KR100252529B1

KR100252529B1 - 파르네실 이인산염 신타아제

Info

Publication number: KR100252529B1
Application number: KR1019970034364A
Authority: KR
Inventors: 히로유키 나카네; 차카라 오토; 신이치 오누마; 가즈다케 히로오카; 도쿠조 니시노
Original assignee: 와다 아끼히로; 도요다 지도샤 가부시끼가이샤
Priority date: 1996-07-24
Filing date: 1997-07-23
Publication date: 2000-04-15
Also published as: JPH1033184A; KR980009456A; DE69737432D1; TW472084B; EP0821065A2; DE69737432T2; JP3379344B2; EP0821065B1; US5935832A; CA2210753A1; CA2210753C; CN1182132A; USRE43425E1; CN1165621C; EP0821065A3

Abstract

본 발명은 프레닐 이인산염 신타아제의 영역 II에 존재하는 아스파르트산-풍부 도메인 DDXX(XX)D (여기서, X는 모든 아미노산을 나타내며, 괄호 속 XX는 존재하지 않을 수 있다) 내 및 이의 상류의 아미노산 서열을 변형하여, 원래의 효소에 의해서 합성되는 것보다 짧은 프레닐 이인산염을 합성할 수 있는 돌연변이 프레닐 이인산염 신타아제에 관한 것이다.

Description

파르네실 이인산염 신타아제{FARNESYL DIPHOSPHATE SYNTHASE}

본 발명은 생물에서 중요한 스테로이드, 유비퀴논, 돌리콜, 카로테노이드, 프레닐화 단백질, 동물 호르몬, 식물 호르몬과 같은 화합물의 전구체인 선형 프레닐 이인산염을 합성하는 신규 돌연변이 효소; 상기 효소를 암호화하는 유전 체계; 및 상기 효소의 사용 및 제조 방법에 관한 것이다.

생물에서 중요한 역할을 하는 물질 중에는, 많은 물질들이 이소프렌 (2-메틸-1,3-부타디엔)을 구성 단위로 사용하여 생합성된다. 이같은 화합물은 또한 이소프레노이드, 테르페노이드 또는 테르펜으로 불리며, 탄소수에 따라 헤미테르펜(C5), 모노테르펜(C10), 세스퀴테르펜(C15), 디테르펜(C20), 세스테르펜(C25), 트리테르펜(30), 테트라테르펜(40) 등으로 분류된다. 실제 생합성은 메발론산-5-이인산염을 합성하는 메발로네이트 경로로 출발하며, 이어서 실제 이소프렌 단위인 이소펜테닐 이인산염(IPP)을 합성한다.

전구체로 예상되는 이소프렌 단위는, 이소펜테닐 이인산염, 즉 활성 이소프렌 단위로 밝혀졌다. 또한, 시토키닌으로 알려진 이소펜테닐 아데닌의 합성시 기질로 사용되고, 식물 호르몬 중 하나인 디메틸알릴 이인산염(DMAPP), 이소펜테닐 이인산염의 이성질체는, 이소펜테닐 이인산염과 축합 반응하여 제라닐 이인산염 (geranyl diphosphate, GPP), 네릴 이인산염(neryl diphosphate), 파르네실 이인산염(farnesyl diphosphate, FPP), 제라닐제라닐 이인산염(GGPP), 제라닐파르네실 이인산염(GFPP), 헥사프레닐 이인산염(HexPP), 헵타프레닐 이인산염(HepPP) 등과 같은 사슬형 활성 이소프레노이드를 합성하는 것으로 알려져 있다.

축합 반응에는 Z-타입 및 E-타입이 있다. 제라닐 이인산염은 E-타입의 축합 생성물이며, 네릴 이인산염은 Z-타입 축합 생성물이다. 파르네실 이인산염 및 제라닐제라닐 이인산염의 E-타입은 모두 활성 형태일 것으로 생각되지만, Z-타입 축합 반응을 통하여 천연 고무, 돌리콜, 박토프레놀(운데카프레놀) 및 식물에서 발견되는 다양한 폴리프레놀을 합성할 수 있다. 이들은, 분자내 피로포스페이트 및 탄소 골격의 포스페이트 에스테르 결합 에너지를 사용하여 축합 반응을 하고, 반응 부산물로서 피로포스페이트를 생성하는 것으로 보인다.

파르네실 이인산염 또는 제라닐제라닐 이인산염은, G-단백질로 대표되고 세포 내 신호 변환기(signal transducer) 메카니즘에서 중요한 프레닐화 단백질(FPP 또는 제라닐제라닐 이인산염으로부터 합성); 아르카에아(archaea)의 세포막 지질(제라닐제라닐 이인산염으로부터 합성); 스테로이드의 전구체인 스쿠알렌(파르네실 이인산염으로부터 합성); 카로테노이드의 전구체인 피토엔(phytoene, 제라닐제라닐 이인산염로부터 합성)을 합성하는 반응 기질로서 사용된다. 이소프렌 단위가 각각 6 및 7인 헥사프레닐 이인산염 및 헵타프레닐 이인산염으로부터의 프레닐 이인산염 내지 이소프렌 단위가 10인 프레닐 이인산염은 전자 수송 체계에서 작용하는 유비퀴논 및 메나퀴논(비타민 K2)의 합성시 전구체로 사용된다.

또한, 이같은 활성-형태의 이소프레노이드 생합성을 통하여, 생명에 필수적인 다양한 종류의 화합물들을 합성하였다. 이러한 화합물에는, 간단히 언급하면, 헤미테르펜을 합성 전구체로 사용하는 식물 호르몬인 시토킨 및 이소펜테닐 아데노신-변형된 tRNA, 장미유 향의 주성분인 모노테르펜에 속하는 제라니올 및 이의 네롤 이성질체 및 살충제인 녹나무 추출물, 캄포르가 있다. 세스퀴호르몬에는 곤충의 용화억제 호르몬이 포함되고, 디테르펜에는 식물 호르몬 지베렐린, 곤충의 트레일 페로몬, 및 가시 안료 전구체로 작용하며 할로필릭 아르카에아의 자주색 막 단백질의 구성성분 및 비타민 A와 결합하는 레티놀 및 레티날이 포함된다.

또한, 스쿠알렌, 트리테르펜을 사용하여 다양한 스테로이드 화합물을 합성하였으며, 예를 들면 동물의 성 호르몬, 비타민 D, 곤충의 짝짓기 호르몬인 엑디손, 식물 호르몬 브라시놀라이드(brassinolide) 및 세포질막 성분 등이 포함된다. 또한, 다양한 생물 안료의 전구체인 테트라테르펜의 다양한 카로테노이드 및 비타민 A는, 활성 이소프레노이드에서 유래하는 중요한 화합물이다. 클로로필, 페오피틴, 토코페롤(비타민 E) 및 필로퀴논(비타민 K1)도 테트라테르펜에서 유래한다.

이소펜테닐 이인산염을 이러한 알릴 기질인 디메틸알릴 이인산염, 제라닐 이인산염, 파르네실 이인산염, 제라닐제라닐 이인산염, 제라닐파르네실 이인산염 등과 연속적으로 축합하는 활성 이소프레노이드 신타아제는, 프레닐 이인산염 신타아제로 불리며, 주요 반응 산물 중 최대 사슬 길이를 갖는 화합물명을 기초로, 예를 들면 파르네실 이인산염 신타아제(FPP 신타아제), 제라닐제라닐 이인산염(GGPP 신타아제) 등으로 명명된다. 박테리아, 아르카데아, 균류, 식물 및 동물로부터, 파르네실 이인산염 신타아제, 제라닐제라닐 이인산염 신타아제, 헥사프레닐 이인산염 신타아제, 헵타프레닐 이인산염 신타아제, 옥타프레닐 이인산염 신타아제, 노나프레닐 이인산염 신타아제(솔라네실 이인산염 신타아제), 운데카프레닐 이인산염 신타아제 등와 같은 효소를 정제, 활성 측정, 유전자 클로닝 및 DNA 암호 서열화 한 것이 보고되어 있다.

이러한 활성 이소프레노이드 신타아제는, 매우 다양한 화합물을 화학적으로 합성하는 기초가 되며, 산업상 및 생명 과학의 학문 분야에서 매우 중요하나, 성질이 불안정하고 특이 활성이 낮아, 실제 산업적으로 적용하여 사용되는 일은 거의 없었다. 그러나, 호열성 세균 및 아르카에아에서 열적으로 안정한 프레닐 이인산염 신타아제 및 이러한 효소를 암호화하는 유전자를 분리하게 되어, 이들을 효소로 사용할 수 있는 가능성이 증가하였다.

파르네실 이인산염 신타아제는, 유전자를 바실러스 스테아로써모필러스 (Bacillus Stearothermophilus) 에서 분리하고, 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli)를 숙주 세포로 사용하여 중간 정도의 열적 안정성을 갖는 효소를 제조하였다[T. Koyama et al. (1993) J. Biochem., 113: 355-363; 일본국 미심사 특허 공개 5(1993)-219961호]. 제라닐제라닐 이인산염 신타아제는 술포로버스 아시도칼다리어스(Sulfolobus acidocaldarius) 및 써머스 써모필러스(Thermus thermophilus)와 같은 고온균에서 유전자를 분리하고[S. -i. Ohnuma et al., (1994) J.Biol. Chem., 269: 14792-14797; 일본국 미심사 특허 공개 7(1995)-308193, 및; 일본국 미심사 특허 공개 7(1995)-294956], 고도의 고온 안정성을 갖는 효소를 제조하였다.

또한, 파르네실 이인산염 신타아제 및 제라닐제라닐 이인산염 신타아제 모두의 기능을 갖는 프레닐 이인산염 신타아제에 관해서는, 이 효소 및 이를 암호화하는 유전자를 고도의 호열성 메타노박테리움 써모오토트로피큠(Methanobacterium thermoautotrophicum)[A.Chen 및 D.Poulter(1993) J.Biol.Chem., 268:11002-11007; A.Chen 및 D.Poulter(1994) ARCHIVES OF BIOCHEMISTRY AND BIOPHYTSICS 314]에서 분리하였고, 효소의 열적 안정성을 확인하였다.

그러나, 메타노박테리움 써모오토트로피큠에서 유래하는 파르네실 이인산염/제라닐제라닐 이인산염의 합성시, 효소 활성의 검정과 관련하여 반응 산물의 사슬 길이를 구체화할 수 있는 박막 크로마토그래피 분석 등의 데이터에 관해 보고된 바가 없다; 사슬 길이는 제라닐 이인산염을 알릴 기질로 측정하여 평가하였다. 제라닐 이인산염은 또한 제라닐제라닐 이인산염 신타아제의 기질로 작용할 수 있으므로, 측정된 활성에 파르네실 이인산염 신타아제의 활성만이 포함될 것으로 보이지는 않는다.

더욱이, 높은 열적 안정성, 높은 염-안정성 및 낮은 pH 안정성을 갖는 것으로 기대되는 아르카에아에 파르네실 이인산염 신타아제가 존재하는지는 확실하지 않다.

상기한 바와 같이, 바실러스 스테아로써모필러스 유래의 파르네실 이인산염 신타아제를 사용하면, 취급이 어렵고 불안정한 효소의 문제점 중 일부가 해결된다. 그러나, 고도의 열안정성을 가지는 효소가 산업적 적용시 더욱 안정하고 사용가능하다.

더욱이, 장쇄의 프레닐 이인산염 신타아제 몇가지는 기질로서 파르네실 이인산염을 사용한다. 이러한 장쇄 프레닐 이인산염 신타아제는, 장쇄 프레닐 이인산염 신타아제의 기질을 제공할 목적으로 파르네실 이인산염 신타아제와 동시에 사용할 때, 파르네실 이인산염 신타아제는 장쇄 프레닐 이인산염 신타아제와 동등하거나 더욱 우수한 안정성을 지녀야 한다. 파르네실 이인산염을 산업적으로 제조하려 할 때, 효소는 재활용을 위하여 고정되거나 회수되어야 한다. 효소를 재생하는 경우, 효소는 더욱 안정하도록 높은 열적 안정성, 높은 염 안정성, 광범위한 pH 범위에서의 높은 안정성을 가져야 한다.

프레닐 이인산염 신타아제의 아미노산 서열을 기초하여 제시되는 두가지 아스파르트산-풍부 도메인 중에서, 아미노 말단 쪽에 아스파르트산-풍부 도메인이 보존되어 있는 서열 I (DDXX(XX)D) (이때, X서열은 모든 아미노산이고, 괄호 안의 두 X는 존재하지 않아도 된다)로부터 N-말단 방향으로 5번째 위치에 있는 아미노산 잔기는 반응 생성물의 사슬 길이 조절과 관련이 있다는 것이 발견되었다. 따라서, 반응 생성물의 사슬 길이를 연장할 목적으로 반응 생성물을 제어하는 방법이 고안되었다[일본국 특허 출원 제 8-191635호(1996년 7월 3일), "돌연변이 프레닐 이인산염 신타아제"]. 이 방법으로 제조한 효소로, 몇가지 사슬 길이를 갖는 반응 생성물을 제조할 수 있었다. 그러나, 파르네실 이인산염을 제조하기 위하여 제라닐제라닐 이인산염 신타아제의 돌연변이를 유도하여 반응 생성물을 단쇄 쪽으로 조절하는 방법은 알려져 있지 않다.

본 발명의 목적은 프레닐 이인산염 효소에서 아미노산 서열을 변형함으로써 파르네실 이인산염 신타아제의 제조방법을 확립하고자 하는 것이다. 산업적으로 적용하기에 더욱 적합하도록 훨씬 안정하거나 고도의 특이 활성을 지니는 새로운 효소를 사용하면, 돌연변이 전의 프레닐 이인산염 신타아제 특성을 지니는 돌연변이 프레닐 이인산염 신타아제 또는 파르네실 이인산염을 제조하는 이의 유전자를 즉시 얻을 수 있다.

돌연변이 술포로버스 아시도칼다리어스(S. 아시도칼다리어스)의 제라닐제라닐 이인산염 신타아제 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대한 정보로부터, 프레닐 이인산염 신타아제의 아미노산 서열 분석에 기초한 아스파르트산이 풍부할 것으로 보이는 두 도메인 중에서, 아미노 말단 쪽에 아스파르트산-풍부 도메인이 보존되어 있는 서열 I(DDXX(XX)D) 내의 아미노산 잔기 또는 상기 보존된 서열 I의 아미노 말단에서 N-말단 쪽의 5 아미노산 잔기는 반응 생성물의 사슬 길이 조절과 관련이 있음이 명백하다.

따라서, 본 발명은 변형된 아미노산 서열을 갖는 돌연변이 프레닐 이인산염 신타아제를 제공하며, 이때 a)영역 II에 존재하는 아스파르트산-풍부 도메인 DDXX(XX)D(이때, X서열은 모든 아미노산이고, 괄호 안의 두 X는 존재하지 않아도 된다)의 상기 N-말단의 D로부터 N-말단 방향으로 첫 번째 위치에 있는 아미노산 잔기 및 N-말단의 D로부터 N-말단 방향으로 5번째 위치에 있는 아미노산 잔기 사이의 아미노산 잔기, 및 b) 상기 아스파르트산-풍부 도메인의 C-말단의 D로부터 N-말단 방향의 위치에 존재하는 아미노산 잔기에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 다른 아미노산으로 치환하고, 및/또는

상기 아스파르트산-풍부 도메인의 상기 C-말단의 D 및 상기 C-말단의 D에서 N-말단 방향으로 첫 번째 위치에 존재하는 아미노산 잔기 사이에 추가의 아미노산(들)을 삽입하였다.

본 발명은 천연 프레닐 이인산염 신타아제의 특성을 지니는 파르네실 이인산염-제조 돌연변이 프레닐 이인산염 신타아제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 효소를 암호화하는 DNA 또는 RNA를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 DNA를 포함하여 구성되는 재조합 벡터 및 특히 발현 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 벡터로 형질 전환된 숙주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 효소가 이소펜테닐 이인산염, 디메틸알릴 이인산염 및 제라닐 이인산염으로 이루어진 그룹에서 선택된 기질과 접촉하는 단계를 포함하는 탄소수 15이하인 프레닐 이인산염의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 따른 돌연변이 효소의 제조 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 숙주를 배양하고 이 배양물로부터 발현 생성물을 수확하는 것이다.

도 1은 다양한 프레닐 이인산염 신타제에서 영역 (I) 내지 (V) 및 아스파르트산-풍부 도메인 I을 나타내는 그래프이다. 도면에서, 서열은 제라닐제라닐 이인산염 신타아제의 아미노산 서열을 나타내며, ATGERPYRS는 아라비돕시스 탈리아나

(Arabidopsis thaliana)에서 유래한 것, LA15778.p는 루피나스 알버스(Lupinas albus)에서, CAGERDIS는 캅시큠 아니움(Capsicum annuum)에서, ATGGPSRP는 아라비돕시스 탈리아나에서, GGPS-pep는 술포로버스 아시도칼다리어스(Sulfolobus acidocaldarius)에서, SPCRT.pep는 로도박터 스파에로이드(Rhodobactor sphaeroides)에서, RCPHSYNG는 로도박터 캅술라투스(Rhodobactor capsulatus)에서, EHCRTS.pe는 에르위니아 헤르비콜라(Erwinia herbicola)에서, MXCRTNODA는 믹소코커스 탈리아나(Myxococcus thaliana)에서, NCAL3.pep는 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa)에서 유래한 것이다. 각 아미노산 서열 왼쪽에 표시된 숫자는 아미노산 서열의 N-말단에 있는 각 제라닐제라닐 이인산염 신타아제의 N-말단쪽으로부터의 위치를 나타낸다.

도 2는 돌연변이 프레닐 이인산염 신타아제의 열적 안정성을 나타내는 그래프이다. 세로 좌표는 60℃ 배양을 100%로 하여 이에 대한 상대 활성을 나타낸다. 가로좌표는 배양 온도이다. SacGGPS는 돌연변이 전의 제라닐제라닐 이인산염 신타아제이다. 다른 것들은 돌연변이 형 효소 각각을 나타낸다. BstFPS는 바실러스 스테아로써모필러스 유래의 파르네실 이인산염 신타아제이다.

도 3은 제라닐 이인산염을 알릴 기질로 사용하는 경우, 돌연변이 프레닐 이인산염 신타아제의 탈인산화 반응 생성물에 대한 박막 크로마토그래피 전개 패턴 사진이다. 도면에서, ori 는 전개 원점이고 s.f.는 용매 앞부분이다.

GOH는 제라니올, FOH는 파르네솔, GGOH는 제라닐 제라니올 및 GFOH는 제라닐파르네솔이고, 이들은 각각 제라닐 이인산염, 파르네실 인산염, 제라닐제라닐 이인산염 및 제라닐파르네실 이인산염의 탈인산화 반응으로부터 생성된다. SacGGPS는 돌연변이 전의 제라닐제라닐 이인산염 신타아제이다. 다른 것들은 각각 돌연변이 효소이다.

프레닐 이인산염 신타아제의 아미노산 서열에는 다섯 개의 보존 영역이 있다고 제안되었다(이형이합체의 경우에 하나의 서브유닛)[A. Chem et al., Protein Science Vol. 3, pp.600-607, 1994]. 다섯 개의 보존 영역 중에서, 영역 II에는 아스파르트산-풍부 도메인 보존 영역 I [DDXX(XX)D](X는 모든 아미노산이고 괄호 안의 두 X는 존재하지 않을 수 있다)이 있다는 것도 알려져 있다. 또한, 영역 V 안에 "DDXXD"로 나타낸 아스파르트산-풍부 도메인이 있더라도, 본 발명의 아미노산 서열의 변형된 영역을 특정화하기 위하여 사용되는 아스파르트산-풍부 도메인은 영역 II에 존재하는 것이며, 영역 V에 존재하는 아스파르트 산-풍부 도메인 II와 비교하여 아스파르트 산-풍부 도메인 I으로 명명된다.

상기와 같이 아스파르트산-풍부 도메인을 갖는 프레닐 이인산염 신타아제로는, 파르네실 이인산염 신타아제, 제라닐제라닐 이인산염 신타아제, 헥사프레닐 이인산염 신타아제, 헵타프레닐 이인산염 신타아제, 옥타프레닐 이인산염 신타아제, 노나프레닐 이인산염 신타아제, 운데카프레닐 이인산염 신타아제 등을 들 수 있다. 더욱 특정한 예로는 바실러스 스테아로써모필러스의 파르네실 이인산염 신타아제, 에스체리키아 콜라이의 파르네실 이인산염 신타아제, 사카로마이스 세레비세아의 파르네실 이인산염 신타아제, 래트의 파르네실 이인산염 신타아제, 인간의 파르네실 이인산염 신타아제, 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)의 제라닐제라닐 이인산염 신타아제, 사카로미스 세라비세아의 헥사프레닐 이인산염 신타아제 등이 포함된다.

이같은 몇가지 예로, 제라닐제라닐 이인산염 신타아제의 아미노산 서열 중 영역 I 내지 V 및 영역 II의 아스파르트산-풍부 도메인 I(박스 내)이 도 1에 나타나있다.

본 발명은 이같은 아스파르트 산-풍부 도메인 I을 갖는 어떤 프레닐 이인산염 신타아제에도 적용 가능하다.

본 발명에 따르면, 프레닐 이인산염 신타아제의 아미노산 서열 중에서, a)영역 II에 존재하는 아스파르트산-풍부 도메인 DDXX(XX)D(이때, X는 모든 아미노산이고, 괄호 안의 두 X는 존재하지 않아도 된다)의 상기 N-말단의 D로부터 N-말단 방향으로 첫 번째 위치에 있는 아미노산 잔기 및 N-말단의 D로부터 N-말단 방향으로 5번째 위치에 있는 아미노산 잔기 사이의 아미노산 잔기, 및 b) 상기 아스파르트산-풍부 도메인의 C-말단의 D로부터 N-말단 방향으로 첫번째 위치에 존재하는 아미노산 잔기에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 다른 아미노산으로 치환하고, 및/또는

상기 아스파르트산-풍부 도메인의 상기 C-말단의 D와 C-말단의 D에서 N-말단 방향으로 첫번째 위치에 존재하는 아미노산 잔기 사이에 하나 이상의 아미노산을 부가적으로 삽입하였다.

본 발명의 돌연변이 프레닐 이인산염 신타아제로는, 천연 프레닐 이인산염 신타아제로 합성한 프레닐 이인산염보다 단쇄인 파르네실 이인산염을 합성할 수 있다.

본 발명에 따르면, 예를 들어, 고도의 호열성 아르카에아, 술포로버스 아시도칼다리어스의 제라닐제라닐 이인산염 신타아제 유전자를 출발 물질로 사용한다. 술포로버스 아시도칼다리어스는 ATCC로부터 입수가능한 ATCC No. 33909를 사용할 수 있다. 유전자의 클로닝 방법은 일본국 미심사 특허 공개 제 7-308193에 상세히 기재되어 있다. 또한, GenBank 등의 유전자 정보 데이터베이스에서 수탁번호 제 D28748호에 개시되어 있다. 이 서열을 사용하여, 본 기술분야에 공지된 통상적인 방법으로 클로닝할 수 있다. 다른 클로닝 예는 실시예 1에 나타내었고, 이의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No:2로 나타난다.

좀더 상세히 하면, 본 발명의 돌연변이 효소는 돌연변이 프레닐 이인산염 신타아제이며, SEQ ID No:1에 나타나는 아미노산 서열을 갖는 제라닐제라닐 이인산염 신타아제에서 77 위치의 페닐알라닌, 78 위치의 트레오닌, 80 위치의 발린, 81 위치의 히스티딘 및 84 위치의 이소류신 중에서 선택되는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고, 및/또는 84 위치의 이소류신 및 85 위치의 메티오닌 사이에 아미노산(들)이 삽입된다.

실시예에 따라, 아미노산이 하기와 같이 치환된 아미노산 서열이 제공된다:

돌연변이 효소 1: 78 위치의 트레오닌을 페닐알라닌으로 치환하고, 81 위치의 히스티딘을 알라닌으로 치환;

돌연변이 효소 2: 78 위치의 트레오닌을 페닐알라닌으로 치환하고, 81 위치의 히스티딘을 류신으로 치환;

돌연변이 효소 3: 77 위치의 페닐알라닌을 티로신으로, 78 위치의 트레오닌을 페닐알라닌으로 치환하고, 81 위치의 히스티딘을 류신으로 치환;

돌연변이 효소 4: 77 위치의 페닐알라닌을 티로신으로, 78 위치의 트레오닌을 페닐알라닌으로 치환하고, 81 위치의 히스티딘을 알라닌으로 치환;

돌연변이 효소 5: 77 위치의 페닐알라닌을 티로신으로, 78 위치의 트레오닌을 세린으로, 80 위치의 발린을 이소류신으로, 84 위치의 이소류신을 류신으로 치환하고, 84위치의 이소류신 및 85 위치의 메티오닌 사이에 프롤린 및 세린을 삽입.

본 발명에 따르면, 돌연변이 프레닐 이인산염 신타아제는 천연 프레닐 이인산염 신타아제의 특성을 갖는다는 것을 알 수 있다. 실시예를 통하여, 상기 5개의 돌연변이 효소는 열에 대한 안정성이 천연 제라닐제라닐 이인산염 신타아제와 거의 비슷하게 나타난다.

본래의 아미노산 서열에 하나 또는 몇 개의 아미노산을 추가, 삭제 및/또는 치환하여 변형시켜도, 때때로 효소는 본래의 효소 활성을 나타낼 수 있다고 알려져 있다. 따라서, 본 발명에는, SEQ ID No:1에 기재된 아미노산 서열과 비교할 때, 하나 또는 몇 개, 예를 들면 5개 이하, 또는 10개 이하의 아미노산을 치환, 삭제 및/또는 추가하여 변형시킨 아미노산 서열을 포함하고 본래의 작용을 할 수 있는 효소가 포함된다.

또한, 본 발명은 다양한 상기 돌연변이 효소를 암호화하는 유전자, 이러한 유전자를 포함하는 벡터, 특히 발현 벡터 및 상기 벡터로 형질 전환된 숙주를 제공한다. 본 발명의 상기 유전자(DNA)는, 예를 들면, SEQ ID No:1과 같은 본래 아미노산 서열을 암호화하는 DNA에 부위-지향적 돌연변이유발(mutagenesis), PCR 등과 같은 다른 통상적인 방법으로 돌연변이화하여, 쉽게 얻을 수 있다.

더욱이, 일단 목적하는 효소의 아미노산 서열이 결정되면, 이를 암호화하는 적당한 뉴클레오티드 서열이 결정되고, 통상적인 DNA 합성법을 통하여 화학적으로 DNA를 합성할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 언급한 바와 같이 DNA를 구성하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 및 이러한 숙주를 사용하여 본 발명의 효소 또는 펩티드을 제조하는 방법을 제공한다.

발현 벡터는 복제부(origin of replication), 발현 조절 서열 등을 포함하지만, 사용된 숙주에 따라 달라질 수 있다. 숙주로는, 원핵 생물, 예를 들면, 에스체리키아 콜라이와 같은 박테리아 및 바실러스 서브틸리스와 같은 바실러스 속 뿐 아니라, 진핵 생물, 예를 들면 효모와 같은 진균류, 예를 들면 사카로미스 세레비세아와 같은 사카로미스 속, 피키아 파스토리스와 같은 피키아 속, 사상 균류, 예를 들면 아스퍼질러스 니거와 같은 아스퍼질러스 속, 동물 세포, 예를 들면 배양된 누에 세포, CHO 세포 등의 고등생물의 배양된 세포를 들 수 있다. 식물도 숙주로 사용가능하다.

실시예에서와 같이, 본 발명에 따라 본 발명의 DNA로 형질전환된 숙주를 배양하는 동안, 파르네실 이인산염이 배양액 안에 축척될 수 있으며, 회수하여 각 파르네실 이인산염을 생산할 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 파르네실 이인산염은 돌연변이형 프레닐 이인산염 신타아제를 기질인 이소펜테닐 이인산염 및 디메틸알릴 이인산염, 제라닐 이인산염과 같은 알릴 기질과 접촉시켜 제조할 수도 있다.

에스체리키아 콜라이를 숙주로 사용하는 경우, DNA로부터 mRNA를 전사하고 mRNA로부터 단백질을 해독하는 단계에서 숙주가 유전자 조절 작용을 하는 것으로 알려져 있다. mRNA 합성을 조절하는 프로모터 서열로서, 자연 발생 서열(예를 들면, lac, trp, bla, lpp, PL, PR, ter, T3, T7 등)뿐 아니라, 이의 돌연변이(예로, lac UV5) 및 자연 발생 프로모터를 인공적으로 융합한 서열(tac, trc 등)이 알려져 있으며, 이를 본 발명에 사용 가능하다.

리보솜 결합 부위의 서열(GGAGG 및 이와 유사한 서열)과 개시 코돈인 ATG 사이의 거리는 중요하다고 알려져 있는데, 이 서열이 mRNA에서 단백질을 합성하는 능력을 조절하기 때문이다. 3'-말단에서 전사를 종결하도록 하는 종결제 [(terminator), 예를 들어, 상업적으로 사용가능한 Pharmacia제의 rrn PT1 T2를 포함하는 벡터]가 재조합에 의한 단백질 합성 효율에 영향을 준다는 것도 잘 알려져 있다.

본 발명의 재조합 벡터를 제조하기 위하여 사용하는 벡터로는, 상업적으로 사용 가능한 벡터를 그대로 사용하거나, 사용목적에 따라 다양한 벡터가 가능하다. 예를 들면, pMB1에서 유래한 레플리콘을 갖는 pBR332, pBR327, pKK223-3, pKK233-3, pTrc99 등; 복사 수를 늘리고자 변환시킨 pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pTV118N, pTV119N, pBluescript, pHSG298, pHSG396 등; 및 p15A에서 유래한 레플리콘을 갖는 pACYC177, pACYC184 등; 또한, pSC101, ColE1, R1, F 인자 등에서 유래한 플라스미드가 가능하다.

또한, pGEX-2T, pGEX-3X, pMal-c2와 같은 정제를 쉽도록 하는 융합 단백질-발현 벡터도 사용가능하다. 본 발명의 출발 물질로 사용되는 유전자 중 하나로는 일본국 미심사 특허 공개 제 7-308193호에 개시된 유전자를 들 수 있다.

또한, 플라스미드 뿐 아니라, λ파지 또는 M13 파지와 같은 바이러스 벡터 또는 트란스포손을 유전자의 형질전환에 사용할 수 있다. 유전자를 에스체리키아 콜라이 이외의 미생물에 도입하는 경우, pUB110(Sigma에서 상업적으로 입수 가능) 또는 pHY300PLK(Takara Shuzo에서 상업적으로 입수 가능)를 사용하여 유전자를 바실러스 속의 생물로 형질전환하는 경우가 알려져 있다. 이같은 벡터는 "분자 클로닝"(J.Sambrook, E.F. Fritsch, and T.Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press) 및 "클로닝 벡터"(P.H. Pouwels, B.E. Enger, Valk, and W.J. Brammar, Elsevier) 및 많은 제조업체의 카탈로그에 기재되어 있다.

적당한 제한 효소 및 리가제를 사용하여 공지의 방법으로, 프레닐 이인산염 신타아제를 암호화하는 DNA 단편과, 필요한 경우 상기 효소의 유전자 발현을 조절하는 DNA 단편을 상기한 벡터 내에 융합(integration)할 수 있다. 이에 사용되는 플라스미드의 구체적인 예로는, pBs-SacGGPS가 있다.

이같은 재조합 벡터를 사용하여 유전자가 직접 도입되는 경우 사용되는 미생물로는, 에스체리키아 콜라이 및 바실러스 속의 미생물이 포함된다. 또한, 이러한 형질 전환은 CaCl2법 및 "분자 클로닝"(J. Sambrook, E.F. Fritsch, 및 T.Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press) 및 "DNA 클로닝" Vol. I 내지 III(D.M.Clover ed., IRL PRESS)에 기재된 프로토플라스트 방법을 통하여 실시할 수 있다.

본 발명의 돌연변이 효소를 제조하기 위하여, 상기와 같이 형질전환된 숙주를 배양한 후, 이 배양물을 염석, 유기 용매로 침강, 겔 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 등을 포함하는 어떤 방법을 실시하여, 상기 효소를 회수하고 정제한다.

또한, 본 발명은, 본 발명의 효소를 사용하여 파르네실 이인산염을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법에 따르면, 본 발명의 효소를 매질, 특히 수용성 매질에서 반응시킨 후, 필요한 경우, 반응 매질로부터 프레닐 이인산염을 회수한다. 효소로는, 정제된 효소 뿐 아니라, 여러 단계에서 반-정제된 크루드 효소나 미생물의 배양된 브로스(broth) 혼합물도 사용가능하다. 이와 달리, 상기 효소, 상기 크루드 효소 또는 이 효소를 포함하는 생성물로부터 통상적인 방법으로 제조한 고정 효소를 사용할 수 있다.

기질로는, 디메틸 알릴 인산염 또는 제라닐 이인산염 및 이소펜테닐 이인산염을 사용할 수 있다. 반응 매질로서, 물 또는 수용성 완충 용액, 예를 들면 Tris 완충 용액 또는 인산염 완충 용액 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 의하여 수득한 프레닐 이인산염의 제조방법에 의하여, 더욱 안정하며, 취급이 쉽고, 프레닐 이인산염을 생산하는, 아르카에아에서 유래한 돌연변이형 프레닐 이인산염 신타아제를 생성할 수 있다. 또한, 여기에 덧붙여 돌연변이 이전의 프레닐 이인산염 신타아제의 특성(예를 들어, 염안정성, 넓은 범위의 pH에서의 안정성)을 가지는, 파르네실 이인산염-제조 돌연변이형 프레닐 이인산염 신타아제를 생성할 가능성이 있다.

본 발명의 청구범위 및 상세한 설명에서, 아미노산 잔기는 단일 문자 코드 또는 세 문자 코드로 표시하였다.

A; Ala; 알라닌

C; Cys; 시스틴

D; Asp; 아스파르트산

E; Glu; 글루탐산

F; Phe; 페닐알라닌

G; Gly; 글리신

H; His; 히스티딘

I; Ile; 이소류신

K; Lys; 리신

L; Leu; 류신

M; Met; 메티오닌

N; Asn; 아스파라긴

P; Pro; 프롤린

Q; Gln; 글루타민

R; Arg; 아르기닌

S; Ser; 세린

T; Thr; 트레오닌

V; Val; 발린

W; Trp; 트립토판

Y; Tyr; 티로신

아미노산 치환은 아미노산의 단일 문자 코드를 사용하여, "치환 전의 아미노산 잔기", "아미노산 잔기의 수" 및 "치환 후의 아미노산 잔기" 순으로 나타내었다. 예를 들면, 81 위치에 있는 티로신 잔기가 메티오닌 잔기로 치환되는 돌연변이는 Y81M으로 나타낸다. 또한, 아미노산 잔기의 삽입은 "삽입전 삽입 부위의 N-말단 측의 아미노산 잔기의 수", "삽입된 아미노산 잔기" 및 "삽입전 삽입 부위의 C-말단 측의 아미노산 잔기의 수"에 의하여 표현하였다. 예를 들어, 알라닌을 84 위치의 아미노산과 85 위치의 아미노산 사이에 삽입하는 경우에는 84A85로 나타낸다.

실시예

본 발명을 하기에 특정한 예를 들어 설명하나, 본 발명이 이에 제한되지는 않는다.

실시예 1: 제라닐제라닐 이인산염 신타아제의 유전자를 함유하는 플라스미드 구조물

술폴로부스 아시도칼다리우스 (Sulfolobus acidocaldarius)에서 유래한 제라닐제라닐 이인산염 신타아제의 유전자(이하, SacGGPS라 칭함)를 Toyoboseki로부터 상업적으로 입수 가능한 플라스미드 벡터 pBluescript II (KS+)의 HindIII 부위에서 서브클론하였다. 플라스미드 DNA로는 pBs-SacGGPS를 선정하였다. SacGGPS 유전자는 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli) DH5α(pGGPS1) 으로부터 얻을 수 있으며, 이는 1994년 1월 31일, 일본, 이바라끼의 산업 과학 및 기술청(Agency of Industrial Science and Technology)인 생과학 및 인간-기술 국립 연구소(the National Institute of Bioscience and Human-Technology)에 국제적으로 기탁되었으며, 수탁번호는 FERM BP-4982이다.

또한, SacGGPS 유전자의 뉴클레오티드 서열 전체가 일본국 특허 공개 No. 7-308193 및 문헌[Shin-ichi Ohnuma et al.,(1994) The Journal of Biological Chemistry Vol. 269:14792-14797] 또는 진뱅크(GenBank)와 같은 유전정보 데이터 은행에 수탁 번호 D28748로 개시되어 있다. 술폴로부스 아시도칼다리우스는 또한 ATCC 등과 같은 다양한 미생물 기탁기관으로부터 입수 가능하며(ATCC No.3909로서 ), SacGGPS 유전자 영역의 DNA는 통상의 유전자 클로닝 방법으로 얻을 수 있다. 실시예 2: 돌연변이 도입을 위한 올리고뉴클레오티드의 합성

제라닐제라닐 이인산염 신타아제 유전자에 돌연변이를 도입하기 위하여, 하기의 올리고뉴클레오티드를 설계하여, 합성하였다:

프리머 DNA (T78F, H81A):

5'-CATACTTTTTTCCTTGTGGCTGATGATATCATGGATC-3'(SEQ ID No: 3)

프리머 DNA (T78F, H81L)

5'-CATACTTTTTTCCTTGTGCTTGATGATATCATGGATC-3'(SEQ ID No: 4)

프리머 DNA (F77Y, T78F, H81L)

5'-CATACTTATTTCCTTGTGCTTGATGATATCATGGATC-3'(SEQ ID No: 5)

프리머 DNA (F77Y, T78F, H81A)

5'-CATACTTATTTCCTTGTGGCTGATGATATCATGGATC-3'(SEQ ID No: 6)

프리머 DNA (F77Y, T78S, V80I, I84L, 84PS85)

5'-GTTCTTCATACTTATTCGCTTATTCATGATAGTATT-3'(SEQ ID No: 7), 및

5'-ATTCATGATGATCTTCCATCGATGGATCAAGAT-3'(SEQ ID No: 8)

두가지 뉴클레오티드를 사용하여, 돌연변이를 도입하였다(F77Y, T78S, V80I, I84L, 84PS85). 우선, 실시예 3에 기재된 바와 같이 올리고뉴클레오티드

5'-GTTCTTCATACTTATTCGCTTATTCATGATAGTATT-3'(SEQ ID No: 7)

를 사용하여 돌연변이를 도입하고, 실시예 4에 따라 형질전환체 (transformant)를 제조하였다. 또한, 올리고뉴클레오티드

5'-ATTCATGATGATCTTCCATCGATGGATCAAGAT-3'(SEQ ID No: 8)

를 사용하여 얻은 플라스미드로 돌연변이를 도입하였다.

이러한 뉴클레오티드는 SacGGPS 중에서 77 위치의 페닐알라닌, 78 위치의 트레오닌, 80 위치의 발린, 81 위치의 히스티딘 및 84 위치의 이소류신에서 선택된 적어도 하나의 아미노산 잔기를 암호화하는 코돈 내에 돌연변이를 가진다. 84 위치의 이소류신과 85 위치의 메티오닌 사이에 삽입될 아미노산을 엔코딩하는 코돈을 도입하는 것 이외에도, 제한효소 BspHI의 분리부위(cleavage site) (5'TGATGA3'), 제한효소 EcoRV의 분리부위(5'GATATC3') 또는 제한효소 ClaI의 분리부위 (5'ATCGAT3')를 새로이 도입하기 위하여 설계된다. BspHI의 분리부위를 도입하는 데 있어서, SacGGPS 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열은 코돈의 변성에 의해서 변화되지 않는, 돌연변이의 도입을 위한 부위이다. SacGGPS 유전자로 치환하여 돌연변이를 도입하는 동시에 새로운 제한효소의 분리 부위가 생성되므로, 이를 이용하여, 적당한 제한 효소로 소화시킨 후, 아가로즈 겔 전기영동하는 방법으로 치환-돌연변이된 플라스미드를 검출한다.

하기의 반응 매질 중에서 이들 프리머 DNA를 37℃에서 30분간 인산화 반응시킨 후, 70℃에서 10분간 변성시킨다:

10pmol/㎕ 프리머 DNA 2㎕

10 x 키네이션 완충용액 1㎕

10mM ATP 1㎕

H2O 5㎕

T4 폴리뉴클레오티드 키나제 1㎕

여기에서, 10 x 키네이션 완충용액은 1000mM Tris-Cl(pH 8.0), 100mM MgCl2 및 70mM DTT이다.

실시예 3: SacGGPSS 유전자의 치환 돌연변이의 도입

쿤켈법(Kunkel method)에 따라, 실시예 2에서 구성된 각각의 프리머 DNA를 사용하여 실시예 1에서 제조된 플라스미드에 치환 돌연변이를 도입하였다. 쿤켈법을 실시하는 데는 뮤탄-K 키트(Mutan-K kit, 상업적으로 입수가능, Takara Shuzo)가 사용된다. 실험 방법은 키트에 첨부된 설명서에 기재되어 있다. 플라스미드의 치환 돌연변이가 쿤켈법에 의해서만 실시될 수 있는 것은 아니다. 예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용한 방법에 의해서도 동일한 결과를 얻을 수 있다.

숙주세포로서 뮤탄-K 키트의 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli) CJ236를 사용하여, 플라스미드 pBS-SacGGPS의 티민 염기가 데옥시우라실 염기로 치환된 단일 가닥 DNA를 얻었다.

이렇게 얻어진 단일 가닥 DNA를 반응에서 주형으로 사용하며, 상보 가닥 합성을 위한 프리머 DNA를 하기의 반응 용액에서 65℃, 15분간 처리한 후, 37℃에서 15분간 정치하여 어닐링시켰다:

단일 가닥 DNA 0.6pmol

어닐링 완충용액 1㎕

프리머 DNA 용액(실시예 2) 1㎕

H2O를 사용하여 최종 부피가 10㎕가 되도록 한다.

여기서, 어닐링 완충용액은 200mM Tris-Cl(pH 8.0), 100mM MgCl2, 500mM NaCl 및 10mM DTT이다.

또한, 연장(elongation) 완충용액 25㎕, 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli) DNA 리가제 60 유닛 및 T4 DNA 폴리머라제 1 유닛을 첨가하여, 25℃에서 2시간 동안 상보 가닥을 합성하였다. 연장 완충용액은 50mM Tris-Cl(pH 8.0), 60mM 암모늄 아세테이트, 5mM MgCl2, 5Mm DTT, 1mM NAD 및 0.5mM dNTP이다.

반응이 종료된 후에, 여기에 0.2M EDTA (pH 8.0) 3㎕를 가하고, 65℃에서 5분동안 처리하여, 반응을 종결시켰다.

실시예 4 : SacGGPS 유전자로 치환 돌연변이가 도입된 유전자를 가진 재조합 구조물

실시예 3에 따라 구성된 DNA 용액을 사용하여, CaCl2법으로 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli) XL1-Blue를 형질전환시켰다. 전기영동과 같은 다른 방법을 사용하여도 유사한 결과가 나타난다. 에스체리키아 콜라이 XL1-Blue 이외의 숙주세포, 예를 들어, JM109 등에서도 유사한 결과가 얻어진다.

CaCl2법에 의해 얻어진 형질전환체(transformant)를 암피실린, 형질전환체의 선택성 표지를 함유하는 아가 플레이트에 플레이트하고, 37℃에서 밤새 배양하였다.

상기에서 얻어진 형질전환체 중에서, BspHI, EcoRV 또는 ClaI의 분리부위를 갖는 치환-돌연변이 pBs-SacGGPS 플라스미드가 선택되었다. 선택된 치환 돌연변이 pBs-SacGGPS 플라스미드의 SacGGPS 유전자의 돌연변이를 진행하는 아미노산 잔기에 해당하는 코돈 주위의 뉴클레오티드 서열은 디데옥시법으로 결정하였다. 그 결과, 하기 5개의 돌연변이 SacGGPS 유전자를 함유하는 pBs-SacGGPS 플라스미드를 얻었다. 77 위치의 아미노산으로부터 85 위치의 아미노산까지 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 하기에 나타내었다.:

돌연변이 뉴클레오티드 서열

T77F, H81A : 5'-TTTTTCCTTGTGGCTGATGATATCATG-3' (SEQ ID No: 9)

T78F, H81L : 5'-TTTTTCCTTGTGCTTGATGATATCATG-3' (SEQ ID No: 10)

F77Y, T78F, H81L : 5'-TATTTCCTTGTGCTTGATGATATCATG-3' (SEQ ID No: 11)

F77Y, T78F, H81A : 5'-TATTTCCTTGTGGCTGATGATATCATG-3' (SEQ ID No: 12)

F77Y, T78S, V80I, I84L, 84PS85 :

5'-TATTCGCTTATTCATGATGATCTTCCATCGATG-3' (SEQ ID No: 13)

와일드 형: 5'-TTTACGCTTGTGCATGATGATATTATG-3' (SEQ ID No: 14)

실시예 5 : 돌연변이 프레닐 이인산염 신타아제의 활성 측정

실시예 4에서 얻어진 다섯 개의 돌연변이 SacGGPS 유전자 및 하나의 와일드형 SacGGPS 유전자를 함유하는 6개의 형질전환체로부터 하기와 같이, 효소 조용액을 제조하였다.

2 x LB 매질에서 밤새 배양한 형질전환체를 원심분리하여 세포를 수확한 후, 세포를 균질화하기 위해 완충용액[50mM 칼슘 인산염 완충용액(pH 5.8), 10mM β-멀캅토에탄올, 1mM EDTA]에 현탁시켰다. 음파처리하여 균질화 한 후, 4℃, 10,000 r.p.m.에서 10분간 원심분리하였다. 이 현탁액을 55℃에서 12분간 처리하여, 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli)에서 유래한 프레닐 디포스페이트 신타아제를 불활성화시켰다. 이를 동일한 조건 하에서 더욱 원심분리하여 얻은 상청액을 효소 조추출액으로 사용하였다. 열 안정성을 조사할 때, 효소 추출물은 60℃, 70℃ 또는 80℃(바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus)에서 유래한 효소에 대해서는 60℃, 65℃, 67℃ 또는 70℃)에서 반응 전 1시간 동안 배양하였다. 하기 반응 용액 중에서 55℃에서 15분 동안 반응시켰다.

[1-14C]-isopentenyl diphosphate (1Ci/mol) 25nmol

알릴 이인산염 (제라닐 이인산염) 25nmol

칼륨 인산염 완충용액 (pH 5.8) 10mM

MgCl2 5mM

효소 용액 100㎍

H2O을 사용하여 200㎕가 되도록 한다.

반응이 종료된 후에, 200㎕의 포화 NaCl을 반응용액에 가하고, 여기에 1ml의 물-포화 부탄올을 가한후, 흔들고, 원심분리하여 두 개의 상으로 분리하였다. 얻어진 부탄올층 800㎕에 액상 신틸레이터 3ml를 가하여, 신틸레이션 카운터로 방사능을 측정하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

돌연변이 프레닐 이인산염 신타아제는 본래의 제라닐제라닐 이인산염 신타아제와 동일한 열안정성을 나타내며, 바실러스 스테아로써모필러스에서 유래한 파르네실 이인산염 신타아제보다 열안정성이 높았다.

부탄올 층의 나머지를 가열하여 0.5ml로 농축하면서, 질소 가스로 세정하여, 용매를 증발시켰다. 이 농축물에 메탄올 2ml 및 감자 산 포스페타제 용액[2mg/ml 감자 산 포스페타제, 0.5M 아세트산 나트륨(pH 4.7)] 1ml를 가하여, 37℃에서 탈인산화 반응시켰다. 그 결과로 탈인산화된 반응 생성물을 n-펜탄 3ml로 추출하였다.

질소 가스로 세정하여 용매를 증발시켜 농축한 후, TLC(역상 TLC 플래이트:LK18(Whatman), 전개용매: 아세톤/물=9/1)로 분석하였다. 전개된 탈인산화 반응 생성물을 생물 이미지 분석기(Bio Image Analyzer BAS2000, 후지 포토 필름사 제)를 사용하여 분석하여, 방사능 위치를 결정하였다. 제라닐 이인산염을 알릴 기질로 사용한 경우의 결과를 도 3에 나타내었다.

돌연변이 프레닐 이인산염 신타아제의 반응생성물로 파르네실 이인산염이 나타났다.

서열 목록

SEQ ID No : 1

길이 :330

형태 : 아미노산

위상 : 선형

분자형태 : 단백질

공급원:

생물: 술폴로부스 아시도칼다리우스 (Sulfolobus acidocaldarius)

종 : ATCC 33909

특징:

특징 요소 : Asp가 풍부한 도메인

위치 : 82-86

SEQ ID No : 2

길이 : 993

형태 : 핵산

가닥 : 이중

위상 : 선형

분자형태 : 게놈 DNA

공급원:

생물: 술폴로부스 아시도칼다리우스 (Sulfolobus acidocaldarius)

종 : ATCC 33909

특징: 특징 요소 : Asp가 풍부한 도메인 코딩

위치 : 246-258

SEQ ID No : 3

길이 :37

형태 : 핵산

가닥 : 단일

위상 : 선형

분자형태 : 합성 DNA

서열 내용:

CATACTTTTT TCCTTGTGGC TGATGATATC ATGGATC

SEQ ID No : 4

길이 :37

형태 : 핵산

가닥 : 단일

위상 : 선형

분자형태 : 합성 DNA

서열 내용:

CATACTTTTT TCCTTGTGCT TGATGATATC ATGGATC

SEQ ID No : 5

길이 :37

형태 : 핵산

가닥 : 단일

위상 : 선형

분자형태 : 합성 DNA

서열 내용:

CATACTTATT TCCTTGTGCT TGATGATATC ATGGATC

SEQ ID No : 6

길이 :37

형태 : 핵산

가닥 : 단일

위상 : 선형

분자형태 : 합성 DNA

서열 내용:

CATACTTATT TCCTTGTGGC TGATGATATC ATGGATC

SEQ ID No : 7

길이 :36

형태 : 핵산

가닥 : 단일

위상 : 선형

분자형태 : 합성 DNA

서열 내용:

GTTCTTCATA CTTATTCGCT TATTCATGAT AGTATT

SEQ ID No : 8

길이 :33

형태 : 핵산

가닥 : 단일

위상 : 선형

분자형태 : 합성 DNA

서열 내용:

ATTCATGATG ATCTTCCATC GATGGTCAA GAT

SEQ ID No : 9

길이 :27

형태 : 핵산

가닥 : 단일

위상 : 선형

분자형태 :

서열 내용:

TTTTTCCTTG TGGCTGATGA TATCATG

SEQ ID No : 10

길이 :27

형태 : 핵산

가닥 : 단일

위상 : 선형

분자형태 :

서열 내용:

TTTTTCCTTG TGCTTGATGA TATCATG

SEQ ID No : 11

길이 :27

형태 : 핵산

가닥 : 단일

위상 : 선형

분자형태 :

서열 내용:

TATTTCCTTG TGCTTGATGA TATCATG

SEQ ID No : 12

길이 :27

형태 : 핵산

가닥 : 단일

위상 : 선형

분자형태 :

서열 내용:

TATTTCCTTG TGGCTGATGA TATCATG

SEQ ID No : 13

길이 :33

형태 : 핵산

가닥 : 단일

위상 : 선형

분자형태 :

서열 내용:

TATTCGCTTA TTCATGATGA TCTTCCATCG ATG

SEQ ID No : 14

길이 :27

형태 : 핵산

가닥 : 단일

위상 : 선형

분자형태 :

서열 내용:

TTTACGCTTG TGCATGATGA TATTATG

본 발명에 의하면 원래의 효소에 의해서 합성되는 것보다 짧은 프레닐 이인산염을 합성할 수 있는 돌연변이 프레닐 이인산염 신타아제를 얻을 수 있다.

Claims

SEQ ID No: 1에 기재된 제라닐제라닐 이인산염 신타아제 중의 77 위치의 페닐알라닌, 78 위치의 트레오닌, 80 위치의 발린, 81 위치의 히스티딘 및 84 위치의 이소류신 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되거나, 또는 84 위치의 이소류신과 85 위치의 메티오닌 사이에 하나 이상의 아미노산이 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 돌연변이 프레닐 이인산염 신타아제.
제 1 항에 있어서,

반응생성물이 파르네실 이인산염인 것을 특징으로 하는 돌연변이 프레닐 이인산염 신타아제.
제 1 항에 있어서,

돌연변이 이전의 프레닐 이인산염 신타아제가 가지는 열안정성을 보유하고 있는 것을 특징으로 하는 돌연변이 프레닐 이인산염 신타아제.
제 1 항에 있어서,

열안정성 효소임을 특징으로 하는 돌연변이 프레닐 이인산염 신타아제.
제 1 항에 있어서,

SEQ ID No: 1에 기재된 제라닐제라닐 이인산염 신타아제 중의 77 위치의 페닐알라닌, 78 위치의 트레오닌, 80 위치의 발린, 81 위치의 히스티딘 및 84 위치의 이소류신 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되거나, 및/또는 84 위치의 이소류신과 85 위치의 메티오닌 사이에 두 개의 아미노산이 삽입되어 있는 돌연변이 프레닐 이인산염 신타아제로서, 77 위치의 페닐알라닌이 티로신으로 치환되거나, 78 위치의 트레오닌이 페닐알라닌 또는 세린으로 치환되거나, 80 위치의 발린이 이소류신으로 치환되거나, 81 위치의 히스티딘이 류신 또는 알라닌으로 치환되거나, 84 위치의 이소류신이 류신으로 치환되거나; 프롤린 및 세린이 84 위치의 이소류신 및 85 위치의 메티오닌 사이에 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 돌연변이 프레닐 이인산염 신타아제.
제 1 항 내지 제 5 항 중의 어느 한 항에 따른 효소를 암호화하는 DNA.
제 6 항에 따른 DNA로부터 전사된 RNA.
제 6 항에 따른 DNA를 포함하여 이루어지는 재조합 벡터.
제 8 항에 따른 재조합 벡터를 사용하여 형질전환된 숙주 생물로서, 상기 숙주 생물이 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 효모, 사카로미스 세레비세아(Saccharomyces cerevisiae), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 배양된 누에세포 및 CHO 세포로 이루어진 그룹에서 선택된 것임을 특징으로 하는 형질전환된 숙주 생물.
제 9 항에 따른 숙주를 배양하는 단계 및 배양물로부터 발현 생성물을 수확하는 단계를 포함하여 이루어지는 제 1 항 내지 제 5 항 중의 어느 한 항에 따른 돌연변이 프레닐 이인산염 신타아제의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중의 어느 한 항에 따른 효소 또는 제 10 항에 따른 방법에 의해서 제조된 효소를 이소펜테닐 이인산염, 디메틸알릴 이인산염 및 제라닐 이인산염으로 구성된 군에서 선택된 기질과 접촉시키는 단계를 포함하여 이루어지는 탄소수가 15이하인 프레닐 이인산염의 제조방법.