KR100379832B1

KR100379832B1 - 고무나무에서 분리한 이소펜테닐 이인산 이성화효소 및 이를 이용한 고무의 제조방법

Info

Publication number: KR100379832B1
Application number: KR10-1999-0016724A
Authority: KR
Inventors: 한경환; 강훈승; 오수경; 신동호; 양재모
Original assignee: 금호석유화학 주식회사
Priority date: 1999-04-22
Filing date: 1999-05-11
Publication date: 2003-04-10
Also published as: JP2003144183A; US6316695B1; KR20000067734A; JP2000300276A; JP3416081B2

Abstract

브라질 고무나무(Hevea brasiliensis)의 유액의 cDNA 라이브러리에서 이소펜테닐 이인산(IPP) 이성화효소로(EC 5.3.3.2) 암호화되는 cDNA 클론을 클로닝하였다. 그 클론은 예상되는 분자량이 26.7 kDa인 234개 아미노산의 펩타이드로 암호화되는 연속적인 오픈 리딩 프레임을 가진다. 추론된 단백질은 4.7의 등전점을 가지는 산성이고 다른 IPP 이성화효소와 높은 서열 동일성을 나타낸다. 대장균(Escherichia coli)에서 발현된 재조합 단백질은 IPP 이성화효소 활성을 나타낸다. 개시제인 알릴 이인산을 제거한 세척된 고무 입자(WRP)를 사용하여 반응 혼합물에 IPP 이성화효소를 첨가하고 시험관내 고무의 생합성 분석을 실행하였다. 재조합 IPP 이성화효소가 고무 생합성에 있어서 염기성 5-탄소 이소프렌 단위의 중요 활성화 단계인 IPP에서 DMAPP로의 전환을 촉진하는 촉매 작용을 한다는 결과가 나타났다. 서던 분석(Southern analysis)으로 IPP 이성화효소가 브라질 고무나무의 두 유전자에 의해 암호화된다는 것을 확인했다. 노던 블랏 분석(Northern blot analysis)에서 유액으로부터 단 하나의 하이브리다이징 밴드가 검출된 반면에 잎 조직으로부터 다른 크기의 두 전사물(1.2 kb와 0.6 kb)이 검출되었다. 네일(nail)로 상처낸 나무의 분출된 유액과 잎 조직에서 추출된 RNA를 분석한 결과 상처가 IPP 이성화효소의 전사 수준을 변화시키지 않는다는 것이 나타났다.

Description

고무나무에서 분리한 이소펜테닐 이인산 이성화효소 및 이를 이용한 고무의 제조방법{ISOPENTENYL DIPHOSPHATE ISOMERASE FROM HEVEA BRASILIENSIS AND RUBBER PRODUCING METHOD USING THE SAME}

본 발명은 브라질 고무나무(Hevea Brasiliensis)에서 분리한 이소펜테닐 이인산 이성화효소와 이를 이용하여 고무를 제조하는 방법에 관한 것이다.

이소프레노이드 생합성 경로는 모든 살아있는 생물에 편재하고 세포의 구조, 전자전달, 광합성, 세포간의 신호전달, 유기체간의 상호작용에 있어 극히 중대한 역할을 하는 23,000개 이상의 화합물을 생산한다(Ramos-Valdivia et al., 1997). 수개의 중요한 화합물류는 스테롤, 카로티노이드, 돌리콜, 유비퀴논, 프레닐화된(prenylated) 단백질을 포함하는 이러한 복잡한 경로에서 파생된다(Hahn and Poulter, 1995). 이러한 화합물들은 모두 같은 빌딩 블록인 이소펜테닐 이인산(IPP)에서 파생된다. 대부분의 진핵생물에서 IPP는 메발론산 경로를 거쳐 아세틸-CoA의 세 분자들로부터 합성된다(Chappell, 1995). 최근에 메발론산과 독립된 개별적인 경로가 세균과 식물에서 발견되었다(Lichtenthaler et al., 1997: Romer et al., 1993). 이러한 경로에는 글리세르알데하이드 인산, 피루베이트(pyruvate) 및 디하이드록시아세톤 인산과 같은 3-탄소 전구체가 이용된다. IPP 이성화효소(IPI)는 IPP가 고도의 친전자성 이성체인 디메틸알릴 이인산(DMAPP)으로 상호전환하는데 촉매 작용을 한다. 이러한 두 이성체는 이소프레노이드 화합물들의 합성에서 기질로 제공된다.

이소프레노이드 생합성의 생물공학은 에센셜 오일, 약제, 고무 및 왁스와 같은 식물 화합물들의 공업적 가치 때문에 큰 관심거리가 된다. IPP와 DMAPP의 상호전환이 같은 IPP 이성화효소에 의해 촉매 될지라도 그 평형에서는 DMAPP를 생산한다(Sun et al., 1998). 이러한 이성화 반응은 이소프레노이드 생합성에 대해 속도를 제한하는 단계일 것이다. 외인성 IPI 유전자의 발현은 대장균에서 이소프레노이드 생합성을 증진시킨다(Kajiwara et al., 1997). 브라질 고무나무(H. brasiliensis)의 HMGCoA 환원효소로 형질전환시킨 유전자전환 담배 식물은 스테롤을 대조군 식물이 생산하는 양의 6배까지 과잉생산한다(Schaller et al., 1995).

천연고무(시스-1,4-폴리이소프렌)는 많은 공업적 용도에 있어 중요한 생원료이다. 비록 약 2,000종의 식물에서 고무가 생산되지만(Backhaus, 1985), 브라질 고무나무(H. brasiliensis)는 나무에 고무가 풍부하고 우량품질이며 수확이 쉽기 때문에 주로 천연고무의 공업적 원천이 되어왔다. 수요의 증가에 따라 고무 재배원의 면적이 감소한 것이 고무 생합성의 연구와 다른 고무 원천의 개발에 대한 연구를 야기시켰다. 고무 생합성의 첫 번째 단계는 IPP 이성화효소에 의해 IPP가 DMAPP로 이성화하는 반응이다. 고무 전이효소(또는 폴리메라아제)라 불리는 효소에 의해 촉매되는 5-탄소 중간물질의 연속적인 헤드-투-테일(head-to-tail) 축합반응이 고무를 산출한다고 여겨져 왔다. IPP 이성화효소 활성은 브라질 고무나무(H. brasiliensis)의 고무 유액의 C-세럼에서 발견되었다(Koyama et al., 1996; Tangpakdee et al., 1997). IPP 이성화효소의 활성부위에 직접적인(site-directed) 특이 저해제인 3,4-옥시도-3-메틸-1-부틸 이인산(OMBPP)이 존재하면 시험관내 고무 분석에서 IPP가 고무로 결합하는 것을 저해한다(Cornish, 1993).

IPP 이성화효소는 카로티노이드, 성장 조절기 및 천연고무를 포함하는 모든 이소프레노이드의 생합성에서 필수적인 단계인 IPP가 DMAPP로 전환하는 반응을 촉매한다. 이 효소는 광범위하게 다양한 생물들로부터 연구되어 왔다(Ramos-Valdivia et al., 1997). 고등 식물에서 IPP 이성화효소는 켑시쿰 크로모플라스트(Capsicumchromoplasts: Dogbo and Camara, 1987), 신코나 로부스타(Cinchona robusta)의 세포 현탁액(Romos-Valdivia et al., 1997) 및 브라질 고무나무(H. brasiliensis: Koyamaet al., 1996)로부터 정제되고 특징 지워져 왔다. 지금까지 고등식물의 IPP 이성화효소의 서열이 문헌에 나타난 것은 거의 없었다. 고등 식물의 IPP 이성화효소에 대한 완전한 유전자는 아라비돕시스(Arabidopsis: Campbell et al., 1997)와 클라키아 종(Clarkiaspp.: Blanc et al., 1996; Blanc and Pichersky, 1995)의 두 개화식물들에 대해서만 유일하게 알려져 있다. 부분적인 서열은 담배에 대해서도 알려져 있다(Accession No. Y09634). 그러나 어떤 유전자도 고무 생합성에 관련되는지 여부를 조사하지 않았다.

IPP에서 DMAPP로의 이성화반응이 고무 생합성의 첫 번째 단계이므로 IPP 이성화효소는 고무 생합성에서 중요한 역할을 할 가능성이 있다. IPP 이성화효소 활성이 헤비아(Hevea) 유액의 밑동과 C-세럼 입자에서 관찰되었지만(Tangpakdee et al., 1997), IPP 이성화효소로 암호화되는 cDNA와 그 단백질은 헤비아 고무나무에서 분리되거나 연구되지 않았다.

본 발명에서는 PCR에서 얻은 탐침(probe)을 이용하여 유액의 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 유전자를 클로닝하였다. 고무 생합성에서 IPP 이성화효소가 중대한 역할을 한다고 여겨짐에도 불구하고, 그 유전자는 30-50%(wt/wt)의 시스-1,4-폴리이소프렌(고무)을 포함하는 유액에서 풍부한 전사물로 발현되지 않는 것 같다. 개별적인 연구에서 우리는 브라질 고무나무(H. brasiliensis)의 유액에서 유전자 발현 프로화일(profile)을 연구하기 위하여 245의 발현된 서열 태그(ESTs)를 얻었다(Han et al., 1999). IPP 이성화효소를 암호화하는 유전자가 ESTs중에서 확인되지 않았다. 게다가 유액의 cDNA 라이브러리의 1 ×10⁶또는 더 작은 플러크(plaque)를 스크리닝한 최초의 시도는 하이브리다이징 cDNA 클론을 생산하는데 실패하였다. 2 ×10⁶이상의 플러크를 스크리닝한 후에 두 하이브리다이징 클론을 얻었다. DMAPP가 이소프레노이드 생합성에서 전구물질이고 반드시 이소프레노이드가 합성되는 세포에 존재하기 때문에, 유액에서 IPIHb의 낮은 전사 수준은 예상 밖의 결과였다.

도 1은 IPIHb의 내부단편(internal fragment)으로 시험한 브라질 고무나무(H. brasiliensis) 잎 게놈의 DNA의 서던블랏을 나타낸 것으로써, 여기서 레인 B, E, 및 X는 각각BamHI,EcoRI, 및XhoI로 전체 DNA를 분해한 것에 상응한다.

도 2는 IPIHb 전사물의 노던 블랏 분석을 나타낸 것으로써, 브라질 고무나무(H. brasiliensis)의 잎과 유액에서 분리한 전체 RNA를³²P로 표기된 IPIHb cDNA의 내부 단편과 하이브리디제이션하였다. 도 2에 있어서, 하부 그림은 전체 RNA와 같은 양을 로딩(loading)하는 블랏팅(blotting)전의 자외선 하에서 에티듐 브롬화물로 염색된 rRNA를 나타낸다. 레인 C와 T는 각각 처리하지 않은 대조군과 상처난 시료에 상응한다. 상처의 영향을 위하여, 다섯 개의 브라질 고무나무(H. brasiliensis)는 베어낸 사면을 따라 그 위에 여섯 개의 네일(nail)로 상처를 낸 반면에, 다른 다섯 대조군 나무에는 상처를 내지 않았다. 상처를 낸 후 약 16 시간이 되었을 때 각각의 나무에서 유액과 잎 시료를 채취하였다.

도 3은 IPP 이성화효소 활성의 분석 결과를 도시한 것으로써, 5μL의 효소액과 20μM의 [¹⁴C]IPP를 포함하는 50μL의 반응혼합물에서 IPP 이성화효소 분석을 실행하고 산에 불안정한 생성물의 방사능을 액체 섬광 계수기(liquid scintillation counter)로 측정하였다. 각각의 값은 3회 실험의 평균치이고; 효소 미첨가(No enzyme)는 세포 배양액 추출물이 없는 것; C-크루드(C-crude)는 IPTG 유도 없이 GST-IPIHb 융합단백질을 발현하는 세균성 세포의 추출물; 크루드(Crude)는 IPTG에 의해 유도된 세포 배양액의 추출물; C-정제(C-purified)는 IPTG 유도를 하지 않는 세포의 정제된 GST-IPIHb 융합단백질; 정제(Purified)는 IPTG에 의해 유도된 세포의 정제된 GST-IPIHb 융합단백질이다.

도 4는 (a) 시간 경과 및 (b) 농도에 따른 IPP 이성화효소의 효소활성을 나타낸 것으로써, 5μL의 정제된 GST-IPIHb 융합단백질을 포함하는 50μL의 반응 혼합물로 시간 경과 실험에 대한 IPP 이성화효소의 분석을 수행하고 효소량을 달리하여 10분 동안 반응을 진행시켰다.

도 5는 시험관내 고무 생합성에 대한 IPP 이성화효소의 영향을 나타낸 것으로써, 신장하는 고무 사슬로의 [¹⁴C]IPP의 결합을 고무 생합성에 효율적인 개시 분자인 FPP 없이 10mg의 WRP와 5μL의 지시된 효소액을 포함하는 50μL의 반응혼합물에서 측정하였다. 각각의 값은 3회 실험의 평균치; WRP는 WRP 만으로 고무 분석한 것; WRP+FPP는 WRP와 FPP로 분석한 것; -WRP는 WRP없이 정제된 GST-IPIHb 융합단백질로 분석한 것; C-정제(C-purified)는 IPTG 유도를 하지 않는 세포의 정제된 GST-IPIHb 융합 단백질과 WRP로 분석한 것; 정제(Pufified)는 IPTG 유도성 세포의 정제된 GST-IPIHb 융합단백질과 WRP로 분석한 것이다.

유전자 분리

브라질 고무나무(H. brasiliensis)의 유액 cDNA 라이브러리를 이용한 IPP 이성화효소 유전자를 증폭하기 위하여 아라비돕시스 탈리아나(A. thaliana: Campbell et al., 1997)의 cDNA에 기초하여 PCR 프라이머(다운스트림)를 구성하고M13 역 프라이머(업스트림)와 함께 사용하였다. PCR로 IPP 이성화효소의 암호화 영역의 부분적인 서열을 증폭하였다. PCR에 의해 유전자를 클론하기 위하여 서열정보로부터 두 PCR 프라이머(IPP-L1 및 IPP-L2)를 디자인하였고 벡터(M13 정 및 역)프라이머와 조합하여 사용하였다. IPP-L2(다운스트림)와 M13 역(업스트림)프라이머를 이용한 PCR 반응에서 약 700-bp의 단편을 산출하였다. 그러나 IPP-L1(업스트림)과 M13 정(다운스트림) 프라이머로는 증폭된 생산물을 얻지 못했다. 700-bp의 PCR 단편은 아라비돕시스 탈리아나(A. thaliana)의 cDNA 서열과 높은 서열 동일성을 나타냈고 같은 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는데 탐침으로 사용되었다. 모두 2 ×10⁶의 플러크를 스크리닝하였다. 그 플러크들을 탐침에 하이브리디제이션시키고 생체내 절제하였다. 그 결과 생성된 완전한 cDNA를 포함하는 파지미드와 그 유전자를 IPIHb로 명명하였다. 그 DNA 서열은 1,288 bp이고, 예상 분자량이 26.7 kDa인 234 아미노산의 펩티드를 암호화하는 연속적인 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF)을 갖는다(서열번호 1과 서열번호 2). 추론된 단백질은 아라비돕시스 탈리아나(A. thaliana)의 IPP 이성화효소의 등전점(pI = 6.0)보다 낮은 4.7의 등전점을 가지는 산성이다.

IPP 이성화효소의 유전자에 대한 서던 분석

IPP 이성화효소 유전자의 카피수(copy number)를 결정하기 위하여 하이브리디제이션 탐침으로 700-bp의 PCR로 증폭한 IPIHb 단편을 사용하여 서던블랏 하이브리디제이션 분석을 수행하였다. 게놈의 DNA를 BamHI, EcoRI, 및 XhoI으로 분해하였다. 이러한 효소들은 IPIHb의 암호화 영역 내에 제한부위를 가지지 않는다. 최하 55℃와 최고65℃의 엄격한 조건하에서 각각의 제한 분해물로부터 두 하이브리다이징 밴드가 관찰되었다(도 1). 이러한 결과는 IPP 이성화효소가 헤비아 고무나무에서 다중성 유전자에 의해 암호화된다는 것을 암시한다. 이것은 문헌에서의 관찰결과를 확인하는 것이다. 캠벨 등은 IPP 이성화효소를 암호화하는 두 cDNA 클론을 보고하였고 그 두 유전자가 작은 유전자족으로부터 파생되는 것이라고 추정하였다(Campbell et al., 1997). IPP 이성화효소의 다중성 동질체(isoform)는 클라르키아 브리웨리(C. breweri: Blanc et al., 1996)와 신코나 로부스타(C. robusta: Ramos-Valdivia et al., 1997)에서 설명되고 있다. 따라서 각각의 동질체의 특이적 역할이 알려지지는 않았지만 IPI 동질체의 존재는 고등식물들의 일반적인 특징이다. IPIHb의 ORF 업스트림(upstream) 바로 가까이에 연속적인 71-아미노산이 존재하는 것은 부세포의 세포소기관으로 적중되는 동질체(들)가 있다는 것을 나타낸다.

IPIHb에 대한 mRNA의 발현

유액과 잎조직에서 IPP 이성화효소 유전자의 발현을 조사하였다. 유액의 블랏(blot)에서 단 하나의 하이브리다이징 밴드(10 kb)가 검출된 반면, 잎조직의 전체 RNA를 포함하는 블랏에서 다른 크기의 두 전사물이 탐침에 하이브리디제이션되었다(도 2). 상처처리와 IPP 이성화효소의 유도능력을 시험하기 위하여 상처낸 브라질 고무나무들로부터 잎과 유액 시료를 얻었다(Oh et al., 1999). 상처난 나무들의 분출된 유액과 잎조직에서 추출된 RNA의 분석결과 상처가 IPP 이성화효소의발현 수준을 변화시키지 않는 것으로 나타났다(도 2).

대장균에서 발현된 IPP 이성화효소의 기능분석

헤비아 IPP 이성화효소로 암호화되는 클로닝된 cDNA를 더 특징 지우기 위하여 GST-IPIHb 융합 유전자를 구성하여 pGEX-IPIHb를 생산하였다. pGEX의 발현 시스템은 조 세균 분해물(crude bacterial lysates)로부터 융합단백질을 간단히 정제할 수 있는 방법이다. GST-IPIHb 융합단백질의 발현과 정제는 SDS-PAGE에 의하여 모니터하였다(자료는 나타내지 않았음). IPP 이성화효소의 효소적 활성은 세포 추출물이나 정제된 GST-IPIHb 융합단백질을 이용하여 분석하였다. 대조군 실험에는 IPTG에 의해 발현유도를 하지 않는 동일한 세균의 추출물이나 GST 단백질만을 암호화하는 cDNA를 운반하는 pGEX가 주입된 대장균의 배양액을 사용하였다.

IPP에서 DMAPP로의 전환은 반응혼합물에서 산에 불안정한 알릴 이인산으로부터 발생하는 방사능의 증가로 확인하였다. 도 3에 나타난 것과 같이 효소가 없는 반응혼합물에 대해 기본수준(basal level)의 방사능이 관찰되었다. IPTG 유도를 하지 않는 세포의 효소를 포함하는 반응 혼합물에 대해 비슷한 기본 수준의 방사능이 검출되었다. 반대로 IPTG에 의해 유도된 세포의 정제된 GST-IPIHb 융합단백질이나 조추출물을 포함하는 반응혼합물에서는 방사능의 현저한 증가가 관찰되었다. 정제된 GST-IPIHb 융합단백질을 이용한 시간 경과 실험에서 산에 불안정한¹⁴C 알릴 이인산의 방사능이 반응시간에 따라 증가하는 것이 분명하게 나타났다(도 4a). 또한, 정제된 GST-IPIHb 융합단백질의 반응혼합물에 첨가된 양에 따라 방사능이 증가하는 것을 관찰하였다(도 4b). 산에 불안정한¹⁴C 알릴 이인산에서 발생하는 방사능의 시간과 농도에 따른 증가는 GST-IPIHb 융합단백질에 의한 시험관내 IPP에서 DMAPP로의 전환이 일어났음을 나타낸다. 이러한 결과는 본 발명의 cDNA 클론이 GST-IPIHb 융합단백질의 부분으로써 기능적인 IPP 이성화효소를 암호화한다는 것을 나타낸다.

시험관내 고무 생합성에 필요한 IPP 이성화효소

새로운 고무 사슬의 형성은 GGPP, FPP, GPP 및 DMAPP와 같은 개시 분자에 IPP가 축합되어 일어난다. 그러므로 시험관내 고무 생합성의 활성 분석에 대한 일반적인 절차에서 반응혼합물에 개시제인 알릴 이인산중 하나가 포함된다. 고무 생합성에 대한 IPP 이성화효소의 역할을 시험하고 분리된 cDNA가 기능성 IPP 이성화효소를 암호화하는지에 대해 더 확인하기 위하여 개시제인 알릴 이인산을 제거하고 WRP에 IPP 이성화효소를 첨가한 반응 혼합물을 이용하여 시험관내 고무의 생합성 분석을 실행하였다. WRP를 포함하는 반응혼합물에서 고무 생합성에 효과적인 개시 분자인 FPP가 필요하다는 것이 분명하게 나타났다(도 5). GST-IPIHb 융합 단백질에 대한 같은 cDNA 클론을 가진 비유도성 대장균 세포의 세균추출액을 포함하는 반응 혼합물은 [¹⁴C]IPP 결합의 기본수준을 나타냈다. 반대로, 정제된 GST-IPIHb 융합단백질과 WRP를 포함하는 반응혼합물에서는 고무로 [¹⁴C]IPP 결합의 현저한 증가가 관찰되었다(도 5). WRP가 없는 반응혼합물에서는 고무로의 [¹⁴C]IPP 결합이 관찰되지 않았고 WRP와 GST-IPIHb 융합단백질을 포함하는 반응혼합물에서 방사능이 증가한 것은 새로운 고무사슬의 합성으로 인한 것이다. 이러한 결과는 본 발명의 cDNA 클론으로부터 암호화된 GST-IPIHb 융합단백질이 고무생합성에서 5-탄소 이소프렌 기본단위의 중요한 활성 단계인 IPP에서 DMAPP로의 전환에 있어서 촉매로 작용을 한다는 것을 나타낸다.

본 발명에서는 IPP 이성화효소를 암호화하는 능력이 있는 DNA 서열(IPIHb DNA 서열)을 분리하였고, IPIHb DNA 서열을 포함하는 하이브리드 벡터와 형질전환된 숙주를 제공한다.

본 발명의 범위에 있어서, 'IPIHb'는 헤비아 브라실리엔시스(Hevea brasiliensis)에서 분리된 IPP 이성화효소를 언급하는 것이다. 여기에서 사용되는 '하이브리드 벡터(Hybrid vector)'는 IPIHb를 생산할 능력이 있는 헤비아나 다른 생물의 DNA 또는 cDNA를 가진 플라스미드, 박테리오파지, 식물 바이러스 또는 다른 벡터들로부터 DNA 결합(ligation)에 의해 형성되는 벡터를 언급하는 것이고, 그러한 식물이나 다른 생물들은 여기서 총괄적으로 '식물 원료' 라고 언급한다.

본 발명의 실시예에서, 예를 들면 헤비아의 식물 원료들은 cDNA를 생산하는데 사용된다. cDNA 라이브러리는 식물 원료의 전체 RNA에서 분리된 mRNA 서열에 근거하여 구성된다. cDNA의 첫 번째 가닥은 분리된 mRNA를 주형으로 사용하고, 올리고 dT 서열을 프라이머(primer)로 사용하고, 역전사효소를 사용하여 효소에 의해 합성할 수 있다. 첫 번째 가닥의 cDNA를 구성한 후에 cDNA의 두 번째 가닥은 첫 번째 가닥의 cDNA를 주형으로 사용하고, 효소로 DNA 폴리메라아제를 사용하여 효소에 의해 합성할 수 있다. 그 결과 생성된 이중가닥의 cDNA 분자를 적절한 벡터에 삽입하여 cDNA 라이브러리를 생산한다.

그 결과 생성된 cDNA 라이브러리를 IPIHb 유전자에 특이적인 핵산 탐침(IPIHb 유전자 특이 탐침)을 사용하여 IPIHb 유전자의 완전한 서열에 대하여 스크리닝할 수 있다. IPIHb 유전자를 포함하는 세포를 증식시키고 IPIHb를 암호화하는 다량의 DNA 서열을 추출할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, IPIHb 유전자의 동정을 위한 핵산 탐침을 IPP 이성화효소의 특이적 프라이머를 사용하여 cDNA 라이브러리의 PCR 증폭에 의해서 생산한다.

IPIHb 유전자에 대해 특정한 라벨된 핵산 탐침과 하이브리디제이션한 식물 cDNA 또는 다른 생물의 cDNA를 확인하고 분리할 수 있다. 분리된 DNA를 벡터 DNA에 결합하여 하이브리드 벡터를 생산할 수 있다. 하이브리드 벡터는 적절한 숙주를 형질전환하고 숙주에서 IPP 이성화효소의 생산을 유도하는 데 사용된다.

본 발명의 범위에서 사용하기 적합한 벡터는 숙주세포로 전이되거나 숙주세포를 감염할 수 있고 숙주세포내에서 복제 가능한 플라스미드 또는 바이러스이다. 바람직한 실시예에서, 하나의 적합한 벡터는 벡터 DNA의 중요치 않은 영역에 완전한 IPIHb DNA 서열을 삽입하여 운반할 수 있는 능력을 가진 것이다.

적절하게 형질전환된 숙주는 IPIHb DNA 서열을 발현할 수 있는 능력을 가진 것이다. 바람직한 실시예에서 적절하게 형질전환된 숙주는 IPP를 고무로 전환하는 촉매작용을 할 수 없는 것이다. 그러한 숙주는 식물, 세균 또는 진균류일 수 있다. 식물 숙주는 담배(tabacco) 종, 풀(grass) 종 또는 사철(perennial)식물 종과 같은 1년생 식물일 수 있다. 세균은 예를 들어 대장균, 바실러스 종(Bacillusspecies) 또는 아그로박테리움 종(Agrobacteriumspecies)과 같은 세균일 수 있다. 진균류는 라크타리우스 종(lactarius species)과 아스퍼질러스 종(Aspergillusspecies)의 그룹에서 선택된다.

본 발명의 다른 실시예에서는 프로모터(promoter)의 조절하에 유전자를 배열하도록 IPIHb 유전자를 포함하는 DNA 단편을 적절한 프로모터에 결합시킬 수 있다. 적절한 프로모터는 형질전환된 숙주에서 기능할 수 있는 것이다. 예를 들어 형질전환된 숙주가 식물이라면 노팔린 합성효소(nopaline synthetase)에 대한 프로모터인 Pnos와 같은 식물 프로모터에 IPIHb 유전자를 결합시키고, 형질전환된 숙주가 세균이라면 IPIHb 유전자를 대장균의 trp 또는 tac 프로모터와 같은 세균성 프로모터에 결합시킨다. 선택적으로 IPIHb 유전자는 콜리플라워 모자이크 바이러스의 16S와 35S 프로모터와 같은 바이러스성 프로모터에 결합시킬 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 게놈의 DNA 라이브러리 대신에 cDNA 라이브러리를 전체 RNA에서 분리된 mRNA를 사용하여 구성한다. 전체 RNA는 식물 원료로부터 쿠시 등에 의한 방법과 실질적으로 동일한 방법으로 얻는다{Kush et al. Proc Natl Acad Sci U S A87, 1787-1790 (1990)}. mRNA를 분리하기 위해 식물 원료는 고무를 합성하는 능력이 있는 식물이나 생물로부터 얻을 수 있다. 예를 들어 헤비아 나무가 유액에서 고무를 생산한다면 IPIHb를 암호화하는 mRNA를 헤비아의 유액에서 얻을 수 있다.

여기서 mRNA의 분리에는 mRNA의 3' 말단에 존재하는 폴리(A)그룹이 이용된다. 3' 말단은 다른 RNA 종으로부터 mRNA를 분리하는데 사용된다. 셀룰로오즈 칼럼상의 T 잔기와 mRNA의 폴리(A)그룹의 결합에 의하여 올리고(dT) 셀룰로오즈 칼럼의 크로마토그래피로 분리한다. 결합되지 않은 RNA는 칼럼에서 유리되어 세척되고 mRNA는 A-T 결합(duplex)을 불안정하게 하는 완충용액으로 용출할 수 있다. 그 다음 RNA의 농도는 분광광도계로 측정한다. 분리된 mRNA는 첫 번째 가닥의 cDNA분자를 합성하는데 주형으로 사용된다. 차례로 cDNA의 첫 번째 가닥은 DNA의 두 번째 가닥을 합성하는데 주형으로 사용된다{Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, Cold Spring Harbor, N.Y. 1987}.

예를 들어 λ벡터와 같이 벡터내 DNA의 중요하지 않는 영역에 완전한 유전자를 가질 수 있고 숙주 세포에서 복제하는 능력이 있는 적합한 벡터는 DNA 단편과 결합하여 재조합 DNA 분자의 라이브러리를 산출할 수 있다. 이러한 재조합 분자를 시험관내 패키징(packaging)하여 재조합 클론으로 이루어진 감염성 파지 스톡(phage stock)을 얻을 수 있다. cDNA 라이브러리가 cDNA를 발현한다면 이러한 방법으로 구성된 재조합 DNA 라이브러리를 핵산탐침이나 항체를 이용한 고무생합성에서 중요한 다른 유전자들과 IPIHb 유전자의 분리에 사용할 수 있다.

IPIHb 유전자의 검출을 위한 핵산 탐침은 예를 들어 종래 기술에 의한 바이오틴의 일부분이나 3' 또는 5'말단에 [.sup.³²P]-인산으로 탐침을 라벨링함으로써 매우 적은 양의 유전자를 검출하기 위해 수식할 수 있다(Sambrook et al.,MOLECULAR CLONING, Cold Spring Harbor, N.Y. 1987). 방사능 표기는 통상적으로 뉴 잉글랜드 뉴클리어 또는 아메르샴 사의 유용한 3' 또는 5' 말단 라벨링 키트(labeling kit)를 사용하여 수행한다. DNA 라이브러리에서 IPIHb 유전자는 라벨된 탐침과 하이브리디제이션하여 동정할 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에서 헤비아 cDNA 라이브러리를 포함하는 재조합 λ파지는 [.sup.³²P]로 라벨된 IPIHb의 특정 올리고뉴클레오티드를 사용하여 샘브룩 등(Sambrook et al., loc. cit.)의 방법에 따라 스크리닝한다.

IPIHb 유전자를 가지며 IPIHb 유전자의 특이 탐침과 양성 반응하는 클론을 분리하고 cDNA 라이브러리 키트에 의한 프로토콜(protocol)에 따라 생체내 절제에 의해 플라스미드 내로 전환시킨다. 파지 DNA를 플라스미드로 전환시키는 이러한 방법은 헤비아 cDNA 라이브러리가 그러한 생체내 절제를 위해 디자인된 스트라타진사(Stratagene)의 유니-잽 Ⅱ 벡터(Uni-ZAP II vector)내로 구성될 때 실행할 수 있다. 그 플라스미드는 이러한 유전자를 다량으로 생산하기 위하여 대장균으로 전이되고 보전된다. IPIHb 유전자를 가진 플라스미드를 포함하고 있는 대장균 세포들을 증식하여 다량의 IPIHb DNA 서열을 생산한다. 이러한 DNA를 종래의 기술로 형질전환된 숙주에서 추출할 수 있다.

본 발명은 헤비아 고무 미립자 단백질(IPIHb)을 암호화하는 DNA 서열과 재조합 DNA 분자 및 재조합 단백질의 생산방법, 서열을 포함하는 벡터, 생산된 재조합 단백질의 배양 및 재조합 단백질의 생산에 중요한 물질들에 관한 것이다. 고무 생합성에 대해 사실상 IPIHb와 같은 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 IPIHb를 암호화하는 DNA 서열을 제공한다.

IPIHb를 암호화하는 cDNA를 포함하는 분리된 재조합 벡터를 다른 진핵 또는 원핵 생물의 숙주로 전이할 수 있고, 그 숙주안에서 IPIHb DNA가 발현되어 고무 생합성을 위한 기능성 IPIHb를 생산할 것이다.

[실시예]

다음의 실시예는 본 발명의 특징을 더 자세히 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위를 한정짓는 것은 아니다.

(실시예1)

식물 원료

말레이시아의 셀랑고르에 위치한 말레이시아 고무 연구소에서 성장한 성숙된 고무 식물들(H. brasiliensisclone RRIM600)에서 유액과 잎 시료를 얻었다. 고무나무에 칼자국을 내어 스며 나오는 유액을 실온이나 얼음에서 같은 부피의 2 X RNA 추출 완충용액(0.1M 트리스·염산, 0.3M 염화리튬, 0.01M EDTA, 10% SDS, pH 9.5)에 계속적으로 혼합하면서 받았다(Han et al., 1999). 수집한 시료를 액상 질소에서 냉동시키고 드라이 아이스에 넣어 실험실로 수송하였다.

전체 RNA와 폴리(A) ⁺ RNA의 분리

키아젠사(Qiagen Inc)의 키아젠 르네시 플랜트 미니키트(Qiagen Rneasy Plant Minikit)를 사용하여 유액에서 RNA를 추출하였다(Oh et al., 1999). 키아젠사의 올리고텍스-dT^TMmRNA 키트(Oligotex-dT^TMmRNA kit)를 사용하여 폴리(A)⁺RNA를 분리하였다.

브라질 고무나무 IPP 이성화효소(IPIHb)의 PCR 증폭

유액의 cDNA 라이브러리를 주형으로 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 아라비돕시스 IPP 이성화효소의 +606bp∼+629bp의 서열에 상응하는 PCR 프라이머(IPP-A2)를 디자인하였다. IPIHb cDNA의 단편을 증폭하는데 사용한 프라이머는 IPP-A2(5'-GTAATCAAGTTCATGCTCTCCCCA-3')와 M13 역 프라이머이다. PCR은 72℃에서 5분간 열로 전처리하고 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초간 30회 반복하고 72℃에서 7분간 최후 증폭하여 수행하였다. PCR 생성물을 아가로스 겔에서 잘라내고 키아젠사의 키액스Ⅱ 아가로스겔 추출 키트(QUAEX Ⅱ Agarose Gel Extraction Kit)로 정제하였다. 정제된 PCR 생성물을 프로메가사(Promega)의 pGEM^R-T 벡터에 삽입하였다. 플라스미드를 변종 XL1-블루 대장균에 형질전환시키고 분리하여 서열을 확인하였다. 헤비아 IPP 이성화효소의 PCR에서 증폭된 서열에 기초하여 다운스트림 프라이머로 IPP-L1 (5'-TATGAGCTACTCCTTCAGCAACGCTCT-3')과 IPP-L2(5'-ATCAAGTTCATGCTCTCCCCACTTTCC-3')의 두 프라이머를 디자인하였다. IPP-L1과 IPP-L2 프라이머를 각각 M13 정(forward) 및 역(reverse) 프라이머와 함께 사용하였다.

유액 cDNA 라이브러리의 구성 및 스크리닝

상기에 설명된 것과 같이 유액에서 얻은 폴리(A)⁺RNA를 사용하여 스트라타진사의 유니-잽Ⅱ 벡터내에 cDNA 라이브러리를 구성하였다. 유액 cDNA 라이브러리로부터 부분적인 IPP 이성화효소 단편을 증폭하기 위해 프라이머(IPP-L2, 다운스트림)와 M13 역 프라이머(업스트림)를 사용하였다. 유액 cDNA 라이브러리의 2×10⁶플러크를 스크리닝하기 위해 700-bp PCR 생성물을 사용하였다(Oh et al., 1999). 탐침에 하이브리디제이션된 cDNA 클론을 cDNA 라이브러리 키트에 의한 프로토콜에 따라 생체내 절제하고 서열을 확인하였다. 완전한 cDNA 삽입물을 가지는 클론을 분리하여 IPIHb라고 명명하였다.

cDNA 클론의 염기서열과 컴퓨터 분석

프로메가사의 위자드 플러스 SV 미니프레프스 DNA 정제 시스템 키트(Wizard^RPlus SV Minipreps DNA Purification System kit)를 사용하여 알칼리 용해 방법(Sambrook et al., 1989)으로 염기서열 반응에 대한 플라스미드 DNA를 얻었다. 형광성 염료로 라벨된 M13 정 또는 역 프라이머(키트에 의해 제공된)를 사용하여 파머시아사(Pharmacia Biotech)의 알프 익스프레스 자동판독 염기서열 키트(ALF Express AutoRead Sequencing kit)로 염기서열 반응을 수행하였다. 퍼킨 엘머사(Perkin Elmer Co.)의 알프 자동 염기서열기(ALF automatic sequencer)로 전기영동하여 뉴클레오티드 서열을 얻었다.

(실시예 2)

상처 처리

베어낸 사면을 따라 그 위에 여섯 네일(nail)로 상처를 낸 고무 나무에서 유액과 잎 시료를 얻었다(Oh et al., 1999).

서던블랏분석과 노던블랏분석

성숙한 브라질 고무나무(H. brasiliensisRRIM600) 잎조직의 게놈의 DNA를 얻었다(Oh et al., 1999). 게놈의 DNA(8-10㎍)를 바람직한 제한효소로 분해하고 0.8 %(w/v)의 아가로스 겔에서 전기영동하여 크기별로 분별하고 블랏팅하고 UV 방사로 아머샴사(Amersham Life Science)의 하이본드-N(Hybond-N) 나일론 막에 교차결합하였다. 노던블랏에서는 20㎍의 전체 RNA를 1.2% 아가로스-포름알데하이드 겔상에서 전기영동하고 서던 블랏에서와 같이 교차결합하였다. 두 하이브리디제이션을 위한 탐침으로는 PCR 에서 얻은³²P로 표기된 700-bp의 IPIHb cDNA의 단편을 사용하였다. 노던분석은 55℃에서 서던분석은 65℃에서 18시간동안 0.9M 염화나트륨, 50mM 인산나트륨(pH 7.6), 5 mM EDTA, 0.4% (w/v) SDS, 5 X 덴하르츠 용액(Denhardts solution), 200㎍ 연어 정충(salmon sperm) DNA에서 하이브리디제이션하였다. 엄격하게 최하 55℃ 또는 최고 65℃에서 0.5 X SSPE, 0.1% SDS에서 두 번 그리고 0.1 X SSPE, 0.1% SDS에서 두 번씩 블랏(blot)을 세척하였다. 그 막을 70℃에서 X-ray 필름에 밤새 노출하였다.

(실시예 3)

대장균에서 IPIHb 단백질의 발현

IPIHb 유전자를 파머시아사의 pGEX(IPTG-유도성 발현벡터)의 EcoRI-XhoI 부위에 클로닝하여 pGEX-IPIHb를 구성하였다. pGEX-IPIHb로 형질전환된 대장균 XL1-블루를 50mg/L의 암피실린이 포함된 루리아 브로스(Luria Broth; LB)에서 강하게 통기하여 30℃에서 중앙정지상(mid-stationary phase)까지 배양하였다. 0.1 mM의 농도가 되게 IPTG를 배양액에 첨가한 후 다시 6시간 동안 배양하였다. 이후의 모든 단계는 4℃에서 수행하였다. 원심분리(5000 X g, 10 min)하여 얻은 세포를 0.1M의 인산칼륨(pH 7.4)으로 세척한 후 초음파로 분쇄하였다. 0.1M의 인산칼슘(pH 7.4)을 포함하는 1ml의 완충용액에서 30초 동안 초음파 처리하는 것을 30초 간격으로 6회 반복하였다. 균질된 시료를 10분 동안 10,000 X g으로 원심분리하고 그 상등액을 램리의 표준방법(Laemmli, 1970)에 따라 12.5%의 석판겔(slab gels)로 SDS-PAGE하였다. 단백질을 쿠마시 브릴리안트 블루 R-250(Coomassie Brilliant Blue R-250)으로 염색하였다. 파머시아사의 글루타치온 세파로스 4B 친화성 매트릭스(Glutathione Sepharose 4B affinity matrix)를 사용하여 그 융합단백질을 친화성 정제하였다.

IPP 이성화효소 활성의 분석

알릴 이인산의 산성에 대한 불안정성에 기초하여 분석을 실시하였다(Satterwhite, 1985). 반응혼합물은 총부피 50μl로 pH7.5, 100mM 트리스-염산, 1.5mM 염화마그네슘, 1.5mM 염화망간, 2mM DTT, 25mM KF, 20μM 아머샴사의 [¹⁴C]IPP (55 mCi mmol^-1) 및 적당량의 효소액을 포함한다. 30℃에서 10분 동안 반응시킨 후 200μL의 메탄올:염산(4:1, v/v)과 0.1μL의 물을 첨가하여 37℃에서 15분 동안 반응을 진행시켰다. 알릴 생성물을 2 X 200μl의 톨루엔으로 추출하였다. 화합된 추출물을 베크만사(Beckman)의 레디 솔브 HP 섬광 칵테일(Ready Solv HP scintillation cocktail) 4ml와 혼합하고 베크만사의 LS 6500 액체 섬광 계수기를 사용하여 방사능을 측정하였다.

시험관내 고무생합성 분석

원심분리/부양(centrifugation/flotation)절차를 반복하여 세척된 고무 입자(WRP)를 준비하였다(Cornish and Backhaus, 1990; Siler and Cornish, 1993). 반응혼합물의 시험관내 고무 생합성 활성을 상기에 설명된 방법으로 측정하였다(Cornish and Backhaus, 1990; Siler and Cornish, 1993). pH 7.5, 100mM 트리스-염산, 80μM 아머샴사의 [¹⁴C]IPP (55 mCi mmol^-1), 20mM FPP, 1mM 황산마그네슘 및 1mM DTT를 포함하는 50μl의 반응혼합물에 WRP를 첨가하여 25℃에서 6시간 동안 반응시켰다. 고무생합성에 대한 IPP 이성화효소의 역할을 조사하기 위하여, 고무생합성의 유용한 개시분자인 FPP를 반응혼합물에서 제거하고 그 대신에 IPP를 고무생합성의 개시분자중 하나인 DMAPP로 전환시키기 위해 적당량의 IPP 이성화효소를 첨가하였다. 대조군에는 고무 전이효소 활성에 필요한 Mg²⁺이온과 킬레이트를 형성하는 25mM의 EDTA를 반응혼합물에 첨가하였다. 그 결과 생성된 [¹⁴C]IPP가 결합된 고무의 양을 여과법 또는 벤젠 추출법으로 측정하였다. 여과법에 서는 반응혼합물을 와트만사(Whatman)의 0.02 또는 0.1μm의 아노디스크 막(anodisc membrane)을 통하여 여과하고 그 필터를 1M의 염산과 95% 에탄올로 여러번 세척하여 세척된 필터에 잔재해 있는 방사능을 베크만사의 액체 섬광 계수기로 측정하였다(Cornish and Backhaus, 1990). 벤젠 추출법에 서는 반응혼합물을 2배 부피의 벤젠으로 3번 추출하고 벤젠 추출물을 베크만사의 레디 솔브 HP 섬광 칵테일과 혼합하여 액체 섬광 계수기로 방사능을 측정하였다.

상술한 바에 의하면 본 발명은 고무의 생합성에 중요한 역할을 하는 브라질 고무나무(Hevea Brasiliensis)에서 분리한 IPP 이성화효소와 이를 이용하여 고무를 제조하는 방법을 제공하는 이점이 있다.

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 헤비아 IPP 이성화효소를 암호화하는 핵산 분자.
서열번호 1의 핵산서열을 암호화하는 핵산 분자.
삭제
삭제
청구항 1의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
청구항 2의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
제5항에 있어서, 상기 헤비아 IPP 이성화효소를 암호화하는 핵산 분자를 프로모터 분자에 효과적으로 결합시킨 것을 특징으로 하는 벡터.
제6항에 있어서, 상기 헤비아 IPP 이성화효소를 암호화하는 핵산 분자를 프로모터 분자에 효과적으로 결합시킨 것을 특징으로 하는 벡터.
제7항에 있어서, 상기 프로모터는 세균 프로모터, 식물 프로모터 및 바이러스 프로모터로 이루어진 그룹에서 선택된 것을 특징으로 하는 벡터.
제8항에 있어서, 상기 프로모터는 세균 프로모터, 식물 프로모터 및 바이러스 프로모터로 이루어진 그룹에서 선택된 것을 특징으로 하는 벡터.
제5항에 있어서, 상기 벡터는 숙주에 전이되어 존재가능하고 숙주내 복제가능한 것임을 특징으로 하는 벡터.
제6항에 있어서, 상기 벡터는 숙주에 전이되어 존재가능하고 숙주내 복제가능한 것임을 특징으로 하는 벡터.
삭제
삭제
제 11항에 있어서, 상기 숙주는 식물, 세균, 효모 및 진균류로 이루어진 그룹에서 선택된 것임을 특징으로 하는 벡터.
제 12항에 있어서, 상기 숙주는 식물, 세균, 효모 및 진균류로 이루어진 그룹에서 선택된 것임을 특징으로 하는 벡터.
청구항1의 핵산 분자를 제공하는 단계와 상기 핵산분자를 식물, 세균, 효모 및 진균류의 숙주세포에 전이하여 형질전환된 숙주 세포를 생산하는 단계와 상기 형질전환된 숙주를 적절한 배지에 배양하여 IPIHb를 생산하고 상기 IPIHb를 이용하여 시험관내 고무 합성을 촉진하는 단계로 이루어진 시험관내 고무의 제조방법.
청구항 2의 핵산 분자를 제공하는 단계와 상기 핵산분자를 식물, 세균, 효모 및 진균류의 숙주세포에 전이하여 형질전환된 숙주 세포를 생산하는 단계와 상기 형질전환된 숙주를 적절한 배지에 배양하여 IPIHb를 생산하고 상기 IPIHb를 이용하여 시험관내 고무 합성을 촉진하는 단계로 이루어진 시험관내 고무의 제조방법.
청구항 1의 핵산 분자를 제공하는 단계와 상기 핵산분자를 식물, 세균, 효모 및 진균류의 숙주세포에 전이하여 형질전환된 숙주 세포를 생산하는 단계와 상기 형질전환된 숙주를 생체내 고무의 생산을 위하여 적합한 환경에서 배양하는 단계로 이루어진 생체내 고무의 제조방법.
청구항 2의 핵산 분자를 제공하는 단계와 상기 핵산분자를 식물, 세균, 효모 및 진균류의 숙주세포에 전이하여 형질전환된 숙주 세포를 생산하는 단계와 상기 형질전환된 숙주를 생체내 고무의 생산을 위하여 적합한 환경에서 배양하는 단계로 이루어진 생체내 고무의 제조방법.