JP3416081B2 - ゴムの木から分離したイソペンテニル２リン酸異性化酵素及びこれを用いたゴムの製造方法 - Google Patents
ゴムの木から分離したイソペンテニル２リン酸異性化酵素及びこれを用いたゴムの製造方法Info
- Publication number
- JP3416081B2 JP3416081B2 JP18416799A JP18416799A JP3416081B2 JP 3416081 B2 JP3416081 B2 JP 3416081B2 JP 18416799 A JP18416799 A JP 18416799A JP 18416799 A JP18416799 A JP 18416799A JP 3416081 B2 JP3416081 B2 JP 3416081B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ipihb
- rubber
- ipp
- leu
- cdna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F136/00—Homopolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, at least one having two or more carbon-to-carbon double bonds
- C08F136/02—Homopolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, at least one having two or more carbon-to-carbon double bonds the radical having only two carbon-to-carbon double bonds
- C08F136/04—Homopolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, at least one having two or more carbon-to-carbon double bonds the radical having only two carbon-to-carbon double bonds conjugated
- C08F136/08—Isoprene
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
- C12P5/007—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons containing one or more isoprene units, i.e. terpenes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ブラジルゴムの木
(Hevea Brasilienses)から分離したイソペンテニル２リ
ン酸異性化酵素とこれを用いてゴムを製造する方法に関
する。
(Hevea Brasilienses)から分離したイソペンテニル２リ
ン酸異性化酵素とこれを用いてゴムを製造する方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】イソプレノイド生合成経路は、全ての生
きている生物に遍在し、細胞の構造、電子伝達、光合
成、細胞間の信号（情報）伝達、有機体間の相互作用に
おいて極めて重要な役割を果たす２３，０００個以上の
化合物を生産する(Ramos-Valdivia et al., 1997)。数
個の重要な化合物類はステロール、カロチノイド、ドリ
コール、ユビキノン、プレニル化された(prenylated)タ
ンパク質を含む、かかる複雑な経路から派生される(Hah
n and Poulter, 1995)。かかる化合物等の全ては同一な
ビルディングブロックであるイソペンテニル２リン酸(I
PP)から派生される。大部分の真核生物で、ＩＰＰはメ
バロン酸経路を経てアセチル−ＣｏＡの３分子等から合
成される(Chappell, 1995)。
きている生物に遍在し、細胞の構造、電子伝達、光合
成、細胞間の信号（情報）伝達、有機体間の相互作用に
おいて極めて重要な役割を果たす２３，０００個以上の
化合物を生産する(Ramos-Valdivia et al., 1997)。数
個の重要な化合物類はステロール、カロチノイド、ドリ
コール、ユビキノン、プレニル化された(prenylated)タ
ンパク質を含む、かかる複雑な経路から派生される(Hah
n and Poulter, 1995)。かかる化合物等の全ては同一な
ビルディングブロックであるイソペンテニル２リン酸(I
PP)から派生される。大部分の真核生物で、ＩＰＰはメ
バロン酸経路を経てアセチル−ＣｏＡの３分子等から合
成される(Chappell, 1995)。
【０００３】最近、メバロン酸と独立された個別的な経
路が細菌と植物とから発見された(Lichtenthaler et a
l., 1997: Romer et al.,1993)。かかる経路にはグリセ
ルアルデヒドリン酸、ピルビン酸塩(pyruvate)及びジハ
イドロキシアセトンリン酸のような３−炭素前駆体が用
いられる。ＩＰＰ異性化酵素(IPI)は、ＩＰＰが高度の
親電子性異性体であるジメチルアリル２リン酸(DMAPP)
に相互転換することに触媒作用を行う。かかる二異性体
は、イソプレノイド化合物等の合成で基質として提供さ
れる。
路が細菌と植物とから発見された(Lichtenthaler et a
l., 1997: Romer et al.,1993)。かかる経路にはグリセ
ルアルデヒドリン酸、ピルビン酸塩(pyruvate)及びジハ
イドロキシアセトンリン酸のような３−炭素前駆体が用
いられる。ＩＰＰ異性化酵素(IPI)は、ＩＰＰが高度の
親電子性異性体であるジメチルアリル２リン酸(DMAPP)
に相互転換することに触媒作用を行う。かかる二異性体
は、イソプレノイド化合物等の合成で基質として提供さ
れる。
【０００４】イソプレノイド生合成の生物工学は、エッ
センシャルオイル、薬剤、ゴム及びワックス等のような
植物化合物等の工業的な価値のため大きく注目される。
ＩＰＰとＤＭＡＰＰの相互転換が同様なＩＰＰ異性化酵
素により触媒されるとしても、その平衡でＤＭＡＰＰが
生産される(Sun et al., 1998)。かかる異性化反応は、
イソプレノイド生合成に対して速度を制限する段階であ
るだろう。外因性ＩＰＩ遺伝子の発現は、大腸菌(E.col
i)でイソプレノイド生合成を増進させる(Kajiwara et a
l.,1997)。ブラジルゴムの木(H.brasiliensis)のＨＭＧ
ＣｏＡ還元酵素に形質転換させた遺伝子導入タバコ植物
は、ステロールを対照群植物が生産する量の６倍まで過
剰生産する(Schaller et al., 1995)。
センシャルオイル、薬剤、ゴム及びワックス等のような
植物化合物等の工業的な価値のため大きく注目される。
ＩＰＰとＤＭＡＰＰの相互転換が同様なＩＰＰ異性化酵
素により触媒されるとしても、その平衡でＤＭＡＰＰが
生産される(Sun et al., 1998)。かかる異性化反応は、
イソプレノイド生合成に対して速度を制限する段階であ
るだろう。外因性ＩＰＩ遺伝子の発現は、大腸菌(E.col
i)でイソプレノイド生合成を増進させる(Kajiwara et a
l.,1997)。ブラジルゴムの木(H.brasiliensis)のＨＭＧ
ＣｏＡ還元酵素に形質転換させた遺伝子導入タバコ植物
は、ステロールを対照群植物が生産する量の６倍まで過
剰生産する(Schaller et al., 1995)。
【０００５】天然ゴム（シス−１，４−ポリイソプレ
ン）は多くの工業的な用途において重要な生の原料であ
る。たとえば、約２，０００種の植物からゴムが生産さ
れるが(Backhaus, 1985)、ブラジルゴムの木(H.brasili
ensis)がその木にゴムが豊富で品質が優良であり収穫し
やすいので、主に天然ゴムの工業的な源泉となってき
た。需要の増加によって、ゴム栽培院の面積の減少が、
ゴム生合成の研究と他のゴム源泉の開発に対する研究を
惹起させた。ゴム生合成の第１段階は、ＩＰＰ異性化酵
素によりＩＰＰがＤＭＡＰＰに異性化する反応である。
ン）は多くの工業的な用途において重要な生の原料であ
る。たとえば、約２，０００種の植物からゴムが生産さ
れるが(Backhaus, 1985)、ブラジルゴムの木(H.brasili
ensis)がその木にゴムが豊富で品質が優良であり収穫し
やすいので、主に天然ゴムの工業的な源泉となってき
た。需要の増加によって、ゴム栽培院の面積の減少が、
ゴム生合成の研究と他のゴム源泉の開発に対する研究を
惹起させた。ゴム生合成の第１段階は、ＩＰＰ異性化酵
素によりＩＰＰがＤＭＡＰＰに異性化する反応である。
【０００６】ゴム転移酵素（またはポリメラーゼ）と呼
ばれる酵素により触媒される５−炭素中間物質の連続的
なヘッド−ツ−テール(head-to-tail)縮合反応がゴムを
産出すると思われてきた。ＩＰＰ異性化酵素の活性は、
ブラジルゴムの木(H.brasiliensis)のゴム乳液のＣ−漿
液から発見された(Koyama et al., 1996; Tangpakdeeet
al., 1997)。ＩＰＰ異性化酵素の活性部位に直接的な
(site-directed)特異阻害剤である３，４−オキシド−
３−メチル−１−ブチル２リン酸(OMBPP)が存在する
と、in vitroのゴム分析でＩＰＰがゴムに結合すること
を阻害する(Cornish, 1993)。
ばれる酵素により触媒される５−炭素中間物質の連続的
なヘッド−ツ−テール(head-to-tail)縮合反応がゴムを
産出すると思われてきた。ＩＰＰ異性化酵素の活性は、
ブラジルゴムの木(H.brasiliensis)のゴム乳液のＣ−漿
液から発見された(Koyama et al., 1996; Tangpakdeeet
al., 1997)。ＩＰＰ異性化酵素の活性部位に直接的な
(site-directed)特異阻害剤である３，４−オキシド−
３−メチル−１−ブチル２リン酸(OMBPP)が存在する
と、in vitroのゴム分析でＩＰＰがゴムに結合すること
を阻害する(Cornish, 1993)。
【０００７】ＩＰＰ異性化酵素は、カロチノイド、成長
調節物質及び天然ゴムを含む全てのイソプレノイドの生
合成で必須的な段階であるＩＰＰがＤＭＡＰＰに転換す
る反応を触媒する。広範囲に多様な生物から酵素が研究
されてきた(Ramos-Valdiviaet al., 1997)。高等植物で
ＩＰＰ異性化酵素は、カプシキュムクロモプラスト(Cap
sicum chromoplasts:Dogbo and Camara, 1987)、シンコ
ナロブスタ(Cinchonarobusta)の細胞懸濁液(Romos-Vald
ivia et al., 1997)及びブラジルゴムの木(H.brasilien
sis:Koyama et al., 1996)から精製され特徴付けられて
きた。現在まで高等植物のＩＰＰ異性化酵素の配列がほ
とんど文献に見られなかった。
調節物質及び天然ゴムを含む全てのイソプレノイドの生
合成で必須的な段階であるＩＰＰがＤＭＡＰＰに転換す
る反応を触媒する。広範囲に多様な生物から酵素が研究
されてきた(Ramos-Valdiviaet al., 1997)。高等植物で
ＩＰＰ異性化酵素は、カプシキュムクロモプラスト(Cap
sicum chromoplasts:Dogbo and Camara, 1987)、シンコ
ナロブスタ(Cinchonarobusta)の細胞懸濁液(Romos-Vald
ivia et al., 1997)及びブラジルゴムの木(H.brasilien
sis:Koyama et al., 1996)から精製され特徴付けられて
きた。現在まで高等植物のＩＰＰ異性化酵素の配列がほ
とんど文献に見られなかった。
【０００８】高等植物のＩＰＰ異性化酵素に対する完全
な遺伝子はアラビドップシス(Arabidopsis:Campbell et
al., 1997)とクラキア種(Clarkia spp.:Blanc et al.,
1996;Blanc and Pichersky, 1995)の二つの開花植物に
対してのみ唯一に知られている。部分的な配列はタバコ
に関しても知られている(Accession No. Y09634)。しか
し、いずれの遺伝子もゴムの生合成に関連するか否かが
調査されていなかった。
な遺伝子はアラビドップシス(Arabidopsis:Campbell et
al., 1997)とクラキア種(Clarkia spp.:Blanc et al.,
1996;Blanc and Pichersky, 1995)の二つの開花植物に
対してのみ唯一に知られている。部分的な配列はタバコ
に関しても知られている(Accession No. Y09634)。しか
し、いずれの遺伝子もゴムの生合成に関連するか否かが
調査されていなかった。
【０００９】ＩＰＰからＤＭＡＰＰへの異性化反応がゴ
ム生合成の第１段階であるので、ＩＰＰ異性化酵素は、
ゴム生合成で重要な役割を果たす可能性がある。ＩＰＰ
異性化酵素活性が、へベア(Hevea)乳液の根本とＣ−漿
液粒子から観察されたが(Tangpakdee et al., 1997)、
ＩＰＰ異性化酵素でコード化されるｃＤＮＡとそのタン
パク質はへベアゴムの木から分離されるかは研究されな
かった。
ム生合成の第１段階であるので、ＩＰＰ異性化酵素は、
ゴム生合成で重要な役割を果たす可能性がある。ＩＰＰ
異性化酵素活性が、へベア(Hevea)乳液の根本とＣ−漿
液粒子から観察されたが(Tangpakdee et al., 1997)、
ＩＰＰ異性化酵素でコード化されるｃＤＮＡとそのタン
パク質はへベアゴムの木から分離されるかは研究されな
かった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明ではＰＣＲから
得たプローブ(probe)を用いて乳液のｃＤＮＡライブラ
リーをスクリニングすることにより遺伝子をクローニン
グした。ゴム生合成でＩＰＰ異性化酵素が重大な役割を
果たすと考えられることにも拘わらず、その遺伝子は３
０〜５０％(wt/wt)のシス−１，４−ポリアイソプレン
（ゴム）を含む乳液から豊富な転写物に発現されなかっ
たと思われる。私は個別的な研究で、ブラジルゴムの木
(H.brasiliensis)の乳液から遺伝子発現プロファイル(p
rofile)を研究するために、２４５の発現された配列タ
グ(ＥＳＴｓ)を得た(Han et al., 1999)。ＩＰＰ異性化
酵素がコード化される遺伝子がＥＳＴｓ中から確認され
なかった。
得たプローブ(probe)を用いて乳液のｃＤＮＡライブラ
リーをスクリニングすることにより遺伝子をクローニン
グした。ゴム生合成でＩＰＰ異性化酵素が重大な役割を
果たすと考えられることにも拘わらず、その遺伝子は３
０〜５０％(wt/wt)のシス−１，４−ポリアイソプレン
（ゴム）を含む乳液から豊富な転写物に発現されなかっ
たと思われる。私は個別的な研究で、ブラジルゴムの木
(H.brasiliensis)の乳液から遺伝子発現プロファイル(p
rofile)を研究するために、２４５の発現された配列タ
グ(ＥＳＴｓ)を得た(Han et al., 1999)。ＩＰＰ異性化
酵素がコード化される遺伝子がＥＳＴｓ中から確認され
なかった。
【００１１】更に、乳液のｃＤＮＡライブラリーの１×
１０6またはもっと小さいプラーク(plaque)をスクリー
ニングした最初の試みは、ハイブリダイジングｃＤＮＡ
クローンを生産することに失敗した。２×１０6以上の
プラークをスクリーニングした後、２つのハイブリダイ
ジングクローンを得た。ＤＭＡＰＰがイソプレノイド生
合成される前駆物質であり、必ずイソプレノイドが合成
される細胞に存在するので、乳液でＩＰＩＨｂの低い転
写水準は予想外の結果であった。
１０6またはもっと小さいプラーク(plaque)をスクリー
ニングした最初の試みは、ハイブリダイジングｃＤＮＡ
クローンを生産することに失敗した。２×１０6以上の
プラークをスクリーニングした後、２つのハイブリダイ
ジングクローンを得た。ＤＭＡＰＰがイソプレノイド生
合成される前駆物質であり、必ずイソプレノイドが合成
される細胞に存在するので、乳液でＩＰＩＨｂの低い転
写水準は予想外の結果であった。
【００１２】
【課題を解決するための手段】遺伝子の分離
ブラジルゴムの木(H.brasiliensis)の乳液ｃＤＮＡライ
ブラリーを用いたＩＰＰ異性化酵素遺伝子を増幅するた
めに、アラビドップシスタリアナ(A.thaliana:Campbell
et al., 1997)のｃＤＮＡに基づいてＰＣＲプライマー
（下流）を構成し、Ｍ１３逆プライマー（上流）と共に
用いた。ＰＣＲによりＩＰＰ異性化酵素のコード化領域
の部分的な配列を増幅した。ＰＣＲにより遺伝子をクロ
ーンするために、配列情報から２個のＰＣＲプライマー
（IPP-L1及びIPP-L2)をデザインし、ベクター（M13正及
び逆）プライマーと組み合せて用いた。ＩＰＰ−Ｌ２
（下流）とＭ１３逆（上流）プライマーとを用いたＰＣ
Ｒ反応で、約７００−ｂｐの断片を産出した。
ブラリーを用いたＩＰＰ異性化酵素遺伝子を増幅するた
めに、アラビドップシスタリアナ(A.thaliana:Campbell
et al., 1997)のｃＤＮＡに基づいてＰＣＲプライマー
（下流）を構成し、Ｍ１３逆プライマー（上流）と共に
用いた。ＰＣＲによりＩＰＰ異性化酵素のコード化領域
の部分的な配列を増幅した。ＰＣＲにより遺伝子をクロ
ーンするために、配列情報から２個のＰＣＲプライマー
（IPP-L1及びIPP-L2)をデザインし、ベクター（M13正及
び逆）プライマーと組み合せて用いた。ＩＰＰ−Ｌ２
（下流）とＭ１３逆（上流）プライマーとを用いたＰＣ
Ｒ反応で、約７００−ｂｐの断片を産出した。
【００１３】しかし、ＩＰＰ−Ｌ１（上流）とＭ１３正
（下流）プライマーでは、増幅された生産物を得ること
ができなかった。７００−ｂｐのＰＣＲ断片は、アラビ
ドップシスタリアナ(A.thaliana)のｃＤＮＡ配列と高い
相同性を示し、同じｃＤＮＡライブラリーをスクリーニ
ングするためにプローブとして用いられた。全部で２×
１０6のプラークをスクリーニングした。そのプラーク
等は、プローブにハイブリダイズされ、in vivo除去に
用いた。
（下流）プライマーでは、増幅された生産物を得ること
ができなかった。７００−ｂｐのＰＣＲ断片は、アラビ
ドップシスタリアナ(A.thaliana)のｃＤＮＡ配列と高い
相同性を示し、同じｃＤＮＡライブラリーをスクリーニ
ングするためにプローブとして用いられた。全部で２×
１０6のプラークをスクリーニングした。そのプラーク
等は、プローブにハイブリダイズされ、in vivo除去に
用いた。
【００１４】その結果で生成された完全なｃＤＮＡを含
むファージミッドとその遺伝子をＩＰＩＨｂと命名し
た。そのＤＮＡ配列は１,２８８ｂｐであり、予想分子
量が２６．７ｋＤａである２３４アミノ酸のペプチドを
コードする連続的なオープンリーディングフレーム(ope
n reading frame, ORF)を有する（配列番号１と配列番
号２）。推論されたタンパク質は、アラビドップシスタ
リアナ(A.thaliana)のＩＰＰ異性化酵素の等電点（pI＝
6.0）より低い4.7の等電点を有し酸性である。
むファージミッドとその遺伝子をＩＰＩＨｂと命名し
た。そのＤＮＡ配列は１,２８８ｂｐであり、予想分子
量が２６．７ｋＤａである２３４アミノ酸のペプチドを
コードする連続的なオープンリーディングフレーム(ope
n reading frame, ORF)を有する（配列番号１と配列番
号２）。推論されたタンパク質は、アラビドップシスタ
リアナ(A.thaliana)のＩＰＰ異性化酵素の等電点（pI＝
6.0）より低い4.7の等電点を有し酸性である。
【００１５】ＩＰＰ異性化酵素の遺伝子に対するサザン
分析 ＩＰＰ異性化酵素遺伝子のコピー数(copy number)を決
定するために、ハイブリダイゼーションプローブで７０
０−ｂｐのＰＣＲで増幅したＩＰＩＨｂ断片を用いて、
サザンブロットハイブリダイゼーション分析を遂行し
た。ゲノムのＤＮＡをＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ及びＸｈ
ｏＩで消化した。かかる酵素等はＩＰＩＨｂのコード化
領域内に制限部位を有しない。最低５５℃と最高６５℃
の厳しい条件下で、それぞれの制限分解物から２つのハ
イブリダイジングバンドが観察された（図１）。
分析 ＩＰＰ異性化酵素遺伝子のコピー数(copy number)を決
定するために、ハイブリダイゼーションプローブで７０
０−ｂｐのＰＣＲで増幅したＩＰＩＨｂ断片を用いて、
サザンブロットハイブリダイゼーション分析を遂行し
た。ゲノムのＤＮＡをＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ及びＸｈ
ｏＩで消化した。かかる酵素等はＩＰＩＨｂのコード化
領域内に制限部位を有しない。最低５５℃と最高６５℃
の厳しい条件下で、それぞれの制限分解物から２つのハ
イブリダイジングバンドが観察された（図１）。
【００１６】かかる結果は、ＩＰＰ異性化酵素がへベア
ゴムの木から多重性遺伝子によりコード化されることを
暗示する。これは文献における観察結果を確認するもの
である。ケンベルらは、ＩＰＰ異性化酵素をコードする
２つのｃＤＮＡクローンを報告した。その２つの遺伝子
は、小さい遺伝子族から派生されるものと推定した(Cam
pbell et al., 1997)。ＩＰＰ異性化酵素の多重性イソ
フォーム(isoform)は、クラルキアブリウェリ(C.brewer
i:Blanc et al., 1996)とシンコナロブスタ(C.robusta:
Ramos-Valdivia et al., 1997)で説明している。
ゴムの木から多重性遺伝子によりコード化されることを
暗示する。これは文献における観察結果を確認するもの
である。ケンベルらは、ＩＰＰ異性化酵素をコードする
２つのｃＤＮＡクローンを報告した。その２つの遺伝子
は、小さい遺伝子族から派生されるものと推定した(Cam
pbell et al., 1997)。ＩＰＰ異性化酵素の多重性イソ
フォーム(isoform)は、クラルキアブリウェリ(C.brewer
i:Blanc et al., 1996)とシンコナロブスタ(C.robusta:
Ramos-Valdivia et al., 1997)で説明している。
【００１７】従って、それぞれの同質体の特異的な役割
が知られていないが、ＩＰＩ同質体の存在は、高等植物
らの一般的な特徴である。ＩＰＩＨｂのＯＲＦ上流(ups
tream)と最近接して連続的な７１−アミノ酸が存在する
ことは、副細胞の細胞小気管に的中される同質体（ら）
があるということを示す。
が知られていないが、ＩＰＩ同質体の存在は、高等植物
らの一般的な特徴である。ＩＰＩＨｂのＯＲＦ上流(ups
tream)と最近接して連続的な７１−アミノ酸が存在する
ことは、副細胞の細胞小気管に的中される同質体（ら）
があるということを示す。
【００１８】ＩＰＩＨｂに対するｍＲＮＡの発現
乳液と葉組織からＩＰＰ異性化酵素遺伝子の発現を調査
した。乳液のブロット(blot)からただ１つのハイブリダ
イジングバンド(10kb)が検出された反面、葉組織の全Ｒ
ＮＡを含むブロットで異なる大きさの２つの転写物がプ
ローブにハイブリダイゼーションされた（図２）。傷処
理とＩＰＰ異性化酵素の誘導能力を試験するために、傷
付けたブラジルゴムの木から葉と乳液の試料とを得た(O
h et al.,1999)。傷付いた木の滲み出た乳液と葉組織か
ら抽出されたＲＮＡの分析結果、傷がＩＰＰ異性化酵素
の発現水準を変化させないことを表した（図２）。
した。乳液のブロット(blot)からただ１つのハイブリダ
イジングバンド(10kb)が検出された反面、葉組織の全Ｒ
ＮＡを含むブロットで異なる大きさの２つの転写物がプ
ローブにハイブリダイゼーションされた（図２）。傷処
理とＩＰＰ異性化酵素の誘導能力を試験するために、傷
付けたブラジルゴムの木から葉と乳液の試料とを得た(O
h et al.,1999)。傷付いた木の滲み出た乳液と葉組織か
ら抽出されたＲＮＡの分析結果、傷がＩＰＰ異性化酵素
の発現水準を変化させないことを表した（図２）。
【００１９】大腸菌(E.coli)から発現されたＩＰＰ異性
化酵素の機能分析 へベアＩＰＰ異性化酵素がコードされ、クローニングさ
れたｃＤＮＡを更に特徴付けるために、ＧＳＴ−ＩＰＩ
Ｈｂ融合遺伝子を構成して、ｐＧＥＸ−ＩＰＩＨｂを生
産した。ｐＧＥＸの発現システムは、粗細菌分解物(cru
de bacterial lysates)から融合タンパク質を簡単に精
製できる方法である。ＧＳＴ−ＩＰＩＨｂ融合タンパク
質の発現と精製は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりモニターし
た（試料は示さなかった）。ＩＰＰ異性化酵素の酵素的
な活性は、細胞抽出物や精製されたＧＳＴ−ＩＰＩＨｂ
融合タンパク質を用いて分析した。対照群実験には、Ｉ
ＰＴＧにより発現誘導しない同一な細菌の抽出物やＧＳ
Ｔタンパク質のみをコードするｃＤＮＡを運搬するｐＧ
ＥＸが注入された大腸菌(E.coli)の培養液を用いた。
化酵素の機能分析 へベアＩＰＰ異性化酵素がコードされ、クローニングさ
れたｃＤＮＡを更に特徴付けるために、ＧＳＴ−ＩＰＩ
Ｈｂ融合遺伝子を構成して、ｐＧＥＸ−ＩＰＩＨｂを生
産した。ｐＧＥＸの発現システムは、粗細菌分解物(cru
de bacterial lysates)から融合タンパク質を簡単に精
製できる方法である。ＧＳＴ−ＩＰＩＨｂ融合タンパク
質の発現と精製は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりモニターし
た（試料は示さなかった）。ＩＰＰ異性化酵素の酵素的
な活性は、細胞抽出物や精製されたＧＳＴ−ＩＰＩＨｂ
融合タンパク質を用いて分析した。対照群実験には、Ｉ
ＰＴＧにより発現誘導しない同一な細菌の抽出物やＧＳ
Ｔタンパク質のみをコードするｃＤＮＡを運搬するｐＧ
ＥＸが注入された大腸菌(E.coli)の培養液を用いた。
【００２０】ＩＰＰからＤＭＡＰＰへの転換は、反応混
合物で酸に不安定なアリル２リン酸から発生する放射能
の増加により確認した。図３の図示のとおり、酵素のな
い反応混合物に対して基本水準(basal level)の放射能
が観察された。ＩＰＴＧ誘導を行わない細胞の酵素を含
む反応混合物に対して、同様な基本水準の放射能が検出
された。その反対に、ＩＰＴＧにより誘導された細胞の
精製されたＧＳＴ−ＩＰＩＨｂ融合タンパク質や粗抽出
物を含む反応混合物では、放射能の顕著な増加が観察さ
れた。精製されたＧＳＴ−ＩＰＩＨｂ融合タンパク質を
用いた時間経過実験で、酸に不安定な14Ｃアリル２リン
酸の放射能が、反応時間により増加することが明らかに
表れた（図４）。
合物で酸に不安定なアリル２リン酸から発生する放射能
の増加により確認した。図３の図示のとおり、酵素のな
い反応混合物に対して基本水準(basal level)の放射能
が観察された。ＩＰＴＧ誘導を行わない細胞の酵素を含
む反応混合物に対して、同様な基本水準の放射能が検出
された。その反対に、ＩＰＴＧにより誘導された細胞の
精製されたＧＳＴ−ＩＰＩＨｂ融合タンパク質や粗抽出
物を含む反応混合物では、放射能の顕著な増加が観察さ
れた。精製されたＧＳＴ−ＩＰＩＨｂ融合タンパク質を
用いた時間経過実験で、酸に不安定な14Ｃアリル２リン
酸の放射能が、反応時間により増加することが明らかに
表れた（図４）。
【００２１】また、精製されたＧＳＴ−ＩＰＩＨｂ融合
タンパク質の反応混合物に添加された量によって放射能
が増加することが観察された（図５）。酸に不安定な14
Ｃアリル２リン酸から発生する放射能の時間と濃度によ
る増加は、ＧＳＴ−ＩＰＩＨｂ融合タンパク質によるin
vitroＩＰＰからＤＭＡＰＰへの転換が発生されたこと
を示す。かかる結果は、本発明のｃＤＮＡクローンがＧ
ＳＴ−ＩＰＩＨｂ融合タンパク質の部分として、機能的
なＩＰＰ異性化酵素をコードすることを示している。
タンパク質の反応混合物に添加された量によって放射能
が増加することが観察された（図５）。酸に不安定な14
Ｃアリル２リン酸から発生する放射能の時間と濃度によ
る増加は、ＧＳＴ−ＩＰＩＨｂ融合タンパク質によるin
vitroＩＰＰからＤＭＡＰＰへの転換が発生されたこと
を示す。かかる結果は、本発明のｃＤＮＡクローンがＧ
ＳＴ−ＩＰＩＨｂ融合タンパク質の部分として、機能的
なＩＰＰ異性化酵素をコードすることを示している。
【００２２】in vitroゴム生合成に必要なＩＰＰ異性化
酵素 新しいゴム鎖の形成は、ＧＧＰＰ、ＦＰＰ、ＧＰＰ及び
ＤＭＡＰＰのような開始分子にＩＰＰが縮合されて発生
される。従って、in vitroゴム生合成の活性分析に対す
る一般的な手順で、反応混合物で開始剤であるアリル２
リン酸の中の１つが含まれる。ゴム生合成に対するＩＰ
Ｐ異性化酵素の役割を試験し、分離されたｃＤＮＡが機
能性ＩＰＰ異性化酵素をコード化することに関して更に
確認するために、開始剤であるアリル２リン酸を除去
し、ＷＲＰにＩＰＰ異性化酵素を添加した反応混合物を
用いて、in vitroゴムの生合成分析を実行した。
酵素 新しいゴム鎖の形成は、ＧＧＰＰ、ＦＰＰ、ＧＰＰ及び
ＤＭＡＰＰのような開始分子にＩＰＰが縮合されて発生
される。従って、in vitroゴム生合成の活性分析に対す
る一般的な手順で、反応混合物で開始剤であるアリル２
リン酸の中の１つが含まれる。ゴム生合成に対するＩＰ
Ｐ異性化酵素の役割を試験し、分離されたｃＤＮＡが機
能性ＩＰＰ異性化酵素をコード化することに関して更に
確認するために、開始剤であるアリル２リン酸を除去
し、ＷＲＰにＩＰＰ異性化酵素を添加した反応混合物を
用いて、in vitroゴムの生合成分析を実行した。
【００２３】ＷＲＰを含む反応混合物で、ゴム生合成に
効果的な開始分子であるＦＰＰが必要であることが明ら
かに表れた（図６）。ＧＳＴ−ＩＰＩＨｂ融合タンパク
質に対する同一なｃＤＮＡクローンを有する非誘導性大
腸菌細胞の細菌抽出液を含む反応混合物は、［14Ｃ］Ｉ
ＰＰ結合の基本水準を示した。反対に、精製されたＧＳ
Ｔ−ＩＰＩＨｂ融合タンパク質とＷＲＰを含む反応混合
物では、ゴムに［14Ｃ］ＩＰＰ結合の顕著な増加が観察
された（図６）。
効果的な開始分子であるＦＰＰが必要であることが明ら
かに表れた（図６）。ＧＳＴ−ＩＰＩＨｂ融合タンパク
質に対する同一なｃＤＮＡクローンを有する非誘導性大
腸菌細胞の細菌抽出液を含む反応混合物は、［14Ｃ］Ｉ
ＰＰ結合の基本水準を示した。反対に、精製されたＧＳ
Ｔ−ＩＰＩＨｂ融合タンパク質とＷＲＰを含む反応混合
物では、ゴムに［14Ｃ］ＩＰＰ結合の顕著な増加が観察
された（図６）。
【００２４】ＷＲＰのない反応混合物では、ゴムへの［
14Ｃ］ＩＰＰ結合が観察されなかったし、ＷＲＰとＧＳ
Ｔ−ＩＰＩＨｂ融合タンパク質を含む反応混合物で放射
能が増加したことは、新しいゴム鎖の合成によるもので
ある。かかる結果は、本発明のｃＤＮＡクローンからコ
ード化されたＧＳＴ−ＩＰＩＨｂ融合タンパク質が、ゴ
ム生合成で５−炭素イソプレン基本単位の重要な活性段
階であるＩＰＰからＤＭＡＰＰへの転換において触媒と
して作用することを示す。
14Ｃ］ＩＰＰ結合が観察されなかったし、ＷＲＰとＧＳ
Ｔ−ＩＰＩＨｂ融合タンパク質を含む反応混合物で放射
能が増加したことは、新しいゴム鎖の合成によるもので
ある。かかる結果は、本発明のｃＤＮＡクローンからコ
ード化されたＧＳＴ−ＩＰＩＨｂ融合タンパク質が、ゴ
ム生合成で５−炭素イソプレン基本単位の重要な活性段
階であるＩＰＰからＤＭＡＰＰへの転換において触媒と
して作用することを示す。
【００２５】本発明では、ＩＰＰ異性化酵素をコードす
る能力があるＤＮＡ配列（IPIHb DNA配列）を分離し、
ＩＰＩＨｂ ＤＮＡ配列を含むハイブリッドベクターと
形質転換された宿主を提供する。本発明の範囲におい
て、“ＩＰＩＨｂ”は、へベアブラシリエンシス(Hevea
brasiliensis)から分離されたＩＰＰ異性化酵素をい
う。ここで用いられる“ハイブリッドベクター(Hybrid
vector)”は、ＩＰＩＨｂを生産する能力があるへベア
やまたは他生物のＤＮＡまたはｃＤＮＡを有するプラス
ミド、バクテリオファージ、植物ウイルスまたは他のベ
クター等からＤＮＡ結合(ligation)により形成されるベ
クターをいうものであり、そのような植物や他の生物
は、ここで総括的に“植物原料”という。
る能力があるＤＮＡ配列（IPIHb DNA配列）を分離し、
ＩＰＩＨｂ ＤＮＡ配列を含むハイブリッドベクターと
形質転換された宿主を提供する。本発明の範囲におい
て、“ＩＰＩＨｂ”は、へベアブラシリエンシス(Hevea
brasiliensis)から分離されたＩＰＰ異性化酵素をい
う。ここで用いられる“ハイブリッドベクター(Hybrid
vector)”は、ＩＰＩＨｂを生産する能力があるへベア
やまたは他生物のＤＮＡまたはｃＤＮＡを有するプラス
ミド、バクテリオファージ、植物ウイルスまたは他のベ
クター等からＤＮＡ結合(ligation)により形成されるベ
クターをいうものであり、そのような植物や他の生物
は、ここで総括的に“植物原料”という。
【００２６】本発明の実施形態において、例えば、へベ
アの植物原料等は、ｃＤＮＡを生産することに用いられ
る。ｃＤＮＡライブラリーは、植物原料の全ＲＮＡから
分離されたｍＲＮＡの配列に基づいて構築される。ｃＤ
ＮＡの第１本鎖は、分離されたｍＲＮＡを鋳型に用い、
オリゴｄＴ配列をプライマー(primer)に用い、逆転写酵
素を用いて酵素により合成することができる。第１本鎖
のｃＤＮＡを構成した後、ｃＤＮＡの第２本鎖は、第１
本鎖のｃＤＮＡを鋳型に用い、酵素としてＤＮＡポリメ
ラーゼを用いて酵素により合成することができる。その
結果で生産された２重鎖のｃＤＮＡ分子を適切なベクタ
ーに挿入して、ｃＤＮＡライブラリーを生産する。
アの植物原料等は、ｃＤＮＡを生産することに用いられ
る。ｃＤＮＡライブラリーは、植物原料の全ＲＮＡから
分離されたｍＲＮＡの配列に基づいて構築される。ｃＤ
ＮＡの第１本鎖は、分離されたｍＲＮＡを鋳型に用い、
オリゴｄＴ配列をプライマー(primer)に用い、逆転写酵
素を用いて酵素により合成することができる。第１本鎖
のｃＤＮＡを構成した後、ｃＤＮＡの第２本鎖は、第１
本鎖のｃＤＮＡを鋳型に用い、酵素としてＤＮＡポリメ
ラーゼを用いて酵素により合成することができる。その
結果で生産された２重鎖のｃＤＮＡ分子を適切なベクタ
ーに挿入して、ｃＤＮＡライブラリーを生産する。
【００２７】その結果で生成されたｃＤＮＡライブラリ
ーをＩＰＩＨｂ遺伝子に特異的な核酸プローブ（ＩＰＩ
Ｈｂ遺伝子特異プローブ）を用いて、ＩＰＩＨｂ遺伝子
の完全な配列に対してスクリーニングすることができ
る。ＩＰＩＨｂ遺伝子を含む細胞を増殖させてＩＰＩＨ
ｂをコードする多量のＤＮＡ配列を抽出することができ
る。本発明の好ましい実施形態において、ＩＰＩＨｂ遺
伝子の同定のための核酸プローブは、ＩＰＰ異性化酵素
の特異的プライマーを用いてｃＤＮＡライブラリーのＰ
ＣＲ増幅により生産される。
ーをＩＰＩＨｂ遺伝子に特異的な核酸プローブ（ＩＰＩ
Ｈｂ遺伝子特異プローブ）を用いて、ＩＰＩＨｂ遺伝子
の完全な配列に対してスクリーニングすることができ
る。ＩＰＩＨｂ遺伝子を含む細胞を増殖させてＩＰＩＨ
ｂをコードする多量のＤＮＡ配列を抽出することができ
る。本発明の好ましい実施形態において、ＩＰＩＨｂ遺
伝子の同定のための核酸プローブは、ＩＰＰ異性化酵素
の特異的プライマーを用いてｃＤＮＡライブラリーのＰ
ＣＲ増幅により生産される。
【００２８】ＩＰＩＨｂ遺伝子に対して特定のラベルさ
れた核酸プローブと、ハイブリダイゼーションした植物
ｃＤＮＡまたは他の生物のｃＤＮＡを確認、分離するこ
とができる。分離されたＤＮＡをベクターＤＮＡに結合
してハイブリッドベクターを生産することができる。ハ
イブリッドベクターは、適切な宿主を形質転換し、宿主
からＩＰＰ異性化酵素の生産を誘導するのに用いられ
る。
れた核酸プローブと、ハイブリダイゼーションした植物
ｃＤＮＡまたは他の生物のｃＤＮＡを確認、分離するこ
とができる。分離されたＤＮＡをベクターＤＮＡに結合
してハイブリッドベクターを生産することができる。ハ
イブリッドベクターは、適切な宿主を形質転換し、宿主
からＩＰＰ異性化酵素の生産を誘導するのに用いられ
る。
【００２９】本発明において好適なベクターは、宿主細
胞に転移されるか宿主細胞を感染することができるし、
宿主細胞内で複製可能なプラスミドまたはウイルスであ
る。好ましい実施形態において、好ましいベクターの１
つは、ベクターＤＮＡの重要でない領域に完全なＩＰＩ
Ｈｂ ＤＮＡ配列を挿入して運搬することができる能力
を有するものである。
胞に転移されるか宿主細胞を感染することができるし、
宿主細胞内で複製可能なプラスミドまたはウイルスであ
る。好ましい実施形態において、好ましいベクターの１
つは、ベクターＤＮＡの重要でない領域に完全なＩＰＩ
Ｈｂ ＤＮＡ配列を挿入して運搬することができる能力
を有するものである。
【００３０】適切に形質転換された宿主は、ＩＰＩＨｂ
ＤＮＡ配列を発現することができる能力を有するもの
である。好ましい実施形態で、好適な形質転換された宿
主は、ＩＰＰをゴムに転換する触媒作用ができないもの
である。そのような宿主は植物、細菌または真菌類であ
ってもよい。植物宿主は、タバコ(tabacco)種、草(gras
s)種または四季(perennial)植物種のような１年生植物
であってもよい。細菌は例えば大腸菌(E.coli)、バシル
ス種(Bacillus species)、またはアグロバクテリウム種
(Agrobacterium species)のような細菌であってもよ
い。真菌類はラクタリウス種(lactarius species)とア
スパージルス種(Aspergillus species)のグループから
選択される。
ＤＮＡ配列を発現することができる能力を有するもの
である。好ましい実施形態で、好適な形質転換された宿
主は、ＩＰＰをゴムに転換する触媒作用ができないもの
である。そのような宿主は植物、細菌または真菌類であ
ってもよい。植物宿主は、タバコ(tabacco)種、草(gras
s)種または四季(perennial)植物種のような１年生植物
であってもよい。細菌は例えば大腸菌(E.coli)、バシル
ス種(Bacillus species)、またはアグロバクテリウム種
(Agrobacterium species)のような細菌であってもよ
い。真菌類はラクタリウス種(lactarius species)とア
スパージルス種(Aspergillus species)のグループから
選択される。
【００３１】本発明の他の実施形態では、プロモーター
(promoter)の調節下で遺伝子を配置するように、ＩＰＩ
Ｈｂ遺伝子を含むＤＮＡ断片を適切なプロモーターに結
合させることができる。適切なプロモーターは、形質転
換された宿主で機能することができる。例えば、形質転
換された宿主が植物であれば、ノパリン合成酵素(nopal
ine synthetase)に対するプロモーターであるＰｎｏｓ
のような植物プロモーターにＩＰＩＨｂ遺伝子を結合さ
せ、形質転換された宿主が細菌であれば、ＩＰＩＨｂ遺
伝子を大腸菌(E.coli)のｔｒｐまたはｔａｃプロモータ
ーのような細菌性プロモーターに結合させる。選択的に
ＩＰＩＨｂ遺伝子は、カリフラワーモザイクウイルスの
１６Ｓと３５Ｓプロモーターのようなウイルス性プロモ
ーターに結合させることができる。
(promoter)の調節下で遺伝子を配置するように、ＩＰＩ
Ｈｂ遺伝子を含むＤＮＡ断片を適切なプロモーターに結
合させることができる。適切なプロモーターは、形質転
換された宿主で機能することができる。例えば、形質転
換された宿主が植物であれば、ノパリン合成酵素(nopal
ine synthetase)に対するプロモーターであるＰｎｏｓ
のような植物プロモーターにＩＰＩＨｂ遺伝子を結合さ
せ、形質転換された宿主が細菌であれば、ＩＰＩＨｂ遺
伝子を大腸菌(E.coli)のｔｒｐまたはｔａｃプロモータ
ーのような細菌性プロモーターに結合させる。選択的に
ＩＰＩＨｂ遺伝子は、カリフラワーモザイクウイルスの
１６Ｓと３５Ｓプロモーターのようなウイルス性プロモ
ーターに結合させることができる。
【００３２】本発明の好ましい実施形態では、ゲノムの
ＤＮＡライブラリーの代わりにｃＤＮＡライブラリー
を、全ＲＮＡから分離されたｍＲＮＡを用いて構成す
る。全ＲＮＡは植物原料からクシらによる方法と実質的
に同一な方法で得る{Kush et al.Proc Natl Acad Sci U
SA 87, 1787-1790(1990)}。ｍＲＮＡを分離するため
に、植物原料はゴムを合成する能力のある植物や生物か
ら得ることができる。例えばへベアの木が乳液からゴム
を生産するとしたら、ＩＰＩＨｂをコードするｍＲＮＡ
をへベアの乳液から得ることができる。
ＤＮＡライブラリーの代わりにｃＤＮＡライブラリー
を、全ＲＮＡから分離されたｍＲＮＡを用いて構成す
る。全ＲＮＡは植物原料からクシらによる方法と実質的
に同一な方法で得る{Kush et al.Proc Natl Acad Sci U
SA 87, 1787-1790(1990)}。ｍＲＮＡを分離するため
に、植物原料はゴムを合成する能力のある植物や生物か
ら得ることができる。例えばへベアの木が乳液からゴム
を生産するとしたら、ＩＰＩＨｂをコードするｍＲＮＡ
をへベアの乳液から得ることができる。
【００３３】ここでｍＲＮＡの分離には、ｍＲＮＡの
３′末端に存在するポリ（Ａ）グループが用いられる。
３′末端は、他のＲＮＡ種からｍＲＮＡを分離するのに
用いられる。セルロースカラムのＴ残基とｍＲＮＡのポ
リ（Ａ）末端との結合によるオリゴ（ｄＴ）セルロース
カラムクロマトグラフィーで分離する。結合されないＲ
ＮＡはカラムから遊離、洗滌され、ｍＲＮＡはＡ−Ｔ結
合（duplex)を不安定にする緩衝溶液により溶出するこ
とができる。それからＲＮＡの濃度は分光光度計で測定
する。分離されたｍＲＮＡは第１本のｃＤＮＡ分子を合
成するための鋳型に用いられる。順次にｃＤＮＡの第１
本は、ＤＮＡの第２本を合成するための鋳型に用いられ
る{Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, Cold Spring
Harbor, N.Y. 1987}。
３′末端に存在するポリ（Ａ）グループが用いられる。
３′末端は、他のＲＮＡ種からｍＲＮＡを分離するのに
用いられる。セルロースカラムのＴ残基とｍＲＮＡのポ
リ（Ａ）末端との結合によるオリゴ（ｄＴ）セルロース
カラムクロマトグラフィーで分離する。結合されないＲ
ＮＡはカラムから遊離、洗滌され、ｍＲＮＡはＡ−Ｔ結
合（duplex)を不安定にする緩衝溶液により溶出するこ
とができる。それからＲＮＡの濃度は分光光度計で測定
する。分離されたｍＲＮＡは第１本のｃＤＮＡ分子を合
成するための鋳型に用いられる。順次にｃＤＮＡの第１
本は、ＤＮＡの第２本を合成するための鋳型に用いられ
る{Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, Cold Spring
Harbor, N.Y. 1987}。
【００３４】例えば、λベクターのように、ベクター内
のＤＮＡの重要でない領域に完全な遺伝子を有すること
ができるし、宿主細胞から複製する能力のある適合した
ベクターはＤＮＡ断片と結合して、組換えＤＮＡ分子の
ライブラリーを産出することができる。かかる組換え分
子を試験管パッケージング(packaging)し、組換えクロ
ーンからなる感染性ファージストック(phage stock)が
得られる。ｃＤＮＡライブラリーがｃＤＮＡを発現すれ
ば、かかる方法により構成された組換えＤＮＡライブラ
リーを、核酸プローブや抗体を用いたゴム生合成で重要
な他の遺伝子らとＩＰＩＨｂ遺伝子の分離に用いること
ができる。
のＤＮＡの重要でない領域に完全な遺伝子を有すること
ができるし、宿主細胞から複製する能力のある適合した
ベクターはＤＮＡ断片と結合して、組換えＤＮＡ分子の
ライブラリーを産出することができる。かかる組換え分
子を試験管パッケージング(packaging)し、組換えクロ
ーンからなる感染性ファージストック(phage stock)が
得られる。ｃＤＮＡライブラリーがｃＤＮＡを発現すれ
ば、かかる方法により構成された組換えＤＮＡライブラ
リーを、核酸プローブや抗体を用いたゴム生合成で重要
な他の遺伝子らとＩＰＩＨｂ遺伝子の分離に用いること
ができる。
【００３５】ＩＰＩＨｂ遺伝子の検出のための核酸プロ
ーブは、例えば従来の技術によるバイオチンの一部分
や、３′または５′末端に[.sup. 32P]−リン酸により
プローブをラベリングすることによって、非常に少量の
遺伝子を検出するために修飾することができる(Sambroo
k et al., MOLECULAR CLONING, Cold Spring Harbor,
N.Y. 1987)。放射能の標識は通常、ニューイングランド
ヌクレアまたはアアーマシャム社の有用な３′または
５′末端ラベリングキット(labeling kit)を用いて遂行
する。ＤＮＡライブラリーで、ＩＰＩＨｂ遺伝子は、ラ
ベルされたプローブとハイブリダイゼーションして同定
することができる。
ーブは、例えば従来の技術によるバイオチンの一部分
や、３′または５′末端に[.sup. 32P]−リン酸により
プローブをラベリングすることによって、非常に少量の
遺伝子を検出するために修飾することができる(Sambroo
k et al., MOLECULAR CLONING, Cold Spring Harbor,
N.Y. 1987)。放射能の標識は通常、ニューイングランド
ヌクレアまたはアアーマシャム社の有用な３′または
５′末端ラベリングキット(labeling kit)を用いて遂行
する。ＤＮＡライブラリーで、ＩＰＩＨｂ遺伝子は、ラ
ベルされたプローブとハイブリダイゼーションして同定
することができる。
【００３６】本発明の他の実施形態で、へベアｃＤＮＡ
ライブラリーを含む組換えλファージは、[.sup.32P]で
ラベルされたＩＰＩＨｂの特定オリゴヌクレオチドを用
いて、サムブルックら(Sambrook et al., loc.cit.)の
方法によりスクリーニングする。
ライブラリーを含む組換えλファージは、[.sup.32P]で
ラベルされたＩＰＩＨｂの特定オリゴヌクレオチドを用
いて、サムブルックら(Sambrook et al., loc.cit.)の
方法によりスクリーニングする。
【００３７】ＩＰＩＨｂ遺伝子を有し、ＩＰＩＨｂ遺伝
子の特異プローブと陽性反応するクローンを分離し、ｃ
ＤＮＡライブラリーキットによるプロトコル(protocol)
によって、in vivo除去によりプラスミド内に転換させ
る。ファージＤＮＡをプラスミドに転換させるこのよう
な方法は、へベアｃＤＮＡライブラリーがそのようなin
vivo除去のためにデザインされたストラタジン社(Stra
tagene)のユニ−ザップＩＩベクター(Uni-ZAP II vecto
r)内に構成される時に実行することができる。そのプラ
スミドはかかる遺伝子を多量に生産するために、大腸菌
(E.coli)に転移され保全される。ＩＰＩＨｂ遺伝子を有
するプラスミドを含んでいる大腸菌細胞らを増殖して、
多量のＩＰＩＨｂ ＤＮＡ配列を生産する。かかるＤＮ
Ａを従来の技術に形質転換された宿主から抽出すること
ができる。
子の特異プローブと陽性反応するクローンを分離し、ｃ
ＤＮＡライブラリーキットによるプロトコル(protocol)
によって、in vivo除去によりプラスミド内に転換させ
る。ファージＤＮＡをプラスミドに転換させるこのよう
な方法は、へベアｃＤＮＡライブラリーがそのようなin
vivo除去のためにデザインされたストラタジン社(Stra
tagene)のユニ−ザップＩＩベクター(Uni-ZAP II vecto
r)内に構成される時に実行することができる。そのプラ
スミドはかかる遺伝子を多量に生産するために、大腸菌
(E.coli)に転移され保全される。ＩＰＩＨｂ遺伝子を有
するプラスミドを含んでいる大腸菌細胞らを増殖して、
多量のＩＰＩＨｂ ＤＮＡ配列を生産する。かかるＤＮ
Ａを従来の技術に形質転換された宿主から抽出すること
ができる。
【００３８】本発明は、へベアゴム微粒子タンパク質
（IPIHb)をコードするＤＮＡ配列と、組換えＤＮＡ分子
及び組換えタンパク質の生産方法、配列を含むベクタ
ー、生産された組換えタンパク質の培養及び、組換えタ
ンパク質の生産に重要な物質等に関する。ゴム生合成に
対して、事実上ＩＰＩＨｂのような生物学的な活性を有
するタンパク質またはＩＰＩＨｂをコードするＤＮＡ配
列を提供する。
（IPIHb)をコードするＤＮＡ配列と、組換えＤＮＡ分子
及び組換えタンパク質の生産方法、配列を含むベクタ
ー、生産された組換えタンパク質の培養及び、組換えタ
ンパク質の生産に重要な物質等に関する。ゴム生合成に
対して、事実上ＩＰＩＨｂのような生物学的な活性を有
するタンパク質またはＩＰＩＨｂをコードするＤＮＡ配
列を提供する。
【００３９】ＩＰＩＨｂをコードするｃＤＮＡを含む分
離された組換えベクターを、他の真核または原核生物の
宿主に転移することができるし、その宿主の中でＩＰＩ
ＨｂＤＮＡが発現されてゴムの生合成のための機能性Ｉ
ＰＩＨｂを生産する。
離された組換えベクターを、他の真核または原核生物の
宿主に転移することができるし、その宿主の中でＩＰＩ
ＨｂＤＮＡが発現されてゴムの生合成のための機能性Ｉ
ＰＩＨｂを生産する。
【００４０】
【発明の実施の形態】次の実施形態は本発明の特徴を更
に詳しく例示するためのものであり、本発明の範囲を制
限するものではない。
に詳しく例示するためのものであり、本発明の範囲を制
限するものではない。
【００４１】（実施形態１）植物原料
マレーシアのセランゴルに位置したマレーシアゴム研修
所で成長した成熟されたゴム植物ら(H.brasiliensis cl
one RRIM600)から乳液と葉の試料を得た。ゴムの木に刀
で傷付けて滲み出る乳液を、室温や氷で同一嵩の２×Ｒ
ＮＡ抽出緩衝溶液（0.1Mトリス−塩酸、0.3M塩化リチウ
ム、0.01M EDTA、10% SDS, pH9.5)に継続的に混合しな
がら受け取った(Han et al., 1999)。収集した試料を液
体窒素で冷凍させ、ドライアイスに入れて実験室に輸送
した。
所で成長した成熟されたゴム植物ら(H.brasiliensis cl
one RRIM600)から乳液と葉の試料を得た。ゴムの木に刀
で傷付けて滲み出る乳液を、室温や氷で同一嵩の２×Ｒ
ＮＡ抽出緩衝溶液（0.1Mトリス−塩酸、0.3M塩化リチウ
ム、0.01M EDTA、10% SDS, pH9.5)に継続的に混合しな
がら受け取った(Han et al., 1999)。収集した試料を液
体窒素で冷凍させ、ドライアイスに入れて実験室に輸送
した。
【００４２】全ＲＮＡとポリ（Ａ）+ＲＮＡの分離
キアゼン社(Qiagen Inc)のキアゼンルネーシプラントミ
ニキット(Qiagen Rneasy Plant Minikit)を用いて乳液
からＲＮＡを抽出した(Oh et al., 1999)。キアゼン社
のオリゴテックス−ｄＴTM ｍＲＮＡ(Oligotex-dTTM m
RNA kit)を用いてポリ（Ａ）+ＲＮＡを分離した。
ニキット(Qiagen Rneasy Plant Minikit)を用いて乳液
からＲＮＡを抽出した(Oh et al., 1999)。キアゼン社
のオリゴテックス−ｄＴTM ｍＲＮＡ(Oligotex-dTTM m
RNA kit)を用いてポリ（Ａ）+ＲＮＡを分離した。
【００４３】ブラジルゴムの木ＩＰＰ異性化酵素（IPIH
b)のＰＣＲ増幅 乳液のｃＤＮＡライブラリーを鋳型に用いてＰＣＲ増幅
を遂行した。アラビドップシスＩＰＰ異性化酵素の＋６
０６ｂｐ〜＋６２９ｂｐの配列に相応するＰＣＲプライ
マー(IPP-A2)をデザインした。ＩＰＩＨｂ ｃＤＮＡの
断片を増幅するのに用いたプライマーは、IPP−A2(5'-G
TAATCAAGTTCATGCTCTCCCCA-3')とＭ１３逆プライマーで
ある。ＰＣＲは、７２℃で５分間熱で前処理し、９４℃
で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒間、３０回
繰り返し、７２℃で７分間にかけて最後増幅して遂行し
た。
b)のＰＣＲ増幅 乳液のｃＤＮＡライブラリーを鋳型に用いてＰＣＲ増幅
を遂行した。アラビドップシスＩＰＰ異性化酵素の＋６
０６ｂｐ〜＋６２９ｂｐの配列に相応するＰＣＲプライ
マー(IPP-A2)をデザインした。ＩＰＩＨｂ ｃＤＮＡの
断片を増幅するのに用いたプライマーは、IPP−A2(5'-G
TAATCAAGTTCATGCTCTCCCCA-3')とＭ１３逆プライマーで
ある。ＰＣＲは、７２℃で５分間熱で前処理し、９４℃
で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒間、３０回
繰り返し、７２℃で７分間にかけて最後増幅して遂行し
た。
【００４４】ＰＣＲ生成物をアガロースゲルから切り取
って、キアゼン社のキエックスＩＩアガロスゲル抽出キ
ット(QUAEX Agarose Gel Extraction Kit)で精製した。
精製されたＰＣＲ生成物をプロメガ社(Promega)のｐＧ
ＥＭR−Ｔベクターに挿入した。プラスミドを変種ＸＬ
１−ブルー大腸菌(E.coli)に形質転換させて分離し、配
列を確認した。へベアＩＰＰ異性化酵素のＰＣＲで増幅
された配列に基づいて、下流プライマーでＩＰＰ−Ｌ１
(5'-TATGAGCTACTCCTTCAGCAACGCTCT-3')とＩＰＰ−Ｌ２
(5'-ATCAAGTTCATGCTCTCCCCACTTTCC-3')の二プライマー
をデザインした。ＩＰＰ−Ｌ１とＩＰＰ−Ｌ２プライマ
ーをそれぞれＭ１３正(forward)及び逆(reverse)プライ
マーと共に用いた。
って、キアゼン社のキエックスＩＩアガロスゲル抽出キ
ット(QUAEX Agarose Gel Extraction Kit)で精製した。
精製されたＰＣＲ生成物をプロメガ社(Promega)のｐＧ
ＥＭR−Ｔベクターに挿入した。プラスミドを変種ＸＬ
１−ブルー大腸菌(E.coli)に形質転換させて分離し、配
列を確認した。へベアＩＰＰ異性化酵素のＰＣＲで増幅
された配列に基づいて、下流プライマーでＩＰＰ−Ｌ１
(5'-TATGAGCTACTCCTTCAGCAACGCTCT-3')とＩＰＰ−Ｌ２
(5'-ATCAAGTTCATGCTCTCCCCACTTTCC-3')の二プライマー
をデザインした。ＩＰＰ−Ｌ１とＩＰＰ−Ｌ２プライマ
ーをそれぞれＭ１３正(forward)及び逆(reverse)プライ
マーと共に用いた。
【００４５】乳液ｃＤＮＡライブラリーの構成及びスク
リーニング 前記説明のとおり、乳液から得たポリ（Ａ）+ＲＮＡを
用いて、ストラタジン社のユニ−ザップIIベクター内に
ｃＤＮＡライブラリーを構築した。乳液ｃＤＮＡライブ
ラリーから部分的なＩＰＰ異性化酵素断片を増幅するた
めに、プライマー（IPP-L2、下流)とＭ１３逆プライマ
ー（上流）を用いた。乳液ｃＤＮＡライブラリーの２×
１０6プラークをスクリーニングするために、７００−
ｂｐ ＰＣＲ生成物を用いた(Oh et al., 1999)。プロ
ーブにハイブリダイゼーションされたｃＤＮＡクローン
を、ｃＤＮＡライブラリーキットによるプロトコルによ
ってin vivoで除去し、配列を確認した。完全なｃＤＮ
Ａ挿入物を有するクローンを分離してＩＰＩＨｂと命名
した。
リーニング 前記説明のとおり、乳液から得たポリ（Ａ）+ＲＮＡを
用いて、ストラタジン社のユニ−ザップIIベクター内に
ｃＤＮＡライブラリーを構築した。乳液ｃＤＮＡライブ
ラリーから部分的なＩＰＰ異性化酵素断片を増幅するた
めに、プライマー（IPP-L2、下流)とＭ１３逆プライマ
ー（上流）を用いた。乳液ｃＤＮＡライブラリーの２×
１０6プラークをスクリーニングするために、７００−
ｂｐ ＰＣＲ生成物を用いた(Oh et al., 1999)。プロ
ーブにハイブリダイゼーションされたｃＤＮＡクローン
を、ｃＤＮＡライブラリーキットによるプロトコルによ
ってin vivoで除去し、配列を確認した。完全なｃＤＮ
Ａ挿入物を有するクローンを分離してＩＰＩＨｂと命名
した。
【００４６】ｃＤＮＡクローンの塩基配列とコンピュー
タ分析 プロメガ社のウイザードプラスＳＶミニプレップスＤＮ
Ａ精製システムキット(WizardR Plus SV Minipreps DNA
Purification System kit)を用いて、アルカリ溶解方
法(Sambrook et al., 1989)により塩基配列反応に対す
るプラスミドＤＮＡを得た。蛍光性染料でラベルされた
Ｍ１３正または逆プライマー（キットにより提供され
た）を用いて、ファーマシア社(Pharmacia Biotech)の
アルフエキスプレス自動判読塩基配列キット(ALF Expre
ss Auto Read Sequencing kit)により塩基配列反応を遂
行した。パーキンエルマー社(Perkin Elmer Co.)のＡＬ
Ｆ自動シークエンサー(ALF automatic sequencer)で電
気泳動して塩基配列を得た。
タ分析 プロメガ社のウイザードプラスＳＶミニプレップスＤＮ
Ａ精製システムキット(WizardR Plus SV Minipreps DNA
Purification System kit)を用いて、アルカリ溶解方
法(Sambrook et al., 1989)により塩基配列反応に対す
るプラスミドＤＮＡを得た。蛍光性染料でラベルされた
Ｍ１３正または逆プライマー（キットにより提供され
た）を用いて、ファーマシア社(Pharmacia Biotech)の
アルフエキスプレス自動判読塩基配列キット(ALF Expre
ss Auto Read Sequencing kit)により塩基配列反応を遂
行した。パーキンエルマー社(Perkin Elmer Co.)のＡＬ
Ｆ自動シークエンサー(ALF automatic sequencer)で電
気泳動して塩基配列を得た。
【００４７】（実施形態２）傷の処理
切り取った斜面に沿って、その上に６個のネール(nail)
で傷付けたゴムの木から乳液と葉の試料を得た(Oh et a
l., 1999)。
で傷付けたゴムの木から乳液と葉の試料を得た(Oh et a
l., 1999)。
【００４８】サザンブロット分析とノーザンブロット分
析 成熟したブラジルゴムの木(H.Brasiliensis RRIM600)の
葉組織のゲノムＤＮＡを得た(Oh et al., 1999)。ゲノ
ムのＤＮＡ（８−１０μg）を好ましい制限酵素で消化
し、０．８％(w/v)のアガロースゲルで電気泳動して、
サイズ別に分別しブロッティングして、ＵＶ放射でアマ
ーシャム社(Amersham Life Science)のハイボンド−Ｎ
(Hybond-N)ナイロン膜に交差結合(cross-link)した。ノ
ーザンブロットでは２０μｇの全ＲＮＡを１．２％アガ
ロース−フォームアルデヒドゲルで電気泳動し、サザン
ブロットでのように交差結合した。２つのハイブリダイ
ゼーションのためのプローブは、ＰＣＲで得た32Ｐで標
識した700-bpのＩＰＩＨｂｃＤＮＡの断片を用いた。
析 成熟したブラジルゴムの木(H.Brasiliensis RRIM600)の
葉組織のゲノムＤＮＡを得た(Oh et al., 1999)。ゲノ
ムのＤＮＡ（８−１０μg）を好ましい制限酵素で消化
し、０．８％(w/v)のアガロースゲルで電気泳動して、
サイズ別に分別しブロッティングして、ＵＶ放射でアマ
ーシャム社(Amersham Life Science)のハイボンド−Ｎ
(Hybond-N)ナイロン膜に交差結合(cross-link)した。ノ
ーザンブロットでは２０μｇの全ＲＮＡを１．２％アガ
ロース−フォームアルデヒドゲルで電気泳動し、サザン
ブロットでのように交差結合した。２つのハイブリダイ
ゼーションのためのプローブは、ＰＣＲで得た32Ｐで標
識した700-bpのＩＰＩＨｂｃＤＮＡの断片を用いた。
【００４９】ノーザン分析は５５℃で、サザン分析は６
５℃で１８時間の間０．９Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭ
リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、
０．４％(w/v)ＳＤＳ、５×デンハルツ溶液(Denhardts
solution)、２００μｇ鮭の精虫(salmon sperm)ＤＮＡ
でハイブリダイゼーションした。厳しく最低５５℃また
は最高６５℃で０．５×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで２
回、そして０．１ＸＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで２回ず
つブロット(blot)を洗滌した。その膜を−７０℃でＸ−
ｒａｙフィルムに一晩中露出した。
５℃で１８時間の間０．９Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭ
リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、
０．４％(w/v)ＳＤＳ、５×デンハルツ溶液(Denhardts
solution)、２００μｇ鮭の精虫(salmon sperm)ＤＮＡ
でハイブリダイゼーションした。厳しく最低５５℃また
は最高６５℃で０．５×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで２
回、そして０．１ＸＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで２回ず
つブロット(blot)を洗滌した。その膜を−７０℃でＸ−
ｒａｙフィルムに一晩中露出した。
【００５０】（実施形態３）大腸菌(E.coli)からＩＰＩＨｂタンパク質の発現
ＩＰＩＨｂ遺伝子をファーマシア社のｐＧＥＸ（IPTG−
誘導性発現ベクター）のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ部位にク
ローニングしてｐＧＥＸ−ＩＰＩＨｂを構成した。ｐＧ
ＥＸ−ＩＰＩＨｂに形質転換された大腸菌ＸＬ−１ブル
ーを、５０mg／Ｌのアンピシリンが含まれたルリアブロ
ス(Luria Broth;LB)で強く通気して、３０℃で中央停止
相(mid-stationary phase)まで培養した。０．１ｍＭの
濃度となるようにＩＰＴＧを培養液に添加してから、更
に６時間の間培養した。以降の全ての段階は４℃で遂行
した。
誘導性発現ベクター）のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ部位にク
ローニングしてｐＧＥＸ−ＩＰＩＨｂを構成した。ｐＧ
ＥＸ−ＩＰＩＨｂに形質転換された大腸菌ＸＬ−１ブル
ーを、５０mg／Ｌのアンピシリンが含まれたルリアブロ
ス(Luria Broth;LB)で強く通気して、３０℃で中央停止
相(mid-stationary phase)まで培養した。０．１ｍＭの
濃度となるようにＩＰＴＧを培養液に添加してから、更
に６時間の間培養した。以降の全ての段階は４℃で遂行
した。
【００５１】遠心分離（5000Ｘg、10min)して得た細胞
を０．１Ｍのリン酸カリウム（ｐＨ７．４）により洗滌
してから超音波で粉砕した。０．１Ｍのリン酸カルシウ
ム（ｐＨ７．４）を含む１ｍｌの緩衝溶液で３０秒間超
音波処理することを、３０秒間隔で６回にかけて繰り返
した。均質された試料を１０分間１０,０００Ｘｇで遠
心分離し、その上澄液をレムリの標準方法(laemmli, 19
70)によって１２．５％のスラブゲール(slab gels)によ
りＳＤＳ−ＰＡＧＥした。タンパク質をクーマッシブリ
リアントブルーＲ−２５０(Coomassie Brilliant Blue
R-250)で染色した。ファーマシア社のグルタチオンセ
ファロス４Ｂ親和性マトリクス(Glutathione Sepharose
4B affinity matrix)を用いてその融合タンパク質を親
和性精製した。
を０．１Ｍのリン酸カリウム（ｐＨ７．４）により洗滌
してから超音波で粉砕した。０．１Ｍのリン酸カルシウ
ム（ｐＨ７．４）を含む１ｍｌの緩衝溶液で３０秒間超
音波処理することを、３０秒間隔で６回にかけて繰り返
した。均質された試料を１０分間１０,０００Ｘｇで遠
心分離し、その上澄液をレムリの標準方法(laemmli, 19
70)によって１２．５％のスラブゲール(slab gels)によ
りＳＤＳ−ＰＡＧＥした。タンパク質をクーマッシブリ
リアントブルーＲ−２５０(Coomassie Brilliant Blue
R-250)で染色した。ファーマシア社のグルタチオンセ
ファロス４Ｂ親和性マトリクス(Glutathione Sepharose
4B affinity matrix)を用いてその融合タンパク質を親
和性精製した。
【００５２】ＩＰＰ異性化酵素活性の分析
アリル２リン酸の酸性に対する不安定性に基づいて分析
を実施した(Satterwhite, 1985)。反応混合物は総嵩５
０μｌでｐＨ７．５、１００ｍＭトリス−塩酸、１．５
ｍＭ塩化マグネシウム、１．５ｍＭ塩化マンガン、２ｍ
Ｍ ＤＴＴ、２５ｍＭ ＫＦ、２０μＭアーマシャム社
の[14C]ＩＰＰ(55mCi mmol-1)及び適当量の酵素液を含
む。３０℃で１０分間反応してから２００μＬのメタノ
ール：塩酸(4:1、v/v）と０．１μＬの水を添加して、
３７℃で１５分間反応を進行させた。アリル生成物を２
Ｘ２００μｌのトルエンで抽出した。混合性の抽出物を
ベックマン社(Beckman)のレディーソルブシンチレーシ
ョンカクテル(Ready Solv HP scintillation cocktail)
４ｍｌと混合し、ベックマン社のＬＳ６５００液体シン
チレーションカウンターを用いて放射能を測定した。
を実施した(Satterwhite, 1985)。反応混合物は総嵩５
０μｌでｐＨ７．５、１００ｍＭトリス−塩酸、１．５
ｍＭ塩化マグネシウム、１．５ｍＭ塩化マンガン、２ｍ
Ｍ ＤＴＴ、２５ｍＭ ＫＦ、２０μＭアーマシャム社
の[14C]ＩＰＰ(55mCi mmol-1)及び適当量の酵素液を含
む。３０℃で１０分間反応してから２００μＬのメタノ
ール：塩酸(4:1、v/v）と０．１μＬの水を添加して、
３７℃で１５分間反応を進行させた。アリル生成物を２
Ｘ２００μｌのトルエンで抽出した。混合性の抽出物を
ベックマン社(Beckman)のレディーソルブシンチレーシ
ョンカクテル(Ready Solv HP scintillation cocktail)
４ｍｌと混合し、ベックマン社のＬＳ６５００液体シン
チレーションカウンターを用いて放射能を測定した。
【００５３】in vitroのゴム生合成分析
遠心分離／懸濁(centrifugation/flotation)の手順を繰
り返して洗滌されたゴム粒子(WRP)を備えた(Cornish an
d Backhaus, 1990;Siler and Cornish, 1993)。反応混
合物の試験管内のゴム生合成活性を、前に説明した方法
により測定した(Cornish and Backhaus, 1990; Siler a
nd Cornish, 1993)。ｐＨ7.5、１００ｍＭトリス−塩
酸、８０μＭアマーシャム社の[14C]ＩＰＰ(55mCi mmol
-1)、２０ｍＭ ＦＰＰ、１ｍＭ硫酸マグネシウム及び
１ｍＭ ＤＴＴを含む50μlの反応混合物にＷＲＰを添加
して、２５℃で６時間の間反応させた。
り返して洗滌されたゴム粒子(WRP)を備えた(Cornish an
d Backhaus, 1990;Siler and Cornish, 1993)。反応混
合物の試験管内のゴム生合成活性を、前に説明した方法
により測定した(Cornish and Backhaus, 1990; Siler a
nd Cornish, 1993)。ｐＨ7.5、１００ｍＭトリス−塩
酸、８０μＭアマーシャム社の[14C]ＩＰＰ(55mCi mmol
-1)、２０ｍＭ ＦＰＰ、１ｍＭ硫酸マグネシウム及び
１ｍＭ ＤＴＴを含む50μlの反応混合物にＷＲＰを添加
して、２５℃で６時間の間反応させた。
【００５４】ゴム生合成に対するＩＰＰ異性化酵素の役
割を調査するために、ゴム生合成の有用な開始分子であ
るＦＰＰを反応混合物から除去し、その代わりにＩＰＰ
をゴム生合成の開始分子の中の１つであるＤＭＡＰＰに
転換させるために、適当量のＩＰＰ異性化酵素を添加し
た。対照群にはゴム転移酵素活性に必要なＭｇ2+イオン
と、キレートを形成する２５ｍＭのＥＤＴＡとを反応混
合物に添加した。その結果で生成された[14Ｃ]ＩＰＰが
結合されたゴム量を、ろ過法またはベンゼン抽出法によ
り測定した。
割を調査するために、ゴム生合成の有用な開始分子であ
るＦＰＰを反応混合物から除去し、その代わりにＩＰＰ
をゴム生合成の開始分子の中の１つであるＤＭＡＰＰに
転換させるために、適当量のＩＰＰ異性化酵素を添加し
た。対照群にはゴム転移酵素活性に必要なＭｇ2+イオン
と、キレートを形成する２５ｍＭのＥＤＴＡとを反応混
合物に添加した。その結果で生成された[14Ｃ]ＩＰＰが
結合されたゴム量を、ろ過法またはベンゼン抽出法によ
り測定した。
【００５５】ろ過法では、反応混合物をワットマン社(W
hatman)の０．０２または０．１μｍのアノディスク膜
(anodisc membrane)を通してろ過し、そのフィルターを
１Ｍの塩酸と９５％のエタノールで多数回にかけて洗滌
して、洗滌されたフィルターに残在している放射能を、
ベックマン社の液体シンチレーションカウンターにより
測定した(Cornish and Backhaus, 1990)。ベンゼン抽出
法では、反応混合物を２倍嵩のベンゼンで３回にかけて
抽出し、ベンゼン抽出物をベックマン社のレディーソル
ブシンチレーションカクテルと混合して、液体シンチレ
ーションカウンターにより放射能を測定した。
hatman)の０．０２または０．１μｍのアノディスク膜
(anodisc membrane)を通してろ過し、そのフィルターを
１Ｍの塩酸と９５％のエタノールで多数回にかけて洗滌
して、洗滌されたフィルターに残在している放射能を、
ベックマン社の液体シンチレーションカウンターにより
測定した(Cornish and Backhaus, 1990)。ベンゼン抽出
法では、反応混合物を２倍嵩のベンゼンで３回にかけて
抽出し、ベンゼン抽出物をベックマン社のレディーソル
ブシンチレーションカクテルと混合して、液体シンチレ
ーションカウンターにより放射能を測定した。
【００５６】図１は、１ＰＩＨｂの内部断片(internal
fragment)を以て試験したブラジルゴムの木(H.brasilie
nsis)の葉ゲノムのＤＮＡのサザンブロットを示したも
ので、ここでレーンＢ、Ｅ及びＸは、それぞれＢａｍＨ
Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩを以て全体ＤＮＡを消化した
ことに相応する。
fragment)を以て試験したブラジルゴムの木(H.brasilie
nsis)の葉ゲノムのＤＮＡのサザンブロットを示したも
ので、ここでレーンＢ、Ｅ及びＸは、それぞれＢａｍＨ
Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩを以て全体ＤＮＡを消化した
ことに相応する。
【００５７】図２は、１ＰＩＨｂの転写物のノーザンブ
ロット分析を示したもので、ブラジルゴムの木(H.brasi
liensis)の葉と乳液から分離した全ＲＮＡを32Ｐで標識
されたＩＰＩＨｂ ｃＤＮＡの内部断片とハイブリダイ
ゼーションした。図２において、下部の図面は、全ＲＮ
Ａと同一量をローディング(loading)するブロッティン
グ(blotting)前の紫外線下で臭化エチジウムで染色され
たｒＲＮＡを示す。レーンＣとＴは、それぞれ処理しな
い対照群と傷付いた試料に相応する。傷の影響のため
に、５個のブラジルゴムの木(H.brasiliensis)は、切り
取った斜面に沿ってその上に６個のネール(nail)で傷付
けた反面、他の５個の対照群の木には傷付けなかった。
傷付けた後約１６時間となった時、それぞれの木から乳
液と葉の試料を採取した。
ロット分析を示したもので、ブラジルゴムの木(H.brasi
liensis)の葉と乳液から分離した全ＲＮＡを32Ｐで標識
されたＩＰＩＨｂ ｃＤＮＡの内部断片とハイブリダイ
ゼーションした。図２において、下部の図面は、全ＲＮ
Ａと同一量をローディング(loading)するブロッティン
グ(blotting)前の紫外線下で臭化エチジウムで染色され
たｒＲＮＡを示す。レーンＣとＴは、それぞれ処理しな
い対照群と傷付いた試料に相応する。傷の影響のため
に、５個のブラジルゴムの木(H.brasiliensis)は、切り
取った斜面に沿ってその上に６個のネール(nail)で傷付
けた反面、他の５個の対照群の木には傷付けなかった。
傷付けた後約１６時間となった時、それぞれの木から乳
液と葉の試料を採取した。
【００５８】図３は、ＩＰＰ異性化酵素活性の分析結果
を図示したもので、５μＬの酵素液と２０μＭの
［14Ｃ］ＩＰＰを含む５０μＬの反応混合物でＩＰＰ異
性化酵素の分析を施し、酸に不安定な生成物の放射能を
液体シンチレーションカウンター(liquid scintillatio
n counter)で測定した。それぞれの値は、３回実験の平
均値；酵素なし(No enzyme)は細胞培養液抽出物がない
もの；Ｃ−クルード(C-crude)は、ＩＰＴＧの誘導なく
ＧＳＴ−ＩＰＩＨｂ融合タンパク質を発現する細菌性細
胞の抽出物；クルード(Crude)はＩＰＴＧを誘導する細
胞培養液の抽出物；Ｃ−精製(C-purified)はＩＰＴＧを
誘導しない細胞の精製されたＧＳＴ−ＩＰＩＨｂ融合タ
ンパク質；精製(Purified)はＩＰＴＧを誘導する細胞の
精製されたＧＳＴ−ＩＰＩＨｂ融合タンパク質である。
を図示したもので、５μＬの酵素液と２０μＭの
［14Ｃ］ＩＰＰを含む５０μＬの反応混合物でＩＰＰ異
性化酵素の分析を施し、酸に不安定な生成物の放射能を
液体シンチレーションカウンター(liquid scintillatio
n counter)で測定した。それぞれの値は、３回実験の平
均値；酵素なし(No enzyme)は細胞培養液抽出物がない
もの；Ｃ−クルード(C-crude)は、ＩＰＴＧの誘導なく
ＧＳＴ−ＩＰＩＨｂ融合タンパク質を発現する細菌性細
胞の抽出物；クルード(Crude)はＩＰＴＧを誘導する細
胞培養液の抽出物；Ｃ−精製(C-purified)はＩＰＴＧを
誘導しない細胞の精製されたＧＳＴ−ＩＰＩＨｂ融合タ
ンパク質；精製(Purified)はＩＰＴＧを誘導する細胞の
精製されたＧＳＴ−ＩＰＩＨｂ融合タンパク質である。
【００５９】図４は、時間経過によるＩＰＰ異性化酵素
の酵素活性を示したもので、５μＬの精製されたＧＳＴ
−ＩＰＩＨｂ融合タンパク質を含む５０μＬの反応混合
物で時間経過実験に対するＩＰＰ異性化酵素の分析を遂
行し、酵素量を異にして１０分間反応を進行させた。図
５は、濃度によるＩＰＰ異性化酵素の酵素活性を示した
もので、５μＬの精製されたＧＳＴ−ＩＰＩＨｂ融合タ
ンパク質を含む５０μＬの反応混合物で時間経過実験に
対するＩＰＰ異性化酵素の分析を遂行し、酵素量を異に
して１０分間反応を進行させた。
の酵素活性を示したもので、５μＬの精製されたＧＳＴ
−ＩＰＩＨｂ融合タンパク質を含む５０μＬの反応混合
物で時間経過実験に対するＩＰＰ異性化酵素の分析を遂
行し、酵素量を異にして１０分間反応を進行させた。図
５は、濃度によるＩＰＰ異性化酵素の酵素活性を示した
もので、５μＬの精製されたＧＳＴ−ＩＰＩＨｂ融合タ
ンパク質を含む５０μＬの反応混合物で時間経過実験に
対するＩＰＰ異性化酵素の分析を遂行し、酵素量を異に
して１０分間反応を進行させた。
【００６０】図６は、in vitroのゴム生合成に対するＩ
ＰＰ異性化酵素の影響を示したもので、伸長するゴム鎖
への［14Ｃ］ＩＰＰの結合をゴム生合成に効率的な開始
分子であるＦＰＰなく、１０ｍｇのＷＲＰと５μＬの指
示された酵素液を含む５０μＬの反応混合物で測定し
た。それぞれの値は、３回実験の平均値；ＷＲＰはＷＲ
Ｐのみでゴム分析したもの；ＷＲＰ＋ＦＰＰはＷＲＰと
ＦＰＰで分析したもの；−ＷＲＰはＷＲＰなく精製され
たＧＳＴ−ＩＰＩＨｂ融合タンパク質で分析したもの；
Ｃ−精製(C-purified)はＩＰＴＧを誘導しない細胞の精
製されたＧＳＴ−ＩＰＩＨｂ融合タンパク質とＷＲＰで
分析したもの；精製(Purified)はＩＰＴＧ誘導性細胞の
精製されたＧＳＴ−ＩＰＩＨｂ融合タンパク質とＷＲＰ
で分析したものである。
ＰＰ異性化酵素の影響を示したもので、伸長するゴム鎖
への［14Ｃ］ＩＰＰの結合をゴム生合成に効率的な開始
分子であるＦＰＰなく、１０ｍｇのＷＲＰと５μＬの指
示された酵素液を含む５０μＬの反応混合物で測定し
た。それぞれの値は、３回実験の平均値；ＷＲＰはＷＲ
Ｐのみでゴム分析したもの；ＷＲＰ＋ＦＰＰはＷＲＰと
ＦＰＰで分析したもの；−ＷＲＰはＷＲＰなく精製され
たＧＳＴ−ＩＰＩＨｂ融合タンパク質で分析したもの；
Ｃ−精製(C-purified)はＩＰＴＧを誘導しない細胞の精
製されたＧＳＴ−ＩＰＩＨｂ融合タンパク質とＷＲＰで
分析したもの；精製(Purified)はＩＰＴＧ誘導性細胞の
精製されたＧＳＴ−ＩＰＩＨｂ融合タンパク質とＷＲＰ
で分析したものである。
【００６１】
【発明の効果】前記の説明によると、本発明はゴムの生
合成に重要な役割を果たすブラジルゴムの木(Hevea Bra
siliensis)から分離したＩＰＰ異性化酵素と、これを用
いてゴムを製造する方法を提供する利点がある。
合成に重要な役割を果たすブラジルゴムの木(Hevea Bra
siliensis)から分離したＩＰＰ異性化酵素と、これを用
いてゴムを製造する方法を提供する利点がある。
【００６２】
【配列表】
<110> Korea Kumho Petrochemical Co. Ltd.
<120> Isopentenyl diphosphate isomerase from Hevea Brasiliensis
<130> F06489A1
<160> 2
<170> PatentIn version 2.0
<210> 1
<211> 1288
<212> DNA
<213> IPIHb (IPP isomerase from Hevea brasiliensis)
<220>
<221> CDS
<222> (209)..(910)
<400> 1
caccactcgc cttctaaatg cccacgccac caccagactc tcgtcctcgc ttccctcctc
60
tgcttctcct cgttattctt actttctctc tacccaattt gcctctcctt ctctcattca 120
attccctcta actcttaaac cttcgtctac ctcttcgttc tctagggtat tttcgtcttc 180
tccatctgca atcaccgcta cttccacc atg ggt gag gct cca gat gtc ggc 232
Met Gly Glu Ala Pro Asp Val Gly
1 5
atg gat gct gtc cag aaa cgc ctc atg ttc gac gat gaa tgc att tta 280
Met Asp Ala Val Gln Lys Arg Leu Met Phe Asp Asp Glu Cys Ile Leu
10 15 20
gta gat gag aac gat ggt gtt gtt ggt cat gct tcc aaa tat aat tgt 328
Val Asp Glu Asn Asp Gly Val Val Gly His Ala Ser Lys Tyr Asn Cys
25 30 35 40
cat ttg tgg gaa aat att ttg aag ggg aac gca tta cat aga gct ttt 376
His Leu Trp Glu Asn Ile Leu Lys Gly Asn Ala Leu His Arg Ala Phe
45 50 55
agc gta ttt ctc ttc aac tca aaa tat gag cta ctc ctt cag caa cgc 424
Ser Val Phe Leu Phe Asn Ser Lys Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Gln Arg
60 65 70
tct ggg aca aag gtg aca ttc ccg ctt gta tgg aca aac act tgc tgt 472
Ser Gly Thr Lys Val Thr Phe Pro Leu Val Trp Thr Asn Thr Cys Cys
75 80 85
agt cat cct ctg tac cgt gaa tct gag ctt att gat gag gat gct ctt 520
Ser His Pro Leu Tyr Arg Glu Ser Glu Leu Ile Asp Glu Asp Ala Leu
90 95 100
ggt gtg aga aat gct gca caa agg aag ctt ttc gat gag ctt ggt atc 568
Gly Val Arg Asn Ala Ala Gln Arg Lys Leu Phe Asp Glu Leu Gly Ile
105 110 115 120
cct gct gaa gat gtt cca gtt gat cag ttt act cca cta gga cgt ata 616
Pro Ala Glu Asp Val Pro Val Asp Gln Phe Thr Pro Leu Gly Arg Ile
125 130 135
cta tat aag gcg tcc tcc gat gga aag tgg gga gag cat gaa ctt gat 664
Leu Tyr Lys Ala Ser Ser Asp Gly Lys Trp Gly Glu His Glu Leu Asp
140 145 150
tat ctg ctc ttt ata gtc cgt gat gtt aat gta aat cca aac cct gat 712
Tyr Leu Leu Phe Ile Val Arg Asp Val Asn Val Asn Pro Asn Pro Asp
155 160 165
gag gta gct gat gta aag tat gtt aac cgg gat cag ttg aag gag ctc 760
Glu Val Ala Asp Val Lys Tyr Val Asn Arg Asp Gln Leu Lys Glu Leu
170 175 180
ttg agg aag gcg gat tct ggc gag gaa ggt ata aat ttg tca cct tgg 808
Leu Arg Lys Ala Asp Ser Gly Glu Glu Gly Ile Asn Leu Ser Pro Trp
185 190 195 200
ttt aga cta gtt gtg gac aac ttc ttg ttg aaa tgg tgg gaa aat gtc 856
Phe Arg Leu Val Val Asp Asn Phe Leu Leu Lys Trp Trp Glu Asn Val
205 210 215
gaa aat ggg aca ctc aag gaa gca gtt gac atg aaa acg att cac aag 904
Glu Asn Gly Thr Leu Lys Glu Ala Val Asp Met Lys Thr Ile His Lys
220 225 230
ttg agt tgagataaat atctatacag aatcaaattt gattgtggca tcacctgtag 960
Leu Ser
ctttattatt tgaataaatt tggtaatgtc agttgtaaac gagttagcct ttctttgctg 1020
ttgtggctgt tagcctggtc caaagttaca ttaaattttt tgatgtttcc tgaaagcagc 1080
tgggcagttc tgatattgta acttagattt ggctcccatc atttaaaact gaataaggag 1140
attttcactt cctttatatc cttaaattgg aggaattttt ttgtctcccc ttgttgagat 1200
cttttttcgg ggtgaggaca ttgttatttg ttttgttatg aatcaagtga gactggctat 1260
tcaagcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1288
<210> 2
<211> 234
<212> PRT
<213> IPIHb (IPP isomerase from Hevea brasiliensis)
<400> 2
Met Gly Glu Ala Pro Asp Val Gly Met Asp Ala Val Gln Lys Arg Leu
1 5 10 15
Met Phe Asp Asp Glu Cys Ile Leu Val Asp Glu Asn Asp Gly Val Val
20 25 30
Gly His Ala Ser Lys Tyr Asn Cys His Leu Trp Glu Asn Ile Leu Lys
35 40 45
Gly Asn Ala Leu His Arg Ala Phe Ser Val Phe Leu Phe Asn Ser Lys
50 55 60
Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Gln Arg Ser Gly Thr Lys Val Thr Phe Pro
65 70 75 80
Leu Val Trp Thr Asn Thr Cys Cys Ser His Pro Leu Tyr Arg Glu Ser
85 90 95
Glu Leu Ile Asp Glu Asp Ala Leu Gly Val Arg Asn Ala Ala Gln Arg
100 105 110
Lys Leu Phe Asp Glu Leu Gly Ile Pro Ala Glu Asp Val Pro Val Asp
115 120 125
Gln Phe Thr Pro Leu Gly Arg Ile Leu Tyr Lys Ala Ser Ser Asp Gly
130 135 140
Lys Trp Gly Glu His Glu Leu Asp Tyr Leu Leu Phe Ile Val Arg Asp
145 150 155 160
Val Asn Val Asn Pro Asn Pro Asp Glu Val Ala Asp Val Lys Tyr Val
165 170 175
Asn Arg Asp Gln Leu Lys Glu Leu Leu Arg Lys Ala Asp Ser Gly Glu
180 185 190
Glu Gly Ile Asn Leu Ser Pro Trp Phe Arg Leu Val Val Asp Asn Phe
195 200 205
Leu Leu Lys Trp Trp Glu Asn Val Glu Asn Gly Thr Leu Lys Glu Ala
210 215 220
Val Asp Met Lys Thr Ile His Lys Leu Ser
225 230
【図１】 １ＰＩＨｂの内部断片を以て試験したブラジ
ルゴムの木の葉ゲノムのＤＮＡのサザンブロットの結果
を示したものである。
ルゴムの木の葉ゲノムのＤＮＡのサザンブロットの結果
を示したものである。
【図２】 １ＰＩＨｂの転写物のノーザンブロットの結
果を示したものである。
果を示したものである。
【図３】 ＩＰＰ異性化酵素活性の分析結果を図示した
ものである。
ものである。
【図４】 時間経過によるＩＰＰ異性化酵素の酵素活性
を示したものである。
を示したものである。
【図５】 濃度によるＩＰＰ異性化酵素の酵素活性を示
したものである。
したものである。
【図６】 in vitroのゴム生合成に対するＩＰＰ異性化
酵素の影響を示したものである。
酵素の影響を示したものである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 申 東昊
大韓民国光州市光山區月桂洞（番地な
し）ライン２次アパート202−506
(72)発明者 梁 在模
大韓民国光州市北區雲岩洞（番地なし)
宇美アパート101−1010
(56)参考文献 Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ.
（1997）Ｖｏｌ．36，Ｎｏ．３，ｐ.
323−328
Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
（1996）Ｖｏｌ．43，Ｎｏ．４，ｐ.
769−772
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/09 ZNA
C12P 5/02
C12N 9/90
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】配列１に記載されたアミノ酸配列を有する
へベアＩＰＰ異性化酵素をコードする核酸分子を提供す
る段階と、前記の核酸分子を宿主細胞に転移して形質転
換された宿主細胞を生産する段階と、前記の形質転換さ
れた宿主を適切な培地に培養してＩＰＩＨｂを生産し、
前記のＩＰＩＨｂを用いてin vitroのゴム合成を促進す
る段階からなるin vitroゴムの製造方法。 - 【請求項２】配列１に記載の核酸配列を有する核酸分子
を提供する段階と、前記の核酸分子を宿主細胞に転移し
て形質転換された宿主細胞を生産する段階と、前記の形
質転換された宿主を適切な培地に培養してＩＰＩＨｂを
生産し、前記のＩＰＩＨｂを用いてin vitroのゴム合成
を促進する段階からなるin vitroゴムの製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US296.754 | 1999-04-22 | ||
| US09/296,754 US6316695B1 (en) | 1999-04-22 | 1999-04-22 | Isopentenyl diphosphate isomerase from Hevea brasiliensis and rubber producing method using the same |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002271999A Division JP2003144183A (ja) | 1999-04-22 | 2002-09-18 | ゴムの木から分離したイソペンテニル２リン酸異性化酵素及びこれを用いたゴムの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000300276A JP2000300276A (ja) | 2000-10-31 |
| JP3416081B2 true JP3416081B2 (ja) | 2003-06-16 |
Family
ID=23143410
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18416799A Expired - Fee Related JP3416081B2 (ja) | 1999-04-22 | 1999-06-29 | ゴムの木から分離したイソペンテニル２リン酸異性化酵素及びこれを用いたゴムの製造方法 |
| JP2002271999A Pending JP2003144183A (ja) | 1999-04-22 | 2002-09-18 | ゴムの木から分離したイソペンテニル２リン酸異性化酵素及びこれを用いたゴムの製造方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002271999A Pending JP2003144183A (ja) | 1999-04-22 | 2002-09-18 | ゴムの木から分離したイソペンテニル２リン酸異性化酵素及びこれを用いたゴムの製造方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6316695B1 (ja) |
| JP (2) | JP3416081B2 (ja) |
| KR (1) | KR100379832B1 (ja) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6645747B1 (en) * | 1999-09-21 | 2003-11-11 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Cis-prenyltransferases from plants |
| US6998471B2 (en) | 2001-07-25 | 2006-02-14 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Polynucleotides encoding an acetyl-CoA acetyltransferase from Hevea brasiliensis, related products, and methods |
| US8337893B2 (en) * | 2002-07-10 | 2012-12-25 | Florida Research Foundation, Inc, University Of | Sol-gel derived bioactive glass polymer composite |
| US8013213B2 (en) * | 2004-11-24 | 2011-09-06 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Guayule plants, products, and derivatives |
| WO2010053553A1 (en) * | 2008-11-06 | 2010-05-14 | University Of Akron | Biosynthesis of polyisoprenoids |
| TWI427149B (zh) * | 2009-06-17 | 2014-02-21 | Danisco Us Inc | 使用ｄｘｐ及ｍｖａ途徑之改良之異戊二烯製造 |
| BR112013016264A2 (pt) | 2010-12-22 | 2018-06-19 | Danisco Us Inc | produção biológica de açúcares de pentose com o uso de células recombinantes |
| SG191235A1 (en) | 2010-12-22 | 2013-07-31 | Danisco Us Inc | Compositions and methods for improved isoprene production using two types of ispg enzymes |
| KR101658346B1 (ko) * | 2014-09-25 | 2016-09-22 | 한국생명공학연구원 | 메탄올 또는 메틸로트로픽 박테리아 처리에 의한 식물체에서 고무 함량을 증가시키는 방법 |
| US10480014B2 (en) * | 2015-06-15 | 2019-11-19 | Ajou University Industry-Academic Cooperation Foundation | Method for producing natural rubber by using recombinant microorganism |
| JP6485771B2 (ja) * | 2015-06-30 | 2019-03-20 | 住友ゴム工業株式会社 | 凝集の抑制されたゴム粒子の製造方法、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4638028A (en) * | 1985-04-08 | 1987-01-20 | Goodyear Tire & Rubber Company | Rubber polymerases and methods for their production and use |
| US4983729A (en) * | 1989-10-19 | 1991-01-08 | The Goodyear Tire & Rubber Company | DNA fragment encoding a rubber polymerase and its use |
-
1999
- 1999-04-22 US US09/296,754 patent/US6316695B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-05-11 KR KR10-1999-0016724A patent/KR100379832B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-06-29 JP JP18416799A patent/JP3416081B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-09-18 JP JP2002271999A patent/JP2003144183A/ja active Pending
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９６）Ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．４，ｐ．７６９−７７２ |
| Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９７）Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．３，ｐ．３２３−３２８ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2003144183A (ja) | 2003-05-20 |
| JP2000300276A (ja) | 2000-10-31 |
| KR100379832B1 (ko) | 2003-04-10 |
| KR20000067734A (ko) | 2000-11-25 |
| US6316695B1 (en) | 2001-11-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Laudert et al. | Cloning, molecular and functional characterization of Arabidopsis thaliana allene oxide synthase (CYP 74), the first enzyme of the octadecanoid pathway to jasmonates | |
| Miller et al. | First isolation of an isoprene synthase gene from poplar and successful expression of the gene in Escherichia coli | |
| Harris et al. | The maize An2 gene is induced by Fusarium attack and encodes an ent-copalyl diphosphate synthase | |
| KR100954975B1 (ko) | 아세토락테이트 합성효소를 암호화하는 유전자 | |
| JP3416081B2 (ja) | ゴムの木から分離したイソペンテニル２リン酸異性化酵素及びこれを用いたゴムの製造方法 | |
| IL180694A (en) | A toxin-removing substance that has the sub-activity of aflatoxin and its genetic coding | |
| AU741619B2 (en) | Monoterpene synthases from common sage (salvia officinalis) | |
| AU747075B2 (en) | Sesquiterpene synthases from grand fir abies grandis, and methods of use | |
| US7217863B2 (en) | Mevalonate synthesis enzymes | |
| JP3120684B2 (ja) | ゲラニルゲラニル二リン酸を合成する変異型ファルネシル二リン酸合成酵素及びそれをコードするｄｎａ | |
| CN110691850A (zh) | 生产折叶苔醇和/或补身醇的方法 | |
| Chen et al. | A cyclophilin from the polycentric anaerobic rumen fungus Orpinomyces sp. strain PC-2 is highly homologous to vertebrate cyclophilin B. | |
| AU747746B2 (en) | Isolation and expression of farnesene synthase from peppermint, mentha x piperita, L. | |
| Hirner et al. | Isoforms of chalcone synthase in Daucus carota L. and their differential expression in organs from the European wild carrot and in ultraviolet-A-irradiated cell cultures | |
| JP5911071B2 (ja) | プロトイルデンシンターゼ | |
| JP2007517496A (ja) | 柑橘類セスキテルペンシンターゼ、その生成方法、及び使用方法 | |
| EP1046709B1 (en) | Rubber producing method using isopentenyl diphosphate isomerase from Hevea Brasiliensis | |
| US6271018B1 (en) | Muskmelon (Cucumis melo) hydroperoxide lyase and uses thereof | |
| JPH09104698A (ja) | カウレン合成酵素 | |
| JP3355368B2 (ja) | 植物由来のエポキシド水解酵素をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドベクターおよび形質転換体 | |
| JPH09511134A (ja) | 蛋白質修飾酵素 | |
| US9109208B2 (en) | Gene, protein, protein complex and method for improving aroma production in a plant | |
| Shewmaker et al. | Engineering vitamin E content: from Arabidopsis mutant to soy oil | |
| WO1999054478A1 (fr) | Gene codant pour une proteine douee d'une activite de synthese d'aurone | |
| US7202084B2 (en) | Beta-alanine N-methyltransferase |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20020604 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20030225 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090404 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100404 Year of fee payment: 7 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |