JP3536594B2 - プレニル二リン酸合成酵素遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、プレニル二リン酸
合成酵素のペプチドおよび活性型のプレニル二リン酸合
成酵素の製造方法、該酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮ
Ａを含む組換えベクター並びに該組換えベクターによっ
て形質転換された形質転換体に関する。

【０００２】

【従来の技術】細菌から高等真核生物にいたるまで、天
然物中には非常に多様なイソプレノイド化合物が見い出
されている。例えば、ステロイド、カロテノイド、糖キ
ャリアーであるポリプレノール、キノン類、イソペンテ
ニルアデニンで修飾されたｔＲＮＡ、プレニル化蛋白質
等がそれである。これらのイソプレノイド化合物は、い
ずれもプレニル二リン酸合成酵素により生成したプレニ
ル二リン酸を中間体として生合成されている（図１）。

【０００３】プレニル二リン酸合成酵素とは、プレニル
二リン酸（アリル性プライマー）と３−イソペンテニル
二リン酸（ＩＰＰ）を重合的に縮合する反応を触媒し、
ポリプレニル二リン酸を生成物とする酵素の総称であ
る。

【０００４】また、プレニル二リン酸合成酵素には、Ｉ
ＰＰの縮合の度に形成される二重結合がＥ型をとる縮合
反応を触媒する酵素と、Ｚ型となる縮合反応を触媒する
酵素がある。さらに、プレニル二リン酸合成酵素は各々
の酵素により生成できる最大のイソプレン鎖長が決まっ
ている。そして、生成物のイソプレン鎖長に応じ生成物
の疎水性が変化するので、酵素活性の発現様式には大き
な違いがある。この発現様式の違いから細菌の酵素につ
いて比較すると、プレニル二リン酸合成酵素は以下の４
つに分類される。

【０００５】(1) プレニル二リン酸合成酵素Ｉ（Ｅ型短
鎖プレニル二リン酸合成酵素） ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）合成酵素（Sagami,H.
et al.,(1978) Biochem.Biophys. Res.Commun.,85,57
5.) （Ｃ₅ →Ｃ₁₀） ここで、「Ｃ₅ →Ｃ₁₀」とは、炭素数５の化合物から炭
素数10の化合物への合成を触媒することを意味する（以
下同様である）。

【０００６】 ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）合成
酵素 (Takahashi,I.and Ogura,K.(1981) J.Biochem.,8
9,1581; Fujisaki,S.et al.,(1986) J.Biochem.,99,132
7.)（Ｃ₅ →Ｃ₁₅） ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）合成酵素(T
akahashi,I.and Ogura,K.(1982) J.Biochem.,92,1527.
； Sagami,H.and Ogura,K.(1981) J.Biochem.,89,157
3.) （Ｃ₅ →Ｃ₂₀） (2) プレニル二リン酸合成酵素II（Ｅ型中鎖プレニル二
リン酸合成酵素） ヘキサプレニル二リン酸（ＨexＰＰ）合成酵素（Fu
jii,H.,et al.,(1982)J.Biol.Chem.,257,14610.) （Ｃ
₁₅→Ｃ₃₀） ヘプタプレニル二リン酸（ＨepＰＰ）合成酵素（Ta
kahashi,I.et al.,(1980) J.Biochem.,255,4539.) （Ｃ
₁₅→Ｃ₃₅）

【０００７】(3) プレニル二リン酸合成酵素III （Ｅ型
長鎖プレニル二リン酸合成酵素） オクタプレニル二リン酸（ＯctＰＰ）合成酵素（Fu
jisaki,S.et al.,(1986) J.Biochem.,99,1327.）（Ｃ₁₅
→Ｃ₄₀） ノナプレニル二リン酸（ＮonＰＰ）合成酵素（Saga
mi,H. et al.,(1977)Biochemistry,16,4616.)（Ｃ₁₀→
Ｃ₄₅） デカプレニル二リン酸（ＤecＰＰ）合成酵素（Ishii,K.
et al.,(1983) Biochem.Biophys.Res.Commun.,116,50
0.)（Ｃ₁₅→Ｃ₅₀）

【０００８】(4) プレニル二リン酸合成酵素IV（Ｚ型長
鎖プレニル二リン酸合成酵素） Ｚ−ノナプレニル二リン酸合成酵素 (Ishii,K. et
al.,(1986) Biochem,J.,233,773.) （Ｃ₁₅⇒Ｃ₄₅） ウンデカプレニル二リン酸（ＵＰＰ）合成酵素 (Ta
kahashi,I.and Ogura,K.(1982) J.Biochem.,92,1527.;
Keenman,M.V.and Allen,C.M.(1974) Arch.Biochem.Biop
hys.,161,375.)（Ｃ₁₅⇒Ｃ₅₅） デヒドロドリキル二リン酸（deＤolＰＰ）合成酵素
(Sagami,H. et al.,(1989) Biochem.Biophys.Acta,100
2,218.) （Ｃ₁₅⇒Ｃ₈₅〜₁₀₅ )

【０００９】プレニル二リン酸合成酵素Ｉは、３−イソ
ペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）の異性化により生じるジ
メチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）をアリル性プライ
マーとしてＩＰＰを順次縮合し、炭素数20以下の、短鎖
の全Ｅ型プレニル二リン酸を合成し、生成物は、ステロ
イドやカロテノイド、プレニル化タンパクの前駆体とな
る。また、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、ファルネシル
二リン酸（ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧ
ＰＰ）は、中、長鎖のプレニル二リン酸合成酵素のアリ
ル性プライマー基質にもなる。

【００１０】プレニル二リン酸合成酵素IIには、ヘキサ
プレニル二リン酸合成酵素（ＨexＰＳ）と、ヘプタプレ
ニル二リン酸合成酵素（ＨepＰＳ）が属する。これら
は、いずれもＤＭＡＰＰやＧＰＰをプライマーとせず、
ＦＰＰをアリル性プライマーとして、それぞれヘキサプ
レニル、ヘプタプレニル二リン酸を合成する。生成物は
疎水性が高く、これらの酵素を持つ生物のメナキノン、
ユビキノンの側鎖の前駆体である。このプレニルキノン
は、呼吸鎖あるいは光合成における電子伝達系で重要な
役割を果たしている。

【００１１】また、プレニル二リン酸合成酵素IIは、い
ずれも２種類の必須タンパク質から成る酵素であり、こ
れらの酵素はそれぞれ単独のタンパク質では触媒活性を
持たない。しかし、上記酵素は基質の存在下では会合し
て触媒機能を発現する特徴を有し (Yoshida,I.et al.,
(1989)Biochem.Biophys.Res.Commun.,160,448.)、この
点で他のプレニル二リン酸合成酵素と大きく異なる。

【００１２】ところで、プレニル二リン酸合成酵素IIを
産生する微生物としては、ミクロコッカス・ルテウス
（Micrococcus luteus) 及びバチルス・ズブチリス（Ba
cillussubtilis)等が知られている（Fujii,H. et al.(1
982)J.Biol.Chem.,257,14610;Takahashi,I. et al.,(19
80)J.Biol.Chem.,255,4539) 。そして、ミクロコッカス
・ルテウスB-P 26のＨexＰＳの２つの成分をそれぞれ成
分Ａおよび成分Ｂとし、バチルス・ズブチリスのＨepＰ
Ｓのそれらを成分Ｉ、IIとすると、次のことが明らかに
されている。

【００１３】ａ）成分Ａ及び成分Ｉは熱安定性が比較的
高いが、成分Ｂ及び成分IIは常温細菌由来の他の酵素と
同程度の熱安定性しかない（Fujii,H.,et al.,(1982)
J.Biol.Chem.,257,14610.) 。

【００１４】ｂ）成分Ａと成分Ｉには互換性がない。即
ち、成分Ａと成分IIとの組合せや成分Ｉと成分Ｂとの組
み合わせでは酵素活性を発現しない（Fujii,H.et al.,
(1983) FEBS Lett.,161,257. ）。

【００１５】ｃ）成分Ｂと成分IIは、ＳＨ試薬及びアル
ギニン特異的試薬によって酵素活性が著しく低下する
が、成分Ａと成分Ｉはこれらの試薬の影響を受けない
(Yoshida,I.,et al.,(1989)Biochem.Biophys.Acta,995,
138.)。

【００１６】プレニル二リン酸合成酵素IIIには、オク
タプレニル二リン酸合成酵素（ＯctＰＳ）とノナプレニ
ル二リン酸合成酵素（ＮonＰＳ）等が属する。これらは
プレニル二リン酸合成酵素Ｉと同様に、同一のサブユニ
ットから成る二量体タンパク質であり、それ自体で触媒
活性を示すが、触媒のターンオーバーを維持するため
に、疎水性の生成物を酵素の活性部位から除去するタン
パク性の因子を必要とする（Ohnuma,S.,et al.,(1991)
J.Biol.Chem.,266,23706.)。この活性化因子には互換性
があり、プレニル二リン酸合成酵素IIIに属する酵素の
いずれに対しても活性化作用を示す (Ohnuma,S.,et a
l.,(1991) J.Biol.Chem.,266,23706.)。

【００１７】プレニル二リン酸合成酵素IVに属する酵素
は、短鎖のプレニル二リン酸（ＧＰＰ，ＦＰＰ）をプラ
イマー基質として、ＩＰＰをＺ型に縮合してＥとＺとの
混合型のポリプレニル二リン酸を合成する。細菌のウン
デカプレニル二リン酸合成酵素（ＵＰＳ）や、真核生物
のデヒドロドリキル二リン酸合成酵素（deＤolＰＳ）が
これに当たる。これらの多くは膜結合タンパク質で、界
面活性剤等で可溶化するとほとんどの場合、活性の発現
にTriton X-100等の界面活性剤の添加が必要である (Ta
kahashi,I and Ogura,K.(1982)J.Biochem.,92,1527; Al
len,C.M.and Muth,J.D.(1977) Biochemistry,16,290
8.)。また、プレニル二リン酸合成酵素IIIに共通する活
性化因子は、ＵＰＳに対しては無効である。このこと
は、膜の疎水的環境が酵素活性発現に必須であるためと
考えられる。

【００１８】これらの知見の多くは、細胞破砕液から抽
出、精製された酵素を用いた実験により得られたもので
あり、より詳細な酵素反応機構を解明するためには、タ
ンパク質の一次構造のみならず、結晶構造等も解析しな
ければならない。そのためにも、これらの酵素タンパク
質をコードする遺伝子のクローニングは必須である。

【００１９】実際に、最近ＦＰＳやＧＧＰＳをはじめと
するプレニル二リン酸合成酵素遺伝子が次々とクローニ
ングされている（ＦＰＰ合成酵素：Koyama,T.et al.,(1
993)J.Biochem.,113,355.; Fujisaki,S.et al.,(1990)
J.Biochem.,108,995.; Anderson,M,A.,et al.,(1989)
J.Biol.Chem.,264,19176.; Clarke,C.F.,et al.,(1987)
Mol.Cell.Bio.,7,3138.; Wilkin,D.J.et al.,(1990)
J.Biol.Chem.,265,4607.;ＧＧＰＰ合成酵素： Carattol
i,A.,et al.,(1991) J.Biol.Chem.,266,5854.;Armstron
g,G.A.et al.,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87,997
5.; Math,S.K.etal.,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,8
9,6761.; Misawa,N.et al.,(1990) J.Bacteriol.,172,6
704.）。また、ＨexＰＰ合成酵素については、酵母にお
ける相補性実験により２つの成分のうち１つ（成分Ｂに
相当する）をコードする遺伝子がクローニングされてい
る。しかし、前述のごとく本酵素の活性の発現には２つ
の成分が必要である。従って、活性型酵素をコードする
遺伝子の完全なクローニングがなされたわけではない
（ＨexＰＰ合成酵素：Ashby,M.M.and Edwards,P.A.(199
0) J.Biol.Chem.,265,13157.) 。

【００２０】本発明者は、前記各酵素について、遺伝子
の塩基配列に基づく一次構造を比較した。その結果、プ
レニル二リン酸合成酵素には、鎖長や生物種間を超えて
アミノ酸配列が比較的保存された７つの領域があること
が明らかとなった（Koyama,T. et al.,J.Biochem.113,3
55-363(1993)）。これらの領域は、本質的に同じ反応を
触媒する酵素に保存されていることから触媒機能に重要
な役割を持っていると考えられる。一方、非保存領域に
は、鎖長を規定する部分や酵素機能発現様式の違いに関
わる部分が存在すると予想される。しかし、その存在を
一次構造上の比較により見出すには、鎖長の異なるプレ
ニル二リン酸合成酵素についてクローニングされている
遺伝子の種類が少ないのが現状である。

【００２１】また、機能発現様式に注目した場合、前述
の通り、プレニル二リン酸合成酵素IIに属する酵素は、
他のプレニル二リン酸合成酵素と大きく異なり、単独で
は触媒機能を持たないが、基質が存在すると、会合し
て、触媒機能を発現する２つのタンパク質（ヘテロダイ
マー型）から成るという特徴がある。

【００２２】このようなヘテロダイマー型プレニル二リ
ン酸合成酵素により合成される物質は、ビタミンＫ、ユ
ビキノンといった生体内で普遍的に存在する物質の前駆
体であり、重要な生理活性物質であることから応用価値
が高い。さらに、ヘテロダイマー型プレニル二リン酸合
成酵素により生成するプレニル二リン酸は、その鎖長お
よび構造異性体が厳密に制御される点で工業的に極めて
有用であるため、大量に発現させることのニーズがあ
る。従って、プレニル二リン酸合成酵素IIに属する２つ
のタンパク質をコードする遺伝子を単離し、別個に発現
させることにより、タンパク質を大量生産することが望
まれる。

【００２３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、プレニル二
リン酸合成酵素のペプチドおよび活性型のプレニル二リ
ン酸合成酵素の製造方法、該酵素をコードするＤＮＡ、
該ＤＮＡを含む組換えベクター並びに該組換えベクター
によって形質転換された形質転換体を提供することを目
的とする。

【００２４】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
基づいて鋭意研究を行った結果、ミクロコッカス・ルテ
ウスからプレニル二リン酸合成酵素の遺伝子をクローニ
ングすることに成功し、また、プレニル二リン酸合成酵
素の各サブユニットのペプチドを混合することにより活
性型のプレニル二リン酸合成酵素を製造することに成功
し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、
プレニル二リン酸合成酵素のサブユニット（Ａ）のポリ
ペプチドおよびサブユニット（Ｂ）のポリペプチドから
選ぶポリペプチドをコードするＤＮＡである。サブユニ
ット（Ａ）及び（Ｂ）は、ヘテロダイマーを形成してプ
レニル二リン酸合成酵素活性を発現する２種類のポリペ
プチド鎖であり、そのうちサブユニット（Ｂ）はプレニ
ルトランスフェラーゼに特徴的なアミノ酸配列を有する
ものである。

【００２５】サブユニット（Ａ）のポリペプチドとして
は実質的に配列番号１のアミノ酸配列を表すものが挙げ
られ、およびサブユニット（Ｂ）のポリペプチドとして
は実質的に配列番号２のアミノ酸配列を表すものが挙げ
られる。また、前記サブユニット（Ａ）のポリペプチド
をコードするＤＮＡとしては配列番号３で表されるもの
が挙げられ、サブユニット（Ｂ）のポリペプチドをコー
ドするＤＮＡとしては配列番号４で表されるものが挙げ
られる。

【００２６】ここで、「実質的に」とは、サブユニット
（Ａ）のポリペプチドおよびサブユニット（Ｂ）のポリ
ペプチドから選ぶポリペプチドがプレニル二リン酸を合
成する活性を有する限り、当該ポリペプチドに含まれる
アミノ酸配列に欠失、置換、挿入等の変異が生じてもよ
いことを意味する。

【００２７】従って、例えば配列番号１のアミノ酸配列
に含まれる第１番目のメチオニン（Met)が欠失している
ものなども、このアミノ酸配列の変化によるポリペプチ
ドに含まれる。また、当該ポリペプチドに含まれるアミ
ノ酸をコードする塩基配列のほか、縮重コドンにおいて
のみ異なる同一のポリペプチドをコードする縮重異性体
も本発明のＤＮＡに含まれる。

【００２８】さらに、本発明は、前記ＤＮＡを含む組換
えベクターである。さらに、本発明は、前記組換えベク
ターで宿主生物を形質転換して得られる形質転換体であ
る。さらに、本発明は、前記形質転換体を培地中で培養
し、培養物中にサブユニット（Ａ）のポリペプチドおよ
び／またはサブユニット（Ｂ）のポリペプチドを蓄積せ
しめ該ポリペプチドを採取することを特徴とするサブユ
ニット（Ａ）のポリペプチドおよび／またはサブユニッ
ト（Ｂ）のポリペプチドの製造方法である。

【００２９】さらに、本発明は、実質的に配列番号１で
表されるサブユニット（Ａ）のポリペプチドおよび実質
的に配列番号２で表されるサブユニット（Ｂ）のポリペ
プチドから選ぶポリペプチドである。

【００３０】さらに、本発明は、ヘテロダイマー型プレ
ニル二リン酸合成酵素において、該プレニル二リン酸合
成酵素の各サブユニットのペプチドを遺伝子組み換えの
手法により調製し、得られる各サブユニットのペプチド
を混合することにより活性型プレニル二リン酸合成酵素
を製造することを特徴とする活性型プレニル二リン酸合
成酵素の製造方法である。各サブユニットのペプチドと
しては、前記サブユニット（Ａ）のポリペプチドおよび
サブユニット（Ｂ）のポリペプチド、例えば、それぞれ
配列番号１で表されるポリペプチドおよび配列番号２で
表されるポリペプチドが挙げられる。

【００３１】さらに、本発明は、由来の生物、例えば微
生物を異にしその一方が特異な性質を有するヘテロダイ
マー型酵素の二つのサブユニットのポリペプチドをそれ
ぞれ調製し、これらのサブユニットのポリペプチドを混
合して特異な性質が付与された活性型酵素を製造するこ
とを特徴とする活性型酵素の製造方法である。この製造
方法において、二つのサブユニットのポリペプチドのう
ちの一方はバチルス・ズブチリス由来であって実質的に
配列番号５のアミノ酸配列を表すものが挙げられ、他方
はバチルス・ステアロサーモフィラス由来であって実質
的に配列番号６のアミノ酸配列を表すものが挙げられ、
そして特異な性質が付与された活性型酵素としては耐熱
性の活性型プレニル二リン酸合成酵素が挙げられる。

【００３２】さらに、本発明は、バチルス・ズブチリス
由来であって実質的に配列番号５のアミノ酸配列を表す
プレニル二リン酸合成酵素のサブユニットのポリペプチ
ドと、バチルス・ステアロサーモフィラス由来であって
実質的に配列番号６のアミノ酸配列を表す耐熱性プレニ
ル二リン酸合成酵素のサブユニットのポリペプチドとを
混合することにより、耐熱性が付与され、かつ活性が高
められたヘテロダイマー型の活性型プレニル二リン酸合
成酵素を製造することを特徴とする活性型プレニル二リ
ン酸合成酵素の製造方法である。以下、本発明を詳細に
説明する。

【００３３】

【発明の実施の形態】プレニル二リン酸合成酵素には、
生物種間、酵素の種類によらず、アミノ酸配列の比較的
保存された７つの領域がある。これらの領域はミクロコ
ッカス・ルテウス（Micrococcus luteus) B-P 26（Dr.
L.Jeffries, Walton Oaks Experimental Station Vitam
ins, Ltd.より入手；以下「M.luteusB-P 26」という)
のヘキサプレニル二リン酸合成酵素にも保存されている
ことが予想される。そこで、本発明は、細菌のプレニル
二リン酸合成酵素における保存アミノ酸配列を参考にし
て、遺伝子組換えの手法によりM.luteus B-P 26 のプレ
ニル二リン酸合成酵素遺伝子をクローニングする。

【００３４】以下、ＤＮＡのクローニング手法について
説明する。まず、プレニル二リン酸合成酵素の産生菌、
例えばM.luteus B-P 26 の培養細胞からゲノムＤＮＡを
調製する。次に、プレニル二リン酸合成酵素の種類、生
物種間をこえてアミノ酸配列が比較的保存された７つの
領域をもとにＤＮＡプローブを合成し、それを用いて、
コロニーハイブリダイゼーション等を行うことにより、
遺伝子全長のクローニングを行う。

【００３５】(1) ゲノムＤＮＡの調製 M.luteus B-P 26 の培養は常法により行うことができ
る。例えば、イーストエキス0.5 ％、ポリペプチド１
％、塩化ナトリウム１％を含む培地にM.luteus B-P26
を植菌し、30〜37℃で１〜３日培養する。M.luteus B-P
26 の培養細胞からプレニル二リン酸合成酵素のポリペ
プチドをコードするゲノムＤＮＡを調製するには、公知
のいずれの手法を用いても行うことができる。例えば、
微生物菌体をリゾチームで処理し、さらにラウリル硫酸
ナトリウム等の界面活性剤で処理した後、フェノール、
クロロホルム、エーテル等の有機溶媒で除タンパクし、
エタノールで沈殿させる方法など、常法により容易に調
製することができる（J.Mol.Biol.,3,208,1961) 。

【００３６】次に、得られるゲノムＤＮＡをベクタープ
ラスミドにつないでゲノムＤＮＡライブラリーを調製す
る。その調製は公知の方法に従って行うことができる。
例えば、適当な制限酵素（例えばEcoRI 、BamHI、Hind
III、Sau3AI、MboI、PstI等）を用いてゲノムのＤＮＡ
鎖とプラスミドのＤＮＡ鎖を切断した後、ＤＮＡリガー
ゼ（例えばＴ４ＤＮＡリガーゼ等）で処理するか、又は
その切断末端の状態によってはターミナルトランスフェ
ラーゼ若しくはＤＮＡポリメラーゼ等で処理した後、Ｄ
ＮＡリガーゼを作用させてＤＮＡ鎖を結合する（Molecu
lar cloning, Cold Spring Harbor Laboratory,269,198
2; Method in Enzymol.,68, 41,1979)。ここで用いられ
るベクターとしては、λファージベクター（λgt10、Ch
aron 4A、EMBL-3等) 、プラスミドベクター（pBR322、p
SC101、pUC19 、pUC119、pACYC117）などが挙げられ、
前記ＤＮＡ断片をこれらのベクターに組み込んだ後、大
腸菌（DH1 、HB101 、JM109 、C600、MV1184、TH2 ）等
を形質転換してゲノムＤＮＡライブラリーを得ることが
できる。

【００３７】(2) スクリーニング用プローブの作製 まず、前記ゲノムＤＮＡをハイブリダイゼーションによ
りスクリーニングするためのプローブを作製する。より
選択性の高いプローブを作製するためには、各生物種間
でアミノ酸残基の保存性の高い領域をコードするオリゴ
ヌクレオチドを作製するのが適当と考えられる。なお、
プローブは、通常の化学合成により作製することができ
る。この条件に合うものとして、以下の保存アミノ酸配
列を選択する（下線を付したアミノ酸は、生物種間（下
記参照）で50％以上保存されたアミノ酸である）（図
２）。

【００３８】領域Ｉの「Gly Gly Lys Arg Ile Ar g Pro
Leu」配列（配列番号７） 領域IIの「Ser Leu Ile H is Asp Asp」配列（配列番号
８）及び「Asp Leu Arg Arg Gly Arg Pro」配列（配列番
号９） 領域III の「Leu Ala Gly Asp Gly Leu Leu」配列（配
列番号10） 領域VIの「Phe Gln Ile Arg Asp Asp Ile Leu Asp」配
列（配列番号11）及び「Gly Lys Pro Val Gly Ser As
p」配列（配列番号12）

【００３９】ここで、領域Ｉ、II、III 、VIは、Koyam
a,T. et al.,J.Biochem.113,355-363(1993)に記載され
たバチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stear
othermophylus ）由来のＦＰＳのアミノ酸配列のうち、
それぞれ第39〜52番目、第73〜103 番目、第115 〜123
番目、第217 〜250 番目の領域である。

【００４０】なお、生物種間における保存アミノ酸配列
の検討は、バチルス・ステアロサーモフィラス、エッシ
ェリヒア・コリ（Escherichia coli）、サッカロミセス
・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ラットお
よびヒトのＦＰＳ、エルウィニア・ヘルビコラ（ Erwin
ia herbicola）およびエルウィニア・ウレドボラ（Erwi
nia uredovora ）のＧＧＰＳ並びにサッカロミセス・セ
レビシエのＨexＰＳの間で行うことができる。プローブ
の設計に当たり、基本とするアミノ酸配列は、M.luteus
B-P 26と同じグラム陽性細菌に属するバチルス・ステ
アロサーモフィラスのものを用いる。

【００４１】これらのアミノ酸配列を基にして以下のオ
リゴヌクレオチドプローブを作製する。 Ｐ1 : 配列番号13 Ｐ2 : 配列番号14 Ｐ3 : 配列番号15 Ｎ1 : 配列番号16 Ｎ2 : 配列番号17 Ｎ3 : 配列番号18 Ｎ4 : 配列番号19 Ｎ5 : 配列番号20 前記ゲノムＤＮＡを鋳型として、また前記オリゴヌクレ
オチドをプローブとしてハイブリダイゼーションを行
う。

【００４２】(3) スクリーニング M. luteus B-P 26のゲノムＤＮＡからのヘキサプレニル
二リン酸合成酵素遺伝子のスクリーニングは、公知の手
法、例えばサザンハイブリダイゼーション、コロニーハ
イブリダイゼーション等によって行うことができる。

【００４３】ここで、本発明者は、実施例２記載の方法
によりM.luteus B-P 26 のＦＰＳ遺伝子をクローニング
した。従って、そのＤＮＡ断片であるＢ500(配列番号2
8）を放射能ラベルしてサザンハイブリダイゼーション
を行うことにより容易にＦＰＳ遺伝子の位置を同定する
ことができる。この結果と同様に、本発明者は、ＨexＰ
Ｓ遺伝子にプレニル二リン酸合成酵素に保存されたアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡ配列が存在するのであれ
ば、プローブに対して陽性で、かつ、ＦＰＳ遺伝子由来
でないＤＮＡ断片についても選出することができると考
えた。

【００４４】そこで、本発明では、前記のように作製し
たプローブを用いて、M.luteus B-P26 のゲノムＤＮＡ
のサザンハイブリダイゼーションを行った。すなわち、
M.luteus B-P 26 のゲノムＤＮＡを適当な制限酵素（Ec
oRＩ, HindIII, Pst I ）で別々に消化する。得られる
制限断片をアガロースゲル中に電気泳動し、そのゲルを
アルカリ処理し、ＤＮＡを一本鎖に変性させた後、ナイ
ロン膜に転写する。このナイロン膜に紫外線を照射し
て、ＤＮＡをナイロン膜に固定させる。次に、標識した
プローブ又はＢ500 をプローブとして用いてハイブリダ
イゼーション及び洗浄を行い、バイオイメージアナライ
ザーを用いてオートラジオグラフィーを行う。そして、
プローブに相同性のあるＤＮＡバンドの位置をオートラ
ジオグラフィーで確認する。

【００４５】なお、プローブ（Ｐ１, Ｐ２, Ｎ３, Ｎ
４, Ｎ５) は、［γ−³²Ｐ］ＡＴＰからリン酸基を5'末
端に酵素的に転移させることによって³²Ｐで末端標識す
る。一方、Ｂ500 については、ランダムプライムラベリ
ング法を用いて［α−³⁵Ｓ］dCTPで³⁵Ｓ−ラベルし、プ
ローブとする。

【００４６】(4) プローブＢ500 と弱くハイブリダイズ
するＤＮＡ断片のクローニング プローブＢ500 は、前述のようにM.luteus B-P 26 のＦ
ＰＳ遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片である。従って、Ｆ
ＰＳ遺伝子とは強くハイブリダイズする。また、Ｂ500
はプレニル二リン酸合成酵素に保存されたアミノ酸配列
をコードするＤＮＡ配列を有する。さらに、ＨexＰＳ遺
伝子にプレニル二リン酸合成酵素に保存されたアミノ酸
配列をコードするＤＮＡ配列が存在するのであれば、Ｂ
500 ともハイブリダイズする。

【００４７】そこで、本発明のプレニル二リン酸合成酵
素のペプチドをコードする遺伝子をスクリーニングする
には、ＦＰＳ遺伝子の存在によりＢ500 と強くハイブリ
ダイズするＤＮＡ断片の他に、プローブＢ500 と弱くハ
イブリダイズするＤＮＡ断片のクローニングを行う。

【００４８】EcoRＩ消化したゲノムＤＮＡの４〜６kbp
の部分をアガロースゲルより抽出し、pUC119に挿入し
て、大腸菌JM109株を形質転換し、この領域のＤＮＡラ
イブラリーを作製する。そして各プローブを用いてコロ
ニーハイブリダイゼーションを行う。

【００４９】得られるクローンを適当な培地（ＬＢ液体
培地等）で培養後、集菌し、超音波処理により菌体を破
砕し、粗酵素抽出液を得る。この粗酵素抽出液を用い
て、ＨexＰＳ活性の測定を行う。こうしてプレニル二リ
ン酸合成酵素遺伝子を含むクローンを得、以後、塩基配
列の解析に用いる。

【００５０】(5) 塩基配列の決定 前記のようにして得られたクローンを適当な制限酵素で
消化してアガロースゲル中で電気泳動し、その泳動パタ
ーンと泳動距離から制限酵素地図を作成する。この制限
酵素地図を基にＤＮＡ断片のデリーション（小断片化）
を行い、活性を示す最小のクローンを得、活性を示すＤ
ＮＡについて塩基配列の解析を行う。

【００５１】塩基配列は、インサートの片側から欠失さ
せたデリーションクローンを正逆両方向について作製し
たものを用いて決定すればよい。

【００５２】スクリーニングされたクローンを、適当な
制限酵素、例えばEcoRI 、PstIなどで切断後、pUC119、
pUC19 等のプラスミドにクローニングし、通常用いられ
る塩基配列分析方法、例えばSangarらのジデオキシ法(
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463(1977)) 等によって目
的とするＤＮＡの塩基配列を決定することができる。塩
基配列の決定は、塩基配列自動分析装置、例えばT7 Seq
uencing Kit （ファルマシア社）等を用いて行うことが
できる。

【００５３】このようにして塩基配列が決定された後
は、化学合成又はＰＣＲ等により得られたＤＮＡ断片を
用いてハイブリダイズさせることにより、目的とするＤ
ＮＡを得ることができる。また、本発明のＤＮＡは、プ
レニル二リン酸合成酵素を発現させるための遺伝子とし
て用いることができる。

【００５４】このようにして決定されるプレニル二リン
酸合成酵素のサブユニットのポリペプチドをコードする
ＤＮＡの塩基配列として、例えば配列番号21で示される
塩基配列が挙げられ、これらの塩基配列には、３つのオ
ープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が含まれる。各
オープンリーディングフレームをｈｅｘ１、ｈｅｘ２、
ｈｅｘ３と命名し、各ＯＲＦは、それぞれ配列番号21で
示される塩基配列の第216 〜644 番目（配列番号３）、
第622 〜1359番目（配列番号29）および第1368〜2342番
目（配列番号４）である。

【００５５】上記各ＯＲＦは、通常の遺伝子組換えの手
法により全体として又はそれぞれ単独にクローニングす
ることができる。例えば、プレニル二リン酸合成酵素の
サブユニットのポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基
配列を適当な制限酵素を用いてｈｅｘ１、ｈｅｘ２およ
びｈｅｘ３を含む各断片に消化し、同じ制限酵素を用い
て消化したプラスミドベクターに連結することによりク
ローニングすることができる。

【００５６】(6) プレニル二リン酸合成酵素遺伝子の同
定 上記のようにして得られた３つの遺伝子が発現すること
により得られるポリペプチドが活性を有するか否かを調
べるため、各ＯＲＦをそれぞれ別個に含むプラスミドを
作製し、それらを用いて宿主を形質転換する。形質転換
体を培養して粗酵素抽出液を調製し、プレニル二リン酸
合成酵素活性を調べる。

【００５７】組み換えベクターによる宿主細胞の形質転
換は、例えば宿主細胞が大腸菌の場合は、CaCl₂ 、MgCl
₂ 又はRbClを共存させて調製したコンピテント細胞に該
組換えベクターを加えることにより実施することができ
る。目的とする遺伝子を保有する細胞を検出するには、
タンパク質のアミノ酸配列をもとにして化学合成したオ
リゴヌクレオチドプローブを用いたコロニー又はプラー
クハイブリダイゼーション法（Molecular cloning, J.S
ambrook,E.F.,Fritsch,T. Maniatis著,Cold Spring Har
bor Laboratory Press発行) などを用いればよい。

【００５８】このようにしてクローニングされたプレニ
ル二リン酸合成酵素のポリペプチドをコードするＤＮＡ
を含む断片は、適当なベクターＤＮＡ（例えばpMalc2、
pTrc99A 等）に再度組み込むことにより、大腸菌内でそ
の遺伝子を高発現させることが可能である。また、適当
なベクターに再度組み込むことにより他の原核生物また
は真核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。
さらに、これらのベクターに適当なプロモーター及び形
質発現に関わる配列を導入することにより、それぞれの
宿主細胞において遺伝子を発現させることができる。

【００５９】宿主細胞としては、ＣＯＳ細胞、チャイニ
ーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＬＡ細胞（ヒ
ト子宮癌細胞）、マウスのセルトリ細胞等の哺乳動物細
胞由来のもの、昆虫細胞由来のもの、ピキア・パストリ
ス、サッカロミセス・セレビシエ等の酵母由来のものが
挙げられ、これらの細胞を形質転換させるベクターとし
てはBacPAK6 、pSVL、SV40等が挙げられる。このベクタ
ーは、複製起源、選択マーカー、プロモーター、ポリア
デニル化シグナルなどを含む。

【００６０】遺伝子発現のプロモーターとしてはレトロ
ウイルス、ポリオーマウイルス等のプロモーターを用い
ることができる。複製起源としては、ＳＶ40、ポリオー
マウイルス、アデノウイルス、ＶＳＶ等の由来のものを
用いることができ、選択マーカーとしては、チミジンキ
ナーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いる
ことができる。

【００６１】(7) ポリペプチドの発現 以上のごとき宿主−ベクター系を用いて培養物中にプレ
ニル二リン酸合成酵素のサブユニット（Ａ）のポリペプ
チドおよび／またはサブユニット（Ｂ）のポリペプチド
を蓄積せしめ、該ポリペプチドを採取するには、ベクタ
ーの適当な部位に該遺伝子を組み込んだ組換えＤＮＡに
より宿主細胞を形質転換させた後、得られる形質転換体
を培養すればよい。さらに細胞内又は培養液からポリペ
プチドを分離、精製するには、公知の手法を用いること
ができる。例えば、塩析、ゲル濾過、イオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆
相クロマトグラフィー等を単独又は適宜組み合わせるこ
とにより精製することができる。精製されたポリペプチ
ドが目的のものか否かは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動、ウエスタンブロッティング等により確認す
ることができる。

【００６２】(8) ヘテロダイマー型の活性型プレニル二
リン酸合成酵素の製造 本発明においては、ヘテロダイマー型プレニル二リン酸
合成酵素において、該プレニル二リン酸合成酵素の各サ
ブユニットのペプチドを遺伝子組み換えの手法により調
製し、得られる各サブユニットのペプチドを混合するこ
とにより活性型プレニル二リン酸合成酵素を製造するこ
とができる。

【００６３】例えば、プレニル二リン酸合成酵素のサブ
ユニット（Ａ）としてｈｅｘ１の発現産物、サブユニッ
ト（Ｂ）としてｈｅｘ３の発現産物を挙げることができ
る。そして、ｈｅｘ１の発現産物とｈｅｘ３の発現産物
とを混合することにより、高い酵素活性を有する活性型
プレニル二リン酸合成酵素を得ることができる。

【００６４】なお、ｈｅｘ１の発現産物（サブユニット
Ａ）とｈｅｘ２の発現産物との混合物、或いはｈｅｘ３
の発現産物（サブユニットＢ）とｈｅｘ２の発現産物と
の混合物は、プレニル二リン酸合成酵素の酵素活性を有
さないものである。さらに、本発明では、由来の生物、
例えば微生物を異にしその一方が特異な性質を有するヘ
テロダイマー型酵素の二つのサブユニットのポリペプチ
ドをそれぞれ調製し、これらのサブユニットのポリペプ
チドを混合して特異な性質が付与された活性型酵素を製
造することができる。

【００６５】ここで、「特異な性質」とは、その酵素の
酵素活性の他にさらに付加された、酵素活性以外の特異
な性質をいう。例えば、耐熱性、耐アルカリ性、耐酸
性、長期保存安定性、有機溶媒耐性等の性質が挙げられ
る。本発明では、これらの特異な性質の他に、比活性の
増大をもたらすこともできる。

【００６６】このような例としては、実質的に配列番号
５のアミノ酸配列を表すバチルス・ズブチリス（ATCC 6
633 ) 由来のサブユニットのポリペプチドと、実質的に
配列番号６のアミノ酸配列を表すバチルス・ステアロサ
ーモフィラス（ATCC 10149)由来のサブユニットのポリ
ペプチド（耐熱性を有する）とを等量混合することによ
り、耐熱性が付与され、かつ活性が高められたヘテロダ
イマー型の活性型プレニル二リン酸合成酵素が挙げられ
る。

【００６７】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範
囲を限定するものではない。

【００６８】〔実施例１〕ミクロコッカス・ルテウス由
来ゲノムＤＮＡの調製 M.luteus B-P 26 を６ＬのL-broth （Bacto Tryptone 1
0g, Bacto Yeast extract ５ｇ，NaCl ５ｇ，Glucose
１g/１L ）中、30℃で24時間培養した。培養液を7,000r
pm、４℃で15分間遠心分離し、細胞をSaline-EDTA （0.
15M NaCl，0.1MEDTA, pH8.0）に懸濁して洗浄し、再度
7,000rpm、４℃で10分間遠心分離した。こうして得た湿
重量約17ｇの菌体を17mLのSaline-EDTA に懸濁した後、
１ｇのリゾチームを加えて、37℃で30分間インキュベー
トした。

【００６９】次に、滅菌水36mL、１M Tris-HCl緩衝液
（pH9.0 ）36mL、５M NaCl 12mL 及び10％ＳＤＳ 12mL
を加え、よく懸濁した後、液体窒素を用いて凍結させ
た。次に、60℃で融解し、室温でリゾチーム1.0gを追加
した後、再び-70 ℃で凍結、60℃で融解した。この凍
結、融解をさらにもう一度行った。37℃で１時間インキ
ュベートした後さらに400mg のリゾチームと3.1mg のプ
ロテイナーゼＫを加えて55℃で30分間インキュベートし
た。等量（〜150mL ）のフェノールを加え、氷冷しなが
ら20分間ゆっくりと攪拌を続けた。これを3,000rpm、４
℃、10分間遠心分離し、上清を分取し、さらに3,000rp
m、４℃、30分間遠心分離した。この上清を15mLづつ50m
Lのコニカルチューブ（ファルコン社製）に移し、２倍
量のエタノールを静かに加えた後、ゆっくり混合した。
糸状のＤＮＡの白沈殿を滅菌したガラス棒で巻きとり、
36mLのDiluted Saline-Citrate (0.015M NaCl, 0.0015M
trisodiumcitrate）に溶解し、４mLのConcentrated Sa
line-Citrate (1.5M NaCl, 0.15Mtrisodium citrate)を
加えた。吸光度A260の測定により、粗収量は約44mgであ
った。ＲＮＡを除去するため、40mLのDiluted Saline-C
itrateを加えて、核酸の濃度を約0.5mg/mLになるように
した後、RNaseTI とRNaseAを、それぞれ終濃度3.6μg/m
L及び50μg/mLとなるように加えて、37℃、30分間イン
キュベートした。等量のフェノールを加えて、氷冷しな
がら10分間チューブを上下反転してゆっくりと攪拌し
た。フェノール混合液を3,000rpm、４℃、10分間遠心分
離し、水層をフェノール、クロロホルム１対１溶液と混
合した。

【００７０】3,000rpm、４℃、15分間遠心分離した後、
水層を分取し、２倍量のエタノールを加えて、ＤＮＡを
沈殿させた。15,000rpm 、４℃、20分間遠心分離し、沈
殿を70％、80％及び90％のエタノールで順次洗浄し、最
後に50mLのＴＥ（10mL Tris-HCl,１mM EDTA, pH7.4）に
懸濁した。吸光度の測定から、収量は4.95mgであった。

【００７１】〔実施例２〕ＰＣＲによるＦＰＰ合成酵素
遺伝子断片（Ｂ500 ）の増幅とＦＰＰ合成酵素遺伝子の
クローニング 種々の生物種間におけるプレニル二リン酸合成酵素のア
ミノ酸の保存領域Ｉの「Gly Gly Lys Arg Ile Arg Pro
Leu 」配列（配列番号７）、領域IIの「Ser Leu Ile Hi
s Asp Asp 」配列（配列番号８）及び「Asp Leu Arg Ar
g Gly Arg Pro」配列（配列番号９）、領域III の「Leu
Ala Gly Asp Gly Leu Leu 」配列（配列番号10）、並
びに領域VIの「Phe Gln Ile Arg Asp Asp Ile Leu Asp
」配列（配列番号11）及び「Gly Lys Pro Val Gly Ser
Asp 」配列（配列番号12）で示されるアミノ酸配列を
基にして以下のプライマーを合成した。

【００７２】センスプライマー Ｐ1 : 配列番号13 Ｐ2 : 配列番号14 Ｐ3 : 配列番号15 アンチセンスプライマー Ｎ1 : 配列番号16 Ｎ2 : 配列番号17 Ｎ3 : 配列番号18 Ｎ4 : 配列番号19 Ｎ5 : 配列番号20

【００７３】前記ゲノムＤＮＡを鋳型として、また前記
オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行っ
た。ＰＣＲは以下の組成を有するＰＣＲ反応液中で、97
℃で90秒、40℃で90秒、72℃で120 秒を１サイクルとし
てこれを５サイクル行なった後、96℃で90秒、55℃で90
秒、72℃で120 秒を１サイクルとしてこれを20サイクル
行なった。

【００７４】ＰＣＲ溶液の組成： genomic ＤＮＡ 1μｇ Tris-HCl（pH8.3) 10 mM KCl 50 mM MgCl₂ 1.5mM gelatin 0.001 ％（w/v) dNTP mixture 各200 μM プライマー 各0.1nmol Ampli Taq DNA Polymerase 2.5U （全量 100 μL）

【００７５】Ｐ１／Ｎ３の組み合わせで特異的に増幅さ
れる約500bp のバンド(B500)が得られたのでpT7Blue T-
vector (Novagen 社製）にライゲーションし、pB500 を
得た。塩基配列をジデオキシ法にて解析した結果、B500
のコードするアミノ酸配列はバチルス・ステアロサーモ
フィラスのＦＰＳと145 アミノ酸中で60.7％の相同性が
あった。M.luteus B-26 のゲノムをSau3AIで限定分解
し、４〜８kbp のＤＮＡ断片をpUC119/ BamHIに挿入し
た後、大腸菌JM109 を形質転換してゲノムライブラリー
を作製した。pB500 をPstIとBamHIで切断後アガロース
ゲルで電気泳動してＤＮＡ断片を切り出し、回収した。
得られたB500断片のラベリングにはRandomPrimer Label
ing Kit（宝酒造社製）を用い、方法はそのプロトコル
に従った。標識B500をプローブとし、コロニーハイブリ
ダイゼーションにより約6000個のライブラリーをスクリ
ーニングして、B500とハイブリダイズするクローンを得
た。プレニル二リン酸合成酵素活性を測定し、生成物を
分析したところＦＰＰ合成酵素であることを確認した。

【００７６】〔実施例３〕M.luteus B-P 26 のゲノムＤ
ＮＡのサザンハイブリダイゼーション (1) ゲノムＤＮＡのナイロン膜へのブロッティング 実施例１で調製した M.luteus B-P 26のゲノムＤＮＡを
サザンブロッティングに用いた。 Genomic DNA 100μL(10μg) 10x buffer 30μL 滅菌水 162μL Enzyme 8μL

【００７７】上記の組成で、M.luteus B-P 26 のゲノム
ＤＮＡ10μg を、制限酵素EcoRＩ（10U/μL)、PstI(100
U/μL)またはHind III (12U/μL)の何れかで、それぞれ
37℃、40時間反応させ完全に消化した。反応溶液をフェ
ノール−クロロホルム処理、クロロホルム処理の後、エ
タノール沈殿した。得られたＤＮＡを減圧下で乾燥後、
100μL のＴＥ（10mM Tris-HCl,１mM EDTA(pH8.0)) に
溶解した（350ng/μL) 。３つのＤＮＡ溶液10μL を0.
８％アガロースゲル中で電気泳動した。なお、サザンブ
ロッティングには平板型転写装置 NA-1512型（日本エイ
ドー社）を使用した。また、制限酵素は市販のもの（宝
酒造社、ＮＥＢ社又はベーリンガーマンハイム社）を使
用した。

【００７８】ＤＮＡを泳動したアガロースゲルを1.５M
NaCl，0.５M NaOHに浸して、30分間ゆっくりと振盪し、
ＤＮＡを変性させた。ナイロンメンブレンおよび濾紙を
ゲルと同じ大きさに切り、0.25M NaOH，1.５M NaClに浸
しておいた。平板転写装置にアガロースゲル、ナイロン
メンブレンをそれぞれ図３のように重ね、150mA(定電
流) の電流を60分間流すことにより、ＤＮＡを膜に転写
した。ＤＮＡを転写したナイロンメンブレンを５×ＳＳ
Ｃ( 0.5M NaCl, 0.075M Sodium citrate) で洗浄して、
濾紙上に置いて風乾した後、紫外線を照射して（120mJ/
cm² ) ＤＮＡを膜に固定した。こうして得られたナイロ
ンメイブレンをサザンハイブリダイゼーションに用い
た。

【００７９】(2) サザンハイブリダイゼーションに用い
るプローブの作製 ＦＰＳ遺伝子のＤＮＡ断片であるＢ500 は、ランダムプ
ライマー（９mer)と［α−³⁵Ｓ］dCTP（アマシャム社）
を用いてラベルした。また、プローブに用いた合成オリ
ゴヌクレオチドについては、以下の組成に含まれるＴ4
ポリヌクレオチドキナーゼにより、その5'末端に［γ−
³²Ｐ］ＡＴＰ（アマシャム社）からγ位のリン酸基を酵
素的に転移する方法でラベルした。

【００８０】 5'-OH オリゴヌクレオチド(P1,P2,N3,N4,N5) 10pmol 10×Kinase buffer 1μL ［γ−³²Ｐ］ATP(3000Ci/mmol,10μCi/μL ） 3μL T4 polynucleotide kinase (10U/μL) 1μL 滅菌水 up to 10μL 10×Kinase buffer ： 0.5M Tris-HCl (pH 8.0) 0.1M MgCl₂ 50mM DTT soln.

【００８１】上記の組成で37℃、30分間反応した後、95
℃で３分間熱処理して、Ｔ4 ポリヌクレオチドキナーゼ
を失活させた。こうして得られた末端標識オリゴヌクレ
オチドをサザンハイブリダイゼーションのプローブとし
て用いた。次に、標識したプローブを用いてハイブリダ
イゼーション及び洗浄を行い、富士写真フィルム社製バ
イオイメージアナライザーを用いてオートラジオグラフ
ィーを行った。

【００８２】ナイロン膜は同一のものを３枚作製した
（No.1, No.2, No.3とする）。はじめにNo.1をプローブ
Ｂ500 、No.2をプローブＮ４、No.3をプローブＮ５でハ
イブリダイゼーションし、オートラジオグラフィーを行
った。その後、フィルターを洗浄してハイブリダイズし
ているプローブを完全に除去して、それぞれプローブＰ
１, Ｐ２, Ｎ３で再びハイブリダイゼーションし、オー
トラジオグラフィーを行った。

【００８３】結果を図４に示す。このオートラジオグラ
ムより、プローブＢ500 との結合の強さから（▲）で示
したバンドがＦＰＳ遺伝子のものと考えられる。さら
に、EcoRＩ消化したゲノムＤＮＡに対してはＦＰＳのバ
ンドの下に弱いバンド（△：〜4.2kbp) が１つ確認され
た。これはプローブＮ４とも比較的強く結合しているこ
とがわかる。

【００８４】ＦＰＳ遺伝子はその内部にEcoRＩ切断部位
を持たないので、ＦＰＳ遺伝子がEcoRＩで切断されて２
本のバンドを示すことはない。よってこの弱く結合する
約4.2kbpのバンドは他のプレニル二リン酸合成酵素の遺
伝子を含んでいる可能性がある。そこで、この約4.2kbp
のＤＮＡ断片をクローニングすることにした。

【００８５】(5) プローブＢ500 と弱くハイブリダイズ
するＤＮＡ断片のクローニング EcoRＩで消化したゲノムＤＮＡの４〜６kbp の画分をア
ガロースゲルより切り出し、ＤＮＡ断片をBIO 101 社の
The GEANCLEAN II Kitを用いて回収した。このＤＮＡ断
片をpUC119に挿入後大腸菌JM109株を形質転換し、コロ
ニーハイブリダイゼーションを行った。

【００８６】その結果、約1,200個のコロニーから全て
のプローブとハイブリダイズする３つのクローンを得
た。これらのクローンをＬＢ培地で培養後、集菌し、超
音波処理により菌体を破砕し、粗酵素抽出液を得た。こ
の粗酵素抽出液を用いて、プレニル二リン酸合成酵素活
性の測定を行った。

【００８７】活性の測定は、以下の通り行った。ポジテ
ィブコロニーを50mLのＬ培地で一晩培養し、４℃、3,00
0rpm、20分の遠心分離により集菌し、菌体を３mLのＴＥ
に懸濁した。これに超音波処理を施し菌体を破砕した
後、４℃、3,000rpm、20分の遠心分離により上清を得、
更に15,000rpm 、５分間遠心分離した上清を粗酵素抽出
液とした。超音波処理は、出力40Ｗ、30％のパルスで５
分間行った。

【００８８】 crude homogenate 20μg Tris-HCl (pH 7.5) 100mM MgCl₂ 5mM FPP 5μM［1-¹⁴C ］IPP (54Ci/mol) 0.46μM Ｈ₂Ｏ up to 1mL

【００８９】上記の組成で37℃、３時間反応を行い、生
成物に３mLのブタノールを添加かくはんした。そして、
静置あるいは遠心により二層分離させた後ブタノール層
を回収した。回収したブタノール層のうち 500μL を用
いて生成物の放射能量を液体シンチレーションカウンタ
ーで測定し、また、回収したブタノール層のうち２mLを
酸性ホスファターゼで処理し、逆相薄層クロマトグラフ
ィー（ＴＬＣ）で生成物の分析を行った。

【００９０】 BuOH抽出液 2mL Acetate buffer(pH5.6) 1mL ５％ TritonX-100 100μL MeOH １mL Acid phosphatase (1g/28mL ） 500μL

【００９１】上記の組成で、37℃、14時間反応し、反応
液に４mLのペンタンを添加かくはんした。そして、静置
あるいは遠心により二層分離させた後ペンタン層を回収
した。窒素ガスで溶媒を除去し、100 μL のペンタンに
溶解した後、ワットマン社製LKC18 逆相薄層クロマトグ
ラフィー（展開溶媒：アセトン／水＝19／１）による分
析を行なった。

【００９２】その結果を図５に示す。これより、生成物
はＨexＰＰであることが分かった。こうしてＨexＰＰ遺
伝子を含むクローンを得たので、これをpHX00 と命名
し、以後、塩基配列の解析に用いた。

【００９３】〔実施例４〕制限酵素地図と塩基配列の解
析 (1) pHX00 のデリーションクローンの作製 pHX00 の制限酵素地図を作製し、これを基にしてデリー
ションクローンの作製を行い、長さの異なるＤＮＡ断片
を得た（図６）。図６に示すように、pHX01 〜pHX05 及
びpEcoRV-Lは、pHX00 をXbaIで切断した後、それぞれの
断片に示されるサイト（例えば、pHX02 についてはMlu
I、pHX05 についてはNruI) で切断し、アガロースゲル
中で電気泳動し、目的の長さのＤＮＡ断片をBIO 101 社
製 The GENECLEAN II Kit を用いた方法で回収した。次
に、ＤＮＡ断片の末端をＴ4 ＤＮＡPolymerase で平滑
化し、セルフライゲーションにより目的のデリーション
クローンを作製した。

【００９４】なお、pSacI-L 及びpSacI-s は、pHX00 を
SacＩで切断したときの一方の断片と他方の断片であ
る。ここでは、２本の断片のうち長い方（pUC119を含
む) についてはセルフライゲーションによりpSacI-L と
し、短い方については SacＩで切断した別のpUC119とラ
イゲーションしてpScI-sとした（図６）。

【００９５】pPstI-L 及びpPstI-s は、pHX01 を基にし
てpSacI-L 及びpSacI-s と同様に処理したものである。
すなわち、pHX01 を PstＩで処理して得られる２本の断
片のうち、長い方についてはセルフライゲーションして
pPstI-L とし、短い方は、別のpUC119の PstＩサイトに
挿入してpPstI-s とした（図６）。

【００９６】なお、pSacI-L 及びpPstI-L では、挿入の
方向の異なる２つのプラスミドが得られるので、挿入の
方向が異なったプラスミドのそれぞれをpSacI-L-1,2 及
びpPstI-L-1,2 とした。以上のデリーションを行った各
クローンについてプレニル二リン酸合成酵素の活性を測
定した。その結果、活性を示す最小の長さのクローンpH
X05 を得た（図６）。

【００９７】さらに、pPstI-L-1 及びpPstI-L-2 につい
てKilo-sequence 用Deletion kit（宝酒造社製）を用い
て遺伝子の順方向又は逆方向から順次欠失したデリーシ
ョンクローンを作製した。方法はキットのプロトコルに
従った。こうして作製したデリーションクローンを用い
て塩基配列の解析を行った。

【００９８】(2) 塩基配列の決定 塩基配列の決定は、以下の手法により行った。アルカリ
−ＳＤＳ法で調製したデリーションクローンを、以下に
示すように、アルカリ変性を行って鋳型ＤＮＡを作製し
た。

【００９９】 Template 32μL (1.5〜２μg DNA)2M NaOH 8μL Total volume 40μL

【０１００】上記の溶液を調製し、穏やかに攪拌して室
温で10分間インキュベートした。７μL の３M 酢酸トリ
ウム（pH 4.8) と、４μL の蒸留水を加えた。120μL
のエタノールを加えて、混合した後、ドライアイス中に
15分置いた。15,000rpm、４℃で15分間遠心分離してＤ
ＮＡを沈殿させた。70％エタノールで洗浄し、15,000rp
m 、４℃で10分間遠心分離し上清を捨てた。減圧下で乾
燥し、10μL の蒸留水に溶解した。これを鋳型ＤＮＡと
して、T7Sequencing Kit（ファルマシア）と、［α−³⁵
Ｓ］dCTPとを用いたジデオキシ法により塩基配列の解析
を行った。

【０１０１】解析した塩基配列を配列番号21に示した。
その結果、pHX05 にはタンパク質をコードする３つの読
み枠が存在することが明らかとなった。上流からそれぞ
れ、ｈｅｘ１、ｈｅｘ２、ｈｅｘ３とした（図７）。

【０１０２】ｈｅｘ１は配列番号１に示した143 個のア
ミノ酸で構成されるタンパク質をコードしており、その
推定分子量は17kDa であった。ｈｅｘ２は配列番号29に
示した246 個のアミノ酸で構成されるタンパク質をコー
ドしており、その推定分子量は28kDa であった。また、
開始コドンを含む始めの23塩基がｈｅｘ１の下流とオー
バーラップしていた。ｈｅｘ３は配列番号２に示した32
5 個のアミノ酸で構成されるタンパク質をコードしてお
り、その推定分子量は37kDa であった。

【０１０３】これら３つのオープンリーディングフレー
ム（ＯＲＦ）がコードするアミノ酸配列（Ｈｅｘ１，Ｈ
ｅｘ２，Ｈｅｘ３）をバチルス・ステアロサーモフィラ
スのＨｅｐＰＳ遺伝子（ｈｅｐ１，ｈｅｐ２）がコード
するアミノ酸配列（Ｈｅｐ１，Ｈｅｐ２）と比較する
と、Ｈｅｘ３はＨｅｐ２と36.4％の相同性を示し、前述
のプレニル二リン酸合成酵素に共通の７つの保存領域も
保持していた。一方，Ｈｅｘ１はＨｅｐ１と8.4 ％の相
同性しか示さず、Ｈｅｐ１が220 個のアミノ酸から成る
のに対し、Ｈｅｘ１は143 個と非常に小さかった。

【０１０４】バチルス・ステアロサーモフィラスのＨｅ
ｐＰＳの構造遺伝子がｈｅｐ１とｈｅｐ２であり、これ
らとの相同性から、ｈｅｘ３はM.luteus B-P 26 のＨｅ
ｘＰＳの構造遺伝子であろうと予想されたが、ｈｅｘ１
またはｈｅｘ２はｈｅｐ１と高い相同性を示さなかった
ので容易に断定できなかった。そこで３つのＯＲＦのう
ち、どれがＨｅｘＰＳの構造遺伝子であるかを確認する
ことにした。

【０１０５】〔実施例５〕ヘテロダイマー型プレニル二
リン酸合成酵素活性の測定(1) ＨｅｘＰＰ合成酵素遺伝子の同定 ｈｅｘ１のみを含むプラスミドを作製するため、pdel 2
-5をHincIIとNruIで切断し、セルフライゲーションさせ
た（図８，９）。これがpREG1 である。同様に、ｈｅｘ
２のみを含むプラスミドを作製するため、pdel 1-1のSa
cI-SacI 断片を切り出し、pUC119のSacI部位に挿入した
のがpREG2 である（図８，９）。

【０１０６】また、ｈｅｘ３のみを含むプラスミドの作
製は次のようにした。pdel 1-13 をEcoRI で切断し、末
端を平滑化した後にPstIで切断した。さらにpPstI-S を
HindIIIで切断し、末端を平滑化した後にPstIで切断し
た。これらをライゲーションしてpREG3 を作製した。pR
EG3 はｈｅｐ３の下流の約400bp を含んでいるため、pR
EG3 をEcoRI とEcoT14I で消化し、平滑末端化した後ラ
イゲーションしてpREG3Sとした（図８，９）。ここで、
pdel 2-5、pdel 1-1、pdel 1-13 は前述したpPstI-L の
Kilo-Sequence 用Deletion Kitを用いて作製したデリー
ションクローンである。

【０１０７】こうしてpHX05 のインサートＤＮＡにある
３つの領域（ｈｅｘ１，ｈｅｘ２，ｈｅｘ３）をそれぞ
れ別個に含むプラスミドを作製した（図９）。ｈｅｘ１
〜３を含むpHX05 はｈｅｘ３の下流の約400bp を含んで
いるため、pHX00 をNruIとEcoT14I で切断後、HincIIで
切断したpUC119とライゲーションし、得られる２種類の
クローンのうちpHX05 と遺伝子の向きが同一のものを選
択してpHX06 とした（図９）。

【０１０８】これらを用いて大腸菌JM109 株を形質転換
し、前記と同様の方法で酵素活性の測定を行なった。な
お、ｈｅｘ１、ｈｅｘ２およびｈｅｘ３遺伝子を含むプ
ラスミド（それぞれpREG1 、pREG2 、pREG3S) を保有す
る形質転換体は、工業技術院生命工学工業技術研究所
に、pREG1/JM109 がFERM BP-5910とし、pREG2/JM109 が
FERM BP-5911とし、pREG3S/JM109がFERM BP-5912として
それぞれ寄託されている。

【０１０９】 酵素活性の測定 得られたクローンの粗酵素抽出液を調製し、表１に示す
組み合わせでＨexＰＰ合成酵素活性を調べた。結果を表
１および図10に示す。

【０１１０】

【表１】

【０１１１】図10中、レーン１〜９は、それぞれ表１の
レーン１〜９に対応する。表１および図10より、ｈｅｘ
１とｈｅｘ３にコードされるポリペプチドが同時に存在
する場合（表１，レーン1, 2, 9 ；図10，レーン1, 9)
にＨexＰＳ活性が発現することが分かる。すなわち、Ｈ
ｅｘ１（サブユニットのポリペプチド（Ａ））とＨｅｘ
３（サブユニットのポリペプチド（Ｂ））とを混合する
ことにより、活性が発現することが分かる。また、この
ことからバチルス・ステアロサーモフィラスのＨepＰＳ
遺伝子と同様に、ｈｅｘ１とｈｅｘ３がＨexＰＳの構造
遺伝子であることが分かる。

【０１１２】〔実施例６〕ヘテロダイマー型プレニル二
リン酸合成酵素活性の測定(2) バチルス・ズブチリス由来ＨｅｐＰＳ遺伝子を持つ
プラスミドの構築 データベース検索により、バチルス・ステアロサーモフ
ィラスのＨｅｐＰＳ遺伝子であるｈｅｐ１、ｈｅｐ２と
高い相同性を示す遺伝子がバチルス・ズブチリスに存在
することがわかった。ｈｅｐ１に対応するのがｇｅｒＣ
１、ｈｅｐ２に対応するのがｇｅｒＣ３である。GenBan
k M80245に登録されたＤＮＡ配列を基に以下のオリゴヌ
クレオチドを合成し、ＰＣＲプライマーとした。

【０１１３】センスプライマー Ｐ６’：配列番号２２ Ｐ５’：配列番号２３ アンチセンスプライマー Ｐ２’：配列番号２４ Ｐ４’：配列番号２５

【０１１４】バチルス・ズブチリス（ATCC 6633)を１L
のＬＢ（Bacto Tryptone 10g, Bacto Yeast extract ５
g, NaCl 10g/1L）中、37℃でOD600 が１になるまで培養
した。培養液を7,000 rpm、４℃で15分間遠心分離し、
集菌した。バチルス・ズブチリス由来のゲノムＤＮＡは
バチルス・ステアロサーモフィラスのゲノムＤＮＡ調製
の方法に従って調製し（Koike-Takeshita, A.,et al.,
(1995)J.Biol.Chem.,270,18396)、ＰＣＲの鋳型とし
た。

【０１１５】前記ゲノムＤＮＡを鋳型として、また前記
オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行っ
た。ＰＣＲは以下の組成を有するＰＣＲ反応液中で、74
℃で30秒、55℃で60秒、72℃で60秒を１サイクルとして
これを24サイクル行なった後、72℃で７分反応した。

【０１１６】 ＰＣＲ溶液の組成： genomic DNA 1 μｇ 10×Ampli Taq DNA Polymerase buffer 10 μＬ dNTP mixture 各200 μＭ プライマー 各 0.2μＭ Ampli Taq DNA Polymerase 2.5u （全量 100μＬ）

【０１１７】ｇｅｒＣ１を持つクローンはＰ６’／Ｐ
４’の組み合わせでＰＣＲを行ない、増幅されたＤＮＡ
断片をNcoIとHind IIIで切断した後、NcoIとHind IIIで
切断したpTrc99A にライゲーションして作製し、pEHA1
とした。ｇｅｒＣ３を持つクローンはＰ５’／Ｐ２’の
組み合わせでＰＣＲを行ない、増幅されたＤＮＡ断片を
NcoIとＢglIIで消化した後、NcoIとBamHIで消化したpTr
c99A にライゲーションして作製し、pEHA3 とした。

【０１１８】 バチルス・ステアロサーモフィラス(A
TCC 10149)由来のｈｅｐＰＳ遺伝子を持つプラスミドの
構築 ｈｅｐ１を持つクローンは、Koike-Takeshita, A.,et a
l.,(1995)J.Biol.Chem.,270,18396 に示されたpTLD7 を
使用した。ｈｅｐ２を持つクローンはKoike-Takeshita,
A.,et al.,(1995)J.Biol.Chem.,270,18396 に示された
pTL6を鋳型にして下記のオリゴヌクレオチドをプライマ
ーとしてＰＣＲを行った後、増幅されたＤＮＡ断片をBs
pHI とHind IIIで消化して、NcoIとHind IIIで消化した
pTrc99A にライゲーションして作製し、pHE5とした。

【０１１９】センスプライマー ＨＰＰ１０：配列番号２６ アンチセンスプライマー ＨＰＰ１２：配列番号２７

【０１２０】 タンパク質の発現 上記４種のプラスミド（pEHA1, pEHA3, pTLD7, pHE5)を
用い大腸菌JM109 株を形質転換した。pEHA1 、pEHA3 の
形質転換体はＭ９ＹＧ培地（１×Ｍ９ salt, 0.2％ gly
cerol, 0.2％ Yeast extract）で、pTLD7 、pHE5の形質
転換体はＬＢで培養し、対数増殖期の後半で１mMのIPTG
を添加後３時間培養して、5,000rpm，20分の遠心分離で
集菌した。各菌体約0.2 ｇを１mL Lysis buffer(25mM T
ris-HCl，１mM EDTA, 10mM ２−メルカプトエタノー
ル）に懸濁後、超音波処理により菌体を破砕し、15,000
rpm ，５分間遠心分離した上清を、pTLD7 、pHE5の形質
転換体についてのみ55℃、15分間熱処理し、粗酵素液と
した。

【０１２１】 酵素活性の測定 表２に示す組み合わせで等量混合し、ＨｅｐＰＳ活性を
調べた。下記の組成で37℃、１時間反応を行ない、前述
と同様に生成物をブタノールで抽出後、放射能量の測定
および逆相ＴＬＣによる生成物の分析に用いた。

【０１２２】 crude homogenate 各１μｇ Tris-HCl(pH8.0) 50mM MgCl₂ 1mM NH₄ Cl 50mM 2-メルカプトエタノール 50mM ＦＰＰ 25μＭ 〔１−^１４Ｃ〕ＩＰＰ（54Ci/mol) 0.46 μ
M

【０１２３】pEHA1 の発現産物であるポリペプチドＧＥ
ＲＣ１〔pEHA1 （ＧＥＲＣ１）という〕とpEHA3 の発現
産物であるポリペプチドＧＥＲＣ３〔pEHA3 （ＧＥＲＣ
３）という〕との組合せ、およびpEHA1 （ＧＥＲＣ１）
とpHE5の発現産物であるポリペプチドＨｅｐ２〔pHE5
（Ｈｅｐ２）という〕との組み合わせの時にプレニル二
リン酸合成酵素活性を示し（表２）、生成物の分析から
両者ともＨｅｐＰＰを合成したことを確認した（図1
1）。

【０１２４】

【表２】

【０１２５】 熱安定性の比較 ポリペプチドＧＥＲＣ１、ＧＥＲＣ３は常温菌バチルス
・ズブチリス由来であり、Ｈｅｐ２は中等度好熱菌バチ
ルス・ステアロサーモフィラス由来である。そこで、pE
HA1 （ＧＥＲＣ１）＋pEHA3 （ＧＥＲＣ３）の組合せ、
およびpEHA1 （ＧＥＲＣ１）＋pHE5（Ｈｅｐ２）の組み
合わせで得たＨｅｐＰＳの至適反応温度および熱安定性
を比較した。

【０１２６】pEHA1 （ＧＥＲＣ１）＋pEHA3 （ＧＥＲＣ
３）の組合せ、およびpEHA1 （ＧＥＲＣ１）＋pHE5（Ｈ
ｅｐ２）の組み合わせで、10、15、20、25、30、37、4
0、45、50、55、60℃で反応を行ないブタノール抽出液
の放射能量を比較した（図12）。pEHA1 （ＧＥＲＣ１）
＋pEHA3 （ＧＥＲＣ３) の組み合わせのＨｅｐＰＳの至
適反応温度が25℃であるのに対し、pEHA1 （ＧＥＲＣ
１）＋pHE5（Ｈｅｐ２）の組み合わせのＨｅｐＰＳでは
至適反応温度が40℃と15℃上昇していた。

【０１２７】さらに熱処理後の残存活性を両者で比較し
た。各組み合わせで粗酵素液を混ぜた後、37、45、50、
55℃で20分間熱処理を施した。その後、30℃で１時間反
応を行ないブタノール抽出液の放射能量を比較した（図
13）。pEHA1 （ＧＥＲＣ１）＋pEHA3 （ＧＥＲＣ３）の
組み合わせのＨｅｐＰＳは37℃の熱処理で残存活性72
％、45℃で20％、50℃で７％であるのに対し、pEHA1
（ＧＥＲＣ１）＋pHE5（Ｈｅｐ２）の組み合わせのＨｅ
ｐＰＳでは45℃の熱処理で残存活性102 ％、50℃で83％
の残存活性を示した。

【０１２８】バチルス・ズブチリス由来ＨｅｐＰＳのＧ
ＥＲＣ３に相当すると思われる成分IIは、ＧＥＲＣ１に
相当すると思われる成分Ｉに比べて熱に不安定であると
いう知見があるが（Fujii,H. et al., (1983) FEBS Let
t.,161,257) 、中等度好熱菌バチルス・ステアロサーモ
フィラス由来のＨｅｐ２（成分IIに相当する）とのハイ
ブリッド型酵素の構築により熱安定性が付与された。

【０１２９】

【発明の効果】本発明により、プレニル二リン酸合成酵
素のペプチドおよび活性型のプレニル二リン酸合成酵素
の製造方法、該酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含
む組換えベクター並びに該組換えベクターを含む形質転
換体が提供される。

【０１３０】また、本発明のプレニル二リン酸合成酵素
により合成される物質は、ビタミンＫ、ユビキノンとい
った生体内で普遍的に存在する物質の前駆体であり、重
要な生理活性物質であることから応用価値が高い。さら
に、ヘテロダイマー型プレニル二リン酸合成酵素により
生成するプレニル二リン酸はその鎖長及び構造異性体が
厳密に制御される点で有用である。

【０１３１】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１４３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： MRYLHKIELE LNRLTSRYPF FKKIAFDAEI IKLVDDLNVD ENVKCAIVAI DTSMRMQDFI NEDNKDSFVL STDVLSALFY KYLSQPFYQH DFLVLTDCVS RINELKSIRA TITDEIALHN INKQIHYMFI QPYMNNEKVV SYE*

【０１３２】配列番号：２ 配列の長さ：３２５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： MIALSYKAFL NPYIIEVEKR LYECIQSDSE TINKAAHHIL SSGGKRVRPM FVLLSGFLND TQKDDLIRTA VSLELVHMAS LVHDDYIDNS DMRRGNTSVH IAFDKDTAIR TGHFLLARAL QNIATINNSK FHQIFSKTIL EVCFGEFDQM ADRFNYPVSF TAYLRRINRK TAILIEASCH LGALSSQLDE QSTYHIKQFG HCIGMSYQII DDILDYTSDE ATLGKPVGSD IRNGHITYPL MAAIANLKEQ DDDKLEAVVK HLTSTSDDEV YQYIVSQVKQ YGIEPAELLS RKYGDKAKYH LSQLQDSNIK DYLEEIHEKM LKRVY*

【０１３３】配列番号：３ 配列の長さ：４３２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列： 10 20 30 40 50 60 ATGCGTTATTTACATAAAATTGAACTAGAATTAAACCGACTTACAAGTCGATATCCATTT M R Y L H K I E L E L N R L T S R Y P F 70 80 90 100 110 120 TTCAAAAAAATTGCATTTGATGCTGAAATCATAAAGCTCGTTGATGACCTAAATGTCGAT F K K I A F D A E I I K L V D D L N V D 130 140 150 160 170 180 GAAAATGTAAAATGTGCGATTGTTGCCATTGACACGAGTATGCGTATGCAGGATTTTATC E N V K C A I V A I D T S M R M Q D F I 190 200 210 220 230 240 AATGAAGATAATAAAGACAGTTTTGTACTATCAACGGATGTTTTGAGTGCTTTATTTTAT N E D N K D S F V L S T D V L S A L F Y 250 260 270 280 290 300 AAGTATTTATCACAGCCATTTTATCAGCATGATTTTTTAGTACTGACGGATTGTGTAAGT K Y L S Q P F Y Q H D F L V L T D C V S 310 320 330 340 350 360 CGTATCAATGAATTAAAATCAATAAGAGCAACGATTACAGACGAAATTGCTTTGCATAAT R I N E L K S I R A T I T D E I A L H N 370 380 390 400 410 420 ATTAATAAACAAATTCATTATATGTTCATACAACCTTATATGAACAATGAGAAAGTGGTG I N K Q I H Y M F I Q P Y M N N E K V V 430 440 TCTTATGAGTAA S Y E *

【０１３４】配列番号：４ 配列の長さ：９７８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列： 10 20 30 40 50 60 ATGATTGCTTTGAGTTATAAAGCGTTTTTAAACCCATATATCATTGAAGTTGAAAAAAGG M I A L S Y K A F L N P Y I I E V E K R 70 80 90 100 110 120 TTATATGAGTGTATTCAGAGTGATTCTGAAACGATAAACAAGGCGGCACACCATATTTTA L Y E C I Q S D S E T I N K A A H H I L 130 140 150 160 170 180 AGTTCAGGAGGAAAGCGCGTACGTCCGATGTTTGTATTATTAAGTGGTTTTCTGAATGAT S S G G K R V R P M F V L L S G F L N D 190 200 210 220 230 240 ACACAAAAGGATGACTTGATTCGTACAGCAGTATCTCTGGAGCTCGTTCATATGGCAAGT T Q K D D L I R T A V S L E L V H M A S 250 260 270 280 290 300 CTCGTTCATGATGATTACATCGATAATAGTGATATGCGTCGTGGTAATACTTCGGTTCAT L V H D D Y I D N S D M R R G N T S V H 310 320 330 340 350 360 ATAGCTTTTGATAAAGACACAGCAATTCGCACAGGACATTTTTTATTAGCACGTGCGTTA I A F D K D T A I R T G H F L L A R A L 370 380 390 400 410 420 CAAAATATTGCAACTATCAATAATTCGAAATTCCATCAAATTTTTAGTAAAACGATACTT Q N I A T I N N S K F H Q I F S K T I L 430 440 450 460 470 480 GAAGTTTGTTTTGGTGAATTTGACCAGATGGCAGATCGATTTAATTATCCTGTATCCTTT E V C F G E F D Q M A D R F N Y P V S F 490 500 510 520 530 540 ACTGCATATTTAAGACGTATTAATCGTAAAACAGCGATACTGATAGAAGCAAGCTGTCAT T A Y L R R I N R K T A I L I E A S C H 550 560 570 580 590 600 TTAGGGGCTCTCAGCTCACAGCTTGATGAACAATCTACATATCATATAAAACAATTTGGG L G A L S S Q L D E Q S T Y H I K Q F G 610 620 630 640 650 660 CATTGTATTGGAATGAGTTATCAAATTATTGATGATATTCTCGATTACACGAGTGACGAA H C I G M S Y Q I I D D I L D Y T S D E 670 680 690 700 710 720 GCAACACTCGGTAAACCTGTCGGTAGCGATATAAGAAACGGTCATATTACGTATCCGCTT A T L G K P V G S D I R N G H I T Y P L 730 740 750 760 770 780 ATGGCCGCTATCGCTAATTTGAAAGAGCAAGATGACGATAAACTTGAAGCAGTTGTTAAA M A A I A N L K E Q D D D K L E A V V K 790 800 810 820 830 840 CATTTAACATCAACATCAGATGATGAAGTGTATCAATATATTGTTTCGCAAGTTAAACAA H L T S T S D D E V Y Q Y I V S Q V K Q 850 860 870 880 890 900 TATGGAATTGAACCTGCAGAATTGCTGAGCAGAAAATATGGTGATAAAGCGAAATATCAC Y G I E P A E L L S R K Y G D K A K Y H 910 920 930 940 950 960 TTGAGTCAATTACAGGATAGTAATATTAAAGATTATTTAGAAGAAATCCACGAAAAAATG L S Q L Q D S N I K D Y L E E I H E K M 970 980 TTAAAACGTGTTTATTAA L K R V Y *

【０１３５】配列番号：５ 配列の長さ：２５１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： MQDIYGTLANLNTKLKQKLSHPYLAKHISAPKIDEDKLLLFHALFEEADIKNNDRENYIVTAMLVQSALDTH DEVTTARVIKRDENKNRQLTVLAGDYFSGLYYSLLSEMKDIYMIRTLATAIKEINEHKIRLYDRSFKDENDF FESVGIVESALFHRVAEHFNLPRWKKLSSDFFVFKRLMNGNDAFLDVIGSFIQLGKTKEEILEDCFKKAKNS IESLLPLNSPIQNILINRLKTISQDQTYHQKVEEG

【０１３６】配列番号：６ 配列の長さ：３２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： MKLKAMYSFL SDDLAAVEEE LERAVQSEYG PLGEAALHLL QAGGKRIRPV FVLLAARFGQ YDLERMKHVA VALELIHMAS LVHDDVIDDA DLRRGRPTIK AKWSNRFAMY TGDYLFARSL ERMAELGNPR AHQVLAKTIV EVCRGEIEQI KDKYRFDQPL RTYLRRIRRK TALLIAASCQ LGALAAGAPE PIVKRLYWFG HYVGMSFQIT DDILDFTGTE EQLGKPAGSD LLQGNVTLPV LYALSDERVK AAIAAVGPET DVAEMAAVIS AIKRTDAIER SYALSDRYLD KALHLLDGLP MNEARGLLRD LALYIGKRDY

【０１３７】配列番号：７ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【０１３８】配列番号：８ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【０１３９】配列番号：９ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【０１４０】配列番号：１０ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【０１４１】配列番号：１１ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【０１４２】配列番号：１２ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【０１４３】配列番号：１３ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GGH GGH AAR CGT AWT CGT CCT TTA

【０１４４】配列番号：１４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GCN TCN YTR VTH CAY GAY GA

【０１４５】配列番号：１５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GAY ACN CGN CGN GGN CGN CC

【０１４６】配列番号：１６ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： YTK WCC TCK TCK TAA ATC ATC

【０１４７】配列番号：１７ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TAA TAA TSC ATC KCC TGC TAA

【０１４８】配列番号：１８ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ATC TAA AAT ATC ATC YTG WAT YTG RAA

【０１４９】配列番号：１９ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GTC GCT NCC NAC NGG YTT NCC

【０１５０】配列番号：２０ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： NAG RTT YTG NAR NGC YTT RTC

【０１５１】配列番号：２１ 配列の長さ：２４５１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列： CGAACGTGCT GCACGTAAAG GGCGTAACCC GCAAACTGGT GATGAAATTG AAATCCCAGC 60 AAGCAAAGTT CCAGCATTCA AAGCTGGTAA AGCATTAAAA GATGCAGTTA AATAATTGTA 120 TCTAAAGCCC ATTATGGGCT TTTTTTATTT GTTCTTATAC CATTTTTTAT AAATTATCGT 180 TATAATAATA AAAGGACAAA AATAGAGGTA GATCAATGCG TTATTTACAT AAAATTGAAC 240 TAGAATTAAA CCGACTTACA AGTCGATATC CATTTTTCAA AAAAATTGCA TTTGATGCTG 300 AAATCATAAA GCTCGTTGAT GACCTAAATG TCGATGAAAA TGTAAAATGT GCGATTGTTG 360 CCATTGACAC GAGTATGCGT ATGCAGGATT TTATCAATGA AGATAATAAA GACAGTTTTG 420 TACTATCAAC GGATGTTTTG AGTGCTTTAT TTTATAAGTA TTTATCACAG CCATTTTATC 480 AGCATGATTT TTTAGTACTG ACGGATTGTG TAAGTCGTAT CAATGAATTA AAATCAATAA 540 GAGCAACGAT TACAGACGAA ATTGCTTTGC ATAATATTAA TAAACAAATT CATTATATGT 600 TCATACAACC TTATATGAAC AATGAGAAAG TGGTGTCTTA TGAGTAAACA GTTAAATGGA 660 CAGGAAAAAA GTGAGCTTGT ACATAATGTA TTCCAGAATG TATCGACAAA GTATGACCGC 720 CTCAACGATA TCATAAGTTT TAATCAGCAT AAATCCTGGC GTAAATATAC GATGAAACAG 780 ATGAATGTTA AAAAAGGGTC GAAAGCACTT GATGTATGCT GCGGTACAGG CGACTGGACA 840 ATTCAGATGG CACAGGCTGT CGGTAAAAAT GGTCATGTTA TTGGTCTTGA TTTCAGTGAG 900 AATATGTTAA GTGTTGCACA AGGAAAAACG AATCATATAC AAAATATTGA ATTAATTCAT 960 GGTAATGCGA TGGAATTACC ATTTGAAGAT AATATATTTG ATTATACAAC GATTGGTTTT 1020 GGTTTACGTA ACTTACCGGA TTATAAAAAA GGATTAGAAG AAATGTATCG TGTATTAAAA 1080 CCTGGCGGCA TGATTGTTGT TTTAGAAACG AGCCATCCAA CAATGCCAGT ATTTAAACAA 1140 GGTTACAAAT TATATTTCAA ATACGTTATG CCCCTGTTTG GGAAAGTATT TGCTAAGTCT 1200 ATGAAGGAAT ATAGCTGGTT ACAGCAAAGT GCTTTTGAAT TTCCTGATAA GTACACGTTA 1260 GCACTTTTAA TGGCTGAAAC TGGATTTACA CACATTAAAT TTAAAGGTTT TACTGGTGGC 1320 GTGAGTGCGA TGCATCTTGC ATACAAGCCG AAAGAAAAAT AGAATGGATG ATTGCTTTGA 1380 GTTATAAAGC GTTTTTAAAC CCATATATCA TTGAAGTTGA AAAAAGGTTA TATGAGTGTA 1440 TTCAGAGTGA TTCTGAAACG ATAAACAAGG CGGCACACCA TATTTTAAGT TCAGGAGGAA 1500 AGCGCGTACG TCCGATGTTT GTATTATTAA GTGGTTTTCT GAATGATACA CAAAAGGATG 1560 ACTTGATTCG TACAGCAGTA TCTCTGGAGC TCGTTCATAT GGCAAGTCTC GTTCATGATG 1620 ATTACATCGA TAATAGTGAT ATGCGTCGTG GTAATACTTC GGTTCATATA GCTTTTGATA 1680 AAGACACAGC AATTCGCACA GGACATTTTT TATTAGCACG TGCGTTACAA AATATTGCAA 1740 CTATCAATAA TTCGAAATTC CATCAAATTT TTAGTAAAAC GATACTTGAA GTTTGTTTTG 1800 GTGAATTTGA CCAGATGGCA GATCGATTTA ATTATCCTGT ATCCTTTACT GCATATTTAA 1860 GACGTATTAA TCGTAAAACA GCGATACTGA TAGAAGCAAG CTGTCATTTA GGGGCTCTCA 1920 GCTCACAGCT TGATGAACAA TCTACATATC ATATAAAACA ATTTGGGCAT TGTATTGGAA 1980 TGAGTTATCA AATTATTGAT GATATTCTCG ATTACACGAG TGACGAAGCA ACACTCGGTA 2040 AACCTGTCGG TAGCGATATA AGAAACGGTC ATATTACGTA TCCGCTTATG GCCGCTATCG 2100 CTAATTTGAA AGAGCAAGAT GACGATAAAC TTGAAGCAGT TGTTAAACAT TTAACATCAA 2160 CATCAGATGA TGAAGTGTAT CAATATATTG TTTCGCAAGT TAAACAATAT GGAATTGAAC 2220 CTGCAGAATT GCTGAGCAGA AAATATGGTG ATAAAGCGAA ATATCACTTG AGTCAATTAC 2280 AGGATAGTAA TATTAAAGAT TATTTAGAAG AAATCCACGA AAAAATGTTA AAACGTGTTT 2340 ATTAACAATT GCAAGTAATC CGCTTACAAT GGTAAACTAT TAAGGATTTA TTAAATTACA 2400 AGAGGTAGGA TAACCATGGA AAAACCACTT TTTATGATTA AACCCTGGAC G 2451

【０１５２】配列番号：２２ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GCCATGGAAG ACATCTACGG AACTTTAGCC

【０１５３】配列番号：２３ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GGTGAATGCC ATGGAATTTA AAATGGCC

【０１５４】配列番号：２４ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CGAGATCTCT GCACACCGAA ATCGTAAC

【０１５５】配列番号：２５ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ＡＧＴＣＣＴＧＣＡＴ ＡＡＡＧＣＴＴＴＡＣ ＣＣＴ
ＴＣ

【０１５６】配列番号：２６ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GGTGAACATC ATGAAGTTAA AGGCG

【０１５７】配列番号：２７ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CGTCCTTGAA AGCTTTAATA ATCCC

【０１５８】配列番号：２８ 配列の長さ：４８６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列： GGTGGCAAGC GCATTAGACC ATTACTTGTT CTGACTACTT TAGATAGTTT AGGTGGCAAT 60 GCACATGACG GTTTACCATT TGGCATTGCG CTTGAAATGA TTCATACGTA TTCTTTAATT 120 CACGATGACT TGCCGGCAAT GGATAATGAT GACTATCGTC GCGGTAAACT CACGAATCAT 180 AAGCGTTTTG ATGAAGCAAC AGCTATACTC GCTGGAGATG CATTGCTCAC TGATGCTTTT 240 CAATGCATTT TAAATACGCA GTTAAACGCA GAAATTAAAT TATCATTGAT TAATTTATTA 300 AGTACTGCTT CTGGATCTAA TGGCATGGTT TACGGCCAAA TGCTCGATAT GCAAGGTGAA 360 CATAAAACAT TGACATTAAA TGAACTGGAA CGTATTCACA TACATAAAAC CGGTGANTTG 420 ATTCGTGCAG CANTTGTAAG TGCAGGTATC ATANTGANTT TTANTGATGC ACAANTGAGC 480 AACTCA 486

【０１５９】配列番号：２９ 配列の長さ：７４１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列： ATGAGAAAGTGGTGTCTTATGAGTAAACAGTTAAATGGA 39 M R K W C L M S K Q L N G CAGGAAAAAAGTGAGCTTGTACATAATGTATTCCAGAATGTATCGACAAAGTATGACCGC 99 Q E K S E L V H N V F Q N V S T K Y D R CTCAACGATATCATAAGTTTTAATCAGCATAAATCCTGGCGTAAATATACGATGAAACAG 159 L N D I I S F N Q H K S W R K Y T M K Q ATGAATGTTAAAAAAGGGTCGAAAGCACTTGATGTATGCTGCGGTACAGGCGACTGGACA 219 M N V K K G S K A L D V C C G T G D W T ATTCAGATGGCACAGGCTGTCGGTAAAAATGGTCATGTTATTGGTCTTGATTTCAGTGAG 279 I Q M A Q A V G K N G H V I G L D F S E AATATGTTAAGTGTTGCACAAGGAAAAACGAATCATATACAAAATATTGAATTAATTCAT 339 N M L S V A Q G K T N H I Q N I E L I H GGTAATGCGATGGAATTACCATTTGAAGATAATATATTTGATTATACAACGATTGGTTTT 399 G N A M E L P F E D N I F D Y T T I G F GGTTTACGTAACTTACCGGATTATAAAAAAGGATTAGAAGAAATGTATCGTGTATTAAAA 459 G L R N L P D Y K K G L E E M Y R V L K CCTGGCGGCATGATTGTTGTTTTAGAAACGAGCCATCCAACAATGCCAGTATTTAAACAA 519 P G G M I V V L E T S H P T M P V F K Q GGTTACAAATTATATTTCAAATACGTTATGCCCCTGTTTGGGAAAGTATTTGCTAAGTCT 579 G Y K L Y F K Y V M P L F G K V F A K S ATGAAGGAATATAGCTGGTTACAGCAAAGTGCTTTTGAATTTCCTGATAAGTACACGTTA 639 M K E Y S W L Q Q S A F E F P D K Y T L GCACTTTTAATGGCTGAAACTGGATTTACACACATTAAATTTAAAGGTTTTACTGGTGGC 699 A L L M A E T G F T H I K F K G F T G G GTGAGTGCGATGCATCTTGCATACAAGCCGAAAGAAAAATAG 741 V S A M H L A Y K P K E K *

【図面の簡単な説明】

【図１】イソプレノイド化合物の生合成経路を示す図で
ある。

【図２】保存アミノ酸配列を基にしたプライマー設計を
示す図である。

【図３】平板転写装置を示す図である。

【図４】サザンハイブリダイゼーションの結果を示す電
気泳動写真である。

【図５】逆相ＴＬＣの結果を示すクロマトグラフの写真
である。

【図６】デリーションクローンの概略を示す図である。

【図７】本発明のＤＮＡのＯＲＦを示す図である。

【図８】各ＯＲＦを単独に持つプラスミドの構築に用い
たクローンの概略図である。

【図９】各ＯＲＦを単独に持つプラスミドを示す図であ
る。

【図１０】各ＯＲＦを単独に持つプラスミドを組み合わ
せたときの酵素活性を示す逆相ＴＬＣの結果（クロマト
グラフの写真）である。

【図１１】バチルス・ズブチリスとバチルス・ステアロ
サーモフィラスの各遺伝子を組み合わせたときの酵素活
性を示す逆相ＴＬＣの結果（クロマトグラフの写真）で
ある。

【図１２】至適反応温度を示す図である。

【図１３】熱処理後の残存活性を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:07） 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−５９１１ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−５９１２ (72)発明者 清水 直人 宮城県仙台市若林区若林１丁目８−８ (72)発明者 張 元偉 宮城県仙台市青葉区新坂町５−18 (56)参考文献 特開 平８−38168（ＪＰ，Ａ) Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏ ｌ．26，Ｎｏ．21，ｐｐ．6840−6845 （1987) Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．， Ｖｏｌ．160, Ｎｏ．２，ｐｐ．448−452 （1989) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， Ｖｏ ｌ．270，Ｎｏ．31，ｐｐ．18396− 18400 （1995) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１のアミノ酸配列を含むプレニ
   ル二リン酸合成酵素のサブユニット（Ａ）のポリペプチ
   ドおよび配列番号２のアミノ酸配列を含むサブユニット
   （Ｂ）のポリペプチドから選ばれるポリペプチドをコー
   ドするＤＮＡ。
2. 【請求項２】 サブユニット（Ａ）のポリペプチドをコ
   ードするＤＮＡが配列番号３で表されるものであること
   を特徴とする請求項１記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 サブユニット（Ｂ）のポリペプチドをコ
   ードするＤＮＡが配列番号４で表されるものであること
   を特徴とする請求項１記載のＤＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項１乃至３のいずれかの項記載のＤ
   ＮＡを含む組換えベクター。
5. 【請求項５】 請求項４記載の組換えベクターで宿主生
   物を形質転換して得られる形質転換体。
6. 【請求項６】 請求項５記載の形質転換体を培地中で培
   養し、培養物中にサブユニット（Ａ）のポリペプチドお
   よび／またはサブユニット（Ｂ）のポリペプチドを蓄積
   せしめ該ポリペプチドを採取することを特徴とするサブ
   ユニット（Ａ）のポリペプチドおよび／またはサブユニ
   ット（Ｂ）のポリペプチドの製造方法。
7. 【請求項７】 配列番号１のアミノ酸配列を含むプレニ
   ル二リン酸合成酵素のサブユニット（Ａ）のポリペプチ
   ドおよび配列番号２のアミノ酸配列を含むサブユニット
   （Ｂ）のポリペプチドから選ばれるポリペプチド。
8. 【請求項８】 配列番号１のアミノ酸配列を含むプレニ
   ル二リン酸合成酵素のサブユニット（Ａ）および配列番
   号２のアミノ酸配列を含むサブユニット（Ｂ）を遺伝子
   組み換えの手法により調製し、得られる各サブユニット
   のペプチドを混合することにより活性型プレニル二リン
   酸合成酵素を製造することを特徴とする活性型プレニル
   二リン酸合成酵素の製造方法。