich, zum Beispiel, tierischen Sexualhormonen, Vitamin D, Ecdyson, welches ein Ecdysis-Hormon von Insekten ist, ein Pflanzenhormon Brassinolid, Bausteine der Plasmamembran usw. Verschiedene Carotinoide aus Tetraterpenen, die Vorläufer von verschiedenen Pigmenten von Organismen und vom Vitamin A sind, sind ebenfalls wichtige Verbindungen, die aus aktiven Isoprenoiden abgeleitet werden. Verbindungen, wie etwa Chlorophyll, Phäophytin, Tocopherol (Vitamin E) und Phyllochinon (Vitamin K1) werden ebenfalls aus Tetraterpenen abgeleitet.
Die aktiven Isoprenoidsynthasen, die nacheinander Isopentenyldiphosphate mit derartigen Allylsubstraten wie Dimethylallyldiphosphat, Geranyldiphosphat, Farnesyldiphosphat, Geranylgeranyldiphosphat, Geranylfarnesyldiphosphat, usw. kondensieren, werden Prenyldiphosphatsynthasen genannt, und werden ebenfalls, auf der Grundlage des Namens der Verbindung der Hauptreaktionsprodukte mit der längsten Kettenlänge benannt, z. B. Farnesyldiphosphatsynthase (FPP-Synthase), Geranylgeranyldiphosphatsynthase (GGPP-Synthase), usw. Es gibt Berichte über die Reinigung, die Aktivitätsmessung, das genetische Klonierung und das Sequenzieren von DNS (bzw. DNA), die für Enzyme codiert, wie etwa Farnesyldiphosphatsynthase, Geranylgeranyldiphosphatsynthase, Hexaprenyldiphosphatsynthase, Heptaprenyldiphosphatsynthase, Octaprenyldiphosphatsynthase, Nonaprenyldiphosphatsynthase (Solanesyldiphosphatsynthase), Undecaprenyldiphosphatsynthase und ähnliche aus Bakterien, Archaebakterien, Pilzen, Pflanzen und Tieren.
Diese aktiven Isoprenoidsynthasen, die die Grundlage der chemischen Synthese einer großen Vielzahl von Verbindungen darstellen, die sowohl in der Industrie als auch im akademischen Gebiet der Biowissenschaften wichtig sind und fanden aufgrund ihrer unstabilen Natur und ihrer geringen spezifischen Aktivitäten wenig praktische Verwendung bei der industriellen Anwendung. Jedoch wurde durch die Isolation von thermostabilen Prenyldiphosphatsynthasen aus thermophilen Bakterien und Archaebakterien und der diese Enzyme codierenden Gene ihre Erhältlichkeit als Enzyme gesteigert.
Hinsichtlich der Farnesyldiphosphatsynthase wurde ein Gen aus Bacillus stearothermophilus isoliert, einem mittleren Thermophil, und ein Enzym mit einer mittleren thermischen Stabilität wurde unter Verwendung von Escherichia coli als Wirtzzelle hergestellt [T. Koyma et al. (1993 J. Biochem: 113: 355–363; Japanische ungeprüfte Patent-Offenlegungschrift Nr. 5(1993)-219961]. Hinsichtlich der Geranylgeranyldiphosphatsynthase wurde ein Gen aus stark thermophilen Organismus wie etwa Sulfolobus acidocaldarius und Thermus thermophilus isoliert [S.-I. Ohnuma et al., (1994) J. Biol. Chem., 269: 14792–14797; Japanische ungeprüfte Patent-Offenlegungschrift Nr. 7(1995)-308193 und Japanische ungeprüfte Patent-Offenlegungschrift Nr. 7(1995)-294956] und Enzyme mit hoher thermischer Stabilität wurden hergestellt.
Außerdem wurden hinsichtlich der Prenyldiphosphatsynthase mit sowohl der Funktion der Farnesyldiphosphatsynthase und der Geranylgeranyldiphosphatsynthase das Enzym und das das Enzym codierende Gen aus dem stark thermophilen Organismus Methanobacterium thermoautotrophicum isoliert [A. Chen und D. Poulter (1993) J. Biol. Chem., 268: 11002–11007; A. Chen und D. Poulter (1994) ARCHIVES OF BIOCHEMSTRY AND BIOPHYTSICS 314] und die thermostabile Eigenschaft dieses Enzyms wurde gezeigt.
Jedoch gibt es bei der Synthese von Farnesyldiphosphate/Geranylgeranyldiphosphat aus Methanobacterium thermoautotrophicum keine Berichte über Daten von Dünnschichtchromatographie-Analysen usw., in denen die Kettenlängen der Reaktionsprodukte in Verbindung mit der Untersuchung der enzymatischen Aktivität spezifiziert werden konnten; die Kettenlänge wurde durch Messung von Geranyldiphosphat als das Allylsubstrat abgeschätzt. Da Geranyldiphosphat ebenfalls als ein Substrat von Geranylgeranyldiphosphatsynthase dienen kann, ist es unwahrscheinlich, dass die gemessene Aktivität allein die der Farnesyldiphosphatsynthase beinhaltet.
Außerdem wurde die Anwesenheit von Farnesyldiphosphatsynthase in Archaebakterien nicht bestätigt, von denen angenommen wird, dass sie Enzyme mit höherer Thermostabilität, höherer Salzstabilität und Stabilität gegen einen niedrigen pH haben.
Wie vorher erwähnt, löste die Verwendung der Farnesyldiphosphatsynthase aus Bacillus stearothermophilus einen Teil des Problems des Enzyms, dass es unstabil und schwer zu handhaben ist. Jedoch würde ein Enzym mit höherer thermischer Stabilität noch stabiler sein und noch zugänglicher für die industrielle Anwendung.
Überdies nutzen einige Prenyldiphosphatsynthasen mit einer längeren Kettenlänge Farnesyldiphosphat als ein Substrat. Wenn eine derartige langkettige Prenyldiphosphatsynthase gleichzeitig mit einer Farnesyldiphosphatsynthase zum Zweck des Bereitstellens des Substrates des ersten Enzyms verwendet wird, muss das letztere Enzym eine Stabilität haben, welche gleich oder höher als die der langkettigen Prenyldiphosphatsynthase ist. Wenn die industrielle Produktion von Farnesyldiphosphat erwogen wird, muss das Enzym immobilisiert oder für die Wiederverwertung gewonnen werden. Wenn es regeneriert wird, muss das Enzym selbst stabiler sein, muss eine höhere Thermostabilität, eine höhere Salzstabilität und eine höhere Stabilität in einem breiteren pH-Bereich haben.
Es wurde herausgefunden, dass von den zwei an Asparaginsäure reichen Domänen, die auf der Grundlage der Aminosäuresequenz der Prenyldiphosphatsynthase vorgeschlagen wurden, der Aminosäurerest an der fünften Position in der N-terminalen Richtung von der konservierten Sequenz I (DDXX(X)D) (wobei X eine Aminosäure bezeichnet und die zwei X in den Klammern nicht vorhanden sein können) der an Asparaginsäure reichen Domäne in der aminoterminalen Seite verantwortlich für die Steuerung der Kettenlänge des Reaktionsprodukts ist. Folglich wurde ein Verfahren erfunden, das die Reaktionsprodukte zum Zweck der Verlängerung der Kettenlänge des Reaktionsprodukts steuert [Japanische Patentanmeldung Nr. 8-191635, eingereicht am 3. Juli 1996 unter dem Titel "A Mutant Prenyl Diphosphate Synthase") entspricht EP-A-0816490]. Das unter Verwendung des Verfahrens hergestellte Enzym ermöglicht die Herstellung von Reaktionsprodukten, die verschiedene Kettenlängen haben. Jedoch waren keine Verfahren bekannt, die die Mutation von Geranylgeranyldiphosphatsynthase induzieren, um die Reaktionsprodukte zu steuern, um in der kurzen Kettenlängenseite zu sein, um Farnesyldiphosphat herzustellen.
EP-A-0 733 709, ein Dokument gemäß Art. 54(3) EPÜ und Journal of Biol. Chem. 96, Vol. 271, No. 17, pp. 10087–10095 offenbaren eine mutierte Farnesyldiphosphatsynthase, die Geranylgeranyldiphosphat synthetisieren kann, und ein Gen, das dafür codiert, wobei spezifische Mutationen in die Aminosäuresequenz des natürlichen Enzyms erzeugt wurden. Außerdem wurden bestimmte Aminosäuresubstitutionen der Steuerung der Kettenlänge der durch das mutierte Enzym synthetisierten Produkte zugeschrieben.
EP-A-0 763 542, ein Dokument gemäß Art. 54(3) EPÜ, offenbart eine mutierte Prenyldiphosphatsynthase aus Sulfolobus acidocaldarius einschließlich spezifischen Aminosäuresubstitutionen, die in das native Enzym eingeführt wurden. Eine derartige mutierte Prenyldiphosphatsynthase kann langkettiges Prenyldiphosphat synthetisieren.
Journal of Biological Chemistry, Bd. 271, Nr. 17, vom 26. April 1996, Seiten 10087–10095, berichtet über die ungerichtete chemische Mutagenese von Prenyldiphosphatsynthase bei Bacillus stearothermophilus. Die Literatur erwähnt verschiedene konservierte Domänen in dem Gen mit zwei an Asparaginsäure reichen Domänen, welche essentiell für die katalytische Aktivität sind. Diese Lehre betrifft eine Studie bezüglich der Frage, welche Aminosäurereste wichtig bei der Bestimmung der Kettenlänge des Endprodukts sind. Es wird weiterhin über die Bestimmung der Aminosäuresequenz der Mutanten berichtet und offenbart, dass diese Mutationen in der gesamten Sequenz des FPP Synthasegens verteilt sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren für die Herstellung von Farnesyldiphosphatsynthasen durch Modifikation von Aminosäuresequenzen von Prenyldiphosphatenzymen zu etablieren. Ein neues Enzym, das stabiler ist, oder dass eine höhere spezifische Aktivität hat, die besser an die industrielle Anwendung angepasst werden kann, würde es ermöglichen, unmittelbar eine mutierte Prenyldiphosphatsynthase oder das Gen davon zu erhalten, das Farnesyldiphosphat erzeugt, und dass die Eigenschaft der Prenyldiphosphatsynthase vor der Mutation aufrechterhält.
Aus der Information über die Nucleotidsequenz des Gens der Geranylgeranyldiphosphatsynthase der Mutante Sulfolobus acidocaldarius (S. acidocaldarius), wurde klargestellt, dass von den zwei an Asparaginsäure reichen Domänen, die auf der Grundlage der Analyse der Aminsäuresequenzen der Prenyldiphosphatsynthasen vorgeschlagen wurden, die Aminosäurereste innerhalb der an Asparaginsäure reichen Domäne der konservierten Sequenz I (DDXX(XX)D) an der aminoterminalen Seite oder die fünf Aminosäurereste von der N-terminalen Seite von dem Aminoterminus der konservierten Sequenz I bei der Steuerung der Kettenlänge der Reaktionsprodukte beteiligt sind.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung eine mutierte Geranylgeranyldiphosphatsynthase mit einer modifizierten Aminosäuresequenz zur Verfügung, wobei die mutierte Geranylgeranyldiphosphatsynthase eine an Asparaginsäure reiche Domäne mit der Sequenz D₁D₂X₁ (X₂X₃)X₄D₃ im konservierten Bereich (Region) II des Enzyms hat, wobei jedes von D₁, D₂ und D₃ einen Asparaginsäurerest bezeichnet; X₁, X₂, X₃ und X₄ sind jeweils unabhängig eine Aminosäure und X₂ und X₃ sind wahlweise unabhängig in der vorher erwähnten Domäne vorhanden, wobei die mutierte Geranylgeranyldiphosphatsynthase wenigstens eine Aminosäuresubstitution ausgewählt aus (a) einer Aminosäuresubstitution zwischen dem Aminosäurerest an der fünften Position in der N-terminalen Richtung von D₁ der an Asparaginsäure reichen Domäne und dem Aminosäurerest an der ersten Position in der N-terminalen Richtung vom D₁ der an Asparaginsäure reichen Domäne hat, und (b) den Aminosäurerest X₁ der an Asparaginsäure reichen Domäne und/oder
(2) zusätzliche Aminosäure(n) zwischen den Aminosäurerest X₁ und dem Aminosäurerest X₄ der Asparaginsäure reichen Domäne eingefügt wurden, wobei die mutierte Geranylgeranyldiphosphatsynthase ein Farnesyldiphosphat synthetisieren kann, das eine kürzere Kettenlänge als die Geranylgeranyldiphosphatsynthase hat, die durch die natürliche Geranylgeranyldiphosphatsynthase synthetisiert wird.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Farnesyldiphosphat produzierende, mutierte Geranylgeranyldiphosphatsynthase zur Verfügung, welche die Eigenschaften beibehält, die die natürliche Geranylgeranyldiphosphatsynthase aufweist.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine DNS oder eine RNS (bzw. RNA) zur Verfügung, die für das vorher erwähnte Enzym codieren.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin einen rekombinanten Vektor und genauer einen Expressionsvektor zur Verfügung, der die vorher erwähnte DNS umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin einen durch den vorher erwähnten Vektor transformierten Wirt zur Verfügung.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren für die Herstellung von Prenyldiphosphaten, die nicht mehr als 15 Kohlenstoffe haben, zur Verfügung, mit einem Schritt, in dem das vorher erwähnte Enzym in Kontakt mit einem Substrat gebracht wird, das aus der Gruppe ausgewählt wird bestehend aus Isopentenyldiphosphat, Dimethylallyldiphosphat, und Geranyldiphosphat.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren für die Herstellung eines mutierten Enzyms gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Verfügung, wobei das Verfahren die Schritte der Kultivierung des vorher erwähnten Wirtes und der Ernte des Expressionsprodukts aus der Kultur umfasst.
KURZE ERLÄUTERUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1 ist eine graphische Darstellung, die die Bereiche (I) bis (V) und die an Asparaginsäure reiche Domäne I von verschiedenen Prenyldiphosphatsynthasen zeigt. In der Figur stellt die Sequenz die Aminosäuresequenz von Geranylgeranyldiphosphatsynthase dar, und ATGERPYRS ist eine Sequenz aus Arabidopsis thaliana, LA15778.p aus Lupinas albus, CAGERDIS aus Capsicum annuum, ATGGPSRP aus Arabidopsis thaliana, GGPSpep aus Sulfolobus acidocaldarius, SPCRT.pep aus Rhodobacter sphaeroides, RCPHSYNG aus Rhodobacter capsulatus, EHCRTS.pe aus Erwinia herbicola, MXCRTNODA aus Myxococcus thaliana und NCAL3.pep aus Neurospora crassa. Die links von jeder Aminosäuresequenz angegebene Nummer stellt den Ort von der N-terminalen Seite jeder Geranylgeranyldiphosphatsynthase am N-Terminus der Aminosäuresequenz dar.
Die 2 ist eine graphische Darstellung, die die thermische Stabilität der mutierten Prenyldiphosphatsynthase zeigt. Die Ordinate zeigt die relative Aktivität von 100 % bei Inkubation bei 60°C. Die Abszisse zeigt die Inkubationstemperatur. SacGGPS ist die Geranylgeranyldiphosphatsynthase vor der Mutation. Die anderen stellen jeweils den mutierten Enzymtyp dar. BstFPS ist die Farnesyldiphosphatsynthase aus Bacillus stearothermophilus.
Die 3 zeigt eine Photographie eines Entwicklungsmusters der Dünnschichtchromatographie von dephosphorylierten Reaktionsprodukten der mutierten Prenyldiphosphatsynthase dar, wenn Geranyldiphosphat als das Allylsubstrat verwendet wurde. In der Figur stellt ori. den Entwicklungsursprung dar, und s.f. stellt die Lösungsmittelfront dar.
GOH ist Geraniol, FOH ist Farnesol, GGOH ist Geranylgeraniol, und GFOH ist Geranylfarnesol, und diese werden durch die Dephosphorylierung von Geranyldiphosphat, Farnesylphosphat, Geranylgeranyldiphosphat bzw. Geranylfarnesyldiphosphat erzeugt. SacGGPS ist die Geranylgeranyldiphosphatsynthase vor der Mutation. Die anderen sind jeweils mutierte Enzyme.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Es wurde vorgeschlagen, dass es fünf konservierte Bereiche in der Aminosäuresequenz einer Prenyldiphosphatsynthase (einer Untereinheit im Fall von einem Heterodimer) gibt [A. Chem et al., Protein Science Bd. 3, Seiten 600–607, 1994]. Es ist ebenfalls bekannt, dass von den fünf konservierten Bereichen es im Bereich II eine an Asparaginsäure reiche Domäne mit der konservierten Sequenz I gibt (wobei jedes von D₁, D₂, D₃, X₁, X₂, X₃ und X₄ gemäß Anspruch 1 definiert sind) gibt. Obwohl es im Bereich V ebenfalls eine als "DDXXD" angegebene, an Asparaginsäure reiche Domäne gibt, ist die zur Spezifizierung des modifizierten Bereichs der Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung verwendete an Asparaginsäure reiche Domäne die in Bereich II vorhandene, und diese Domäne wird als die an Asparaginsäure reiche Domäne I im Vergleich zu der im Bereich V vorhandenen an Asparaginsäure reichen Domäne II bezeichnet.
Als die Prenyldiphosphatsynthasen mit der vorher beschriebenen, an Asparaginsäure reichen Domäne können Farnesyldiphosphatsynthase, Geranylgeranyldiphosphatsynthase, Hexaprenyldiphosphatsynthase, Heptaprenyldiphosphatsynthase, Oetaprenyldiphosphatsynthase, Nonaprenyldiphosphatsynthase, Undecaprenyldiphosphatsynthase usw. erwähnt werden. Spezifischere Beispiele enthalten die Farnesyldiphosphatsynthase von Bacillus stearothermophilus, die Farnesyldiphosphatsynthase von Escherichia coli, die Farnesyldiphosphatsynthase von Saccharomyces cerevisiae, die Farnesyldiphosphatsynthase der Ratte, die Farnesyldiphosphatsynthase des Menschen, die Geranylgeranyldiphosphatsynthase von Neurospodera crassa, die Hexaprenyldiphosphatsynthase von Saccharomyces cerevisiae usw.
An einigen von diesen werden beispielhaft die Bereich I bis V und die an Asparaginsäure reiche Domäne I (im Kasten) im Bereich II der Aminosäuresequenz der Geranylgeranyldiphosphatsynthasen in der 1 gezeigt.
Die vorliegende Erfindung kann an jede Prenyldiphosphatsynthase mit der an Asparaginsäure reichen Domäne I angewandt werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung sind in der Aminosäuresequenz der Prenyldiphosphatsynthase Mutationen eingefügt, welche wenigstens eine Aminosäuresubstitution umfasst ausgewählt aus (a) den Aminosäureresten zwischen dem Aminosäurerest an der fünften Position in der N-terminalen Richtung von D₁ und dem Aminosäurerest an der ersten Position in der N-terminalen Richtung von D₁ der vorher definierten an Asparaginsäure reichen Domäne vorhanden im Bereich II, und (b) dem Aminosäurerest X₁ der an Asparaginsäure reichen Domäne und/oder
zusätzlich eine oder mehrere Aminosäure(n) wurden zwischen dem Aminosäurerest X₁ und dem Aminosäurerest X₄ der an Asparaginsäure reichen Domäne eingefügt.
Die mutierte Geranylgeranyldiphosphatsynthase der vorliegenden Erfindung synthetisiert ein Farnesyldiphosphat mit einer kürzeren Kettenlänge als das Geranylgeranyldiphosphat, das durch die natürliche Geranylgeranyldiphosphatsynthase synthetisiert wird.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird beispielsweise das Gen der Geranylgeranyldiphosphatsynthase des stark thermophilen Archaebakterium, Sulfolobus acidocaldarius, als das Ausgangsmaterial verwendet. Sulfolobus acidocaldarius ist erhältlich von der ATCC als ATTC Nr. 33909. Das Verfahren zur Klonierung des Gens wurde ausführlich in der Japanischen ungeprüften Patent-Offenlegungsschrift Nr. 7-308193 beschrieben. Es wurde ebenfalls mit der Eintragungsnummer D28748 in der genetischen Informationsdatenbank GenBank offenbart. Zur Verwendung der Sequenz kann sie durch ein in der Technik bekanntes herkömmliches Verfahren kloniert werden. Ein Beispiel der anderen Klonierungsverfahren wird in Beispiel 1 hierin dargestellt und seine Nucleotidsequenz wird als SEQ ID Nr.: 2 gezeigt.
Genauer ist das mutierte Enzym der vorliegenden Erfindung eine mutierte Geranylgeranyldiphosphatsynthase, die dadurch gekennzeichnet ist, dass wenigstens eine Aminosäure ausgewählt aus Phenylalanin an Position 77, Threonin an Position 78, Valin an Position 80, Histidin an Position 81, und Isoleucin an Position 84 durch eine andere Aminosäure ersetzt wurde, und/oder Aminosäure(n) zwischen Isoleucin an Position 84 und Methionin an Position 85 in der Geranylgeranyldiphosphatsynthase mit der in SEQ ID Nr.: 1 angegebenen Aminosäuresequenz eingefügt wurden.
Beispielsweise werden die Aminosäuresequenzen zur Verfügung gestellt, in denen die Aminosäuren wie im Folgenden gezeigt ersetzt wurden:
Mutiertes Enzym 1: Änderungen von Threonin an Position 78 zu Phenylalanin, und von Histidin an Position 81 zu Alanin;
Mutiertes Enzym 2: Änderungen von Threonin an Position 78 zu Phenylalanin, und von Histidin an Position 81 zu Leucin;
Mutiertes Enzym 3: Änderungen von Phenylalanin an Position 77 zu Tyrosin, von Threonin an Position 78 zu Phenylalanin, und von Histidin an Position 81 zu Leucin;
Mutiertes Enzym 4: Änderungen von Phenylalanin an Position 77 zu Tyrosin, Threonin an Position 78 zu Phenylalanin, und von Histidin an Position 81 zu Alanin;
Mutiertes Enzym 5: Änderungen von Phenylalanin an Position 77 zu Tyrosin, von Threonin an Position 78 zu Serin, von Valin an Position 80 zu Isoleucin und Isoleucin an Position 84 zu Leucin, und Einfügen von Prolin und Serin zwischen Isoleucin an Position 84 und Methionin an Position 85.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird angezeigt, dass die mutierte Geranylgeranyldiphosphatsynthase die charakteristischen Eigenschaften beibehält, die durch die native Geranylgeranyldiphosphatsynthase aufgewiesen werden. Zum Beispiel zeigen die vorher erwähnten fünf mutierten Enzyme eine Wärmebeständigkeit, die nahezu gleich zu der durch die native Geranylgeranyldiphosphatsynthase aufgewiesene ist.
Es ist bekannt, dass ein Enzym manchmal seine ursprüngliche enzymatische Aktivität aufweisen kann, selbst wenn es durch Addition, Entfernung und/oder Substitution von einer oder einiger Aminosäuren verglichen mit der ursprünglichen Aminosäuresequenz modifiziert wurde. Daher beabsichtigt die vorliegende Erfindung diejenigen Enzyme zu beinhalten, die durch Addition, Deletion und/oder Substitution von einer oder einiger, z. B. bis zu fünf oder bis zu 10, Aminosäuren im Vergleich zu der Aminosäuresequenz festgesetzt in der SEQ ID Nr. 1 haben, und die ihre ursprüngliche Funktion aufrecht erhalten können.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls die Gene zur Verfügung, die für die verschiedenen vorher erwähnten mutierten Enzyme codieren, die Vektoren, die diese Gene enthalten, genauer Expressionsvektoren, und die Wirte, die mit den Vektoren transformiert sind. Das Gen (DNS) der vorliegenden Erfindung kann leicht erhalten werden, z. B. durch Einführen einer Mutation in die DNS, die für die ursprüngliche Aminosäuresequenz, wie in der SEQ ID Nr.: 1 festgesetzt, codiert, unter Verwendung eines herkömmlichen Verfahrens, wie etwa ortsgerichtete Mutagenese, PCR usw.
Außerdem kann, wenn einmal die Aminosäuresequenz des erwünschten Enzyms bestimmt wurde, kann eine geeignete, dafür codierende Nucleotidsequenz bestimmt werden, und die DNS kann chemisch in Übereinstimmung mit einem herkömmlichen Verfahren der DNS-Synthese chemisch synthetisiert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin zur Verfügung einen Explosionsvektor mit einer wie vorher erwähnten DNS zur Verfügung, den durch den Expressionsvektor transformierten Wirt und ein Verfahren für die Herstellung des Enzyms oder Peptids der vorliegenden Erfindung unter Verwendung dieser Wirte.
Expressionsvektoren enthalten einen Ursprung der Replikation, die Expression regulierende Sequenzen usw., aber sie können in Abhängigkeit von den verwendeten Wirten sich unterscheiden. Als die Wirte können Prokaryoten, z. B. Bakterien wie etwa Escherichia coli, Organismen der Gattung Bacillus, wie etwa Bacillus subtilis und eukaryotischen Mikroorganismen, zum Beispiel Pilze, zum Beispiel Hefe, zum Beispiel Saccharomyces cerevisiae der Gattung Saccharomyces und Pichia pastoris der Gattung Pichia, filamentöse Pilze, z. B. der Gattung Aspergillus, wie etwa Aspergillus niger, tierische Zellen, zum Beispiel die kultivierten Zellen der Seidenraupe, die kultivierten Zellen von höheren Tieren, zum Beispiel CHO-Zellen, usw. erwähnt werden. Außerdem können Pflanzen ebenfalls als der Wirt verwendet werden.
Wie in den Beispielen angegeben, kann in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung können durch die Kultivierung des durch die DNS der vorliegenden Erfindung transformierten Wirtes, Farnesyldiphosphate in der Kulturflüssigkeit angereichert werden, welche geerntet werden können, um ihre Farnesyldiphosphate zu erzeugen. Außerdem können in Übereinstimmung mit der Erfindung Farnesyldiphosphate ebenfalls durch in Kontakt bringen der mutierten, durch das Verfahren der Erfindung erzeugten Geranylgeranyldiphosphatsynthase mit dem Substrat Isopentenyldiphosphat und jedem Allylsubstrat, wie etwa Dimethylallyldiphosphat und Geranyldiphosphat, erzeugt werden.
Wenn Escherichia coli als der Wirt verwendet wird, ist bekannt, dass der Wirt regulatorische Funktionen im Stadium der Transkription der mRNS aus DNS und der Translation des Proteins aus mRNS hat. Als die Promotorsequenz zur Regulation der mRNS-Synthese sind zusätzlich zu den natürlich auftretenden Sequenzen (z. B. lac, trp, bla, lpp, P_L P_R, ter, T3, Tz, usw.) ihre Mutanten (z. B. lac UV5) und die Sequenzen (wie etwa tac, trc, usw.) bekannt, in welchem ein natürlich auftretender Promotor künstlich fusioniert ist, und sie können für die vorliegende Erfindung verwendet werden.
Es ist bekannt, dass der Abstand zwischen der Sequenz der Ribosomenbindungstelle (GGAGG und ähnliche Sequenzen davon) und dem Startcodon ATG wichtig als die Sequenz ist, die die Fähigkeit der Synthese des Proteins aus mRNS reguliert. Es ist ebenfalls gut bekannt, dass ein Terminator (z. B. ein Vektor, der rrn Pt₁ T₂ enthält, ist kommerziell von Pharmacia erhältlich), der die Transkriptionsbeendigung am 3'-Ende steuert, die Effizienz der Proteinsynthese durch eine Rekombinante beeinflusst.
Als die Vektoren, die für die Herstellung der rekombinanten Vektoren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können kommerziell erhältliche Vektoren, wie sie sind verwendet werden, oder verschiedene Vektoren können erwähnt werden, die in Abhängigkeit von der beabsichtigten Verwendung abgeleitet werden. Zum Beispiel können pBR322, pBR327, pKK223-3, pKK233-3, pTrc99, und ähnliche erwähnt werden, die ein von pMB1 abgeleitetes Replikon haben; pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pTV118N, pTV119N, pBluescript, pHSG298, pHSG396, und Ähnliche, die verändert wurden, um die Kopienanzahl zu erhöhen; und pACYC177, pACYC184, und ähnliche, die ein von p15A abgeleitetes Replikon haben; und außerdem Plasmide abgeleitet von pSC101, ColE1, R1, der F-Faktor usw.
Außerdem können Fusionsproteine exprimierende Vektoren, die eine einfachere Reinigung erlauben, wie etwa pGEX-2T, pGEX-3X, pMal-c2 verwendet werden. Ein Beispiel des Gens, das als das Ausgangsmaterial der vorliegenden Erfindung verwendet wurde, wurde in der Japanischen ungeprüfte Patent-Offenlegungsschrift Nr. 7-308193 beschrieben.
Außerdem können zusätzlich zu den Plasmiden Virusvektoren, wie etwa der λ-Phage oder der M13-Phage, oder ein Transposon für die Transformation der Gene verwendet werden. Hinsichtlich der Transformation des Gens in einen anderen Mikroorganismus als Escherichia coli ist die Gentransformation in Organismen der Gattung Bacillus durch pUB110 (kommerziell erhältlich von Sigma) oder pHY300PLK (kommerziell hergestellt von Takara Shuzo) bekannt. Diese Vektoren werden beschrieben in "Molecular Cloning" (J. Sambrook, E.F. Fritsch, und T. Maniatis, Cold Spring Harboder Laboratory Press) und "Cloning Vector" (P.H. Pouwels, B.B. Enger, Valk, und W.J. Brammar, Elsevier), und in den Katalogen der Hersteller.
Die Integration des die Prenyldiphosphatsynthase codierenden DNS-Fragments und, wo erforderlich, des DNS-Fragments mit einer Funktion zur regulierten Expression des Gens des Enzyms in diesen Vektoren, kann durch ein bekanntes Verfahren unter Verwendung eines geeigneten Restriktionsenzyms und einer Ligase erfolgen. Spezifiche Beispiele der auf diese Weise konstruierten Plasmide enthalten zum Beispiel pBs-SacGGPS.
Die Mikroorganismen, in welche Gene direkt unter Verwendung derartiger rekombinanter Vektoren eingebracht werden können, beinhalten Escherichia coli und Mikroorganismen der Gattung Bacillus. Eine derartige Transformation kann ebenfalls zur Verwendung eines allgemeinen Verfahrens erfolgen, z. B. dem CaCl₂-Verfahren und dem Protoplasten-Verfahren wie in (J. Sambrook, E.F. Fritsch, und T.Maniatis, Cold Spring Harboder Laboratory Press) und "DNS Cloning" Bd. I bis III (O. M. Clover ed., IRL PRESS) beschrieben.
Um das mutierte Enzym der vorliegenden Erfindung zu erzeugen, wird ein wie vorher beschrieben transformierter Wirt kultiviert und dann wird die Kultur einem Verfahren mit Aussalzen, Ausfällen mit einem organischen Lösungsmittel, Gelchromatographie, Affinitätschromatographie, hydrophobe Chromatographie, Ionenaustauschchromatographie usw. unterzogen, um das Enzym zu gewinnen und zu reinigen.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung von Farnesyldiphosphaten unter Verwendung der Enzyme der vorliegenden Erfindung zur Verfügung. Gemäß diesem Verfahren reagiert das erfindungsgemäße Enzym mit einem Substrat in einem Medium, insbesondere einem wässrigen Medium, und dann wird, wie erwünscht, das Prenyldiphosphat aus dem Reaktionsmedium geerntet. Als das Enzym kann nicht nur ein gereinigtes Enzym sondern ebenfalls ein ungereinigtes Enzym, wie etwa ein halbgereinigtes Enzym in verschiedenen Stadien, oder eine Mischung der Kulturbrühe eines Mikroorganismus verwendet werden. Alternativ können immobilisierte Enzyme erzeugt gemäß dem allgemeinen Verfahren aus dem Enzym, dem ungereinigten Enzym oder einem Produkt, das das Enzym enthält, verwendet werden.
Als das Substrat, können Dimethylallyldiphosphate oder Geranyldiphosphate und Isopentenyldiphosphate verwendet werden. Als das Reaktionsmedium kann Wasser oder eine wässrige Pufferlösung, zum Beispiel Tris- Puffer oder Phosphatpuffer und ähnliche verwendet werden.
Unter Verwendung des Verfahrens zur Herstellung der mutierten Geranylgeranyldiphosphatsynthase erhalten durch die vorliegende Erfindung, kann die mutierte Prenyldiphosphatsynthase, die aus einem Archaebakterium stammt, erzeugt werden, die stabiler und daher einfacher zu handhaben ist, und die Prenylphosphat erzeugt. Außerdem wird ebenfalls eine Erzeugung der Farnesyldiphosphat produzierenden mutierten Prenyldiphosphatsynthase erwartet, die die Eigenschaft der Prenylphosphatsynthase vor der hinzugefügten Mutation (z. B. Salzstabilität oder Stabilität in einem weiten pH-Bereich) hat.
In den Ansprüchen und der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden Aminosäurereste durch den Einbuchstabencode oder dem Dreibuchstabencode, wie hiernach beschrieben, ausgedrückt:
A; Ala, Alanin
C; Cys; Cystein
D; Asp; Asparaginsäure
E; Glu; Glutaminsäure
F; Phe; Phenylalanin
G; Gly; Glycin
H; His; Histidin
I; Ile; Isoleucin
K; Lys; Lysin
L; Leu; Leucin
M; Met; Methionin
N; Asn; Asparagin
P; Pro; Prolin
Q; Gln; Glutamin
R; Arg; Arginin
D; Ser; Serin
T; Thr; Theronin
V; Val; Valin
W; Trp; Tryptophan
Y; Tyr; Tyrosin
Die Substitution der Aminosäure wird in der Reihenfolge "der Aminosäurerest vor Substitution" "Nummer des Aminosäurerestes" und "der Aminosäurerest nach Substitution" durch den Einbuchstabencode der Aminosäuren dargestellt. Zum Beispiel wird die Mutation, in welchem ein Tyrosinrest an Position 81 durch einen Methioninrest ersetzt wird als Y81M dargestellt. Außerdem wird die Einfügung von Aminosäureresten durch "die Nummer des Aminosäurerestes an der N-terminalen Seite des Insertionsortes vor der Insertion" und "dem Aminosäurerest, der eingefügt wurde" und "die Ziffer des Aminosäurerestes an der C-terminalen Seite des Insertionsortes vor der Insertion" angegeben. Zum Beispiel wird das Einfügen von Alanin zwischen der Aminosäure an Position 84 und der Aminosäure an Position 85 als 84A85 angegeben.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf spezifische Beispiele erläutert, aber sie sollten nicht so angesehen werden, dass sie die Erfindung auf irgendeine Weise beschränken.
Beispiel 1. Konstruktion eines Plasmids, das das Gen für die Geranylgeranyldiphosphatsynthase enthält
Das Gen für die Geranylgeranyldiphosphatsynthase (hiernach als SacGGPS bezeichnet) aus Sulfolobus acidocaldarius wurde an der HindIII-Stelle des Plasmidvektors pBluescript II (KS+), kommerziell erhältlich von Toyoboseki, subkloniert. Die Plasmid-DNS wurde als pBs-SacGGPS bezeichnet. Das SacGGPS-Gene ist erhältlich aus Escherichia coli DH5α (pGGPS1), das international am 31. Januar 1994 bei dem National Institute of Bioscience und Human Technology Agency of Industrial Science und Technology, Ibalaki, Japan 2 unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-498 hinterlegt wurde.
Außerdem wurde die gesamte Nucleotidsequenz des SacGGPS-Gens in der Japanischen ungeprüften Patent-Offenlegungsschrift Nr. 7-308193 von Shin-ichi Ohnuma et al. (1994), The Journal of Biological Chemistry Bd. 269: 14792–14797 oder in der genetischen Informationsdatenbank GenBank unter der Hinterlegungsnummer D28748 veröffentlicht. Da Sulfolobus acidocaldarius ebenfalls von verschiedenen Hinterlegungsstellen von Mikroorganismen, wie etwa der ATCC usw. (als ATCC Nr. 33909) erhältlich ist, kann die DNS des Genbereichs von SacGGPS durch das herkömmliche Genklonierungsverfahren erhalten werden.
Beispiel 2. Synthese der Oligonucleotide für das Einbringen der Mutation
Für das Einbringen der Mutation des Gens der Geranylgeranyldiphosphatsynthase, wurden die folgenden Oligonucleotide entworfen und synthetisiert:
Primer DNS (T78F, H81A):
5'-CATACTTTTTTCCTTGTGGCTGATGATATCATGGATC-3' (SEQ ID Nr.: 3)
Primer DNS (T78F, H81L):
5'-CATACTTTTTTCCTTGTGCTTGATGATATCATGGATC-3' (SEQ ID Nr.: 4)
Primer DNS (F77Y, T78F, H81L):
5'-CATACTTATTTCCTTGTGCTTGATGATATCATGGATC-3' (SEQ ID Nr.: 5)
Primer DNS (F77Y, T78F, H81A):
5'-CATACTTATTTCCTTGTGGCTGATGATATCATGGATC-3' (SEQ ID Nr.: 6)
Primer DNS (F77Y, T78S, V80I I84L, 84PS85)
5'-GTTCTTCATACTTATTCGCTTATTCATGATAGTATT-3' (SEQ ID Nr.: 7), und
5'-ATTCATGATGATCTTCCATCGATGGATCAAGAT-3' (SEQ ID Nr.: 8)
Das Einbringen der Mutation (F77Y, T78S, V80I, I84L, 84PS85) wurde unter Verwendung von zwei Nucleotiden durchgeführt. Zunächst wurde die Mutation wie in Beispiel 3 erwähnt, unter Verwendung des Oligonucleotids 5'-GTTCTTCATACTTATTCGCTTATTCATGATAGTATT-3' (SEQ ID Nr.: 7) eingebracht und eine Transformante wurde in Übereinstimmung mit Beispiel 4 erzeugt, und außerdem wurde eine Mutation in das auf diese Weise erhaltene Plasmid unter Verwendung des Oligonucleotids 5'-ATTCATGATGATCTTCCATCGATGGATCAAGAT-3' (SEQ ID Nr.: 8) eingebracht.
Diese Nucleotide haben eine Mutation in dem Codon, das wenigstens einen Aminosäurerest ausgewählt aus Phenylalanin an Position 77, Threonin an Position 78, Valin an Position 80, Histidin an Position 81 und Isoleucin an Position 84 in SacGGPS codiert. Zusätzlich zu dem Einbringen des Codons, das eine Aminosäure codiert, die zwischen Isoleucin an Position 84 und Methionin an Position 85 eingefügt ist, sind sie so entworfen, dass sie neuerlich die Spaltstelle des Restriktionsenzyms BspHI (5'TGATGA3'), die Spaltstelle des Restriktionsenzyms EcoRV (5'GATATC3') oder die Spaltstelle des Restriktionsenzyms ClaI (5'ATCGAT3') zuzufügen. Beim Einbringen der Spaltstelle von BspHI ändert sich die durch das SacGGPS-Gen codierte Aminosäuresequenz aufgrund der Degeneration der Codons nicht, oder es ist eine Stelle zum Einbringen einer Mutation. Dies wird verwendet, um das Substitutions-mutierte Plasmid mittels Agarosegelelektrophorese nach Verdauung mit einem geeigneten Restriktionsenzym nachzuweisen, da das Einbringen der Mutation durch Substitution in das SacGGPS-Gen gleichzeitig neue Spaltstellen von Restriktionsenzymen erzeugt.
Diese Primer-DNS wurden einer Phosphorylierungsbehandlung bei 37°C für 30 Minuten in dem im Folgenden gezeigten Reaktionsmedium gefolgt von einer Denaturierung bei 70°C für 10 Minuten unterzogen:

10 pmol/μl Primer-DNS 2 μl

10 × Kinasepuffer 1 μl

10 mM ATP 1 μl

H₂O 5 μl

T4-Polynucleotid-Kinase 1 μl

, wobei der 10 × Kinasepuffer 1000 mM Tris-Cl (pH 8,0), 100 mM MgCl₂ und 70 mM DTT ist.
Beispiel 3. Das Einbringen der Substitutionsmutation in das SacGGPSS-Gen
Unter Verwendung jeder der in Beispiel 2 konstruierten Primer-DNS wurde in Übereinstimmung mit dem Kunkel-Verfahren in das in Beispiel 1 hergestellte Plasmid eine Substitutions-Mutation eingeführt. Der Mutan-K Reagenziensatz, der kommerziell erhältlich von Takara Shuzo ist, wurde verwendet, um das Kunkel-Verfahren durchzuführen. Das experimentelle Vorgehen war wie in der Reagenziensatzbeilage beschrieben. Die Substitutions-Mutation des Plasmids muss nicht durch das Kunkel-Verfahren erfolgen. Zum Beispiel kann ein identisches Ergebnis durch ein Verfahren unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) erhalten werden.
Unter Verwendung von Escherichia coli CJ236 in dem Mutan-K Reagenziensatz als die Wirtzzelle wurde eine einzelsträngige DNS erhalten, in welchem eine Thyminbase in dem Plasmid pBS-SacGGPS durch eine Deoxyuracilbase ersetzt war.
Die auf diese Weise erhaltende einzelsträngige DNS wurde als die Matrize in der Reaktion verwendet, in welcher eine Primer-DNS für die Synthese eines komplementären Strangs in der folgenden Reaktionslösung bei 65°C für 15 Minuten behandelt und dann durch Stehen lassen bei 37°C für 15 Minuten angelagert wurde:

Einzelsträngige DNS 0,6 pmol

Anlagerungspufferlösung 1 μl

Primer-DNS-Lösung (Beispiel 2) 1 μl

H₂O um ein Endvolumen von 10 μl zu ergeben

, in welchem die Anlagerungspufferlösung 200 mM Tris-Cl (pH 8,0), 100 mM MgCl₂, 500 mM NaCl und 10 mM DTT ist.
Außerdem wurden 25 μl der Elongationspufferlösung, 60 Einheiten der DNS-Ligase von Escherichia coli und 1 Einheit der T4-DNS-Polymerase zugegeben, um die komplementären Stränge bei 25°C für 2 Stunden zu synthetisieren. Die Elongationspufferlösung ist 50 mM Tris-Cl (pH 8,0), 60 mM Ammoniumacetat, 5 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 1 mM NAD und 0,5 mM dNTP.
Nachdem die Reaktion vorbei ist, wurden 3 μl 0,2 M EDTA (pH 8,0) dazugegeben, und eine Behandlung bei 65°C für 5 Minuten durchgeführt, um die Reaktion zu beenden.
Beispiel 4. Konstruktion einer Rekombinante mit einem Gen, in welchem die Substitutions-Mutation in das SacGGPS-Gen eingebracht wurden
Die in Übereinstimmung mit Beispiel 3 hergestellte DNS-Lösung wurde verwendet, um Escherichia coli XL1-Blue durch das CaCl₂-Verfahren zu transformieren. Ein alternatives Verfahren, wie etwa Elektroporation, ergibt ein ähnliches Ergebnis. Eine andere Wirtzzelle als Escherichia coli XL1-Blue, z. B. JM109 oder Ähnliche, sie ergaben ebenfalls ein ähnliches Ergebnis.
Die durch das CaCl₂-Verfahren erhaltene Transformante wurde auf einer Agarplatte mit Ampicillin plattiert, einem selektierbaren Marker der Transformanten, und über Nach bei 37°C inkubiert.
Von den wie vorher erhaltenen Transformanten wurde das substitutionsmutierte pBs-SacGGPS-Plasmid, das eine Spaltstelle von BspHI, EcoRV oder ClaI hat, ausgewählt.

Die Nucleotidsequenz in der Nachbarschaft des Codons, das dem Aminosäurerest entspricht, der der Mutation des SacGGPS-Gens für das ausgewählte substitutionsmutierte pBs-SacGGPS-Plasmid entsprach, wurde durch das Dideoxyverfahren bestimmt. Im Ergebnis wurde das pBs-SacGGPS-Plasmid mit den folgenden fünf mutierten SacGGPS-Genen erhalten. Die Nucleotidsequenzen, die für die Aminosäuresequenzen von der Aminosäure an Position 77 bis zur Aminosäure an Position 85 codieren, werden im Folgenden gezeigt:

Mutation	Nucleotidsequenz
T77F,H81A:	5'-TTTTTCCTTGTGGCTGATGATATCATG-3'
(SEQ ID Nr.: 9)
T78F, H81L:	5'-TTTTTCCTTGTGCTTGATGATATCATG-3'
(SEQ ID Nr.: 10)
F77Y, T78F, H81L:	5'-TATTTCCTTGTGCTTGATGATATCATG-3'
(SEQ ID Nr.: 11)
F77Y, T78F, H81A:	5'-TATTTCCTTGTGGCTGATGATATCATG-3'
(SEQ ID Nr.: 12)
F77Y, T78S, V80I, I84L, 84PS85:	5'-TATTCGCTTATTCATGATGATCTTCCATCGATG-3'
(SEQ ID Nr.: 13)
Wild-Typ:	5'-TTTACGCTTGTGCATGATGATATTATG-3'
(SEQ ID Nr.: 14).

Beispiel 5. Messung der Aktivität der mutierten Prenyldiphosphatsynthase
Rohe Enzymlösungen wurden wie folgt aus den 6 Tranformanten erhalten Beispiel 4 mit 5 mutierten SacGGPS-Genen und einem Wildtyp SacGGPS-Gen hergestellt.
Die über Nacht in dem 2 × LB-Medium kultivierte Transformante wurde zentrifugiert, um die Zellen zu ernten und dann wurden die Zellen in einen Puffer für die Zellhomogenisierung (54 mM Calciumphosphatpufferlösung (pH 5,8), 10 mM β-Mercaptoethanol, 1 mM EDTA) suspendiert. Diese wurde durch Ultraschall homogenisiert und bei 4°C bei 10000 U/min für 10 Minuten zentrifugiert.
Der erhaltene Überstand wurde bei 55°C für 12 Stunden behandelt, um die Aktivität der aus Escherichia coli stammender Prenyldiphosphatsynthase zu inaktivieren.
Diese wurde weiter unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert und der erhaltene Überstand wurde als ein roher Enzymextrakt verwendet. Wenn die Thermostabilität untersucht wurde, wurde der Enzymextrakt bei 60°C, 70°C oder 80°C (60°C, 65°C, 67°C oder 70°C für die aus Bacillus stearothermophilus stammenden Enzyme) für eine Stunde vor der Reaktion inkubiert. Die Reaktion wurde bei 55°C für 15 Minuten in der folgenden Reaktionslösung durchgeführt:

[1-¹⁴C] Isopentenyldiphosphat (1 Ci/mol) 25 nmol

Allyldiphosphat (Geranyldiphosphat) 25 nmol

Kaliumphosphatpuffer (pH 5,8) 10 mM

MgCl₂ 5 mM

Enzymlösung 100 μg

H₂O auf 200 μl
Nachdem die Reaktion vorbei ist, wurden 200 μl gesättigte NaCl-Lösung zu der Reaktionslösung gegeben und 1 ml wassergesättigtes Butanol wurde zu dieser gegeben, welche dann geschüttelt, zentrifugiert und in zwei Phasen aufgetrennt wurde. Zu 800 μl der erhaltenden Butanolschicht wurden 3 ml eines Flüssigszintillators gegeben, und dann wurde die Radioaktivität durch den Flüssigkeits-Szintillationszähler gemessen. Das Ergebnis wird in der 2 gezeigt.
Die mutierte Prenyldiphosphatsynthase wies eine Thermostabilität auf, welche gleich zu der der nativen Geranylgeranyldiphosphatsynthase ist, und höher als die der aus Bacillus stearothermophilus stammenden Farnesyldiphosphatsynthase.
Das Lösungsmittel wird aus dem Rückstand der Butanolschicht durch Einströmen von Stickstoffgas darin verdampft, während die Schicht erwärmt wird, um auf ein Volumen von etwa 0,5 ml konzentriert zu werden. Zu dem Konzentrat wurden 2 ml Methanol und ein ml einer Lösung von saurer Phosphatase von der Kartoffel, (2 mg/ml saure Phosphortase von der Kartoffel, 0,5 M Natriumacetat (pH 4,7)) gegeben, um die Dephosphorylierungsreaktion bei 37°C durchzuführen. Nachfolgend wurde das Dephosphorylierte Reaktionsprodukt mit 3 ml n-Pentan extrahiert.
Dies wurde durch Verdampfen des Lösungsmittels durch Einströmen von Stickstoffgas darin verdampft, welches dann durch TLC (Umkehrphasen-TLC Platte: LKC18 (Whatman), Entwicklungslösung: Aceton/Wasser = 9/1) analysiert wurde. Das entwickelte dephosphorylierte Reaktionsprodukt wurde durch den Bio Image Analyzer BAS2000 (Fuji Photo Film) analysiert, um die Lokalisation der Radioaktivität zu bestimmen. Das Ergebnis, wenn Geranyldiphosphat als das allylische Substrat verwendet wurde, wird in der 3 gezeigt.
Es wurde gezeigt, dass das Reaktionsprodukt der mutierten Prenyldisphosphatsynthase ein Farnesylphosphat war.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Mutierte Geranylgeranyldiphosphatsynthase mit einer modifizierten Aminosäuresequenz, wobei die mutierte Diphosphatsynthase eine an Asparaginsäure reiche Domäne mit der Sequenz D₁D₂X₁(X₂X₃)X₄D₃ im konservierten Bereich II der mutierten Geranylgeranyldiphosphatsynthase umfasst, wobei jedes von D₁, D₂ und D₃ einen Asparaginsäurerest bezeichnet; X₁, X₂, X₃ und X₄ sind unabhängig eine Aminosäure, und X₂ und X₃ sind optional jeweils unabhängig in der an Asparaginsäure reichen Domäne vorhanden, die mutierte Geranylgeranyldiphosphatsynthase umfasst (1) wenigstens eine Aminosäuresubstitution ausgewählt aus (a) einer Aminosäuresubstitution lokalisiert in einem Bereich zwischen dem Aminosäurerest an der fünften Position in der N-terminalen Richtung vom D₁ der an Asparaginsäure reichen Domäne und des Aminosäurerests an der ersten Position in der N-terminalen Richtung vom D₁ der an Asparaginsäure reichen Domäne, und (b) dem Aminosäurerest an der zweiten Position in der N-terminalen Richtung vom D₃ der an Asparaginsäure reichen Domäne, und/oder (2) zusätzliche Aminosäure(n) sind in einem Bereich zwischen dem Aminosäurerest X₁ der an Asparaginsäure reichen Domäne und dem Aminosäurerest X₄ der an Asparaginsäure reichen Domäne eingefügt, wodurch die mutierte Geranylgeranyldiphosphatsynthase in der Lage ist, Farnesyldiphosphat mit einer kürzeren Kettenlänge als das durch die native Geranylgeranyldiphosphatsynthase synthetisierte Geranylgeranyldiphosphat zu synthetisieren.
Mutierte Geranylgeranyldiphosphatsynthase nach Anspruch 1, wobei das Reaktionsprodukt der mutierten Diphosphatsynthase Farnesyldiphosphat ist.
Mutierte Geranylgeranyldiphosphatsynthase nach Anspruch 1 oder 2, wobei die mutierte Diphosphatsynthase vom Homodimer-Typ ist.
Mutierte Geranylgeranyldiphosphatsynthase nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die mutierte Diphosphatsynthase aus Archaebakterien stammt.
Mutierte Geranylgeranyldiphosphatsynthase nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die mutierte Diphosphatsynthase aus Sulfolobus acidocaldarius stammt.
Mutierte Geranylgeranyldiphosphatsynthase nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die mutierte Diphosphatsynthase ein thermostabiles Enzym ist.
Mutierte Geranylgeranyldiphosphatsynthase nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei in der in SEQ ID Nr: 1 festgelegten Geranylgeranyldiphosphatsynthase wenigstens eine Aminosäure ausgewählt aus Phenylalanin an Position 77, Threonin an Position 78, Valin an Position 80, Histidin an Position 81 und Isoleucin an Position 84, durch eine andere Aminosäure ersetzt ist, oder eine oder mehrere Aminosäuren zwischen Isoleucin an Position 84 und Methionin an Position 85 eingefügt sind.
Mutierte Geranylgeranyldiphosphatsynthase nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei in der in SEQ ID Nr: 1 festgelegten Geranylgeranyldiphosphatsynthase wenigstens eine Aminosäure ausgewählt aus Phenylalanin an Position 77, Threonin an Position 78, Valin an Position 80, Histidin an Position 81 und Isoleucin an Position 84 durch eine andere Aminosäure ersetzt ist, und/oder zwei Aminosäuren zwischen Isoleucin an Position 84 und Methionin an Position 85 eingefügt sind, wobei das Phenylalanin an Position 77 durch Tyrosin ersetzt wurde, das Threonin an Position 78 durch Phenylalanin oder Serin ersetzt ist, das Valin an Position 80 durch Isoleucin ersetzt ist, das Histidin an Position 81 durch Leucin oder Alanin ersetzt ist oder das Isoleucin an Position 84 durch Leucin ersetzt ist; oder Prolin und Serin zwischen dem Isoleucin an Position 84 und dem Methionin an Position 85 eingefügt ist.
Mutierte Geranylgeranyldiphosphatsynthase nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die mutierte Diphosphatsynthase von einer nativen Geranylgeranyldiphosphatsynthase eines Organismus stammt, der aus der Gruppe bestehend aus Arabidopsis thaliana, Lupinas albus, Capsicum annuum, Sulfolobus acidocaldarius, Rhodobactor sphaeroides, Rhodobactor capsulatus, Erwinia herbicola, Myxococcus thaliana und Neurospora crassa ausgewählt ist.
DNS, die für eine mutierte Geranylgeranyldiphosphatsynthase nach einem der Ansprüche 1 bis 9 kodiert.
RNS, transkribiert von einer DNS nach Anspruch 10.
Rekombinanter Vektor mit einer DNS nach Anspruch 10.
Nicht menschlicher Wirtsorganismus transformiert mit einem rekombinanten Vektor nach Anspruch 12.
Verfahren für die Herstellung einer mutierten Geranylgeranyldiphosphatsynthase nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Verfahren die Schritte der Kultivierung eines Wirts nach Anspruch 13 und der Ernte des Expressionsprodukts aus der Kultur umfasst.
Verfahren für die Herstellung einer Prenyldiphosphatsynthase mit nicht mehr als 15 Kohlenstoffen mit dem Schritt des in Kontakt bringen einer mutierten Geranylgeranyldiphosphatsynthase nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder einer durch das Verfahren nach Anspruch 14 hergestellten, mutierten Geranylgeranyldiphosphatsynthase mit einem Substrat, das aus der Gruppe bestehend aus Isopentenyldiphosphat, Dimethylallyldiphosphat und Geranyldiphosphat ausgewählt wird.