TW472084B - Farnesyl diphosphate synthase - Google Patents

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472084 經濟部中央標準局舅工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（1 ) 1 .發明之範圍 本發明係關於一種新的合成線性二磷酸異戊烯酯之突 變酵素’線性二磷酸異戊烯酯是生物體內重要化合物的先 驅物，該化合物如：類固醇、輔酶Q、扁豆醇、類胡蘿蔔 素、異戊烯化的蛋白質、動物的荷爾蒙、植物的荷爾蒙等 :一種編碼該酵素的基因系統；以及一種製備該酵素的方 法。 2 .相關之技藝 在生物體中許多具備重要功能的物質，可以用異戊間 一燦（2 —甲基一1 ’ 3 - 丁二烯）作爲組成單元而合成 。這些化合物亦稱爲類異戊間二烯、類萜烯、或萜烯，而 依其碳原子數分類成半結烯（C 5 )、單結嫌（C 1 〇 ) 、倍半萜烯（C 1 5 )、二萜烯（C 2 0 )、二倍半萜烯 (C25)、三萜烯（C30)、四萜烯（C40)等。 實際之生合成是經甲羥戊酸鹽路徑合成甲羥戊酸一 5 一二 磷酸’然後合成異戊烯基二磷酸（I p p，一種活化的異 戊間二烯單元）。 作爲先驅物之異戊間二烯單元是異戊烯基二磷酸，故 稱爲活化的異戊間二烯單元。二磷酸二甲基烯丙酯（ DMAP P，一種異戊烯基二磷酸的異構物，爲合成植物 荷爾蒙細胞分裂素異戊烯基腺嘌呤之底物）亦和異戊烯基 二磷酸進行縮合反應合成鏈狀之活化的類異戊間二烯，例 如：二磷酸樾牛兒酯（GPP)、二磷酸橙花酯、二磷酸 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐ΐ — 4 _ — ----------私衣-------玎------線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 472084 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（2 ) 法呢酯（FPP)、二磷酸樾牛兒酯樾牛兒酯（GGPP )、二磷酸樾牛兒酯法呢酯（GFPP)、二磷酸六異戊 烯酯（He xPP)、二磷酸七異戊烯酯（He pPP) ο 縮合反應有Ζ型和Ε型二種。二磷酸锯牛兒酯由ε型 縮合反應產生，而二磷酸橙花酯由Ζ型縮合反應產生<•所 有的Ε型反應產生具活性形式之二磷酸法呢酯及二磷酸樾 牛兒酯牴牛兒酯’而Ζ型縮合反應合成天然橡膠、扁豆醇 、細菌萜醇（+—萜醇）、及植物的各種聚萜醇。該化合 物使用焦磷酸酯之磷酯鍵能及分子之碳骨幹進行縮合反應 ’並且產生焦磷酸酯之反應副產品。 以二磷酸法呢酯或二磷酸椐牛兒酯拋牛兒酯作爲反應 底物合成的物質包括：細胞信號傳導機制上重要之G蛋白 質的異戊烯化蛋白質（來自二磷酸法呢酯或二磷酸樾牛兒 酯椐牛兒酯）；古生菌之細胞膜脂質（來自二磷酸樾牛兒 酯樾牛兒酯）；類固醇先驅物的鯊烯（來自二磷酸法呢酯 );及類胡蘿蔔素先驅物的八氫番茄紅素（來自二磷酸樾 牛兒酯樾牛酯）。來自二磷酸六異戊烯酯及二磷酸七異戊 烯酯之二磷酸異戊烯酯各自具有六及七個異戊間二烯單元 ’及具有十個異戊間二烯單元之二磷酸異戊烯酯是作爲合 成電子傳遞系統中輔酶Q及甲基某醌（維生素Κ 2 )的先 驅物。 此外，許多經由活性形式之類異戊間二烯生合成的化 合物是維持生命所必需的。其中包括：植物荷爾蒙細胞分 本紙張尺度適用中國國家標本（CNS ) Α4規格（210X297公釐）- --------- \ 裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、?τ -丨線 472084 A7 __B7 五、發明説明（3 ) 裂素及用半萜烯作爲先驅物合成之異戊烯基腺嘌呤核苷-修飾的t RNA、以樾牛兒醇及其單萜烯橙花醇異構物爲 主之玫瑰油香水以及萃取自樟腦樹的殺蟲劑樟腦。倍半荷 爾蒙包括昆蟲的保幼荷爾蒙，二萜烯包括植物的荷爾蒙赤 黴素、昆蟲的追蹤費洛蒙、功能上作爲視覺色素先驅物的 視黃醇和視黃醛、高度嗜鹽的古生菌其紫色細胞膜之蛋白 質的組成部分、及維生素A。 此外使用鯊烯（三萜烯）可以合成各種的類固醇化合 物，包括：動物的性荷爾蒙、維生素D、銳皮激素（一種 昆蟲的銳皮荷爾蒙）、植物的荷爾蒙伯斯來（brassinol-ide)、細胞膜組成物等。來自活化的類異戊間二烯之各 類類胡蘿蔔素（四萜烯）亦是生物體重要的色素化合物及 維生素A的先驅物。化合物例如：葉綠素、脫鎂葉綠素、 生育酚（維生素E)、及葉醌（維生素K1)亦來自四萜 嫌。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 活化的類異戊間二烯合成酶能縮合異戊烯基二磷酸和 烯丙基的底物，例如：二磷酸二甲基烯丙酯、二磷酸樾牛 兒酯、二磷酸法呢酯、二磷酸椹牛兒基樾牛兒酯、二磷酸 樾牛兒基法呢酯等稱作二磷酸異戊烯酯合成酶，亦可基於 具有最大鏈長的主要反應生成物之化合物而命名，例如： 二磷酸法呢酯合成酶（FPP合成酶）、二磷酸樾牛兒基 拋牛兒酯（GGPP合成酶）等。己發表的有關該類酵素 之純化、活性測量、基因選殖、及酵素D N A編碼序列包 括來自細菌、古生菌、真菌，、植物、及動物之二磷酸法呢 ( CNS ) A4^ ( 210X297^ ) " 6 _ 1 ' 472084 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 A7 B7 五、發明説明（4 ) 酯合成酶、二磷酸樾牛兒基樾牛兒酯合成酶、二磷酸六異 戊烯酯合成酶、二磷酸七異戊烯酯合成酶、二磷酸八異戊 烯酯合成酶、二磷酸九異戊烯酯合成酶、二磷酸十一異戊 烯酯合成酶等。 這些活化的類異戊間二烯合成酶是各式化合物化學合 成的基本酵素，在工業上及生命科學的學術研究上非常重 要。但是因爲酵素不穩定及低比活性的緣故，所以實際上 很少應用於工業上》然而自嗜熱的細菌及古生菌分離耐熱 性的二磷酸異戊烯酯合成酶及這些酵素的編碼基因可以增 進酵素的利用性。 關於二磷酸法呢酯合成酶，其基因已自一種中等程度 的嗜熱性（菌嗜熱脂肪芽孢桿菌）分離而此自中等程度的 耐熱性酵素亦曾經大腸桿菌宿主細胞製備，參閱[T. Koyama et al. ( 1 9 93 ) J. Biochem. , 1 1 3: 355-363 ；

Japanese Unexamined Patent Publication No. 5(1993) -219961]。關於二磷酸樾牛兒酯樾牛兒酯合成酶，其基因 已自高度的嗜熱性的菌株（例如：酸熱硫化葉菌及嗜熱棲 熱囷）中分離’參閱[S· -i. Ohnuma et al·， （1994) J. Biol . Chem., 269： 14792-14797 > Japanese Unexa-mined Patent Publication No. 7(1995)-308193 ;及 Japanese Unexamined Patent Publication No.7(1995)-294956]而此高度耐熱性的酵素亦曾被製備過。 此外關於具有二磷酸法呢酯合成酶及二磷酸樾牛兒基 椹牛兒酯合成酶雙重功能的二磷酸異戊烯酯合成酶，此酵 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）—7 - I-----------批衣------、玎------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 472084 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（5 ) 素的編碼基因己自高度嗜熱性的熱自養甲烷桿菌[A. Chen and D. Poulter (1993) J. Biol. Chem., 268： 11002- 11007； A. Chen and D. Poulter (1994) ARCHIVES OF BIOCHEMSTRY AND BIOPHYTSICS 314]分離，而此耐熱性的 酵素亦經展示。 但是用薄層色層分析作鏈長分析，測定熱自養甲烷桿 菌之該酵素合成二磷酸法呢酯/二磷酸樾牛兒酯据牛兒酯 的活性時，是用二磷酸樾牛兒酯作烯丙基的底物測定反應 的生成物。因爲二磷酸樾牛兒酯亦可作爲二磷酸樾牛兒基 拋牛兒酯合成酶的底物，所以測得的活性不可能僅單獨包 括二磷酸法呢酯合成酶的活性。 此外古生菌的二磷酸法呢酯合成酶亦未經証實其具備 較高的耐熱性、較高的鹽穩定性及酸穩定性. 如前文所提’使用來自嗜熱脂肪芽孢桿菌的二磷酸法 呢酯合成酶能解決酵素不穩定及難操作等部分的問題。但 是若酵素具備較高的耐熱性則會更穩定及更經得起工業上 之應用。 此外，某些二磷酸異戊烯酯合成酶能使用較長鏈長的 二磷酸法呢酯作爲底物。當此長鏈之二磷酸異戊烯酯合成 酶和二磷酸法呢酯合成酶共同作用以提供前酵素底物時， 後酵素的穩定性必須相等或高於長鏈二磷酸異戊嫌酯合成 酶。當考慮工業生成產二磷酸法呢酯時，酵素必須固定或 再循環回收。當再生時’酵素本身要更穩走，必須有較高 的耐熱性、較高的耐鹽性及在更廣的P Η範圍間有較高的 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（2數297公釐）—8 — 、^"^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 472084 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（2丨〇X297公釐） A7 __ B7 五、發明説明（6 ) 穩定性。 根據二磷酸異戊烯酯合成酶的胺基酸序列，發現兩個 富含天門冬胺酸的結構區。位於富含天門冬胺酸的結構區 之保留序列I ( D D X X ( X X ) D )(其中X代表任何胺 基酸，而括弧內之兩個X可以不存在），從N -端算起第 五個胺基酸殘基負責控制反應生成物的鏈長。因此發明出 一種方法控制反應生成物的鍵長 nt application No. 8-191635 filed on July 3, 1996 under the title of "A Mutant Prenyl Diphosphate Synthase"]。用此方法生產的酵素生產的反應生成物有許 多種鍵長。但是此方法不曾、亦不知誘導二磷酸樾牛兒基 樾牛兒酯合成酶突變能控制反應生成物的鏈長因而產生二 磷酸法呢酯。 發明之摘要： 本發明的目的是建立一種修飾二磷酸異戊烯酯合成酶 之胺基酸序列後產生二磷酸法呢酯合成酶的方法。此新酵 素較穩定或具高的比活性，更適於工業應用。此方法可能 直接獲得突變之二磷酸異戊烯酯合成酶或其基因生產二磷 酸法呢酯並且保持二磷酸異戊烯酯合成酶突變前的性質。 根據分析二磷酸異戊烯酯合成酶之胺基酸序列資料的 結果，從突變之酸熱硫化葉菌（S. acidocaldarius)的 二磷酸樾牛兒基樾牛兒酯合成酶之核酸序列資料中能找出 兩個富含天門冬胺酸的結構區。而富含天門冬胺酸的結構 --- ----------¾衣------，玎------^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 472084 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（7) 區之保留序列I (DDXX(XX)D)之N —端第五個 胺基酸殘基和控制反應生成物的鏈長有關。 因此，本發明提供一種突變的二磷酸異戊烯酯合成酶 ，該酵素具備修飾的胺基酸序列，其中 至少一個胺基酸殘基選自（a)區域I I富含天門冬 胺酸之結構區DDXX (XX) D (其中X代表任何胺基 酸，而括弧內之兩個X可以不存在），位於N—端D&N 一端方向算起第五個胺基酸和N -端D從N -端方向算起 第一個胺基酸間之胺基酸殘基，及（b )位於該富含天門 冬胺酸之結構區C 一端之D的N —端方向上被其他胺基酸 取代的胺基酸殘基，及/或 該富含天門冬胺酸之結構區介於C一端之D的N—端 方向第一個位置和C 一端之D之間被崁入額外的胺基酸。 本發明提供一種產生二磷酸法呢酯之突變二磷酸異戊 烯酯合成酶，該突變酵素仍然保存其原本之二磷酸異戊烯 酯合成酶活性。 本發明亦提供上述酵素一種DNA或RNA的編碼。 本發明更提供一種重組載體，更具體的說是一種包含 上述DNA之表達載體。 本發明更提供一種經上述載體轉形之宿主。 本發明更提供一種製程生產不超過十五個碳的二磷酸 異戊烯酯，其步驟包含將上述酵素和包括選自異戊烯基二 磷酸、二磷酸二甲基烯丙酯、及二磷酸樾牛兒酯在內之底 物反應。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐厂10 一 ---------, i 裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、\=口 .丨線 472084 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A7 B7 五、發明説明（8 ) 本發明更提供一種製程生產突變酵素，根據申請專利 範圍1至8項，該方法包括培養上述宿主及自培養液收穫 表達生成物的步驟。 圖形簡短的解釋 圖1顯示各種二磷酸異戊烯酯合成酶之區域（〇至（V) 及富含天門冬胺酸的結構區I。圖中的序列代表二磷酸槌 牛兒基樾牛兒酯合成酶的胺基酸序列，而ATGERPYRS代表 阿拉伯菌（Arabidopsis thaliana)、LA15778.P代表羽扇 豆（Lupinas albus)、CAGERDIS代表土耳其辣椒（Capsicum annuum)、 ATGGPSRP代表阿拉伯菌（Arabidopsis thalia-na)、GGPS-pep代表酸熱硫化葉菌、SPCRT. pep代表紅色桿 菌（Rhodobactor sphaeroides)、RCPESYNG 代表紅色桿菌 (Rhodobactor capsulatus)、EHCRTS.pe代表草生歐文氏 菌、MXCRTNODA代表黏球菌、而NCAL3.pep代表粗糙脈孢菌 。左邊的數目是指各二磷酸樾牛兒基犓牛兒酯合成酶從N -端胺基酸起算之胺基酸序列數目。 圖2顯示耐熱性的突變二磷酸異戊烯酯合成酶。縱軸 代表6 0 °C處理後之相對活性。橫軸代表處理的溫度》 S a c G G P S是指突變前之二磷酸樾牛兒基椹牛兒酯合 成酶。其他則各自代表不同的突變型酵素。B s t F P S 是嗜熱脂肪芽孢桿菌的二磷酸法呢酯合成酶。 圖3顯式以循牛兒基二磷酸作爲儲丙基的底物，突變 之二磷酸異戊烯酯合成酶的去磷酸化反應生成物之薄層色 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210χ297公釐）_ 11 -' " — I--------, ▲------、1T------^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 472084 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A7 B7 五、發明説明（9 ) 層分析的展開圖。圖中，〇 r i .代表展開的原點，而s .f .代表展開溶劑的頂點。 GOH是牛兒醇、FOH是法呢醇、GGOH是樾 牛兒基樾牛兒醇、而G F 0H是樾牛兒基法呢醇，上述化 合物各是樾牛兒基二磷酸、法呢基磷酸、樾牛兒基樾牛兒 基二磷酸、及犓牛兒基法呢基二磷酸經去磷酸反應的產物 。S a c GGP S是突變前的二磷酸德牛兒基槌牛兒酯合 成酶。其他則代表各突變酵素。 詳細描述 二磷酸異戊烯酯合成酶（其異雙體的一個次單元）的胺 基酸序列有五個保留區，參閱[A. Chem et al.，protein Science Vol. 3，pp. 600-607，1 994 ]。五個保留區之第 二區中有一個富含天門冬胺酸的結構區其保留序列I爲[ DDXX (XX) D](其中X代表任何胺基酸，而括弧 內之兩個X可以不存在）。雖然在第五個保留區也有一個 富含天門冬胺酸的結構區其保留序列爲、DDXXD〃 ， 但本發明修飾之富含天門冬胺酸的結構區的胺基酸序列位 於第二個保留區’此結構區稱爲富含天門冬胺酸的結構區 I而位於第五個保留區之富含天門冬胺酸的結構區則稱爲 富含天門冬胺酸的結構區I I 。 二磷酸異戊嫌酯合成酶中具有上述之富含天門冬胺酸 的結構區者包括：二磷酸法呢酯合成酶、二磷酸樾牛兒基 樾牛兒酯合成酶、二磷酸六異戊烯酯合成酶、二磷酸七異 '^紙張尺度ΐΐ用中國國家標準（CNS ) A4規i~^210X297公酱）-12 - ---------1[^------、玎------^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 472084 經濟部中央標準局員工消費合作社印掣 A7 B7 五、發明説明（10) 戊烯酯合成酶、二磷酸八異戊烯酯合成酶、二磷酸九異戊 烯酯合成酶、二磷酸十一異戊烯酯合成酶等。更明確的實 施例包括：嗜熱脂肪芽孢桿菌的二磷酸法呢酯合成酶、大 腸桿菌的二磷酸法呢酯合成酶、釀酒酵母的二磷酸法呢酯 合成酶、大白鼠的二磷酸法呢酯合成酶、人類的二磷酸法 呢酯合成酶、粗糙脈孢菌的二磷酸楣牛兒基樾牛兒酯合成 酶、釀酒酵母的二磷酸六異戊烯酯合成酶等。 上述某些實施例之二磷酸樾牛兒基樾牛兒酯合成酶其 保留區I至v及保留區IΓ內之富含天門冬胺酸的結構區 I (用箱線框起）的胺基酸序列示於圖1 。 本發明可用於任何具有富含天門冬胺酸的結構區I之 二磷酸異戊烯酯合成酶。 根據本發明，二磷酸異戊烯酯合成酶的胺基酸序列， 至少一個胺基酸殘基選自（a )區域I I富含天門冬胺酸 之結構區DDXX (XX) D (其中X代表任何胺基酸， 而括弧內之兩個X可以不存在），位於N—端D從N—端 方向算起第五個胺基酸和N -端D從N -端方向算起第一 個胺基酸間之胺基酸殘基，及（b )位於該富含天門冬胺 酸之結構區C 一端之D的N —端方向上被其他胺基酸取代 的胺基酸殘基，及/或 該富含天門冬胺酸之結構區介於C 一端之D的N —端 方向第一個位置和C 一端之D之間被崁入額外的胺基酸。 相對於天然的二磷酸異戊烯酯合成酶，本發明之突變 的二磷酸異戊烯酯合成酶可以合成鏈長較二磷酸異戊烯酯 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐厂1：i — ---------------ΐτ------i (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 472084 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（11) 短的二磷酸法呢酯。 根據本發明之實施例是以高度嗜熱的古生菌（酸熱硫 化葉菌）之二磷酸樾牛兒基樾牛兒酯合成酶的基因作爲起 始物質。酸熱硫化葉菌來自ATCC，其編號爲ATCC No. 33909。基因選殖的方法詳細描述於180&11636 11116乂&111-ined Patent Publication No. 7-308193。基因序列亦捍 揭本於基因庫（例如：GenBank，其編號爲No. D28748) 。用此序列能用己知的傳統方法選殖基因。其他選殖方法 的實施例示於實施例1 ，其核酸序列是序列號碼：2。 更明確的說，本發明之突變的二磷酸異戊烯酯合成酶 ，是將具有胺基酸序列號碼：1之二磷酸楣牛兒基拋牛兒 酯合成酶，其胺基酸序列中至少一個胺基酸選自位置7 7 的苯丙胺酸、位置7 8的羥丁氨酸、位置8 0的纈草胺酸 、位置8 1的組織胺酸、及位置8 4的異白胺酸用其他的 胺基酸取代，及/或在位置8 4的異白胺酸及位置8 5的 甲硫胺酸間崁入胺基酸。 於實施例提供之胺基酸序列中，被取代的胺基酸顯示 如下： 突變酵素1 :位置7 8的羥丁氨酸改變成苯丙胺酸而 位置8 1的組織胺酸改變成丙胺酸； 突變酵素2:位置78的羥丁氨酸改變成苯丙胺酸而 位置8 1的組織胺酸改變成白胺酸； 突變酵素3:位置77的苯丙胺酸改變成酪胺酸、位 置7 8的羥丁氨酸改變成苯丙胺酸、而位置8 1的組織胺 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐厂14 Z ' ---------:-¾衣------1T------^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 472084 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（l2) 酸改變成白胺酸； 突變酵素4 :位置7 7的苯丙胺酸改變成酪胺酸、位 置7 8的羥丁氨酸改變成苯丙胺酸、而位置8 1的組織胺 酸改變成丙胺酸； 突變酵素5 :位置7 7的苯丙胺酸改變成酪胺酸、位 置7 8的羥丁氨酸改變絲胺酸、位置8 0的纈草胺酸改變 成異白胺酸、位置8 4的異白胺酸改變成白胺酸、而位置 8 4的異白胺酸和位置8 5的甲硫胺酸之間崁入脯胺酸及 絲胺酸。 根據本發明突變之二磷酸異戊烯酯合成酶亦具有天然 之二磷酸異戊烯酯合成酶的性質。上述之五個突變酵素其 抗熱性幾乎和天然的二磷酸犓牛兒基樾牛兒酯合成酶一樣 〇 有時酵素之原始序列經崁入、移除、及/或取代一個 或數個胺基酸的修飾後仍具有原始的酵素活性。而本發明 之這些酵素（如序列號碼：1 )經崁入、移除、及/或取 代一個或數個（多至五個或十個）胺基酸的修飾後仍具有 原始的酵素活性。 本發明亦提供上述各種突變酵素的基因編碼，含此基 因之載體、特別地表達載體、及轉形該載體的宿主。本發 明的基因（D N A )可以輕易得到，例如：將原始的胺基 酸序列（序列號碼：1 )的DNA編碼用傳統的方法（例 如：定點突型，PCR等）突變。 此外一旦決定酵素的胺基酸序列後，接著能定出適當 ^^尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐厂155 一 ----------裝------、玎------^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 472084 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（l3) 的核酸編碼序列、而此DNA能根據傳統的DNA合成法 用化學合成。 本發明更提供—種含DNA的表達載體，例如：上述 之表達載體、轉形該表達載體的宿主、及用此宿主生產本 發明酵素或胜肽的方法。 表達載體內含複製起點、表達調控序列等，但依使用 之宿主而各不相同。至於宿主則包括：原核生物，例如： 細菌（例如：大腸桿菌）、枯草桿菌屬的生物體（例如： 枯草芽孢桿菌）；真核的微生物，例如：真菌（例如：酵 母菌、酵母屬之釀酒酵母及畢赤酵母屬的巴斯德畢赤酵母 )、絲狀的真菌（例如：曲霉屬、黑曲霉）：動物的細胞 ，例如：培養的蠶細胞、及培養的高等動物的細胞（例如 :CHO細胞等）。此外植物的細胞亦可作爲宿主。 於實施例中，根據本發明培養DNA轉形之宿主，二 磷酸法呢酯能堆積在培養液中，經收穫後可生產二磷酸法 呢酯。此外根據本發明，用本發明方法生產之突變的二磷 酸異戊烯酯合成酶和底物異戊烯基二磷酸及各烯丙基底物 例如：二磷酸二甲基烯丙酯及二磷酸樾牛兒酯反應後可產 生二磷酸法呢酯。 當以大腸桿菌作爲宿主，其調控步驟位於DN A轉錄 成mRNA及mRNA轉譯成蛋白質之階段。本發明用以 調控mRNA合成的啓動子序列包括：天然序列（例如： lac、t r p ' b 1 a ' 1 p p ' P L ' P R ' ter、 T3、T7等）、突變序列（例如：lac U V 5 )、 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210^97公釐厂^二 ~ I---------裝------,玎------^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 472084 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（Η) 及人工融合之序列（例如：t a c、t r c等）。 核醣體結合位置（GGAGG及類似之序列）及起始 密碼A U G間之序列距離是控制mRNA合成蛋白質的重 要序列。而在3 / -端直接終止轉錄的終止子（例如： Pharmacia生產之含r r n ρ τ 1 Τ2之載體）是控制重 組蛋白質的合成效率。 製備本發明之重組載體的商用載體包括：複製起點衍 生自pMB 1之載體（例如：pBR322、 P B R 3 2 7、PKK223-3、pKK233 — 3、 pTrc99等）：增強質體複製數目之質體（例如： pUC18、pEC19、pUC118、pUC119 、pTVl 18N、 pTV119N、 pBluescript ' pHSG298、pHSG396等）：及複製起點衍生 自p 1 5A之載體（例如：pACYC177、 PACYC184 等）：及衍生自 pSClOl、 C ο 1 E 1 、R 1、 Ffactor之質體等。 此外，可使用融合蛋白質-表達載體（例如： PGEX-2T、pGEX-3X、pMa l-c2)簡 化純化過程。本發明使用之其中一個基因起始物質的實施 例揭示於Japanese Unexamined Patent Publication No. 7-30 8 1 9 3 0 除了質體之外，病毒載體（例如：噬菌體或Ml 3噬菌 體）、或轉因子亦可用於基因轉形。除了將基因轉形入大 腸桿菌之外’亦可將plIBllO (購自Sigma)或pHY3 0 0 PLK ( 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐厂I?" ----------批衣------ir------^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 472084 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（is) 購自Takara Shuzo)轉形入桿菌屬的微生物。這些載體插 述於"Molecular Cloning" (J. Sambrook，E.F. Fritsch ，and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press)&"CloningVector"(P.H.Pouwels,B.B·

Enger, Valk， and W.J. Brammar, Elsevier)，及商品目 錄β 利用已知的方法使用適當的限制性內切酶及聯接酶， 能將二磷酸異戊烯酯合成酶的D Ν Α編碼片段裝入能調控 該酵素表達的載體；該構建質體實際的實施例包括，例如 :pBs-SacGGPS» 將這些重組載體轉形入能直接使用這些重組載體的微 生物大腸桿菌及桿菌屬的微生物。此轉形能用一般的方法 進行，例如：〇3(3 12法及原生質體法，參閱 "Molecular Cloning" (j. Sambrook , E.F. Fritsch, and T.Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press)及"DNA Cloning" Vol. I至 III (D .M. Clover ed_, IRL PRESS)。 爲了生產本發明之突變酵素，將宿主轉形後培養，然 後從該培養液中可用任何方法包括：鹽析、有機溶劑沈澱 、膠體色層分析、親和力色層分析、疏水性色層分析、離 子交換色層分析等方法回收純化該酵素。 本發明亦提供一種使用本發明之酵素生產二磷酸法呢 酯的方法。根據此方法，將本發明之酵素和底物在溶液（ 尤其是水溶液）中反應，然後在反應溶液中回收二隣酸異 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐厂 ----------、裳— c請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁〕 -訂· .丨線 472084 A7 B7 五、發明説明（16) 戊烯酯。上述的酵素可以使用純化的酵素及半純化之各步 驟的粗酵素，或微生物培養液之混合物。此外亦可使用根 據一般方法固定後之純化的酵素、粗酵素，或含該酵素的 生成物。 至於底物，可使用二甲基烯丙基二磷酸或二磷酸樾牛 兒酯及異戊烯基二磷酸。至於反應溶液，可使用水或緩衝 溶液，例如：三羥甲基氨基甲烷緩衝溶液或磷酸緩衝溶液 等。 本發明所生產的突變之二磷酸異戊烯酯合成酶，是衍 生自古生菌的突變二磷酸異戊烯酯合成酶，該酵素更穩定 因此更易操作生產法呢基二磷酸。此外亦如預期，此生產 法呢基二磷酸之突變二磷酸異戊烯酯合成酶具備突變前之 二磷酸異戊烯酯合成酶之特性（例如：耐鹽性或在大P Η 範圍間的穩定性）。 在本發明申請專利範圍及詳細說明中、胺基酸殘基是 用下列的一字碼或三字碼代表： 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A ; A 1 a ;丙胺酸 C;Cys;半胱胺酸 D ; A s p ;天門冬胺酸 E ; G 1 u ;麩胺酸 F ; P h e ;苯丙胺酸 G ; G 1 y ;甘胺酸 Η ; H i s ;.組織胺酸 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210;^公釐厂U - 472084 A7 B7 五、發明説明（π) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 I I 1 e * 異 白 胺 酸 Κ L y S t 離 胺 酸 L L e U t 白 胺 酸 Μ Μ e t } 甲 硫 胺 酸 Ν A s η j 天 門 冬 醯 胺 酸 Ρ Ρ r 0 > 脯 胺 酸 Q G 1 η > 麩 胺 醯 胺 酸 R A r g $ 精 胺 酸 S S e r 1 絲 胺 酸 T T h r > 羥 丁 氨 酸 V V a 1 y 纈 草 胺 酸 w T r P t 色 胺 酸 Y » T y r t 酪 胺 酸 取 代 之 胺 基 酸 用 -* 字 碼 基 酸 殘 基 、 胺 基 酸 殘 基 之 胺 基 酸 殘 基 ff 0 例如 第 代 成 甲 硫 胺 酸 殘 基 則 表 示 成 基 則 表 示 成 'Ν 崁 入 刖 崁 入 點 A 崁 入 的 胺 基 酸 殘 基 及 W 基 的 號 碼 » 例 如 在 第 8 基 酸 間 崁 入 丙 胺 酸 則 表 示 成 表示，其順序是'*'取代前之胺 所在位置的號碼"及"取代後 8 1個位置的酪胺酸殘基被取 Y81M。此外崁入胺基酸殘 N-端胺基酸殘基的號碼"、 崁入前崁入點C 一端胺基酸殘 4個位置及第8 5個位置的胺 8 4 A 8 5 。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 實施例 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 472084 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（is) 本發明舉出下列之具體實施例作爲參考，而非限制本 發明之範圍。 實施例1 構建內含二磷酸樾牛兒基樾牛兒酯合成酶基因之質體 二磷酸樾牛兒基樾牛兒酯合成酶（以下簡稱SacGGPS) 之基因來自酸熱硫化葉菌，經Hind III位置次選殖入購自 Toyoboseki 的質體載體 pBluescript II (KS+)。此質體 DNA命名爲pBs- SacGGPS。來自大腸桿菌DH5a (pGGPSl)之 SacGGPS 之基因於 January 3 1, 1 9 94 儲存於日本 Ibalaki 之National Institute of Bioscience and Human Technology Agency of Industrial Science and Technology，其編號是 FERM BP-4982。 整個SacGGPS基因的核酸序列發表於Japanese Unexamined Patent Publication No. 7-308193 ， Shinichi Ohnuma et a 1. ( 1 9 9 4) The Journal of Biological Chemistry Vol. 269:1 4792- 1 4797，或基因 資訊資料庫例如：GenBank其編號是D28748。因爲酸熱硫 化葉菌亦可得自各微生物保存庫’例如：ATCC等（如： ATCC No . 33909)，所以SacGGPS的DNA基因區域亦可用傳 統的選殖方法得到。 實施例2 合成寡核苷酸引入突變 本紙張尺度適用中國國家梯準（CNS ) A4規格（210X297公釐Γ 21 ' ---------- Ί------、訂------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央操隼局員工消費合作社印製 472084 A7 __ B7 五、發明説明（19) 爲了將德牛兒基樾牛兒基二磷酸合成酶的基因引入突 變，所以設計和合成以下之寡核苷酸： 引子 DNA (T78F，H81A): 5’ -CATACTTTTTTCCTTGTGGCTGATGATATCATGGATC-3’ （序列 號碼：3 ) 引子 DNA (T78F，H81L): 5’ -CATACTTTTTTCCTTGTGCTTGATGATATCATGGATC-3’ （序列 號碼：4) 引子 DNA (F77Y, T78F, H81L): 5,-CATACTTATTTCCTTGTGCTTGATGATATCATGGATC-3,(序列 號碼：5) 引子 MA (F77Y, T78F, H81A): 5’ -CATACTTATTTCCTTGTGGCTGATGATATCATGGATC-3’ （序列 號碼：6) 引子 DNA (F77Y, T78S, V80I, I84L， 84PS85): 5’ -GTTCTTCATACTTATTCGCTTATTCATGATAGTATT-31 (序列號 碼：7 )、 及 5’-ATTCATGATGATCTTCCATCGATGGATCAAGAT- 3’ （序列號 碼：8 )。 本紙張尺度'適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇f297公釐厂22 _ ' ^^1, I -- I 1-1- I - -I k. !--- ——111 I —^ϋ .^ϋ m ^^1 n^i In , (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 472084 A7 B7五、發明説明（2〇) 引入突變（F77Ys T78S, V80I，I84L，84PS85)是使用 兩種寡核替酸。首先，依實施例3使用寡核苷酸 5’ -GTTCTTCATACTTATTCGCTTATTCATGATAGTATT-3，（序列號 碼：7)引入突變及根據實施例4製備轉形細胞，然後質體 用寡核苷酸 5’ -ATTCATGATGATCTTCCATCGATGGATCAAGAT--3’ （序列號碼 :8)再次引入突變而得之。 這些核苷酸至少在一個胺基酸殘基上有突變的密碼編 碼，分別是位於Sa cGGPS上位置77的苯丙胺酸， 位置7 8的羥丁氨酸，位置8 0的纈草胺酸，位置8 1的 組織胺酸，及位置8 4的異白胺酸。此外除了崁入位置 8 4的異白胺酸和位置8 5的甲硫胺酸間的密碼編碼之外 ，並設計引入新的限制性內切酶切點B s ρ Η I ( 5"TGATGA3") 、EcoRV( 經濟部中央操準局員工消費合作社印製 5 5 a

3 C T A τ A G

3 T A G c T A Η ( Ρ I S a B 1 入 C 弓 或。 時 點 切 的 簡點 碼位 密變 爲突 因的 些入 有引 碼是 編好 的正 歹 貝 序些 酸有 基， 胺變 的改 因生 基發 S 不 P 以 G所 G 素 因 的 S 併 ---------i------tr------^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

C 限性 的制 新限 生的 產當 會適 後用。 變可測 突體檢 代質析 取變分 入突泳 引的電 因代質 基取膠 S 以糖 P 所脂 G ， 瓊 G點用 C 切後 a 酶解 S 切水 爲內酶 因性切 。 制 內 行 進 中。 液鐘 溶分 應 ο 反 1 的性 列變 下下 ’ 。C 下 ο OC 7 7 在 3 後 在然 A 鐘 N 分 D ο 子 3 引應 些反 這化 酸 磷 A VI/ S N C /(\ 準 標 家 國 國 -中 用 |適 尺 張 -紙 本

I釐 公 7 29 X 472084 2 β 1 1 β 1 1 u l 5 β 1 1 u l A7 ______ B7 五、發明説明（21) 10 pmol/el 引子DNA 10 X磷化反應緩衝溶液 10 m M ATP Η 2 〇 Τ4聚核苷酸激酶 其中1 0 χ磷化反應緩衝溶液內含1 〇 〇 三經甲基 氨基甲烷一氯化氫（pH 8.0) . 1 〇 〇 m μ

MgCl2，及 70mM DTT。 實施例3 引入S a c GG P S S基因之取代突變 使用實施例2之各引子D N A及根據實施例1製備之 質體用Kunkel方法構建引入取代突變。使用購自

Takara Shuzo公司的Mutan-K工具組進行Kunkel方 法。實驗過程描述於工具組內之說明。質體的取代突變不 一定要用Kunkel方法。例如：用聚合酶連鎖反應（ PCR) 亦可得到相同的結果。

Mutan — K工具組使用大腸桿菌c J 2 3 6作爲宿主 細胞，pBS_SacGGPs質體之單股DNA的胸腺 嘧啶被去氧尿嘧啶取代。 用此單股D N A作爲模板和引子d N A反應合成互補 鏈，在下列之反應溶液中於6 5。(：下反應1 5分鐘後在 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（24 - ----------t-------?T------^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 472084 A7 B7 五、發明説明（22) 3 7 °C下退火1 5分鐘： 單股 DNA 〇 · 6 P m ο 1 退火（退火（Anneal ing))緩衝溶液 1 Μ 1 引子DNA溶液（實施例2) 1#1 H20其使最終體積爲 10#1 其中退火（Annealing)緩衝溶液是2 0 OmM三羥甲基 氨基甲烷—氯化氫（pH 8.0) * 1 0 0 m Μ

MgC 12> 500mM NaCl，及 l〇mM D T T。 接著於2 5 /z 1之延長反應緩衝溶液中加入6 0單位 之大腸桿菌DNA聯接酶，及1單位之T4 DNA聚合 酶，在2 5 °C下進行2小時反應合成互補鏈。延長反應緩 衝溶液是5 OmM三羥甲基氨基甲烷一氯化氫（P Η 8.0) ，6〇mM 醋酸敍，5mM MgC 1 2 > 5 m Μ DTT，lmM NAD，及 0.5mM dNTP。 經濟部中央標準局員Η消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 反應結束後，加入3#1之0.2M EDTA ( pH8 . 0)後在6 5°C下加熱5分鐘終止反應。 實施例4 構建具有取代突變之S a c G G P S基因的重組菌株 使用根據實施例3製備之D N A溶液將大腸桿菌 XL1— Blue 用CaCl2之方法轉形。取他的方 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨〇X 297公釐） 472084 A7 B7 五、發明説明（23) 法例如：電穿孔（electroporation)亦可得到相似的結 果。除了大腸桿菌XL 1 — B 1 u e之外其他的宿主細 經濟部中央標準局畐ς工消費合作社印裝 胞 > 例 如 J Μ 1 0 9 等 亦 可 得 到 相 似 的 結 果 0 用 C a C 1 2之方法轉形後塗片至內含氨比西林作爲 選 擇 標 記 的 瓊 脂 培 養 血 9 在 3 7 °c 下 作 隔 夜 培 養 〇 從 上 述 得 到 的 轉 形 株 中 > 選 擇 具 有 B S P Η I ， Ε C 0 R V 或 C 1 a I 切 點 的 P B S — S a C G G P S 質 體 Usz. 〇 用 二 去 氧 ( d i deoxy ) 1方法分析pBs- S a C G G P s 質 體 之 S a C G G P S 基 因 進 行 突 變 之 胺 基 酸 殘 基 附 近 的 核 酸 編 碼 之 核 酸 序 列 〇 結 果 找 到 的 P B s — S a C G G P S 質 ίΛΛ 體 含 下 列 五 種 突 變 之 S a C G G P S 基 因 0 其 胺 基 酸 序 列 的 核 甘 酸 序 列 編 碼 胺 基 酸 位 置 7 7 至 胺 基 酸 位 置 8 5 顯 示 如 下 突 變 核 酸 序 列 Τ 7 7 F » Η 8 1 A 5 - — T T T T T C C Τ T G T G G C T G A T G A Τ A T C A T G — 3 〆 ( 序 列 號 碼 9 ) Τ 7 8 F » Η 8 1 L : 5 〆 — T T T T T C C T T G T G C T T G A T G A Τ A T C A T G — 3 - ( 序 列 號 碼 1 0 ) F 7 7 Y » Τ 7 8 F > 5 - — T A Τ T T C C Τ T G T Η 8 1 L ； G C T T G A T G A Τ A 丁 C A T G 一 3 - ( 序 列 號 碼 1 1 ) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2Ι0Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 472084 五、發明説明（24) F77Y，T78F ，Η 8 1 A : F77Y，T78S V 8 Ο I , I 8 4 L 8 4 P S 8 5 ·· 野生型： A7 B7 5 > - TATTTCCTTGT GGCTGATGATATCA T G — 3 (序列號碼：1 2 ) 5 / -TATTCGCTTAT TCATGATGATCTTC CATCGATG-3 (序列 號碼：1 3 )

5 "-TTTACGCTTGT GCATGATGATATTA TG — (序列號碼：14). 實施例5 測量突變之二磷酸異戊烯酯合成酶的活性 從實施例4的六個轉形菌株（五個含突變之 Sa cGGPS基因，一個含野生型sa cGGPS基因 )製備未經加工的酵素溶液。 轉形菌株在2 X L B培養液中隔夜培養後離心收集 ，懸浮於緩衝溶液（50 mM鈣磷酸緩衝溶液（PH 5.8) '10 m Μ /3 —乙硫醇、1 mM EDTA) 後將細胞用音波均漿研磨。此均漿液於4 °C， 10，OOOr . p .m下離心1〇分鐘》上清液在55 °c下加熱1 2小時去除大腸桿菌自身之二磷酸異戊烯酯合 成酶活性。於相同條件下離心取上清液作爲未經加工的酵 II -裝— n ^ I · 線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ττ^ 472084 A7 ______ B7 五、發明説明（25) 素萃取液。將酵素萃取液在60°C、70°C、或80°C( 嗜熱脂肪芽孢桿菌之酵素則於6 0 °C、6 5 ΐ、6 了。e、 或7 0 °C )下先處理一小時後’作酵素萃取液的耐熱性測 試。反應在5 5 ΐ下進行1 5分鐘，反應溶液如下： [1-14C ]—異戊烯基二磷酸（1 C i / 烯丙基二磷酸（樾牛兒基二磷酸） 磷酸鉀緩衝溶液（pH5 . 8) M g C 1 2 酵素溶液 Η 2 〇 m )25 25 10 m Μ Μ 1 0 0 β g 加至200私 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 反 液，然 分成兩 液後在 突 兒基樾 孢桿菌 將 0 . 5 鈴薯酸 、0 . 磷酸反 應終止後加入2 Ο Ο β 1 後再加入1 ml之水飽 層。約800//1之丁醇 閃爍計數器下測量其放射 變的二磷酸異戊烯酯合成 牛兒基二磷酸合成酶相等 的二磷酸法呢酯合成酶。 其餘的丁醇層在氮氣下加 m 1 。濃縮物中加入2 性磷酸酶溶液 （2 mg 5 Μ醋酸鈉（pH 4. 應。去磷酸的反應生成物用3 之飽合N a C 1至反應溶 合過之丁醇’混合離心後 層中加入3 m 1之閃爍 性。結果示於圖2。 酶其耐熱性和天然的樾牛 ，而高於來自嗜熱脂肪芽 熱揮發，將其體積濃縮至 ml之甲醇及iml之馬 / m 1馬鈴馨酸性磷酸酶 7))在3 7°C下進行去 1之η —戊烷萃 ----------¾衣------"------^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210'犬2的公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 472084 A7 B7 五、發明説明（26 ) 取。 在氮氣下揮發溶劑濃縮後以TLC (反相T L C片 ：L K C 1 8 ( Whatman ))分析。展開溶劑：丙酮/水 = 9/1 。展開的去隣酸化反應生成物用Bio Image Analyzer B A S 2 0 0 0 (Fuji Photo Film)分析測定 放射性的位置。當使用樾牛兒基二磷酸作爲烯丙基的底物 時結果示於圖3。 突變的二磷酸異戊烯酯合成酶之反應生成物是二磷酸 法呢酯。 序列表 序列號碼：1 長度：3 3 0 類型：胺基酸 拓樸構造’·線性 分子型態：蛋白質 原始來源： 生物：酸熱硫化葉菌 菌株：ATCC 33909 特徵： 關鍵特徵：富含天門冬胺酸的結構區 位置：8 2 — 8 6 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（ ---------i------ΐτ------.^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 472084 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ----- D / 五、發明説明（ 27) 1 | Het Ser Tyr Phe Asp Asn Tyr Phe Asn Glu lie Val Asn Ser Val Asn 1 I 5 10 15 1 1 Asp lie lie Lys Ser Ty t lie Ser Gly Asp Val Pro Lys Leu Tyr Glu 1 I 20 25 30 1 1 Ala Ser Tyr His Leu Phe Thr Ser Gly Gly Lys Arg Leu Arg Pro Leu '—s 1 I 35 A5 請 先 閱 1 1 lie Leu Thr lie Ser Ser Asp Leu Phe Gly Gly Gin Arg Glu Arg Ala 1 | 50 55 60 讀 背 | Tyr Tyr Λ1 a G1 y Ala Ala I le Glu Val Leu His Thr Phe Thr Leu Val 面 之 注 1 65 70 75 80 1 His Asp Asp lie Me t Asp Gin Asp Asn lie Arg Arg Gly Leu Pro Thr 意 1 05 90 .95 項 再 填 1 Vai His Val Lys Tyr Gly L.eu Pro Leu Ala lie Leu Ala Gly Asp Leu 100 105 110 寫 裝 Leu His Ala Lys ΛΙη Pile Gin Leu Leu Thr Gin Ala Leu Arg Gly Leu 頁 1 115 120 125 1 Pro Ser Glu Thr lie lie Lys Ala Phe Asp lie Phe Thr Arg Ser lie 1 130 135 1A0 1 He lie lie Ser Glu Gly Gin Ala Val Asp He t Glu Phe Glu Asp Arg 1 165 150 155 160 1 訂 1 lie Asp lie Lys Glu Gin Glu Tyr Leu Asp Met lie Ser Arg Lys Thr 165 170 175 1 I Ala Ala Leu Pile Ser Ala Ser Ser Ser lie Gly Ala Leu lie Ala Gly 1 I 180 185 190 1 I Ala Asn Asp Asn Asp Vai Arg Leu Met Ser Asp Phe Gly Thr Asn Leu 1 | 195 200 * 205 Gly lie Ala Phe Gin lie Val Asp Asp He Leu Gly Leu Thr Ala Asp 線 I 210 215 220 Glu Ly s Glu Leu Gly Lys Pro Val Phe Ser Asp lie Arg Glu Gly Lys 1 225 23 0 235 2A0 1 Ly s Thr lie Leu Val lie Lys Thr Leu Glu Leu Cys Lys Glu Asp Glu 1 2^5 250 255 1 Ly s Ly s lie Val Lru Lys Ala Leu Gly Asn Lys Ser Ala Ser Lys Glu 260 265 270 1 Glu Leu Met Ser Ser Ala Asp lie lie Lys Lys Tyr Ser Leu Asp Tyr i 275 280 285 1 Ala Tyr Asn Lea Ala Glu Lys Tyr Tyr Lys Asn Ala lie Asp Ser Leu 1 290 Z95 300 1 Asn Gin Val Ser Ser Uys Ser Asp He Pro Gly Lys Ala Leu Lys Tyr 1 305 310 315 320 1 Leu Ala Glu Phe Thr lie Arg Arg Arg Lys 1 325 330 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） 472084 A7 B7 五、發明説明（28) 序列號碼：2 長度：9 9 3 類型：核酸 股類別：雙股 拓樸構造：線性

分子型態：基因的DNA 原始來源： 生物：酸熱硫化葉菌 菌株：ATCC 33909 特徵：關鍵特徵：富含天門冬胺酸的編碼結構區 位置：246 — 258 ----------裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央橾準局員工消費‘S·· i-製

ATGAGTTACT

AGCTATATAT

GGAGGTAAGA

AGAGAAAGAG

CATGATGATA

TACGGCTTAC

TTAACCCAGG

ACTCGTTCAA

ATTGATATAA

TCGGCATCCT

ATGTCTGATT

CTAACAGCAG

AAGACTATAC

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GGTTAAGACC

CTTATTATGC

TTATGGATCA

CCTTAGCAAT

CTCTTAGAGG

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AGGAGCAGGA

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TTACGATAAG

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ATTAATCTTA

AGGTGCAGCT

AGATAATATC

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TTTGCCAAGT

ATCCGAAGGA

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ACTTGGAAAG

AACACTGGAG

GTCAGCCTCA

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CTCCTCTAAG

AAGGAGAAAA

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ACTATATCAT

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AGAAGAGGGT

GATTTACTAC

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CCTGTTTTTA

CTTTGTAAAG

AAAGAAGAAT

AATTTAGCAG

AGTGATATAC

TAA

CTGTAAACGA

CATATCATTT

CAGATTTATT

TTCATACTTT

TACCCACAGT

ATGCAAAGGC

TTAAGGCTTT

ATATGGAATT

GTAAGACAGC

ATGATAATGA

TTGTTGACGA

GTGATATTAG

AGGACGAGAA

TAATGAGCTC

AGAAATATTA

CTGGAAAGGC CATTATTAAG 60 GTTTACATCT 120 CGGAGGACAG 180 TACGCTTGTG 240 CCACGTGAAA 300 TTTTCAGCTC 360 CGATATTTTC 420 TGAGGACAGA 480 TGCATTATTC 540 TGTAAGACTG 600 TATCTTAGGT 660 GGAGGGTAAA 720 GAAGATTGTC 780 AGCAGATATA 840 TAAAAATGCT 900 TTTAAAATAT 960

472084 經濟部中央標準局員工消費合作社印掣 Α7 Β7 五、發明説明（29) 序列號碼：3 長度：3 7 類型：核酸 股類別：單股 拓樸構造：線性 分子型態：合成的DNA 序列描述：

CATACTTTTT TCCTTGTGGC TGATGATATC ATGGATC 序列號碼：4 長度：3 7 類型：核酸 股類別：單股 拓樸構造：線性 分子型態：合成的DNA 序列描述：

CATACTTTTT TCCTTGTGCT TGATGATATC ATGGATC

序列號碼：5 長度：3 7 類型：核酸 股類別：單股 拓樸構造：線性 分子型態：合成的DNA 本紙張尺k適用中國國家標準（CNi")__A_4規格（210_ϋ^_ϊ厂32 = .- ! U - - ! I I^-- - - -- ----1 i-i 8-i--aJI—I - !-i— m I . (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 472084 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（3〇) 序列描述：

CATACTTATT TCCTTGTGCT TGATGATATC ATGGATC 序列號碼：6 長度：3 7 類型：核酸 股類別’·單股 拓樸構造：線性

分子型態：合成的DNA 序列描述：

CATACTTATT TCCTTGTGGC TGATGATATC ATGGATC 序列號碼：7 長度：3 6 類型：核酸 股類別：單股 拓樸構造：線性 分子型態：合成的DNA 序列描述：

GTTCTTCATA CTTATTCGCT TATTCATGAT AGTATT 序列號碼：8 長度：3 3 類型：核酸 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐厂^ _ ,1 .私衣------订-----> m. (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 472084 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 B7 五、發明説明（31) 股類別：單股 拓樸構造：線性 分子型態：合成的DNA 序列描述：

ATTCATGATG ATCTTCCATC GATGGATCAA GAT 序列號碼：9 長度：2 7 類型：核酸 股類別：單股 拓樸構造：線性 分子型態： 序列描述：

TTTTTCCTTG TGGCTGATGA TATCATG 序列號碼：1 0 長度：2 7 類型：核酸 股類別：單股 拓樸構造：線性 分子型態： 序列描述：

TTTTTCCTTG TGCTTGATGA TATCATG — '批本 訂 ^ .—線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 472084 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（32) 序列號碼：1 1 長度：2 7 類型：核酸 股類別：單股 拓樸構造：線性 分子型態： 序列描述：

TATTTCCTTG TGCTTGATGA TATCATG 序列號碼：1 2 長度：2 7 類型：核酸 股類別：單股 拓樸構造：線性 分子型態： 序列描述：

TATTTCCTTG TGGCTGATGA TATCATG 序列號碼：1 3 長度：3 3 類型：核酸 股類別=單股 拓樸構造：線性 分子型態= 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐厂35 ^n. In ^^^1 - - - - I - ί ^^1 »1^J^ n -I - - I - -、一-aJ _· 1^1 F- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 472084 A7 B7 五、發明説明（33) 序列描述：

TTTACGCTTG TGCATGATGA TATTATG 序列號碼：1 4 序列長度：2 7 序列型態：核酸 股類別：單股 拓樸構造：線性 分子型態： 序列描述： (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝.

、1T ——線 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（210X297公*厂36

Claims (1)

1. 472084 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 附 it丄二.L—^Γ90. 5 J4 修正4 補 /p... 第8 6 1 1 0 4 1 2號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 民國9 0年5月呈 1.一種具有經修飾之胺基酸序列的二磷酸異戊烯酯 合成酶突變酵素，其中至少一個胺基酸殘基選自（ a )區 域I I中富含天門冬胺酸之結構區DDXX (XX) D (其中X代表任何胺基酸，而括弧內之兩個X可以不存在 )，位於自N -端之D以N —端方向算起的第五個胺基酸 和自N —端之D以N —端方向算起的第一個胺基酸之間的 胺基酸殘基，及（b )位於該富含天門冬胺酸之結構區 <：-端之〇以 N -端方向算起之第一個位置上被其他胺 基酸取代的胺基酸殘基，及/或 該富含天門冬胺酸之結構區介於C -端之D的N -端 ------------、' '' ^一^ --------訂·-------- (请先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ’ 戊更： 酸異酯 ο 基酸烯N 胺磷戊 的二異 D 外之、酸 I 額成磷 入合二 Q 崁素之 E 被酵成 S 間變合下 之突素如 D 酶，酵有 之成，型具 端合生係 I 酯野素 ： C 烯之酵列 和戊應型序 置異對生酸 位酸其野基 個磷比該胺 1 二度中之 第該長其示 向中酯，所 方其烯短 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 472084 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 六、申請專利範圍 Het Ser Tyr Phe Asp Asn Tyr Phe Asn Glu lie Val Asn Ser Val Asn 5 10 15 Asp lie lie Lys Ser Tyr lie Ser Gly Asp Val Pro Lys Leu Tyr Glu 20 25 30 ALa Ser Tyr His Leu Phe The Sec Gly Gly i，ys Arg Leu Arg Pro teu 35 40 45 lie Leu Thr lie Ser 5er Asp Leu Phe Gly Gly Gin Arg Glu Arg Ala 50 55 60 Tyr 丁)rr Ala Giy Ala Ala lie Glu Val Leu His Thr Phe Thr Leu Val 65 70 75 80 His Asp Asp lie Met. Asp Gin Asp Asn lie Arg Arg Gly Leu Pro Thr 05 9〇 95 Val His Val Lys Tyr Gl/ Leu Pro Leu Ala He Leu Ala Gly Asp Leu 100 105 HO Leu His Ala Lys Ala Phe Gin ,Leu Leu Thr Gin Ala Leu Arg Gly Leu 115 120 125 Pro Ser Glu Thr He lie Lys Ala Phe Asp He Phe Thr Arg Ser He 130 135 1^*0 lie lie lie Ser GIw Gly Gin Ala Val Asp Het Glu Phe Glu Asp Arg 1A5 130 155 160 lie Asp lie Lys Glu Gin Glu Tyr Leu Asp Met He Sec Arg Lys Thr 165 170 175 Ala Ala Leu Phe Ser Ala Ser 5er Sec lie Gly Ala Ueu lie Ala Gly ΧΘ0 185 190 Ala Asn Asp Asn Asp Val Arg Leu Met 5er Asp Phe Gly Thr Asn Leu 195 200 205 Giy lie Ala Phe Gin He Val Asp Asp lie Leu Gly Leu Thr Ala Asp 210 215 220 Glu Lys Glu Leu Gly Lys Pro Val Phe Ser Asp lie Arg Glu Gly Lys 225 230 235 2^0 Lys Thr lie Leu Val lie Lys Thr Leu Glu Leu Cys Lys Glu Asp Glu 2^5 Z50 255 Lys Lys lie Val Leu Lys Ala Leu Gly Asn Lys Ser Ala Ser Lys GJLu 260 265 270 Glu Leu Het Ser Ser Ala Asp lie lie Lys Lys Tyr' Ser Leu Asp Tyr 275 280 285 A丄a Tyr Asn Leu Ala Glu Lys Tyr Tyr Lys Asn Ala lie Asp Ser Leu 290 295 300 Asn Gin Val Ser Ser Lys Ser Asp He Pro Gly Lys Ala Leu Lys Tyr 305 310 315 320 Leu Ala Glu Phe The He Arg Arg Arg Lys 325 330 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規柃（210 x 297公釐〉 I I cl I - n 1 n n K n ii f 」 n ϋ - - —i I I! i I )ejI ..... n 1-1-. i _ n J I (請先閲讀背面之注意i項再填寫本頁) -2 一 472084 A8 B8 C3 D8 經濟即智慧財產局員工消費合作社印製 六、申請專利範圍 2 ·如申請專利範圍第1項之突變酵素，其中二磷酸 異戊烯酯合成酶的反應生成物是法呢基二磷酸。 3 .如申請專利範圍第1或2項之突變酵素，其中二 磷酸異戊烯酯合成酶是同雙體類型。 4 .如申請專利範圍第1或2項之突變酵素，其中二 磷酸異戊烯酯合成酶源自古生菌。 5 .如申請專利範圍第1或2項之突變酵素，其中二 磷酸異戊烯酯合g酶源自酸熱硫化葉菌。 6 .如申請專利範圍第1或2項之突變酵素，其中二 磷酸異戊烯酯合成酶保留二磷酸異戊烯酯合成酶突變前之 特性。 7 .如申請專利範圍第.1或2項之突變酵素，其中二 磷酸異戊烯酯合成酶是一種耐熱性的酵素。 8 .如申請專利範圍第1或2」瑱之突變酵素.，其中至 少一個胺基酸選自樾牛兒基年兒基二磷酸合成酶（如序 列號碼：1 )之位置7 7的苯丙胺酸，位置7 8的羥丁氨 酸，位置8 0的纈草胺酸，位置8 1的組織胺酸，及位置 8 4的異白胺酸被其他的胺基酸取代，或在位置8 4的異 白胺酸和位置8 5的甲硫胺酸間崁入一個或多個胺基酸。 9 ·如申請專利範圍第1或2項之突變酵素，其中至 少一個胺基酸選自樾牛兒基樾牛兒基二磷酸合成酶（如序 列號碼：1 )之位置7 7的苯丙胺酸，位置7 8的羥丁氨 酸，位置8 0的纈草胺酸，位置8 1的組織胺酸，及位置 8 4的異白胺酸被其他的胺基酸取代，或在位置8 4的異 (請先閱頊背面之注意事項再赛寫本頁) 裝*--- ，訂---- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公发> 472084 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 白胺酸和位置8 5的甲硫胺酸間崁入一個或多個胺基酸， 而位置7 7的苯丙胺酸被酪胺酸取代，位置7 8的羥丁氨 酸被苯丙胺酸或絲胺酸取代，位置8 0的纈草胺酸被異白 胺酸取代，位置8 1的組織胺酸被白胺酸或丙胺酸取代、 及位置8 4的異白胺酸被白胺酸取代；或在位置8 4的異 白胺酸和位置8 5的甲硫胺酸間崁入脯胺酸及絲胺酸。 10.—種編碼如申請專利範圍第1或2項之突變酵 素的D N A。 1 1 . 一種由如申請專利範圍第1 〇項之DNA轉錄 的 R N A。 I---------—丨· ---I I--訂---— II--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 x 297公釐） -夺-