KR20020040810A - 식물로부터의 시스-프레닐트랜스퍼라제 - Google Patents

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KR20020040810A
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크리스 콜드렌
데니스 플린트
데이비드 엘 할라한
홍 왕
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메리 이. 보울러
이 아이 듀폰 디 네모아 앤드 캄파니
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Abstract

본 발명은 시스-프레닐트랜스퍼라제, 마이크로코커스 루테우스 (Micrococcus luteus) 박테리아로부터의 UPP 신타제 또는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 효모로부터의 데돌-PP 신타제와 상동성인 식물 단백질을 코딩하는 핵산 단편에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 밀, 포도, 대두, 쌀, 아프리칸 데이지, 고무 나무 유액 및 금잔화로부터의 시스-프레닐트랜스퍼라제 상동체에 관한 것이다.

Description

식물로부터의 시스-프레닐트랜스퍼라제{Cis-Prenyltransferases from Plants}
식물은 폴리이소프레노이드류로 불리우는 이소프렌 단위 (C5H8)로 구성된 다양한 탄화수소를 합성한다 (문헌 [Tanaka, Y. InRubber and Related Polyprenols. Methods in Plant Biochemistry; Dey, P.M. and Harborne, J.B., Eds., Academic Press: San Diego, 1991, Vol.7, pp519-536]). 다양한 개수의 시스- 및 트랜스- (Z- 및 E-) 이중 결합을 갖는 탄소수 45 내지 115의 탄화수소를 폴리프레놀류로 부르며, 더 긴 사슬 길이를 갖는 것들은 고무라고 불리운다 (문헌 [Tanaka, Y. InMinor Classes of Terpenoids. Methods in Plant Biochemistry; Dey, P.M. and Harborne, J.B., Eds., Academic Press: San Diego, 1991, Vol.7, pp537-542]).이들 화합물의 합성은 프레닐트랜스퍼라제로 불리는 효소군에 의해 수행되며, 이 효소는 C5단위가 개시 분자에 순차적으로 부가되는 것을 촉매한다.
개시 분자 자체는 이소프렌 단위로부터 서로 다른 프레닐트랜스퍼라제의 작용을 통해 유래되며, 디메틸알릴디포스페이트 (DMAPP)와 같은 알릴계 테르페노이드 디포스페이트류이지만, 보다 일반적으로는 C10화합물 게라닐 디포스페이트 (GPP), C15화합물 파르네실 디포스페이트 (FPP) 또는 C20화합물 게라닐게라닐 디포스페이트 (GGPP)이다. 이들 알릴계 테르페노이드 디포스페이트 합성 효소를 코딩하는 유전자는 식물을 비롯한 다수의 생물체로부터 클로닝되었고, 이들 유전자 모두는 상동성이 있는 보존 영역을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다 (문헌 [McGarvey et al.,Plant Cell7:1015-1026 (1995)], 문헌 [Chappell, J.,Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 46:521-547]). 이들 유전자 산물 모두 트랜스- 배치의 이소프렌 단위를 더 많이 생산한다. 시스- 배치의 이소프렌 단위를 응축시키는 프레닐트랜스퍼라제는 고등 동물 또는 식물에서 확인된 바 없으며, C20화합물 게라닐게라닐 디포스페이트를 넘어서는 폴리이소프레노이드 사슬의 연장을 촉매하는 프레닐트랜스퍼라제도 확인된 바 없다.
이. 콜라이 (E. coli) 박테리아로부터의 옥타프레닐 디포스페이트 (OPP) 신타제를 코딩하는 유전자가 확인되었고 (문헌 [Asai et al.,Biochem. Biophys. Res. Commun. 202:340-345 (1994)]), 보다 최근에는 박테리아의 운데카프레닐디포스페이트 (UPP) 신타제 (문헌 [Shimizu et al.,J. Biol. Chem. 273:19476-19481(1998)]; 문헌 [Apfel et al.,J. Bacteriol. 181:483-492 (1999)]) 및 효모의 데히드로돌리칠 디포스페이트 (데돌-PP (Dedol-PP)) 신타제 (문헌 [Sato et al.,Mol. Cell. Biol. 19:471-483 (1999)])가 확인되었다. OPP 신타제는 생물학적 퀴논의 올-트랜스 폴리이소프레노이드 측쇄 (유비퀴논-8, 메나퀴논-8 및 디메틸메나퀴논-8)를 생성하며, 그의 1차 구조는 GPP, FPP 및 GGPP 신타제와 유사한 영역을 포함한다. UPP 신타제 및 데돌-PP 신타제는 시스-폴리이소프레노이드를 생성하며, 그의 1차 구조는 서로 연관이 있으면서도, OPP, GPP, FPP 및 GGPP 신타제의 구조와는 구별된다.
식물 폴리이소프레노이드류의 기능에 대해 여러 제안이 있다. 테르페노이드 퀴논류는 광인산화 및 호흡연쇄 인산화에 관여하는 것으로 여겨진다. 고무는 초식동물에 대한 식물의 방어에 관여하며, 아마도 곤충을 쫓아내거나 속이고 식물 수지와 유사한 방식으로 상처를 봉합하는데 관여하는 것으로 여겨진다. C45-C115폴리프레놀류의 구체적인 역할은 미확인 상태로 남아 있지만, 대부분의 2차 대사 물질과 마찬가지로 식물 방어에서 역할을 할 것이다. 또한 단쇄 폴리프레놀류는 동물 대사 작용에서의 돌리콜의 역할과 유사하게 식물에서 단백질의 글리코실화에 관여할 수도 있다.
해결해야 할 문제는 식물 방어 기전에 유용성이 있는 신규 식물 유전자를 확인하는 것이다. 본 출원인은 식물 시스-프레닐트랜스퍼라제를 코딩하는 식물 유전자를 확인함으로써 상기 언급된 문제를 해결하였다. 본 발명은 식물로부터 박테리아 UPP 신타제 및 효모 데돌-PP 신타제와 상당한 상동성을 나타내는 유전자를 제공한다. 본 발명은 그러한 유전자가 곡물 및 고무 나무 (헤베아 브라실리엔시스,Hevea brasiliensis)와 같이 경제상 중요한 작물을 비롯한, 여러 범위의 식물종에서 존재함을 입증하였고, 따라서 어느 식물에나 존재하는 듯하다.
본 발명은 시스-프레닐트랜스퍼라제 단백질을 코딩하는 밀, 포도, 대두, 쌀, 아프리칸 데이지, 고무 나무 및 금잔화로부터의 EST 서열의 확인 및 특성화에 관한 것이다.
<발명의 개요>
본 발명의 목적은 (a) 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 서열 18 및 서열 20으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산의 전부 또는 실질적인 일부를 코딩하는 단리된 핵산 단편, (b) 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 서열 18 및 서열 20으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 전부 또는 실질적인 일부를 코딩하는 단리된 핵산 단편과 실질적으로 유사한 단리된 핵산 단편, (c) 서열 24에 기재된 아미노산 서열과 41％ 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 단편, (d) 서열 23에 기재된 핵산 서열과 50％ 이상의 동일성을 갖는 핵산을 코딩하는 단리된 핵산 단편, (e) 0.1X SSC, 0.1％ SDS, 65℃의 혼성화 조건 및 0.2X SSC, 0.5％ SDS의 세척 조건 하에서 (a), (b), (c) 또는 (d)의 핵산 서열과 혼성화하는 단리된 핵산 분자, (f) 0.1X SSC, 0.1％ SDS, 65℃의 혼성화 조건 및 0.2X SSC, 0.5％ SDS의 세척 조건 하에서 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 13, 서열 15, 서열 17 및 서열 19로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열과 혼성화하는 단리된 핵산 단편 및 (g) (a), (b), (c), (d), (e) 또는 (f)와 상보적인 단리된 핵산 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 식물 시스-프레닐트랜스퍼라제 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 단편을 제공하는 것이다.
추가로 본 발명은 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 서열 18 및 서열 20에 나타난 바와 같이, 본 발명의 단리된 핵산 단편에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 제공한다.
추가의 실시 태양에서, 본 발명은 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 단리된 핵산 단편을 포함하는 키메라 유전자를 제공한다.
추가로 본 발명은 (a) 본 발명의 키메라 유전자로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계, (b) (a)단계로부터 생성된 형질전환 숙주 세포를 키메라 유전자의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하여 형질전환되지 않은 숙주 세포에서의 발현 수준에 비해 상기 형질전환 숙주세포 내에서 식물 시스-프레닐트랜스퍼라제 단백질이 변화된 수준으로 생산되도록 하는 단계를 포함하는, 숙주 세포 내에서 식물 시스-프레닐트랜스퍼라제 단백질의 발현 수준을 변화시키는 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 시스-프레닐트랜스퍼라제 단백질을 형질전환 식물 내에서 발현시켜 식물의 방어 기전을 변형시키는 방법을 제공한다.
추가로 본 발명은 본 발명의 키메라 유전자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
다른 실시 태양에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열 일부를 혼성화 프로브또는 프라이머로서 사용하여 식물 시스-프레닐트랜스퍼라제 단백질을 코딩하는 아미노산 서열의 전부 또는 실질적인 일부를 코딩하는 핵산 단편을 얻는 방법을 제공한다.
<도면의 간단한 설명 및 서열에 대한 설명>
도 1은 IPP로부터 GPP, FPP 및 GGPP의 합성과 GPP, FPP 및 GGPP로부터 폴리프레놀류의 합성에 대한 모식도를 나타낸다.
도 2는 다른 식물 종들로부터의 박테리아 운데카프레닐 포스페이트 신타제 상동체를 코딩하는 cDNA의 코딩 영역과 박테리아 (마이크로코커스 루테우스,Micrococcus luteus) 및 두 효모 유전자 (rer2,srt1)의 서열 정렬을 나타낸다.
도 3은 식물 시스-프레닐트랜스퍼라제의 추정 아미노산 서열에 대한 서열 정렬을 나타낸다.
도 4는 도 2에서 도시된 식물 cDNA의 일부로부터 유래된 단백질과 박테리아 (마이크로코커스 루테우스) 및 두 효모 유전자 (rer2, srt1)의 추정된 아미노산 서열의 서열 정렬을 나타낸다.
도 5A는 야생형 아라비돕시스 (arabidopsis) 잎으로부터 추출된 비-검화 (non-saponifiable) 물질의 LC-MS 분석에 의해 생성된 크로마토그램 (210 nm에서의 다이오드 어레이 검출기 반응)을 도시하고 있다.
도 5B는 35S::Hpt3 구조물로 형질전환된 아라비돕시스의 잎으로부터 추출된 비-검화 물질의 LC-MS 분석에 의해 생성된 크로마토그램 (210 nm에서의 다이오드 어레이 검출기 반응)을 도시하고 있다.
도 5C는 35S::rr1 구조물로 형질전환된 아라비돕시스의 잎으로부터 추출된 비-검화 물질의 LC-MS 분석에 의해 생성된 크로마토그램 (210 nm에서의 다이오드 어레이 검출기 반응)을 도시하고 있다.
도 5D는 35S::Apt5 구조물로 형질전환된 아라비돕시스의 잎으로부터 추출된 비-검화 물질의 LC-MS 분석에 의해 생성된 크로마토그램 (210 nm에서의 다이오드 어레이 검출기 반응)을 도시하고 있다.
도 5E는 35S::Sl1 구조물로 형질전환된 아라비돕시스의 잎으로부터 추출된 비-검화 물질의 LC-MS 분석에 의해 생성된 크로마토그램 (210 nm에서의 다이오드 어레이 검출기 반응)을 도시하고 있다.
도 6A는 야생형 아라비돕시스 잎으로부터 추출된 비-검화 물질의 LC-MS 분석에 의해 생성된 도데카프레놀에 대한 추출 이온 크로마토그램 (m/z 816 내지 818의 이온에 대한 질량 검출기 반응)을 도시하고 있다.
도 6B는 35S::Hpt3 구조물로 형질전환된 아라비돕시스 잎으로부터 추출된 비-검화 물질의 LC-MS 분석에 의해 생성된 도데카프레놀에 대한 추출 이온 크로마토그램 (m/z 816 내지 818의 이온에 대한 질량 검출기 반응)을 도시하고 있다.
도 6C는 35S::rr1 구조물로 형질전환된 아라비돕시스 잎으로부터 추출된 비-검화 물질의 LC-MS 분석에 의해 생성된 도데카프레놀에 대한 추출 이온 크로마토그램 (m/z 816 내지 818의 이온에 대한 질량 검출기 반응)을 도시하고 있다.
도 6D는 35S::Apt5 구조물로 형질전환된 아라비돕시스 잎으로부터 추출된 비-검화 물질의 LC-MS 분석에 의해 생성된 도데카프레놀에 대한 추출 이온 크로마토그램 (m/z 816 내지 818의 이온에 대한 질량 검출기 반응)을 도시하고 있다.
도 6E는 35S::Sl1 구조물로 형질전환된 아라비돕시스 잎으로부터 추출된 비-검화 물질의 LC-MS 분석에 의해 생성된 도데카프레놀에 대한 추출 이온 크로마토그램 (m/z 816 내지 818의 이온에 대한 질량 검출기 반응)을 도시하고 있다.
본 발명은 하기의 상세한 설명 및 본 출원의 일부를 형성하는 서열에 대한 설명으로부터 보다 완전하게 이해될 수 있다.
하기 서열에 대한 설명 및 본원에 첨부된 서열 목록은 미국 특허 시행 규칙 37 C.F.R. 1.821항 내지 1.825항 ("핵산 서열 및(또는) 아미노산 서열 공개를 포함하는 특허 출원에 대한 필요 조건 - 서열 규정")에 의한 특허 출원의 핵산 및(또는) 아미노산 서열 공개 규정에 따른 것이며, 세계 지적 소유권 기구 (WIPO) 표준 ST2.5 (1998) 및 EPO와 PCT의 서열 목록 필요 조건 (규정 5.2 및 49.5(a-bis)과 행정 지침 (Administration Instruction) 제208조 및 부록 C)에 부합한다. 서열에 대한 설명은 문헌 [Nucleic Acids Res. 13:3021-3030 (1985)] 및 문헌 [Biochemical Journal219:345-373 (1984)] (상기 문헌은 이 인용을 통해 본원에 포함됨)에서 기술된 IUPAC-IYUB 표준에 준거하여 정의된 바와 같이 뉴클레오티드 서열 문자에 대한 단일 문자 코드 및 아미노산에 대한 3 문자 코드를 포함한다.
서열 1은 아프리칸 데이지 클론 dms2c.pk005.c7의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 2는 서열 1에 의해 코딩되는 아프리칸 데이지 클론 dms2c.pk005.c7의 추정 아미노산 서열이다.
서열 3은 금잔화 클론 ecs1c.pk009.p19의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 4는 서열 3에 의해 코딩되는 금잔화 클론 ecs1c.pk009.p19의 추정 아미노산 서열이다.
서열 5는 헤베아 클론 ehb2c.pk001.i10의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 6은 서열 5에 의해 코딩되는 헤베아 클론 ehb2c.pk001.i10의 추정 아미노산 서열이다.
서열 7은 헤베아 클론 ehb2c.pk001.d17의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 8은 서열 7에 의해 코딩되는 헤베아 클론 ehb2c.pk001.d17의 추정 아미노산 서열이다.
서열 9는 헤베아 클론 ehb2c.pk001.o18의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 10은 서열 9에 의해 코딩되는 헤베아 클론 ehb2c.pk001.o18의 추정 아미노산 서열이다.
서열 11은 포도 클론 vdb1c.pk001.k23의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 12는 서열 11에 의해 코딩되는 포도 클론 vdb1c.pk001.k23의 추정 아미노산 서열이다.
서열 13은 쌀 클론 rl0n.pk117.i23의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 14는 서열 13에 의해 코딩되는 쌀 클론 rl0n.pk117.i23의 추정 아미노산 서열이다.
서열 15는 쌀 클론 rr1.pk0050.h8의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 16은 서열 15에 의해 코딩되는 쌀 클론 rr1.pk0050.h8의 추정 아미노산 서열이다.
서열 17은 대두 클론 sl1.pk0128.h7의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 18은 서열 17에 의해 코딩되는 대두 클론 sl1.pk0128.h7의 추정 아미노산 서열이다.
서열 19는 밀 클론 wdk5c.pk005.f22의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 20은 서열 19에 의해 코딩되는 밀 클론 wdk5c.pk005.f22의 추정 아미노산 서열이다.
서열 21은 보존된 도메인 I이다.
서열 22는 보존된 도메인 V이다.
서열 23은 마이크로코커스 루테우스로부터 단리된 박테리아 운데카프레닐 포스페이트 신타제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열 24는 마이크로코커스 루테우스로부터 단리된 박테리아 운데카프레닐 포스페이트 신타제의 추정 아미노산 서열이다.
서열 25는 효모 균주rer2로부터 단리된 효모 운데카프레닐 포스페이트 신타제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열 26은 효모 균주rer2로부터 단리된 효모 운데카프레닐 포스페이트 신타제의 추정 아미노산 서열이다.
서열 27은 효모 균주srt1로부터 단리된 효모 운데카프레닐 포스페이트 신타제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열 28은 효모 균주srt1로부터 단리된 효모 운데카프레닐 포스페이트 신타제의 추정 아미노산 서열이다.
서열 29 내지 36은 다양한 시스-프레닐트랜스퍼라제 유전자로 아라비돕시스를 형질전환하는데 사용된 프라이머이다.
서열 37은 Apt5 아라비돕시스 시스-프레닐트랜스퍼라제 상동체의 뉴클레오티드 서열이다.
본 발명은 식물 분자 생물학 분야에 대한 것이다. 본 발명은 이전에 미생물에서만 확인된 운데카프레닐 디포스페이트 및 데히드로돌리칠 디포스페이트 신타제 (시스-프레닐트랜스퍼라제)의 상동체인 단백질을 코딩하는, 식물로부터의 핵산 단편에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 밀, 포도, 콩, 쌀, 아프리칸 데이지, 고무 나무 및 금잔화로부터의 상동체에 관한 것이다.
본 발명은 밀, 포도, 대두, 쌀, 아프리칸 데이지, 고무 및 금잔화로부터의 EST로서, 미생물의 시스-프레닐트랜스퍼라제와 상동성인 유전자에 대응하는 cDNA의 단리 및 특성화를 기재하고 있다. 이러한 상동체는 이전에 이들 종에 대해서 기술된 적이 없었다. 본원에서 기술하고 있는 유전자의 발현 수준은 공억제 및 과발현 방법에 의해 식물에서 변화시킬 수 있다. 이들은 기본적인 세포 수준의 역할 뿐만 아니라 식물 방어계에서 역할을 갖는 분자군을 합성하는데 관여하는 종래에 개시된 바 없는 유전자이기 때문에, 이는 작물 보호, 생산 또는 폴리이소프레노이드류의 산업적 공급원으로서 이로운 효과를 기대할 수 있는 신규 표현형을 제공할 수 있다. 또한, 유전자 중 하나의 발현 감소가 식물의 생장 또는 발달 결함을 일으키는 경우, 이 유전자는 신규 제초제 표적으로서 이용될 수 있다. 모든 단리된 단백질은 식물에 의한 고분자 시스-이소프레노이드류의 동화 작용을 연구하는 데 대한 도구로서 이용될 수 있다. 이를 통해 상기 기술한 바와 같이 이용될 수 있는 추가의 단백질 확인이 가능하다. 어떠한 관련 EST 서열이든 작물 식물 내에서 상기 기술된 용도를 위해 직접적으로 사용될 수 있다.
하기 정의는 본 명세서에서 사용된 용어 및 약어에 대한 완전한 이해를 위해제공된다.
"중합효소 연쇄 반응"은 PCR로 약칭된다.
"발현 서열 태그"는 EST로 약칭된다.
"오픈 리딩 프레임"은 ORF로 약칭된다.
"SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동"은 SDS-PAGE로 약칭된다.
"UPPS"는 박테리아로부터 단리된 특정 운데카프레닐 디포스페이트 신타제의 약어이다.
"OPPS"는 박테리아로부터 단리된 특정 옥타프레닐 디포스페이트 신타제의 약어이다.
"데돌-PP (Dedol-PP)"는 데히드로돌리콜 디포스페이트이다.
"DMAPP"는 디메틸 알릴 디포스페이트이다.
"IPP"는 이소펜테닐 디포스페이트이다.
"GPP"는 게라닐 디포스페이트이다.
"FPP"는 파르네실 디포스페이트이다.
"GGPP"는 게라닐게라닐 디포스페이트이다.
용어 "시스-프레닐트랜스퍼라제"란 일반적으로 C5단위가 폴리프레닐 및 고무에 연속적으로 부가되는 것을 촉매할 수 있는 효소 계통을 지칭하는 것이다. 시스-프레닐트랜스퍼라제의 두가지 예로 운데카프레닐 디포스페이트 및 데히드로돌리칠 디포스페이트 신타제가 있다.
용어 "단리된 핵산 단편" 또는 "단리된 핵산 분자"란 단일쇄 또는 이중쇄이며, 임의로 합성, 비-천연 또는 변형된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 RNA 또는 DNA 중합체를 지칭하는 것이다. DNA 중합체 형태의 단리된 핵산 단편 또는 단리된 핵산 분자는 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA의 하나 이상의 단편을 포함할 수 있다.
용어 "숙주 세포" 및 "숙주 생물체"란 외래 유전자 또는 이종 유전자를 수용할 수 있고 그 유전자를 발현시켜 활성 유전자 산물을 생산할 수 있는 세포를 지칭하는 것이다. 적합한 숙주 세포는 박테리아 및 진균류와 같은 미생물 뿐만 아니라 식물 세포를 포함한다.
용어 "식물 방어 반응"이란 곤충, 진균류, 박테리아 또는 바이러스와 같은 병원체 뿐만 아니라 초식동물에 의한 조직 손상을 막는 식물의 능력을 지칭하는 것이다.
용어 "단편"이란 본 발명의 핵산 서열 또는 단백질의 부분 서열을 포함하는 DNA 또는 아미노산 서열을 지칭하는 것이다. 그러나, 본 발명의 활성 단편은 활성을 유지하기에 충분한 단백질의 일부를 포함한다.
본원에서 사용된 "실질적으로 유사한"이란 하나 이상의 뉴클레오티드 염기에서 일어난 변화가 하나 이상의 아미노산 치환을 야기하지만, 그 DNA 서열에 의해 코딩된 단백질의 기능적 특성에는 영향을 주지 않는 핵산 단편을 지칭하는 것이다. 또한 "실질적으로 유사한"이란 하나 이상의 뉴클레오티드 염기에서 일어난 변화가 안티센스 또는 공억제 기술에 의해 유전자 발현의 변화를 조절하는 데 대한 그 핵산 단편의 능력에 영향을 주지 않는 핵산 단편을 지칭하는 것이다. 또한 "실질적으로 유사한"이란 안티센스 또는 공억제 기술에 의하거나 생성된 단백질 분자의 기능적 특성을 변화시킴으로써 유전자 발현의 변화를 조절하는 능력에 관련하여, 생성된 전사물의 기능적 특성에 실질적으로 영향을 주지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드 염기에 대한 결실 또는 삽입과 같은 본 발명의 핵산 단편에 대한 수식을 지칭하는 것이다. 따라서, 본 발명은 구체적인 예시 서열보다 많은 서열을 포함하는 것이다.
예를 들어, 유전자 발현의 안티센스 억제 및 공억제는 유전자의 전체 코딩 영역 보다 적은 영역을 나타내는 핵산 단편을 이용하여, 그리고 억제되는 유전자와 100％ 동일성을 공유하지는 않는 핵산 단편에 의해서 수행될 수 있다는 것은 당업계에 널리 공지되어 있다. 또한, 코딩된 단백질의 기능적 특성에는 영향을 주지 않고 주어진 부위에서 화학적으로 동등한 아미노산의 생성을 야기하는, 유전자의 변형법이 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 소수성 아미노산인 알라닌 아미노산의 코돈은 다른 덜 소수성인 잔기 (예를 들어, 글라이신) 또는 보다 더 소수성인 잔기 (예를 들어, 발린, 루신 또는 이소루신)를 코딩하는 코돈으로 치환될 수 있다. 유사하게, 음전하 잔기가 다른 음전하 잔기로 (예를 들어, 아스파르트산이 글루탐산으로) 또는 양전하 잔기가 다른 양전하 잔기로 (예를 들어, 리신이 아르기닌으로) 치환되도록 변화시켜도 기능적으로 동등한 산물을 생성하리라고 기대할 수 있다. 또한, 단백질 분자의 N-말단 또는 C-말단 부위에 변형을 일으키는 뉴클레오티드 변화도 단백질 활성에는 변화를 일으키지 않으리라고 기대할 수 있다. 코딩된 산물의 생물학적 활성의 보유 여부를 결정하는 것과 마찬가지로, 제안된 각각의수식 방법은 당업계에서 일상적인 기술이다. 또한, 당업자는 본 발명에 포함되는 실질적으로 유사한 서열이 본원에서 예시한 서열과 엄격도 조건 (0.1X SSC, 0.1％ SDS, 65℃) 하에서 혼성화하는 능력에 의해서도 규정될 수 있음을 이해한다. 본 발명의 실질적으로 유사한 핵산 단편은 본원에서 제시한 핵산 단편의 DNA 서열과 80％ 이상의 동일성을 갖는 DNA 서열의 핵산 단편인 것이 바람직하다. 보다 바람직한 핵산 단편은 본원에서 제시한 핵산 단편의 DNA 서열과 90％ 이상의 동일성을 갖는 것이다. 본원에서 제시하는 핵산 단편의 DNA 서열과 95％ 이상의 동일성을 갖는 핵산 단편이 보다 바람직하다.
아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 "실질적인 일부"란 당업자가 수동으로 서열을 평가하는 것에 의하거나 컴퓨터를 통해 자동으로 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; 문헌 [Altschul, S.F., et al., (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410] 참조; 또한 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 참조)와 같은 알고리즘을 이용하여 서열을 비교하고 확인하는 것에 의해, 폴리펩티드 또는 유전자를 잠정적으로 확인하는데 충분한 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다. 일반적으로, 폴리펩티드 또는 핵산 서열이 공지된 단백질 또는 유전자와 상동성이 있는지 잠정적으로 확인하기 위해서는 열 개 이상의 연속적인 아미노산의 서열 또는 30개 이상의 연속적인 뉴클레오티드의 서열이 필요하다. 또한, 뉴클레오티드 서열에 관해서는, 20 내지 30개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 유전자 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 유전자 확인에 대한 서열-의존적 방법 (예, 서던 혼성화 (Southern hybridization)) 및 단리 (예, 박테리아 콜로니 또는 박테리오파지 플라크에 대한 인 사이투 혼성화 (in situ hybridization))에 이용할 수 있다. 또한, 염기 12 내지 15개의 짧은 올리고뉴클레오티드를 PCR에서 증폭 프라이머로 사용하여 프라이머를 포함한 특정 핵산 단편을 얻을 수 있다. 따라서, 뉴클레오티드 서열의 "실질적인 일부"란 그 서열을 포함하는 핵산 단편을 구체적으로 확인하고(하거나) 단리하는데 충분한 서열을 포함하는 것이다. 본 명세서는 하나 이상의 특정 진균류 단백질을 코딩하는 일부 또는 전체 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 교시하고 있다. 본원에 기재한 서열의 잇점을 이해한 당업자라면 당업자에게 공지된 목적에 따라 개시된 서열의 전체 또는 실질적인 일부를 이용할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 서열 목록에 기재한 완전한 서열 뿐만 아니라 상기 정의된 바의 그 서열의 실질적인 일부도 포함한다.
용어 "서열 분석 소프트웨어"란 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 분석에 유용한 임의의 컴퓨터 알고리즘 또는 소프트웨어 프로그램을 지칭하는 것이다. "서열 분석 소프트웨어"는 시판되거나 독립적으로 개발될 수 있다. 전형적인 서열 분석 소프트웨어에는 GCG 스위트 프로그램 (위스콘신 팩키지 버전 9.0, 제네틱스 컴퓨터 그룹 (Genetics Computer Group) (GCG), 위스콘신주 매디슨), BLASTP, BLASTN, BLASTX (문헌 [Altschul et al.,J. Mol. Biol. 215;403-410 (1990)] 참조), Vector NTI (인포맥스 인크 (InforMax Inc). 매릴랜드주 노스 베세다 스위트 400 6110 엑세큐티브 불리바드) 및 DNASTAR (디엔에이스타 인크 (DNASTAR Inc.) 위스콘신주 매디슨 파크 스트리트 12285)가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.본 출원의 취지상 서열 분석 소프트웨어가 분석에 이용된 경우, 그 분석 결과는 달리 명시하지 않는 한 참조된 프로그램의 "디폴트 값 (default value)"에 근거한 것임을 이해할 것이다. 본원에서 사용된 "디폴트 값"이란 처음 시작하였을 때 소프트웨어가 원래 읽어들이는 임의의 값 또는 파라미터 세트를 의미한다. 당업계에 공지된 바의 용어 "동일성 ％"란 서열을 비교하여 결정된 둘 이상의 폴리펩티드 서열 또는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 관계이다. 또한, 당업계에서 "동일성"이란, 서열의 문자 사이의 매치 (match)에 의해 결정되는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 서열 관련성 정도를 의미한다. "동일성" 및 "유사성"은 문헌 [Computational Molecular Biology(Lesk, A.M., ed.) Oxford University Press, New York (1988)], 문헌 [Biocomputing: Informatics and Genome Projects(Smith, D.W., ed.) Academic Press, New York (1993)], 문헌 [Computer Analysis of Sequence Data, Part I(Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994)], 문헌 [Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987)] 및 문헌 [Sequence Analysis Primer(Gribskov, M. and Devereux, J., eds) Stockton Press, New York (1991)]에 기술된 것들을 비롯하여 공지된 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 동일성을 결정하는 바람직한 방법은 시험 서열 사이에서 우수한 매치 결과를 얻도록 설계된 것이다.
동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 공개적으로 입수 가능한 컴퓨터 프로그램으로 코드화되어 있다. 서열 정렬 및 동일성 ％ 계산은 레이저진 (LASERGENE)바이오인포매틱스 계산 스위트의 멕얼라인 (Megalign) 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다 (DNASTAR Inc., 위스콘신주 매디슨). 다중 서열 정렬은 디폴트 파라미터 (GAP PENALTY = 10, GAP LENGTH PENALTY = 10)로 클러스탈 (Clustal) 정렬 방법을 이용하여 수행할 수 있다 (문헌 [Higgins and Sharp (1989) CABIOS. 5:151-153] 참조). 클러스탈 법을 이용한 쌍정렬을 위한 디폴트 파라미터는 KTUPLE 1, GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5 및 DIAGONALS SAVED = 5 이다.
적합한 핵산 단편 (본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드)은 본원에 기재된 아미노산 서열과 약 70％ 이상, 바람직하게는 약 80％ 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것이다. 바람직한 핵산 단편은 본원에 기재된 아미노산 서열과 약 85％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 것이다. 보다 바람직한 핵산 단편은 본원에 기재된 아미노산 서열과 약 90％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 것이다. 본원에 기재된 아미노산 서열과 약 95％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 단편이 가장 바람직하다. 적합한 핵산 단편은 상기의 상동성을 가질뿐만 아니라 일반적으로 50개 이상의 아미노산, 바람직하게는 100개 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 150개 이상의 아미노산, 보다 더 바람직하게는 200개 이상의 아미노산, 가장 바람직하게는 250개 이상의 아미노산을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것이다.
"코돈 축중 (codon degeneracy)"이란 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대한 영향 없이 뉴클레오티드 서열의 변동을 허용하는 유전자 코드에서의 이형성을 지칭한다. 따라서, 본 발명은 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열12, 서열 14, 서열 16, 서열 18 및 서열 20에 기재된 단백질의 전부 또는 실질적인 일부를 코딩하는 임의의 핵산 단편에 관한 것이다. 당업자는 뉴클레오티드 코돈을 이용한 주어진 아미노산의 기재에 특정 숙주 세포가 나타내는 "코돈-편향성"을 잘 알고 있다. 따라서, 숙주 세포 내에서 발현을 증진시키기 위한 유전자를 합성하는 경우, 코돈 사용의 빈도가 숙주세포의 바람직한 코돈 사용 빈도에 근접하도록 유전자를 설계하는 것이 바람직하다.
"상보적"이란 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 사이의 관계를 기술하기 위해 사용되는 용어이다. 따라서, DNA의 경우, 아데노신은 티민에 상보적이고, 시토신은 구아닌에 상보적이다.
핵산 분자의 단일쇄 형태가 적절한 온도 및 용액 이온 강도 조건 하에서 다른 핵산 분자와 어닐링할 수 있는 경우, 그 핵산 분자는 상기 다른 핵산 분자, 예를 들어 cDNA, 게놈 DNA 또는 RNA에 대해 "혼성화 가능"한 것이다. 혼성화 및 세척 조건은 널리 공지되어 있으며, 문헌 [Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T.Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989)], 특히 그 안의 11장 및 표 11.1에 잘 예시되어 있다 (이 인용을 통해 전체가 본원에 포함됨). 온도 및 이온 강도에 대한 조건은 혼성화의 "엄격도"를 결정한다. 먼 관계의 생물체로부터 얻은 상동성 서열과 같이 어느 정도 유사한 단편에서부터 가까운 관계인 생물체로부터의 기능성 효소가 중복되는 유전자와 같이 매우 유사한 단편에 이르기까지 엄격도 조건을 조정하여 스크리닝할 수 있다. 혼성화 후의 세척도 엄격도 조건을 결정한다. 바람직한 조건의 한 세트에서는 실온에서 15분 동안 6X SSC, 0.5％ SDS로 출발하여, 그 후 45℃에서 30분 동안 2X SSC, 0.5％ SDS로 반복하고, 그 후 50℃에서 30분동안 0.2X SSC, 0.5％ SDS로 2회 반복하는 일련의 세척 과정을 이용한다. 엄격 조건의 보다 바람직한 세트에서는 상기의 세척 과정과 동일하되 고온을 이용하여, 0.2X SSC, 0.5％ SDS로 세척하는 최종 2회의 30분 세척에서 온도를 60℃로 증가시킨다. 높은 엄격도 조건의 다른 바람직한 세트에서는 65℃에서 0.1X SSC, 0.1％ SDS로 최종 2회 세척하는 것을 이용한다. 혼성화의 엄격도에 따라 염기 사이의 미스매치도 있을 수 있지만, 혼성화에서는 두 핵산이 상보적인 서열을 포함하는 것이 요구된다. 핵산을 혼성화하는데 적절한 엄격도는 그 핵산의 길이와 상보성의 정도, 당업계에 널리 공지된 변수에 따라 결정된다. 두 뉴클레오티드 서열 사이에 유사성 또는 상동성의 정도가 클수록, 상기 서열을 갖는 핵산의 하이브리드에 대한 Tm값이 커진다. 핵산 혼성화의 상대적 안정성 (더 높은 Tm에 대응함)은 하기 순서대로 감소한다. RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. 길이가 100 뉴클레오티드를 넘는 하이브리드의 경우에 대해 Tm을 계산하기 위한 등식이 유도되었다 (문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌, 9.50-9.51] 참조). 보다 짧은 핵산, 즉, 올리고뉴클레오티드의 혼성화인 경우, 미스매치의 위치가 보다 중요하며, 올리고뉴클레오티드의 길이가 그의 특이성을 결정한다 (문헌 [(Sambrook et al., 상기 문헌, 11.7-11.8) 참조]. 한 실시 태양에서, 혼성화 가능한 핵산의 길이는 약 10 뉴클레오티드 이상이다. 혼성화 가능한 핵산의 바람직한 최소 길이는 약 15 뉴클레오티드 이상이고, 보다 바람직하게는 약 20 뉴클레오티드이며, 30 뉴클레오티드 이상이 가장바람직한 길이이다. 또한, 당업자는 온도 및 세척 용액 염 농도가 프로브 길이 등의 인자에 따라 필요에 따라 조정될 수 있음을 이해할 것이다.
"합성 유전자"는 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드 빌딩 블록으로부터 조립될 수 있다. 이들 빌딩 블록은 리게이션 및 어닐링되어 유전자 단편을 형성하고, 그후 효소적으로 조립되어 전체 유전자가 제작된다. DNA의 서열과 관련하여 "화학적으로 합성된"이란 성분 뉴클레오티드가 시험관 내에서 합성되는 것을 의미한다. 잘 확립된 방법을 사용하여 DNA의 수동식 화학적 합성을 수행할 수 있으며, 또는 다수의 시판 기계 중 하나를 이용하여 자동식 화학적 합성을 수행할 수 있다. 따라서, 숙주 세포의 코돈 편향성을 반영한 뉴클레오티드 서열의 최적화를 기반하여 최적의 유전자 발현을 위한 유전자를 제작할 수 있다. 당업자는 코돈 이용이 숙주가 선호하는 코돈으로 편향되는 경우 성공적으로 유전자가 발현할 가능성을 이해할 것이다. 바람직한 코돈을 결정하는 것은 그 숙주로부터 유래되고, 서열 정보가 이용 가능한 유전자의 연구를 기반으로 한다.
"유전자"란 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 지칭하는 것이며, 코딩 서열 앞 (5' 비-코딩 서열)과 뒤 (3' 비-코딩 서열)의 조절 서열을 포함한다. "천연 서열"이란 천연 상태에서 발견되는 그 자체의 조절 서열을 함유한 유전자를 지칭하는 것이다. "키메라 유전자"란 천연 유전자가 아닌 임의의 유전자로서 천연 상태에서 함께 발견되지 않는 조절 서열 및 코딩 서열을 포함하는 것을 지칭하는 것이다. 따라서, 키메라 유전자는 다른 기원으로부터 유래된 조절 서열 및 코딩 서열을 포함하거나, 같은 기원으로부터 유래하였어도 천연 상태에서 발견되는 것과는 다른 방식으로 배열된 조절 서열 및 코딩 서열을 포함할 수 있다. "내생 유전자"란 생물체의 게놈 내에서 그의 본래 위치에 있는 천연 유전자를 지칭하는 것이다. "외래 유전자"란 숙주 생물체 내에서는 정상적으로 발견되지 않지만, 유전자 전달에 의해 숙주 생물체 내로 도입된 유전자를 지칭하는 것이다. 외래 유전자는 비-천연 생물체에 삽입된 천연 유전자 또는 키메라 유전자를 포함할 수 있다. "트랜스진"이란 형질 전환법에 의해 게놈 내로 도입된 유전자이다.
"코딩 서열"이란 특정 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 지칭하는 것이다. "조절 서열"이란 코딩 서열의 상류 (5' 비-코딩 서열), 내부 또는 하류 (3' 비-코딩 서열)에 위치한 뉴클레오티드 서열로서, 관련 코딩 서열의 전사, RNA 프로세싱 또는 안정성이나 번역에 영향을 주는 것을 지칭하는 것이다. 조절 서열은 프로모터, 번역 리더 (leader) 서열, 인트론 및 폴리아데닐화 인식 서열을 포함할 수 있다.
"프로모터"란 코딩 서열 또는 기능성 RNA의 발현을 조절할 수 있는 DNA 서열을 지칭하는 것이다. 일반적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열의 3' 위치에 있다. 프로모터 서열은 근접한 인자 및 보다 먼 상류 인자 (element)로 구성되어 있으며, 후자의 경우 대개 인헨서 (enhancer)로 지칭된다. 따라서, "인헨서"란 프로모터 활성을 자극할 수 있는 DNA 서열이며, 그 프로모터의 본래 인자이거나 프로모터의 수준 또는 조직-특이성을 높이기 위해 삽입된 이종 인자일 수 있다. 프로모터는 천연 유전자로부터 그 전체가 유래되거나, 천연 상태에서 발견되는 다른 프로모터로부터 유래된 다른 인자로 구성되거나, 합성 DNA 단편을 포함할 수도 있다. 당업자는 다른 프로모터가 다른 조직 또는 세포형에서나 다른 발생 단계에서, 또는 다른 환경 조건에 대한 반응으로 유전자의 발현을 일으킬 수 있음을 이해한다. 대부분의 세포형에서 대부분의 시간에 유전자가 발현되도록 하는 프로모터는 일반적으로 "구성적 프로모터"로 지칭된다. 식물 세포에 유용한 다양한 유형의 신규 프로모터가 지속적으로 발견되었으며, 편찬 문헌 [Okamuro and Goldberg,Biochem. Plants15:1-82 (1998)]에서 여러 예를 찾을 수 있을 것이다. 또한 대부분의 경우 조절 서열의 정확한 범위가 완전히 정해지지 않기 때문에, 다른 길이의 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있다는 것도 알려져 있다.
"번역 리더 서열"이란 유전자의 프로모터 서열 및 코딩 서열 사이에 위치한 DNA 서열을 지칭하는 것이다. 번역 리더 서열은 번역 출발 서열의 완전히 프로세싱된 mRNA 상류에 존재한다. 번역 리더 서열은 1차 전사물의 mRNA로의 프로세싱, mRNA 안정성 또는 번역 효율에 영향을 줄 수 있다. 번역 리더 서열의 예가 기술되어 있다 (문헌 [Turner et al., Mol. Biotech. 3:225 (1995)] 참조).
"3' 비-코딩 서열"이란 코딩 서열의 하류에 위치한 DNA 서열을 지칭하는 것이며, 폴리아데닐화 인식 서열 및 mRNA 프로세싱 또는 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 조절 신호를 코딩하는 다른 서열을 포함한다. 폴리아데닐화 신호는 일반적으로 폴리아데닐산 부위가 mRNA 전구체의 3' 말단에 첨가되는 것에 영향을 주는 것을 특징으로 한다. 다른 3' 비-코딩 서열의 용도가 문헌 [Ingelbrecht et al.,Plnat Cell1:671-680 (1989)]에 예시되어 있다.
"RNA 전사물"이란 RNA 중합효소로 촉매된 DNA 서열의 전사 작용으로 인한 생성물을 지칭하는 것이다. RNA 전사물이 DNA 서열의 완벽한 상보적 복제물인 경우 이를 1차 전사물로 지칭하며, 1차 전사물의 전사후 프로세싱으로부터 유래한 RNA 서열인 경우 이를 성숙 RNA로 지칭한다. "메신저 RNA" (mRNA)란 인트론이 없고 세포에 의해 단백질로 번역될 수 있는 RNA를 지칭하는 것이다. "cDNA"란 mRNA에 상보적이며, mRNA로부터 유래한 이중쇄 DNA를 지칭하는 것이다. "센스" RNA란 mRNA를 포함한 RNA 전사물을 지칭하는 것이며, 따라서 세포에 의해 단백질로 번역될 수 있는 것이다. "안티센스 RNA"란 표적 1차 전사물 또는 mRNA의 전부 또는 일부와 상보적이며, 표적 유전자의 발현을 차단하는 RNA 전사물을 지칭하는 것이다 (미국 특허 제5,107,065호). 안티센스 RNA의 상보성은 특정 유전자 전사물의 임의의 부분, 즉 5' 비-코딩 서열, 3' 비-코딩 서열, 인트론 또는 코딩 서열에서 존재할 수 있다. "기능성 RNA"란 안티센스 RNA, 리보자임 RNA 또는 번역되지는 않지만 세포 작용에 영향을 주는 다른 RNA를 지칭하는 것이다.
"작동 가능하게 연결된"이란 한 핵산 서열의 기능이 다른 핵산 서열에 의해 영향을 받도록 단일 핵산 단편 상에서 핵산 서열들이 연결되는 것을 지칭하는 용어이다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 발현에 영향을 주는 경우, 그 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 것이다 (즉, 상기 코딩 서열은 프로모터의 전사 조절 하에 있다). 코딩 서열은 조절 서열에 센스 또는 안티 센스 방향으로 작동 가능하게 연결될 수 있다.
"발현"이란 본 발명의 핵산 단편으로부터 유래된 센스 (mRNA) 또는 안티센스RNA의 전사 및 안정적인 축적을 지칭하는 용어이다. 또한, 발현은 mRNA가 폴리펩티드로 번역되는 것을 지칭할 수도 있다. "안티센스 저해"란 표적 단백질의 발현을 억제할 수 있는 안티센스 RNA 전사물이 생산되는 것을 지칭한다. "과발현"이란 정상적인 또는 형질전환되지 않은 생물체에서의 생산 수준을 초과하여 트랜스제닉 생물체에서 유전자 산물이 생산되는 것을 지칭한다. "공억제 (co-suppression)"란 동일한 또는 실질적으로 유사한 외래 또는 내생 유전자의 발현을 억제할 수 있는 센스 RNA 전사물이 생산되는 것을 지칭한다 (미국 특허 제5,231,020호).
"변화된 수준"이란 정상 또는 형질전환되지 않은 생물체와는 다른 양 또는 다른 비율로 생물체 내에서 유전자 산물(들)이 생산되는 것을 지칭한다.
"성숙" 단백질이란 번역후 프로세싱을 거친 폴리펩티드, 즉 1차 번역 산물에서 존재하던 임의의 프리-또는 프로펩티드가 제거된 형태를 지칭한다. "전구체" 단백질이란 mRNA의 1차 번역 산물, 즉 여전히 프리- 및 프로펩티드가 있는 것을 지칭한다. 프리- 및 프로펩티드는 세포내 이동 신호일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
"엽록체 운송 펩티드 (chloroplast transit peptide)"란 단백질과 함께 번역되며, 그 단백질이 만들어진 세포 내에 존재하는 엽록체 또는 다른 색소체 유형으로 상기 단백질을 이동시키는 아미노산 서열이다. "엽록체 운송 서열"이란 엽록체 운송 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. "신호 펩티드"란 단백질과 함께 번역되며, 그 단백질을 분비계로 이동시키는 아미노산 서열이다 (문헌 [Chrispeels, J.J.,Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 42:21-53 (1991)] 참조). 단백질이 액포로 이동하는 경우, 액포 표적 신호 (상기 문헌)가 추가로 첨가되고, 세포질 소포체로 이동하는 경우, 세포질 소포체 보유 신호 (상기 문헌)가 첨가될 수 있다. 단백질이 핵으로 이동하는 경우, 존재하는 임의의 신호 펩티드는 제거되어야 하고, 대신 핵 배치 신호 (nuclear localization signal)를 함유하게 된다 (문헌 [Raikhel et al., Plant Phys. 100:1627-1632 (1992)] 참조).
"형질전환"이란 숙주 생물체의 게놈 내로 핵산 단편을 전달하여, 유전적으로 안정한 유전 양상을 나타내는 것을 지칭한다. 형질전환된 핵산 단편을 함유하는 숙주 생물체는 "트랜스제닉" 생물체로 지칭된다. 식물 형질전환 방법의 예로는 아그로박테리움-매개 형질전환 (문헌 [De Blaere et al.,Meth. Enzymol. 143:277 (1987)] 참조) 및 입자-가속 또는 "유전자 총" 형질전환 기술이 포함된다 (문헌 [Klein et al.,Nature, London327:70-73 (1987)], 미국 특허 제4,945,050호 참조).
본원에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 문헌 [Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T.Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989] (이후 "Sambrook et al."로 지칭함)에 보다 상세히 기술되어 있다.
폴리-시스-이소프레노이드류의 합성에 관여하는 미생물 시스-프레닐트랜스퍼라제 단백질의 독특한 식물 상동체가 밀, 포도, 대두, 쌀, 아프리칸 데이지, 고무 및 금잔화로부터 단리되었다. 당업자에게 널리 공지된 BLAST 알고리즘을 이용하여 이들의 랜덤 cDNA 서열을 진뱅크 (GenBank) 데이터베이스와 비교한 결과, 이들 단백질이 식물 내에서 확인된 다른 단백질과 의미있는 상동성을 가지고 있지 않는 것으로 나타났다. 본 상동체 cDNA의 뉴클레오티드 서열은 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 13, 서열 15, 서열 17 및 서열 19에서 제공된다. 다른 식물로부터의 다른 폴리-시스-이소프레노이드 신타제 유전자 및 단백질은 본 명세서에서 제공된 본원의 시스-프레닐트랜스퍼라제 서열과 랜덤 cDNA 서열을 비교함으로써 확인할 수 있다.
본 발명의 서열은 공용 데이터베이스 뿐만 아니라 내부의 사설 데이터베이스에 의해서도 확인되었다. 본 발명의 서열과 마이크로코커스 루테우스 (문헌 [Shimizu, N., Koyama, T. and Ogura, K.,J. Biol. Chem. 273:19476-19481 (1998)] 참조) 및 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)로부터 단리된 시스-프레닐트랜스퍼라제 유전자 및 단백질 사이에 강한 연관성이 나타났다. 따라서, 본 발명의 목적은 핵산 서열이 마이크로코커스 루테우스로부터 단리된 박테리아 운데카프레닐 디포스페이트 신타제 유전자와 50％ 이상의 동일성을 가지며, 80％ 이상의 연관성을 갖는 것이 바람직한 식물 시스-프레닐트랜스퍼라제 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 것이다. 유사하게, 본 발명은 아미노산 서열이 마이크로코커스 루테우스로부터 단리된 박테리아 운데카프레닐 디포스페이트 신타제 단백질과 41％ 이상의 동일성을 가지며, 70％ 이상의 연관성을 갖는 것이 바람직한 식물 시스-프레닐트랜스퍼라제 단백질을 제공한다.
본 발명의 핵산 단편은 동일한 또는 다른 식물 종으로부터 상동성 프레닐트랜스퍼라제를 코딩하는 cDNA 및 유전자를 단리하는데 사용할 수 있다. 서열-의존성 프로토콜을 이용하여 상동성 유전자를 단리하는 것은 당업계에 널리 공지되어 있다. 서열-의존성 프로토콜의 예로는 핵산 혼성화법과 핵산 증폭 기술의 다양한 용법에 의한 DNA 및 RNA 증폭 방법 (예, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 또는 연결효소 연쇄 반응)이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들어, 본 발명의 핵산 단편 전부 또는 일부를 DNA 혼성화 프로브로서 사용하여 임의의 원하는 식물로부터 얻은 라이브러리를 당업자에게 널리 공지된 방법으로 스크리닝함으로써 다른 시스-프레닐트랜스퍼라제 유전자 (및 특히 운데카프레닐 디포스페이트 및 데히드로돌리칠 디포스페이트 신타제)를 cDNA 또는 게놈 DNA로서 직접 단리할 수 있을 것이다. 본 발명의 시스-프레닐트랜스퍼라제 서열에 근거한 특정 올리고뉴클레오티드 프로브는 당업계에 공지된 방법으로 설계 및 합성할 수 있다 ([Sambrook et al.], 상기 문헌 참조). 또한, 전체 서열을 직접 사용하여 랜덤 프라이머, DNA 표지, 닉 (nick) 번역 또는 말단-표지 기술과 같이 당업계에 공지된 기술을 이용한 DNA 프로브나 입수 가능한 시험관내 전사 시스템을 이용한 RNA 프로브를 합성할 수 있다. 또한, 이 특정 프라이머를 설계하고 이용하여 본 발명의 서열의 일부 또는 전장 서열을 증폭시킬 수 있다. 생성된 증폭 산물은 증폭 반응동안 직접 표지되거나 증폭 반응 이후에 표지될 수 있으며, 이를 프로브로서 이용하여 적절한 엄격도의 조건 하에서 전장 cDNA 또는 게놈 단편을 단리할 수 있다.
또한, 본 핵산 단편의 두 짧은 단편을 PCR 프로토콜에 사용하여 DNA 또는 RNA로부터 상동성 유전자를 코딩하는 보다 긴 핵산 단편을 증폭시킬 수 있다. 또한, 한 프라이머의 서열이 본 발명의 핵산 단편으로부터 유래된 것이고 다른 프라이머의 서열은 식물 UPPS 상동체를 코딩하는 mRNA 전구체의 3' 말단에 있는 폴리아데닐산 부위의 존재를 이용하는 것으로 사용하여, 클로닝된 핵산 단편의 라이브러리 상에서 중합효소 연쇄 반응을 수행할 수 있다.
별법으로, 제2 프라이머 서열이 클로닝 벡터로부터 유래된 서열에 근거한 것일 수 있다. 예를 들어, 당업자는 RACE 프로토콜 (문헌 [Frohman et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:8998 (1988) 참조)에 따라 PCR을 이용하여 전사물의 한 지점과 3' 또는 5' 말단 사이에 있는 영역의 카피를 증폭시킴으로써 cDNA를 생성시킬 수 있다. 3' 및 5' 방향으로 배향된 프라이머를 본 발명의 서열로부터 설계할 수 있다. 시판되는 3' RACE 또는 5' RACE 시스템 (BRL)을 이용하여, 특정 3' 또는 5' cDNA 단편을 단리할 수 있다 (문헌 [Ohara et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., USA86:5673 (1989)], 문헌 [Loh et al.,Science243:217 (1989)] 참조). 3' 및 5' RACE 법에 의해 생성된 산물을 합하여 전장 cDNA를 생성할 수 있다 (문헌 [Frohman et al.,Techniques1:165 (1989)] 참조).
최종적으로, 본 발명의 뉴클레오티드 및 추정 아미노산 서열을 이용하여 cDNA 발현 라이브러리의 면역학적 스크리닝을 쉽게 수행할 수 있다. 본 발명의 아미노산 서열의 일부를 나타내는 합성 펩티드를 합성할 수 있다. 이들 펩티드는 동물을 면역화시켜 상기 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 단백질에 특이적인 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 생산하도록 하는데 이용할 수 있다. 그 후, 이들 항체는 cDNA 발현 라이브러리를 스크리닝하여 목적 전장 cDNA 클론을 단리하는데 이용할 수 있다 (문헌 [Lerner et al.,Adv. Immunol. 36:1 (1984)], [Sambrook et al.] 상기 문헌 참조)
또한, 본 발명의 핵산 단편을 이용하여 본 발명의 시스-프레닐트랜스퍼라제 단백질이 정상보다 높은 또는 낮은 수준으로 존재하는 트랜스제닉 식물을 만들 수 있다. 별법으로, 일부 적용 분야에서는 본 발명의 시스-프레닐트랜스퍼라제를 특정 식물 조직 및(또는) 세포형 또는 정상적인 경우에서는 나타나지 않는 발생 단계 동안에 발현되도록 하는 것이 바람직할 수 있다. 전장 식물 시스-프레닐트랜스퍼라제 cDNA (즉, 임의의 하기 서열 또는 적절한 인-프레임 (in-frame) ATG 코돈이 혼입된 관련 서열)가 박테리아 (예, 이 콜라이), 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애, 피키아 파스토랄리스 (Pichia pastoralis)) 또는 식물 내에서 발현되면 IPP 기질로부터 시스-폴리이소프레노이드류를 합성할 수 있는 성숙 단백질이 생산된다. 개시제인 알릴 이소프레노이드 디포스페이트 (DMAPP, GPP, FPP 또는 GGPP)의 존재는 상기 활성을 증가시킨다.
본 발명의 시스-프레닐트랜스퍼라제 서열을 발현시키는 트랜스제닉 식물이 다양한 병원체 및 자연계의 포식자에 대한 방어 기작을 변화 또는 변형시킨다. 예를 들어, 다양한 유액 단백질은 항원성이며 IgE 항체에 의해 인식되는 것으로 알려져 있는데, 이는 면역학적 방어에서의 그들의 역할을 시사하는 것이다 (문헌 [Yagami et al.,Journal of Allergy and Clinical Immunology, (March, 1998) Vol. 101, No.3, pp379-385] 참조). 추가로, 헤베아 브라실리엔시스로부터 단리한 유액의 상당 부분은 진균 세표 벽의 키틴 성분 및 박테리아 세포벽의 펩티도글리칸성분을 분해할 수 있는 키티나제/리소자임을 함유하는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Martin, M.N.,Plant Physiol(Bethesda), (1991) 95 (2), 469-476] 참조). 따라서, 본 발명의 목적은 다양한 병원체 및 초식동물에 대해 변화된, 변형된 또는 증가된 방어력을 갖는 트랜스제닉 식물을 제공하는 것이다.
본 발명의 서열이 발현하는 데 적합한 식물 종은 담배 (니코티아나 (Nicotiana) 종), 토마토 (리코페르시콘 (Licopersicon) 종), 감자 (솔라눔 (solanum) 종), 대마 (칸나비스 (Cannabis) 종), 해바라기 (헬리안투스 (Helianthus) 종), 사탕수수 (소르굼 불가레 (Sorghum vulgare)), 밀 (트리티쿰 (Triticum) 종), 옥수수 (지 매이스 (Zea mays)), 쌀 (오리자 사티바 (Oryza sativa)), 호밀 (세칼레 세레알레 (Secale cereale)), 귀리 (아베나 (Avena) 종), 보리 (호르데움 불가레 (Hordeum vulgare)), 평지씨 (브라시카 (Brassica) 종), 잠두 (비시아 파바 (Vicia faba)), 강낭콩 (파세올루스 불가리스 (Phaseolus vulgaris)), 다른 콩 종 (비그나 (Vigna종)), 렌즈콩 (렌스 쿨리나리스 (Lens culinaris)), 대두 (글라이시네 맥스 (Glycine max)), 아라비돕시스 (아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis Thaliana)), 구아율 (파르테니움 아르겐타툼 (Parthenium argentatum)), 목화 (고시피움 히르수툼 (Gossypium hirsutum)), 페튜니아 (페튜니아 하이브리다 (Petunia hybrida)), 아마 (리눔 우시타티시뭄 (Linum usitatissimum)) 및 당근 (다우쿠스 카로타 사티바 (Daucus carota sativa))일 수 있다.
본 발명에 따라 고등 식물의 세포를 형질전환하는 다양한 방법이 당업자에게이용 가능하다 (유럽 특허청 공보 제0 295 059 A2호 및 제0 318 341 A1호 참조). 그러한 방법으로는 아그로박테리움 종의 Ti 및 Ri 플라스미드를 이용한 형질전환 벡터에 근거한 것들이 포함된다. 구체적으로 이들 벡터의 2원성 유형을 사용하는 것이 바람직하다. Ti-유래의 벡터는 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물을 비롯하여 매우 다양한 고등 식물을 형질전환시킨다 (문헌 [Sukhapinda et al.,Plant Mol. Biol. 8:209-216 (1987)]; 문헌 [Potrykus et al.,Mol. Gen. Genet. 199:183 (1985)] 참조). 당업자는 외래 DNA 구조물을 직접 흡수하게 하거나 (유럽 특허청 공보 제0 295 959 A2호 참조), 전기천공법 (문헌 [Fromm et al.,Nature(London) 319:791 (1986)] 참조) 또는 핵산 구조물로 코팅된 금속 입자에 의한 고속 유전자 탄도법 (문헌 [Kline et al.,Nature(London) 327:70 (1987)] 참조)와 같이 다른 형질 전환 방법을 이용할 수 있다. 일단 형질전환된 세포는 당업자에 의해 재생될 수 있다.
최근 기술된 방법은 외래 유전자를 상업적으로 중요한 작물, 예를 들어 평지 씨 (문헌 [De Block et al.,Plant Physiol. 91:694-701 (1989)], 해바라기 (문헌 [Everett et al.,Bio/Technology5:1201 (1987)] 참조) 및 대두 (문헌 [Christou et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:7500-7504 (1989)] 참조)에 형질전환시킨 것과 구체적으로 관련이 있다.
본 시스-프레닐트랜스퍼라제 상동체의 과발현은, 우선 그 코딩 영역을 프로모터와 작동 가능하게 연결하여 원하는 조직에서 원하는 발생 단계시 유전자 발현을 일으키는 것이 가능한 키메라 유전자를 제작함으로써 달성할 수 있다. 편의를위해, 상기 키메라 유전자는 같은 유전자로부터 유래된 프로모터 서열 및 번역 리더 서열을 포함할 수 있다. 또한, 전사 종결 신호를 코딩하는 3' 비-코딩 서열도 제공되어야 한다. 또한, 본 키메라 유전자는 유전자 발현을 촉진하기 위해 하나 이상의 인트론을 포함할 수 있다.
그 후, 본 키메라 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터가 제조될 수 있다. 플라스미드 벡터의 선택은 숙주 세포를 형질전환하는데 이용하는 방법에 따라 결정된다. 당업자는 키메라 유전자를 포함하는 세포의 성공적인 형질 전환, 선별 및 증식을 위해 플라스미드 벡터 상에 존재하여야 하는 유전 인자를 잘 알고 있다. 또한, 당업자는, 다른 독립적인 형질 전환 결과물마다 발현의 수준 및 패턴이 다르고 (문헌 [Jones et al.,EMBO J. 4:2411-2418 (1985)], 문헌 [De Ammeida et al.,Mol. Gen. Genetics218:78-86 (1989)] 참조), 따라서, 원하는 발현 수준 및 패턴을 나타내는 세포주를 얻기 위해 여러 결과물을 스크리닝하여야 함을 이해할 것이다. 그러한 스크리닝은 DNA의 서던 분석, mRNA 발현의 노던 분석, 단백질 발현의 웨스턴 분석 또는 표현형 분석을 통해 이루어질 수 있다.
일부 응용의 경우, 시스-프레닐트랜스퍼라제 단백질이 다른 세포 소기관으로 운반되도록 하거나 세포로부터 분비되도록 촉진하는 것이 유용할 수 있다. 상기 기술한 키메라 유전자는 그의 코딩 영역에 적절한 세포내 또는 세포외 표적 서열을 첨가함으로써 추가로 수식될 수 있다. 이는 엽록체 운송 펩티드 (문헌 [Keegstra et al.,Cell56:247-253 (1989)]), 세포질 소포체에 단백질을 이동시키는 신호 서열 (문헌 [Chrispeels et al.,Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. 42:21-53(1991)]) 및 핵 배치 신호 (문헌 [Raikhel et al.,Plant Phys. 100:1627-1632 (1992)])를 포함한다. 상기 인용된 참조 문헌은 이들 각각에 대한 예를 제공하지만, 그 목록은 완전하지 않으며, 이용가능한 추가의 표적 신호가 장래에 발견될 수 있다.
또한, 일부 응용의 경우 식물 내에서 시스-프레닐트랜스퍼라제 유전자의 발현을 감소시키거나 제거하는 것이 바람직할 수도 있다. 이를 위해, 이들 효소의 일부를 코딩하는 유전자 또는 유전자 단편을 식물 프로모터 서열에 연결시킴으로써 시스-프레닐트랜스퍼라제 상동체의 안티센스 또는 공억제용으로 설계된 키메라 유전자를 제작할 수 있다. 예를 들어, UPPS 상동체의 전부 또는 일부에 대한 안티센스 RNA를 발현시키도록 설계된 키메라 유전자는 시스-프레닐트랜스퍼라제 상동체 유전자 또는 유전자 단편을 역방향으로 식물 프로모터 서열에 연결시킴으로써 제작할 수 있다. 공억제 또는 안티센스 키메라 유전자 구조물은 대응 내생 유전자의 발현을 감소 또는 제거하려는 식물 내로 널리 공지된 형질 전환 프로토콜에 의해 도입시킬 수 있다.
본 시스-프레닐트랜스퍼라제 상동체 단백질은 이종 숙주 세포, 구체적으로 미생물 숙주 세포 내에서 생산될 수 있으며, 당업자에게 널리 공지된 방법으로 상기 단백질에 대한 항체를 제조하는 데 사용 가능하다. 상기 항체는 본 시스-프레닐트랜스퍼라제 단백질을 세포 내의 원위치에서 검출하거나 세포 추출물로부터 시험관내에서 검출하는 데 유용하다. 본 시스-프레닐트랜스퍼라제 단백질의 생산에 바람직한 이종 숙주 세포는 미생물 숙주이다. 외래 단백질을 높은 수준으로 발현시키는 조절 서열을 포함하는 미생물 발현 시스템 및 발현 벡터가 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이들 중 어떠한 것이든 본 시스-프레닐트랜스퍼라제 상동체 생산용 키메라 유전자를 제작하는 데 사용 가능하다. 그 후, 이 키메라 유전자를 적절한 미생물체 내로 형질전환을 통해 도입하여 본 시스-프레닐트랜스퍼라제 단백질이 높은 수준으로 발현되도록 할 수 있다.
본 시스-프레닐트랜스퍼라제 단백질의 발현에 적합한 미생물 숙주 세포에는 이들 단백질을 코딩하는 키메라 유전자가 발현 가능한 어떠한 세포든지 포함된다. 그러한 세포로는, 예를 들어 효모 (예, 아스퍼질루스 (Aspergillus), 사카로마이세스, 피키아, 칸디다 (Candida) 및 한세눌라 (Hansenula)), 바실루스 (Bacillus) 속 뿐만 아니라 장내세균 (예, 에셰리키아 (Escherichia), 살모넬라 (Salmonella) 및 시겔라 (Shigella))을 비롯한 박테리아 및 진균류 둘 다가 포함된다. 그러한 숙주의 형질전환 방법 및 외래 단백질의 발현 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 적합한 프로토콜의 예를 문헌 [Manual of Methods for General Bacteriology; Gerhardt et al., Eds.; American Society for Microbiology: Washington, DC, 1994] 또는 문헌 [Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, 2nd Edition, Brock, T.D., Ed.; Sinauer Associates, Inc.: Sunderland, MA, 1989]에서 찾을 수 있다.
적합한 미생물 숙주 세포를 형질전환하는 데 유용한 벡터 또는 카세트가 당업계에 널리 공지되어 있다. 일반적으로 벡터 또는 카세트는 관련 유전자의 전사 및 번역을 지시하는 서열, 선별 가능한 마커 및 자가 복제 또는 염색체 삽입을 허용하는 서열을 포함한다. 적합한 벡터는 전사 개시 조절 서열을 보유하는 유전자의 5' 영역 및 전사 종결을 조절하는 DNA 단편의 3' 영역을 포함한다. 비록 그러한 조절 영역이 생산용 숙주로서 선택된 특정 종의 본래 유전자로부터 유래될 필요는 없지만, 두 조절 영역 둘 모두 형질전환 숙주 세포에 대해 동질성인 유전자로부터 유래된 경우가 가장 바람직하다.
원하는 숙주 세포 내에서 시스-프레닐트랜스퍼라제 단백질 코딩 유전자의 발현을 촉진하는데 유용한 개시 조절 영역 또는 프로모터는 셀 수 없이 많으며 당업자에게 친숙한 것이다. CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI (사카로마이세스에서의 발현에 유용함); AOX1 (피키아에서의 발현에 유용함)과 lac, trp, IPL, IPR, T7, tac 및 trc (이. 콜라이에서의 발현에 유용함)를 비롯하여, 임의로 상기 유전자를 촉진할 수 있는 어떠한 프로모터이든 본 발명에 적합하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 종결 조절 영역도 바람직한 숙주 본래의 다양한 유전자로부터 유래될 수 있다. 임의로, 종결 부위는 필요하지 않지만, 포함된 경우가 가장 바람직하다.
추가로, 본 시스-프레닐트랜스퍼라제 단백질은 표적으로서 이용되어 제초제 또는 살균제로서 유용할 수 있는 시스프레닐트랜스퍼라제 상동체 저해제의 설계 및(또는) 확인을 용이하게 할 수 있다. 이는 정제된 본 식물 단백질로부터 얻은 구조적 정보 및(또는) 작용기작의 정보에 의한 합리적 약품 설계 (rational drug design) 및 강력한 기능성 저해제의 합성을 통해, 또는 화학물질 라이브러리의 무작위 시험관내 스크리닝을 통해 이루어질 수 있다. 본원에 기술된 임의의 시스-프레닐트랜스퍼라제 상동체에 대해서 주목할만한 생체내 저해는 심각한 세포 대사 장애를 일으킬 수 있으며 식물 (또는 진균류)의 치사를 일으킬 수 있을 것으로 예상된다.
또한, 본 발명의 핵산 단편 전부 또는 일부를 프로브로서 사용하여 그들이 속한 유전자를 유전적 및 물리적으로 맵핑할 수 있고, 본 시스-프레닐트랜스퍼라제 상동체의 발현과 관련된 특성을 위한 마커로서 이용할 수도 있다. 그러한 정보는 원하는 표현형을 갖는 종자 개발을 위한 식물 육종에 있어서 유용할 수 있다. 예를 들어, 본 핵산 단편을 제한효소 단편 길이 다형성 (RFLP) 마커로서 이용할 수 있다. 제한 효소로 분해된 식물 게놈 DNA에 대한 서던 블롯 ([Sambrook et al.], 상기 문헌)에 대해서 본 발명의 핵산 단편을 프로브로 사용하여 탐색할 수 있다. 그 후, 나타난 밴드 패턴에 대해 맵메이커 (MapMaker) (문헌 [Lander et al., Genomics 1:174-181 (1987)] 참조)와 같은 컴퓨터 프로그램을 이용하여 유전자 지도를 제작하기 위한 유전자 분석을 수행할 수 있다. 또한, 본 발명의 핵산 단편을 프로브로서 사용하여 정해진 유전자 교배의 부모 및 자손을 나타내는 개체 세트의 제한효소 처리 게놈 DNA가 포함된 서던 블롯을 탐색할 수 있다. DNA 다형성의 분리는 알려져 있으며, 상기 집단을 이용하여 기존에 얻은 유전자 지도에서 본 핵산 서열의 위치를 계산하는데 이용된다 (문헌 [Botstein et al.,Am. J. Hum. Genet. 32:314-331 (1980)] 참조).
유전자 지도에서의 용도를 위한 식물 유전자-유래 프로브의 생산 및 용도는문헌 [Bernatzky et al.,Plant Mol. Biol. Reporter4;37-41 (1986)]에 기술되어 있다. 다수의 문헌이 상기에서 개략한 방법 및 그의 변형 방법을 이용하는 특이적 cDNA 클론의 유전자 맵핑을 기술하고 있다. 예를 들어, F2 이종 교배 집단, 역교배 집단, 무작위 교배 집단, 동질 유전자에 가까운 계통 및 개체의 다른 세트를 맵핑에 이용할 수 있다. 그러한 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
또한, 본 핵산 서열로부터 유래된 핵산 프로브는 물리적 맵핑에 이용할 수 있다 (즉, 물리적 지도상의 서열의 위치; 문헌 [Hoheisel et al.,Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide; Academic Press, 1996; pp. 319-346] 및 그 안에 인용된 참조 문헌을 참조).
다른 실시 태양에서, 본 핵산 서열로부터 유래된 핵산 프로브는 형광 인 사이투 혼성화 (FISH) 맵핑에 직접 이용할 수 있다. FISH 맵핑을 위한 현행 방법에서는 거대 클론의 사용이 바람직하지만 (수 내지 수백 kb), 감도를 개선하면 보다 짧은 프로브를 이용한 FISH 맵핑의 수행도 가능하다.
유전자 맵핑 및 물리적 맵핑의 다양한 핵산 증폭계 방법이 본 핵산 서열을 이용하여 수행될 수 있다. 그 예로는 대립유전자-특이적 증폭 (문헌 [Kazazian et al.,J. Lab. Clin. Med. 114:95-96 (1989)] 참조), PCR 증폭 단편의 다형성 (CAPS; 문헌 [Sheffield et al.,Genomics16:325-332 (1993)] 참조), 대립유전자-특이적 리게이션 (문헌 [Landegren et al.,Science241:1077-1080 (1988)] 참조), 뉴클레오티드 신장 반응 (문헌 [Sokolov et al,Nucleic Acid Res. 18:3671 (1990)] 참조), 방사선 하이브리드 맵핑 (문헌 [Walter et al.,Nature Genetics7:22-28 (1997)] 참조) 및 해피 맵핑 (Happy Mapping, 문헌 [Dear et al.,Nucleic Acid Res. 17:6795-6807 (1989)] 참조)이 포함된다. 이들 방법을 위해, 핵산 단편의 서열이 증폭 반응용 또는 프라이머 신장 반응용으로 프라이머 쌍을 설계 및 생산하는데 이용된다. 그러한 프라이머의 설계는 당업자에게 널리 공지되어 있다. PCR-계 유전자 맵핑을 이용한 방법에서는, 본 핵산 서열에 대응하는 영역에서의 맵핑 교차의 기원 사이에 나타난 DNA 서열 차이를 확인하는 것이 필요할 수 있다. 그러나, 이는 일반적으로 맵핑 방법에서 필요하지 않다.
본 cDNA 클론에 대해서 표적 유전자 파괴 프로토콜에 의하거나 모든 가능한 유전자에서 돌연변이를 보유하는 식물의 집단내에 포함된 이들 유전자의 특정 돌연변이를 확인함으로써 기능 상실-돌연변이 표현형을 확인할 수 있다 (예, 문헌 [Ballinger et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:9402 (1989)], 문헌 [Koes et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA92:8149 (1995)], 문헌 [Bensen et al.,Plant Cell7:75 (1995)] 참조). 후자의 방법은 두 가지 방식으로 수행할 수 있다. 첫번째는, 뮤테이터 (Mutator) 트랜스포손 또는 수종의 다른 돌연변이 유발 DNA 인자가 삽입된 식물의 집단으로부터 프렙된 DNA 상의 돌연변이 태그 서열 프라이머와 함께 본 핵산 단편의 짧은 단편을 중합효소 연쇄 반응 프로토콜에서 이용할 수 있다 ([Bensen], 상기 문헌 참조). 이들 프라이머와 함께 특이적인 DNA 단편을 증폭시키는 것은 상기 돌연변이 태그 인자가 시스-프레닐트랜스퍼라제 단백질을 코딩하는 식물 유전자 안에 또는 근처에 삽입됨을 의미한다. 별법으로, 제한 효소 부위-고정 합성 아답터를 위한 것과 같은 임의의 게놈 부위 프라이머와 함께 돌연변이태그 서열 프라이머를 사용하여 돌연변이 집단으로부터 생성한 PCR 증폭 산물에 대하여 본 핵산 단편을 혼성화 프로브로서 이용할 수 있다. 어떠한 방법으로든, 시스-프레닐트랜스퍼라제 단백질을 코딩하는 내생 유전자에서의 돌연변이를 포함하는 식물을 확인하고 얻을 수 있다. 그 후, 이 돌연변이 식물은 시스-프레닐트랜스퍼라제 유전자 산물의 천연 기능을 결정하거나 확증하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 정의되며, 달리 언급하지 않는 한, 그 안의 모든 부 단위 및 ％ 단위는 중량부와 중량％이고, 온도는 섭씨 온도이다. 이들 실시예는 본 발명의 바람직한 실시 태양을 나타내지만, 단지 설명의 방편으로 제공된 것임을 이해해야 한다. 상기 토의 및 이들 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 본질적인 특성을 확인할 수 있으며, 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않고 본 발명에 대해 다양한 변화 및 변형을 가하여 다양한 용도 및 조건에 적용시킬 수 있다.
일반적인 방법
본원에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당업계에 널리 공지된 것이며, 문헌 [Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ndEdition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989)] (이하 "Sambrook et al.") 및 문헌 [T.J. Silhavy, M.L. Bennan, and L.W. Enquist,Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring, NY (1984)]과 문헌 [Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. 및 Wiley-Interscience (1987) 출판]에 기술되어 있다.
뉴클레오티드 및 아미노산의 동일성 및 유사성 ％ 비교는 달리 언급하지 않는 한 디폴트 파라미터를 적용한 GCG 스위트 프로그램을 이용하여 수행하였다.
약어의 의미는 하기와 같다. "sec"는 초를, "min"는 분을, "h"는 시간을, "d"는 일을 의미하며, "㎕"는 마이크로리터, "㎖"는 밀리리터, "ℓ"는 리터를 의미하고, "mM"는 밀리몰랄, "M"는 몰랄, "mmol"는 밀리몰을 의미한다.
<실시예 1>
시스-프레닐트랜스퍼라제 상동체를 코딩하는 식물 종으로부터 cDNA 클론을 확인하기 위해 사용된 cDNA 라이브러리의 비교
밀, 포도, 대두, 쌀, 아프리칸 데이지, 고무 나무 유액 및 금잔화 조직으로부터의 mRNA에 상응하는 cDNA 라이브러리를 제작하였다. 상기 라이브러리의 특성은 표 1에 기재되어 있다. cDNA 라이브러리를 수종의 방법 중 임의의 한 방법에 의해 제조하였다. 우선 공급업자 (스트라타젠 클로닝 시스템스 (Stratagene Cloning Systems), 캘리포니아주 라 욜라 소재)의 프로토콜에 따라 Uni-ZAP XR 벡터 내에서 cDNA를 제조함으로써 그 cDNA 라이브러리를 플라스미드 벡터로 삽입하였다. 상기 Uni-ZAP XR 라이브러리를 스트라타젠에서 제공한 프로토콜에 따라 플라스미드 라이브러리로 전환하였다. 전환 시, cDNA 인서트 (insert)를 pBluescript 플라스미드 벡터 내에 포함시켰다. 별법으로, T4 DNA 리가제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스, New England Biolabs)를 사용하여 상기 cDNA를 예비 절단된 Bluescript II SK(+) 벡터 (스트라타젠) 내에 도입하고, 그 후 공급업자 (깁코 비알엘 프로덕츠, GIBCO BRL Products)의 프로토콜에 따라 DH10B 세포 내로 트랜스펙션시켰다. 일단 cDNA 인서트가 플라스미드 벡터 내에 있게 되면, 재조합 pBluescript 플라스미드를 함유하는 박테리아 콜로니를 무작위로 선택하여, 그로부터 플라스미드 DNA를 제조하거나, 삽입된 cDNA 서열 양 끝의 벡터 서열에 특이적인 프라이머를 사용한 중합효소 연쇄 반응을 통해 인서트 cDNA 서열을 증폭시켰다. 증폭된 인서트 DNA 또는 플라스미드 DNA를 염료-프라이머 시퀀싱 반응으로 시퀀싱하여 부분적인 cDNA 서열을 만들었다 (발현 서열 태그 또는 "EST"; 문헌 [Adams et al.,Science252;1651-1656 (1991)] 참조). 퍼킨 엘머 모델 (Perkin Elmer Model) 377 형광 시퀀서를 이용하여 생성된 EST를 분석하였다.
식물로부터의 cDNA 라이브러리
라이브러리 종 및 조직
dms2c 아프리칸 데이지 (디모르포테카 시누아타, Dimorphotheca sinuata) 발아중인 종자
ecs1c 금잔화 (칼렌둘라 오피시날리스, Calendula officinalis) 발아중인 종자
ehb2c 파라 고무 나무 (헤베아 브라실리엔시스, PR255) 2일 수거 주기의 두번째 날에 수거한 유액
Vdb1c 포도 (비티스 (Vitis) 종) 발아중인 눈
rl0n 쌀 (오리자 사티바 엘.) 15일된 잎 (표준화)
rr1 쌀 (오리자 사티바 엘.) 2주된 발아 묘목
sl1 대두 (글라이시네 맥스 엘) 2주된, 물로 처리한 발아 묘목
wdk5c 밀 (트리티쿰 애스트붐 엘. (Triticum aestvum L.)) 발아중인 낟알, 개화 후 30일
<실시예 2>
EST의 특성화
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; 문헌 [Altschul, S.F., et al., (1993)J. Mol. Biol. 215:403-410] 참조; 또한 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST 참조)로 BLAST "nr" 데이타베이스 (비-풍부 진뱅크 CDS 번역물, 브루크헤이븐 프로틴 데이타 뱅크 (Brookhaven Protein Data Bank)의 3차구조로부터 유래된 서열, SWISS-PROT 단백질 서열 데이타베이스의 최근 주요 배포물, EMBL 및 DDBJ 데이타베이스 모두를 포함)에 포함된 서열에 대해서 유사성을 검색하여 시스-프레닐트랜스퍼라제를 코딩하는 후보 EST를 확인하였다. 실시예 3에서 얻은 cDNA 서열은 미국 생물 정보 센터 (NCBI)가 제공하는 BLASTN 알고리즘을 이용하여 "nr" 데이타베이스 내에 포함된 모든 공용 DNA 서열과 유사성을 분석하였다. 상기 DNA 서열은 모두 리딩 프레임에 맞게 번역되었고, NCBI가 제공하는 BLASTX 알고리즘을 이용하여 "nr" 데이타베이스에 포함된 모든 공용 단백질 서열과 유사성을 비교하였다 (문헌 [Gish, W. and States, D.J.Nature Genetics3:266-272 (1993)] 참조). 편의를 위해, BLAST에 의해 계산되는 값으로서, 단지 우연히 검색된 데이타베이스 내에 포함된 서열에 대한 cDNA 서열의 매치를 관찰하는 P-값 (확률)을 본원에서는 "pLog" 값으로 나타내었으며, 이는 보고된 P-값의 로그에 대한 음수값을 나타낸다. 따라서, pLog 값이 클수록, 마찬가지로 cDNA 서열 및 BLAST "히트"가 상동성인 단백질로 나타날 확률이 커진다.
<실시예 3>
시스-프레닐트랜스퍼라제에 대한 cDNA 클론의 확인 및 특성화
실시예 1 및 2에서 기술한 데이타베이스의 질의 결과에 근거하여 표 1에 열거된 라이브러리로부터의 cDNA가 시스-프레닐트랜스퍼라제 상동체로서 확인되었다. 예를 들어, cDNA는 1) 키워드 검색 (예, "운데카프레닐"), 2) 미국 생물 정보 센터 (NCBI)가 제공하는 TBLASTN 알고리즘을 이용한 데이타베이스 검색 및 박테리아 운데카프레닐 신타제에서 존재하는 보존된 서열의 단편 검색, 3) FASTA 프로그램을 이용하여 사설 데이타베이스 내에서 1개 및 2개 발견된 cDNA의 상동체 추가 확인을 비롯하여, 다수의 방법에 의해 확인되었다. 이. 콜라이 운데카프레닐 피로포스페이트 신타제 유전자의 추정 아미노산 서열을 박테리아, 효모 (사카로마이세스 세레비지애) 및 진핵세포 (캐노랍디티스 엘레간스,Caenorhabditis elegans)로부터의 다수의 다른 공용 서열과 정렬시킨 결과가 발표되었다 (문헌 [Apfel et al.,J. Bacteriol. 81:483-492 (1992)] 참조). 이 정렬 결과는 다섯개의 보존 도메인을 나타낸다. 이들 중 하나 (도메인 I)는 이들 유전자의 ORF의 5' 말단에서 존재하며, 하기 서열로 구성되어 있다. HXXMDGNXRXA (X = 임의의 아미노산; (서열 21)). 다른 도메인 (도메인 V)은 그 ORF의 3' 말단을 향해 존재하며, 하기 서열로 구성되어 있다. DLXIRTXGEXRXSNFLLWQXXYXE (X = 임의의 아미노산; (서열 22)). 보존 서열의 이들 부분은 시스-프레닐트랜스퍼라제 효소군에 특징적인 것으로 보이며, 전술한 TBLASTN 검색에서 사용되었다.
사설 데이타베이스에서 첫번째 및 두번째 방법에 의해 발견된 cDNA의 추가의 상동체가 FASTA 정렬에 의해 지정된 서열 (동일한 라이브러리에 제한되거나, 모든 라이브러리 또는 라이브러리 군에 걸쳐 나타남)과 상동성인 서열로 확인되었다. 이들 방법에 의해 확인된 cDNA가 표 2에 열거되어 있다.
시스-프레닐트랜스퍼라제 상동체로 확인된 cDNA
서열 인식 번호 (SID) 기원
dms2c.pk005.c7 아프리칸 데이지
ecs1c.pk009.p19 금잔화
ehb2c.pk001.i10 헤베아 브라실리엔시스
ehb2c.pk001.d17 헤베아 브라실리엔시스
ehb2c.pk001.o18 헤베아 브라실리엔시스
Vdb1c.pk001.k23 포도
rl0n.pk117.i23 쌀
rr1.pk0050.h8 쌀
sl1.pk0128.h7 대두
wdk5c.pk005.f22 밀
이들 EST의 뉴클레오티드 서열 (서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 13, 서열 15, 서열 17 및 서열 19) 및 추정 아미노산 서열 (서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 서열 18 및 서열 20)을 대표적인 박테리아 시스-프레닐트랜스퍼라제 (마이크로코커스 루테우스 UPPS; 문헌 [Shimizu, N., Koyama, T. and Ogura, K.,J. Biol. Chem.273:19476-19481 (1998)] 참조)의 서열과 비교한 결과, 뉴클레오티드 서열에서 45％ 초과의 동일성과 아미노산 서열에서 30％ 초과의 동일성을 나타내었다. 표 3은 밀, 포도, 대두, 쌀, 아프리칸 데이지, 고무 나무 및 금잔화로부터 단리된 시스-프레닐트랜스퍼라제 서열을 마이크로코커스 루테우스 UPPS의 서열과 비교한 목록이다. 도 2는 이들 cDNA의 코딩 영역 내에서의 뉴클레오티드 서열을 마이크로코커스 루테우스 UPPS의 서열 및 효모 시스-프레닐트랜스퍼라제 유전자rer2(진뱅크 승인 번호 AB013497) 및srt1(진뱅크 승인 번호 AB013498) 2종과 정렬시킨 결과를 도시하고 있으며, 이는 다양한 종으로부터 이들 시스-프레닐트랜스퍼라제 유전자의 1차 서열 사이에 광범위한 상동성이 있음을 나타낸다.
포도, 쌀, 대두, 고무 나무 및 아프리칸 데이지 서열의 마이크로코커스 루테우스 운데카프레닐 피로포스페이트 신타제 서열에 대한 비교
동일성 ％1 엠. 루테우스 유전자에 대해 확인된 유사성5
cDNA/추정 단백질 서열 NA2 AA2 BLAST알고리즘 스코어3 pLog4
dms2c.pk005.c7 50.13 39.024 Xnr 162 10.57
ecs1c.pk009.p19 50.40 38.938
ehb2c.pk001.i10 46.00 33.603 Xnr 71 1.48
ehb2c.pk001.d17 46.133 33.603 Xnr 161 10.46
ehb2c.pk001.o18 49.464 32.129
vdb1c.pk001.o18 46.559 34.413
rl0n.pk117.i23 45.652 33.186 Xnr 152 9.41
rr1.pk0050.h8 45.699 34.694
sl1.pk0128.h7 50.133 41.564
wdk5c.pk005.f22 43.067 38.00
1디폴트 값을 적용한 GCG GAP 프로그램을 이용하여 수행한 비교2AA는 아미노산 서열의 약어이다; NA는 뉴클레오티드 서열의 약어이다.3스코어는 BLAST 프로그램에 의해 두 서열 사이의 매치 정도가 지정된 값이다.4pLog는 보고된 P-값 (BLAST에 의해 계산되는 값으로서, 단지 우연히 검색된 데이타베이스 내에 포함된 서열에 대한 cDNA 서열의 매치를 관찰할 확률)의 로그에 대한 음수값이다.5이 유사성이 처음 BLAST 검색에 의해 관측되었을 경우에, 그 cDNA에 대해 주어진다.
<실시예 4>
식물의 시스-프레닐트랜스퍼라제 상동체로서 확인된 cDNA의 추정 아미노산 서열에 대한 분석
상기 기술한 바와 같이 확인된 식물 cDNA를 번역하고, GCG GAP 프로그램을 이용하여 추정 아미노산 서열을 서로 비교하였다. 갭 (Gap)은 두 서열 사이에서 모든 가능한 정렬 및 갭 위치를 계산하여, 매치된 잔기의 수를 최대화하고 갭의 수 및 크기를 최소화하는 전역 정렬을 생성한다. 스코어링 매트릭스 (scoring matrix)가 심볼의 매치 값을 지정하는데 이용된다. 또한, 정렬 결과에 갭의 삽입을 제한하기 위해 갭 발생 페널티 (gap creation penalty) 및 갭 증가 페널티 (gap extension penalty)가 필요하다. 갭은 문헌 [Needleman and Wunsch,J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970)]의 정렬 방법을 이용한다. 이 분석 (표 4)으로부터, 이들 서열이 최소 27.826％의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것이 명백하다. 이 분석에 의해 같은 종으로부터의 서열 사이에서 나타난 가장 높은 동일성은 두 쌀 서열이 보인 90.668％의 동일성 및 두 고무 유액 서열이 보인 98.282％의 동일성이었다. 다른 종으로부터의 서열 사이에서 가장 높은 동일성은 쌀 및 포도 서열에 의해 나타났다. 또한, 이들 cDNA의 추정 아미노산 서열 (도 3)과 함께 박테리아 및 효모 시스-프레닐트랜스퍼라제 (도 4)의 서열을 VECTOR NTI 프로그램 스위트 내의 CLUSTALW 프로그램으로 정렬시킨 결과 이 유전자군 (실시예 2 참조)의 특징적인 보존 도메인의 존재가 나타났다.
GAP 프로그램을 이용한식물 시스-프레닐트랜스퍼라제로부터의 추정 아미노산 서열의 동일성 비교
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
2 100 48.684 31.907 33.858 31.923 52.669 33.043 30.545 58.537 50.965
4 48.684 100 30.701 30.702 33.333 46.222 33.186 33.186 48.246 45.133
6 31.907 30.701 100 99.655 78.547 32.296 47.773 46.182 33.588 31.679
8 33.858 30.702 99.655 100 78.201 32.296 47.773 46.182 33.588 31.679
10 31.923 33.333 78.547 78.201 100 29.502 46.154 44.891 32.067 30.943
12 52.669 46.222 32.296 32.296 29.502 100 33.478 31.250 53.398 48.450
14 33.043 33.186 47.773 47.773 46.154 33.478 100 100 32.051 37.627
16 30.545 33.186 46.182 46.182 44.891 31.250 100 100 29.643 30.916
18 58.537 48.246 33.588 33.588 32.061 53.398 32.051 29.643 100 50.775
20 50.965 45.133 90.943 31.679 30.943 48.450 37.627 30.916 50.775 100
<실시예 5>
민들레 식물 내의 헤베아 시스-프래닐트랜스퍼라제의 형질 전환 및 발현
적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한 헤베아 시스-프레닐트랜스퍼라제 유전자의 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 상기 유전자 (서열 5)를 센스 방향으로 포함하는 키메라 유전자를 제작하였다. 클로닝 부위 (EcoRI 및 KpnI)가 올리고뉴클레오티드 내로 혼입되어, 분해된 pML82 벡터 내로 삽입시 DNA 단편의 적합한 방향을 제공하였다. 2원성 벡터인 pML82를 동결/해동법 (문헌 [Holsters et al.,Mol. Gen. Genet. 163:181-187 (1978)] 참조)에 의해 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 균주인 LBA4404 및 아그로박테리움 리조게네스 (Agrobacterium rhizogenes) 균주인 ATCC 15834로 전달하였다 (문헌 [Hockema et al.,Nature303:179-180 (1983)] 참조).
적절한 2원성 벡터를 운반하는, 무력화된 아그로박테리움 투메파시엔스 균주인 LBA4404 및 아그로박테리움 리조게네스 균주 ATCC 15834와 함께 잎 및 잎자루 절편 (explant)을 공동-배양함으로써 민들레 식물을 형질전환하였다.
온실로부터의 민들레 잎 및 잎자루를 70％ 에탄올 중에서 10분동안 교반시키고, 5％ 클로록스 (등록상표, ChloroxTM), 0.01％ 트리톤-X로 옮겨 30분동안 두고, 그 후 멸균된 증류수로 완전히 헹구어서 멸균하였다. 식물의 형질전환을 위한 아그로박테리움의 액체 배양을 카나마이신 100 mg/ℓ가 함유된 최소 A 배지 중에서 밤새 28℃에서 수행하였다. 원심분리에 의해 박테리아 세포를 펠렛으로 가라앉히고, BAP 1 mg/ℓ 및 NAA 0.2 mg/ℓ가 함유된 액체 MS 배지 중에 A600= 0.5의 밀도로재현탁시키고, 잎 및 잎자루 절편을 상기 박테리아 현탁액으로 10분동안 접종시키고, 멸균 필터지로 빨아들여 건조시키고, 그 후 고체 MS 배지 상에서 2 내지 4일동안 공동-배양하였다 (절편 및 LBA440 균주를 공동-배양하는 경우, BAP 0.5 mg/ℓ 및 NAA 0.2 mg/ℓ가 함유된 MS 배지를 사용함). 상기 절편을 세포탁심 (cefotaxime) 200 mg/ℓ 및 카나마이신 50 mg/ℓ가 추가로 함유된 동일 배지 상에 옮겨 아그로박테리움을 죽이고 형질전환된 식물 세포를 선별함으로써 공동 배양을 종결시켰다.
LBA4404 균주로 접종된 절편을 쿨 화이트 형광등 하에서 16시간/8시간 명/암 광원 주기를 두고 27℃에서 유지하였다. 3주 내지 4주 후, 절제된 줄기는 상기와 같은 항생제를 동일한 농도로 함유하는 루팅 (rooting) 배지 (NAA 0.2 mg/ℓ가 첨가된 1/2 MS) 상으로 옮겼다. 일단 형질전환된 식물이 뿌리계를 확립하게 되면, 수경 메트로-믹스 (Metro-Mix) 350 무토양 포팅 (potting) 배지로 바로 옮겼다. 화분은 플라스틱 봉지로 덮여있고, 식물이 완전히 자라면 (약 10일 후) 이를 제거하였다.
ATCC 15834 균주로 접종된 절편은 27℃에서 지속적인 암실 조건 하에서 배양하였다. 10 내지 15일 후, 형질전환된 뿌리의 대량 생산을 위하여 절제된 뿌리를 동일한 플레이트에 옮겼다.
<실시예 6>
미생물 세포 내에서의 식물 시스-프레닐트랜스퍼라제의 발현 및 유전자 산물의 정제
실시예 6은 ehb2c.pk001.o18 클론의 발현을 일례로 들어, 시스-프레닐트랜스퍼라제를 코딩하는 단리된 전장 유전자의 이.콜라이 내에서의 발현을 설명하고 있다.
키아필터 (QIAFilter) 카트릿지 (키아젠 인크. (Qiagen Inc.), 캘리포니아주 챗스워트 9600 데 소토 애비뉴)를 이용하여 공급업자의 지시에 따라 ehb2c.pk001.o18로부터의 플라스미드 DNA를 정제하였다. 벡터의 재조합 및 인서트-특이적 프라이머를 사용하는 염료 터미네이터 기술 (미국 특허 제5,366,860호, 유럽 특허 272007호)을 이용하여 ABI 자동 시퀀서 상에서 서열을 생성하였다. 서열 편집은 Vector NTI, DNAStar 또는 위스콘신 GCG 프로그램을 통해 수행하였다 (상기 문헌 참조).
본 시스-프레닐트랜스퍼라제 효소를 코딩하는 ehb2c.pk001.o18 전장 클론으로부터의 cDNA를 특이적인 PCR 프라이머 (코딩 영역의 5' 및 3' 말단으로 설계되고 적절한 제한 효소 분해 부위를 포함함)와 함께 증폭시켰다. 증폭된 DNA를 공급업자 (노바젠 인크 (Novagen Inc.), 위스콘신주 매디슨 597 사이언스 드라이브)의 지시에 따라 T7lac프로모터의 조절 하의 발현에 적합한 제한 효소 부위로 리게이션시킴으로써 pET28b 벡터에 삽입하였다. 그 후, 상기 벡터를 사용하여 BL21 (DE3) 콤피턴트 이.콜라이 숙주를 형질전환시키고, 카나마이신 50 ㎍/㎖가 함유된 LB 아가 플레이트 상에서 선별하였다. 이 형질전환으로부터 나타난 콜로니를 밤새 37℃의 루리아 브로스 (Lauria Broth) 중에서 OD600이 약 0.5로 될 때까지 배양하고, 50mM IPTG로 유도하고, 추가로 4.5시간동안 배양하였다. 상기 배양물을 수획하고, 완충액 중에 재현탁시키고, 프렌치 프레스로 파쇄하고, 20,000 x g에서 원심분리하였다. 20,000 x g 원심 분리 이후, 그 상청액을 100,000 x g에서 1시간동안 원심분리하여 막 분획을 얻고, 이를 ㎖ 당 단백질 약 7 mg의 농도로 완충액 중에 재현탁시켰다. 상기 정제된 막 분획 중의 단백질을 젤코드 (Gelcode) 시약 (피어스 (Pierce), 일리노이주 록포드 사서함 117)으로 염색한 후, 4-12％ SDS-PAGE 젤 (노벡스 (Novex), 캘리포니아주 샌디에고 11040 로셀 스트리트) 상에서 관찰하였다. 추정 시스-프레닐트랜스퍼라제를 발현하지 않는 이.콜라이 세포로부터 유사한 조제를 제조하여 염색된 젤과 비교한 결과, ehb2c.pk001.o18에 해당하는 단백질 (분자량 34,004 달톤)이 주목할만한 수준으로 상기 정제된 막 분획에 존재하였다. 발현된 시스-프레닐트랜스퍼라제 단백질을 함유하는 미생물 숙주로부터 본 실시예에서 기술한 바와 같이 막을 단리하여 (예, 단백질을 가용화한 후 크로마토그래피 방법에 의해), 생화학적, 화학적 또는 물리화학적 수단으로 분석하기에 충분한 효소 단백질을 얻었다.
<실시예 7>
아라비돕시스 탈리아나에서의 식물 시스-프레닐트랜스퍼라제의 발현
아라비돕시스 탈리아나에서의 발현을 위해, 헤베아, 쌀 및 대두 시스-프레닐트랜스퍼라제 (각각 서열 9, 15 및 17)를 센스 방향으로 포함하는 키메라 유전자가 헤베아, 쌀 또는 대두 시스-프레닐트랜스퍼라제 상동체를 포함하는 플라스미드로부터 중합효소 연쇄 반응에 의해 제작되었다.
헤베아 DNA (Hpt3으로 지칭됨)를 올리고뉴클레오티드 프라이머 Hpt3/Xba I (5'-GCTCTAGAGAAGGTTAAGTCAGTTTAGCATCG-3') (서열 29) 및 Hpt3/Kpn I (5'-GGGGTACCTTATTTTAAATATTCCTTATGCTTCTCC-3') (서열 30)을 사용하여 ehb2c.pk001.o18 클론으로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 증폭된 Hpt3 cDNA를 XbaI 및 KpnI로 절단하고 아그로스 젤 상에서 분리하였다. 키아퀵 (QIAguick) 젤 추출 키트를 이용하여 공급업자 (키아젠, 미국)의 지시에 따라 DNA 단편을 단리 및 정제하였다. 정제된 DNA 단편을 2원성 벡터인 pBI-35S의 대응 부위로 클로닝하였다 (상기 문헌 참조).
쌀 및 대두 DNA를 PCR에 의해 유사하게 단리하였다. 이들 클론을 위해, BamHI 및 SacI 클로닝 부위를 올리고뉴클레오티드 프라이머로 혼입시켜, 2원성 벡터인 pGV827로 삽입시 DNA 단편에게 적합한 방향을 제공하도록 하였다. JK1 (5'-GTGGATCCATGCTTGGCTCACTTATG-3') (서열 31) 및 JK2 (5'-TTGAGCTCTATCTCC TCCCAGGGAGG-3') (서열 32) 프라이머를 사용하여 쌀 상동체를 rr1.pk0050.h8 클론으로부터 증폭시키고, JK3 (5'-ACGGATCCATGTTCTCGTTAAGACTCC-3') (서열 33) 및 JK4 (5'-TCGAGCTCTTATGAATGTCGACCACC-3') (서열 34) 프라이머를 사용하여 대두 상동체를 sl1.pk0128.h7 클론으로부터 증폭시켰다. TA-클로닝 키트 (프로메가 코포레이션 (Promega Corporation), 위스콘신주 매디슨 2800 우즈 할로우 로드)를 이용하여 PCR 산물을 pGEM T-이지 벡터로 클로닝하고, 그 후 이들 플라스미드로 이.콜라이를 형질전환시켰다.
사설 데이타베이스에서 확인된 시스-프레닐트랜스퍼라제 유전자 뿐만 아니라, 실시예 3에서 본질적으로 개략한 바와 같이 박테리아 및 효모 시스-프레닐트랜스퍼라제의 서열을 이용한 BLAST 검색을 수행하여 추정 시스-프레닐트랜스퍼라제 유전자 서열을 포함하는 수종의 아라비돕시스 탈리아나 게놈 DNA 단편을 공용 데이타베이스로부터 확인하였다. Apt5 (서열 37)로 지칭되는, 아라비돕시스 탈리아나 염색체 5번 게놈 DNA로부터의 유전자 (진뱅크 번호 AB011483)는 인트론 서열 없이 813 nt의 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이는 아미노산 271개의 단백질을 코딩하고 실시예 3 및 4에서 기술한 미생물 및 식물 시스-프레닐트랜스퍼라제 서열과 광범위한 상동성을 갖는다. 이 유전자를 본 아라비돕시스 형질전환 실험에 포함시켜 내생 유전자의 과발현에 의한 영향을 결정하도록 정하였다. 아라비돕시스 탈리아나 게놈 DNA를 템플레이트로서 사용하여 PCR 증폭에 의해 Apt5 유전자 (서열 37)를 클로닝하였다. 특이적인 제한효소 부위를 각 말단에 포함시켜 클로닝이 용이하도록 프라이머를 설계하였다. 사용된 프라이머는 Apt5/XbaI (5'-CTAGTCTAGAATCTCCCCTCCGATAACCAAAAAATCC-3') (서열 35 ) 및 Apt5/KpnI (5'-GGGGTACCTAGGGTTTAACTTAGAAACTATTTAG-3') (서열 36)이었다. 증폭된 Apt5 유전자 (서열 37)를 XbaI 및 KpnI로 분해하고, 아그로스 젤 상에서 분리하였다. 키아퀵 젤 추출 키트를 이용하여 공급업자 (키아젠, 미국)의 지시에 따라 길이 약 850 bp의 DNA 단편을 단리 및 정제하였다. 정제된 DNA 단편을 공급업자 (스트라타젠 (Stratagene, 캘리포니아주 라욜라 11011 노스 토리 파인스 로드)의 지시에 따라 pBluescript 벡터로 클로닝하였다.
증폭된 DNA의 완전성을 확인하기 위해, 키아필터 카트리지 (키아젠 인크, 캘리포니아주 챗스워트 9600 데 소토 애비뉴)를 이용하여 공급업자의 지시에 따라 단리 및 정제하였다. 벡터-특이적 프라이머를 조합하여 사용하는 염료 터미네이터 기술 (미국 특허 제5,366,860호, 유럽 특허 272007호)을 이용하여 ABI 자동 시퀀서 상에서 서열을 생성하였다. 서열 편집은 Vector NTI, DNAStar 또는 위스콘신 GCG 프로그램을 통해 수행하였다 (상기 문헌 참조).
동결/해동법 (문헌 [Holsters et al.,Mol. Gen. Genet. 163:181-187 (1978)] 참조)을 이용하여 Hpt3 유전자를 포함하는 pBI-35S 플라스미드로 아그로박테리움 투메파시엔스 C58 균주를 형질전환시켰다. 아그로박테리움-매개 형질전환을 통해 아라비돕시스 탈리아나 식물을 형질전환시켰다 (문헌 [Clough S.J., Bent A.F.; Plant Journal 1998 Dec;16(6):735-43] 참조).
쌀 및 대두 시스-프레닐트랜스퍼라제를 코딩하는 플라스미드를 BamHI 및 SacI로 분해하고, 본 시스-프레닐트랜스퍼라제를 코딩하는 cDNA 단편을 아가로스 젤 정제에 의해 단리하였다. 상기 단편을 2원성 벡터인 pBIN19의 유도체 (적절한 제한효소 부위와 함께 35S 양배추 모자이크 바이러스 프로모터 및 노팔린 신타제 3' 번역 종결 서열 (nos)를 포함)에 리게이션시켰다 (문헌 [Frisch, R.A. et al. (1995) Complete sequence of the binary vector BIN19.Plant Molecular Biology27, 405-409] 참조). 생성된 쌀 및 대두 유전자 발현 구조물을 각각 35S::rr1 및 35S::sl1로 명명하였다. 이들 플라스미드로 이.콜라이를 형질전환시키고, 상기 기술된 바와 같이 플라스미드 단리 및 제한효소 분해를 통하여 상기 2원성 벡터의 완전성을 확증하였다. 그 후, 동결/해동법 (문헌 [Holsters et al.,Mol. Gen.Genet. 163:181-187 (1978)] 참조)을 이용하여 상기 플라스미드로 아그로박테리움 투메파시엔스 C58 균주를 형질전환시켰다. 상기 2원성 벡터 구조물을 함유한 아그로박테리움 균주를 PCR에 의해 선별하고, 플로랄 딥 (floral dip) 방법을 이용하여 아라비돕시스 탈리아나를 형질전환시키는 데 사용하였다.(문헌 [Clough S.J., Bent A.F.; Plant Journal 1998 Dec;16(6):735-43] 참조).
800 bp HindIII-XbaI CaMV 35 프로모터 DNA 단편 (문헌 [Guilley H, Dudley R. K., Jonard G, Balazs E, Richards K. E. (1982) Transcription of Cauliflower mosaic virus DNA: detection of promoter sequences, and characterization of transcripts,Cell30(3):763-73] 참조)을 벡터 pBIB/NPT (문헌 [Detlef Becker (1990) Binary vectors which allow the exchange of plant selectable mekers and reporter genes.Nucleic Acids Research18(1):203] 참조)의 대응 부위로 라이게이션시켜 식물 내에서의 Apt5 유전자 (서열 37)의 발현을 위한 2원성 벡터인 pBI-35S를 제작하였다. 그 후, Apt5 유전자 (서열 37)를 코딩하는 상기 XbaI-KpnI DNA 단편을 pBI-35S 벡터 내로 클로닝하여, 35S::Apt5 구조물을 얻었다. 동결/해동법 (문헌 [Holsters et al.,Mol. Gen. Genet. 163:181-187 (1978)] 참조)을 이용하여 상기 구조물로 아그로박테리움 투메파시엔스 C58 균주를 형질전환시켰다. 아그로박테리움-매개 형질전환을 통해 아라비돕시스 탈리아나 식물을 형질전환시켰다 (문헌 [Clough S.J., Bent A.F.; Plant Journal 1998 Dec;16(6):735-43] 참조).
감염된 식물로부터 생산된 종자를 카나마이신 100 ㎍/㎖가 함유된 아가 플레이트 상에 플레이팅하였다. 카나마이신에 대해 내성인 아라비돕시스 식물을 선별하고, 토양에 심었다.
<실시예 8>
트랜스제닉 식물의 폴리프레놀 프로필 분석
실시예 7에서 기술한 쌀, 헤베아 브라실리엔시스, 아라비돕시스 또는 대두 시스-프레닐트랜스퍼라제 상동체 중 어느 하나를 발현하는 이형 접합 트랜스제닉 식물을 19℃에서 1일 18시간의 조광시간을 주며 재배하였다. 로제트 잎을 수획하여, 액체 질소 중에서 동결시키고, 그 후 동결건조시켰다. 건조된 잎 물질을 클로로포름:메탄올 (부피비 2:1) 2 ㎖ 중에서 밤새 추출하고, 게라닐제라니올을 건중량 10 mg 당 1 ㎍으로 첨가하여 내부 표준으로 삼았다. 그 유기 추출물을 물 400 ㎕로 세척하고, 수성상을 제거하였다. 그 후, 상기 추출물을 질소 분류 하에서 건조시키고, 2M KOH/50％ 메탄올 1 ㎖ 중에 재용해시킨 후, 70℃에서 2시간동안 가열하여 검화시켰다. 상기 검화 혼합물을 헥산으로 2회 추출하였다. 그 후, 잎 10 mg (건중량)에 상응하는 이들 헥산 추출물의 부피를 대기압 하의 화학적 이온화 (APCI) 모드에서 고압 조합 액체 크로마토그래피-질량분석기 (LC_MS) (휴렛-팩커드 (Hewlett-Packard) 1100 시리즈 LC-MS 이용)에 의해 분석하였다.
크로마토그래피는 유속 0.25 ㎖/분의 메탄올:이소프로판올:물 (12:8:1)을 초기 용매로서 사용한 조르백스 (Zorbax) C18 역상 컬럼 (2.1 x 150 mm; 5 ㎛)을 이용하여 수행하였다. 이소프로판올:헥산 (1:4)의 농도구배를 가하여 폴리프레놀을 용출시키고, 용출액을 210 nm에서 모니터링하였다. 폴리프레놀은 용출 시간 및 질량 분석 스펙트럼을 인증된 표준 (시그마 (Sigma), 미저리주 세인트 루이스)과 비교함으로써 확인하였다.
이들 분석으로부터 얻은 데이타는 대두 클론 sl1.pk0128.h7 (서열 17)의 발현 및 아라비돕시스 시스-프레닐트랜스퍼라제 Apt5의 과발현이 트랜스제닉 아라비돕시스 식물의 잎에서 폴리프레놀 조성을 주목할만큼 변화시켰음을 나타내었다. 이들 경우 둘 다에서, 도데카프레놀 (탄소수 60의 폴리프레놀 (C60), 12 이소프렌 단위로 구성됨)은 다이오드 어레이 검출기 (DAD; 도 5) 반응 또는 질량 검출기 데이타에 대한 선택적 이온 모니터링에 의해 검출될 수 없었다 (표 5; 도 6).
도 5는 야생형 및 트랜스제닉 아라비돕시스 잎으로부터의 추출물에 대한 LC-MS 분석을 설명하고 있다. 잎 10 mg (건중량)에 해당하는 시료를 역상 크로마토그래피에 의해 분리하고, 폴리프레놀 용출액을 다이오드 어레이 검출기 (DAD)로 210 nm에서 모니터링하였다. 표준 폴리프레놀 (C45-C60)의 용출이 야생형 아라비돕시스로부터의 추출물의 프로필에서 나타났다. 유사하게, 도 6은 아라비돕시스의 로제트 잎에서 도데카프레놀 (C60)에 대한 분자 이온의 LC-MS 분석을 설명하고 있다.
상기 일차 결과 뿐만 아니라, 다른 폴리프레놀 (탄소수 45, 50, 55)의 양도 야생형 식물의 추출물 (이들 폴리프레놀 모두를 상당량 함유함; 표 5, 도5)에 비해 많이 감소하였다 (도 5). 이 결과는 헤베아 Hpt3 또는 쌀 클론을 발현하는 식물에서 나타나지 않았다. 본 데이타는 실시예 2 및 3에서 확인된 유전자 (상동성에 의해 식물 시스-프레닐트랜스퍼라제를 코딩하는 것으로 나타남) 2종 이상의 과발현 이 폴리프레놀 조성에 대한 트랜스제닉 식물의 표현형을 많이 변화시킨다는 것을명백하게 증명하고 있다.
트랜스제닉 아라비돕시스 잎의 폴리프레놀 프로필
폴리프레놀 야생형 35S::Hpt3 35S::rr1 35::Sl1 35S::Apt3
C45m/z 612-614 + + + + +
C50m/z 680-682 + + + + +
C55m/z 748-750 + + + + +
C60m/z 816-818 + + + - -
특정 폴리프레놀이 야생형 또는 트랜스제닉 아라비돕시스 잎의 추출물에서 존재하는지의 여부는 추출물의 크로마토그래피 동안 질량 분석 스펙트럼 결과에 대한 선택적 이온 모니터링에 의해 결정하였다. 존재의 경우는 '+' 기호로, 부재의 경우는 '-'로 표시하고 있다.

Claims (15)

  1. (a) 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 서열 18 및 서열 20으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 전부 또는 실질적인 일부를 코딩하는 단리된 핵산 단편;
    (b) 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 서열 18 및 서열 20으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 전부 또는 실질적인 일부를 코딩하는 단리된 핵산 단편과 실질적으로 유사한 단리된 핵산 단편;
    (c) 서열 24에 기재된 아미노산 서열과 41％ 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 단편;
    (d) 서열 23에 기재된 핵산 서열과 50％ 이상의 동일성을 갖는 단리된 핵산 단편;
    (e) 0.1X SSC, 0.1％ SDS, 65℃의 혼성화 조건 및 0.2X SSC, 0.5％ SDS의 세척 조건 하에서 (a), (b), (c) 또는 (d)의 핵산 서열과 혼성화하는 단리된 핵산 분자;
    (f) 0.1X SSC, 0.1％ SDS, 65℃의 혼성화 조건 및 0.2X SSC, 0.5％ SDS의 세척 조건 하에서 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 13, 서열 15, 서열 17 및 서열 19로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열과 혼성화하는 단리된 핵산 단편; 및
    (g) (a), (b), (c), (d), (e) 및 (f)와 상보적인 단리된 핵산 단편
    으로 구성된 군으로부터 선택된 식물 시스-프레닐트랜스퍼라제 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 단편.
  2. 제1항에 있어서, 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 13, 서열 15, 서열 17 및 서열 19로 구성된 군으로부터 선택된 단리된 핵산 단편.
  3. 제1항의 단리된 핵산 단편에 의해 코딩된 폴리펩티드.
  4. 제3항에 있어서, 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 서열 18 및 서열 20으로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드.
  5. 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 제1항의 단리된 핵산 단편을 포함하는 키메라 유전자.
  6. 숙주 세포 및 제5항의 키메라 유전자를 포함하는 형질전환된 숙주 세포.
  7. 제6항에 있어서, 숙주 세포가 식물 세포 및 미생물 세포로 구성된 군으로부터 선택된 것인 형질전환된 숙주 세포.
  8. 제7항에 있어서, 숙주 세포가 담배 (니코티아나 (Nicotiana) 종), 토마토 (리코페르시콘 (Licopersicon) 종), 감자 (솔라눔 (solanum) 종), 대마 (칸나비스 (Cannabis) 종), 해바라기 (헬리안투스 (Helianthus) 종), 사탕수수 (소르굼 불가레 (Sorghum vulgare)), 밀 (트리티쿰 (Triticum) 종), 옥수수 (지 매이스 (Zea mays)), 쌀 (오리자 사티바 (Oryza sativa)), 호밀 (세칼레 세레알레 (Secale cereale)), 귀리 (아베나 (Avena) 종), 보리 (호르데움 불가레 (Hordeum vulgare)), 평지씨 (브라시카 (Brassica) 종), 잠두 (비시아 파바 (Vicia faba)), 강낭콩 (파세올루스 불가리스 (Phaseolus vulgaris)), 다른 콩 종 (비그나 (Vigna)종), 렌즈콩 (렌스 쿨리나리스 (Lens culinaris)), 대두 (글라이시네 맥스 (Glycine max)), 아라비돕시스 (아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis Thaliana)), 구아율 (파르테니움 아르겐타툼 (Parthenium argentatum)), 목화 (고시피움 히르수툼 (Gossypium hirsutum)), 페튜니아 (페튜니아 하이브리다 (Petunia hybrida)), 아마 (리눔 우시타티시뭄 (Linum usitatissimum)) 및 당근 (다우쿠스 카로타 사티바 (Daucus carota sativa))으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 숙주 세포.
  9. 제7항에 있어서, 숙주 세포가 아스퍼질루스 (Aspergillus), 사카로마이세스 (Saccharomyces), 피키아 (Pichia), 칸디다 (Candida), 한세눌라 (Hansenula), 바실루스 (Bacillus), 에셰리키아 (Escherichia), 살모넬라 (Salmonella) 및 시겔라 (Shigella)로 구성된 군으로부터 선택된 것인 형질전환된 숙주 세포.
  10. (a) 숙주 세포를 제6항의 키메라 유전자로 형질전환시키는 단계 및
    (b) (a) 단계에서 생성된 형질전환된 숙주 세포를 상기 키메라 유전자의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하여, 형질전환되지 않은 숙주 세포에서의 발현 수준에 비해 상기 형질전환된 숙주 세포 내에서 식물 시스-프레닐트랜스퍼라제 단백질이 변화된 수준으로 생산되도록 하는 단계
    를 포함하는, 숙주 세포 내에서 식물 시스-프레닐트랜스퍼라제 단백질의 발현 수준을 변화시키는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 숙주 세포가 담배 (니코티아나 종), 토마토 (리코페르시콘 종), 감자 (솔라늄 종), 대마 (칸나비스 종), 해바라기 (헬리안투스 종), 사탕수수 (소르굼 불가레), 밀 (트리티쿰 종), 옥수수 (지 매이스), 쌀 (오리자 사티바), 호밀 (세칼레 세레알레), 귀리 (아베나 종), 보리 (호르데움 불가레), 평지씨 (브라시카 종), 잠두 (비시아 파바), 강낭콩 (파세올루스 불가리스), 다른 콩 종 (비그나 종), 렌즈콩 (렌스 쿨리나리스), 대두 (글라이시네 맥스), 애기장대 (아라비돕시스 탈리아나), 구아율 (파르테니움 아르겐타툼), 목화 (고시피움 히르수툼), 페튜니아 (페튜니아 하이브리다), 아마 (리눔 우시타티시뭄) 및 당근 (다우쿠스 카로타 사티바)으로 구성된 군으로부터 선택된 식물 세포인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 식물 시스-프레닐트랜스퍼라제 단백질의 발현 수준 변화가 식물의 방어 기전의 변형을 유발하는 것인 방법.
  13. (a) 제1항의 핵산 단편을 프로브로 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 탐색하는 단계;
    (b) 제1항의 핵산 단편과 혼성화하는 DNA 클론을 확인하는 단계; 및
    (c) (b) 단계에서 확인된 클론을 포함하는 cDNA 또는 게놈 단편을 시퀀싱하는 단계 (시퀀싱된 cDNA 또는 게놈 단편은 식물 시스-프레닐트랜스퍼라제 단백질을 코딩함)
    를 포함하는, 식물 시스-프레닐트랜스퍼라제 단백질을 코딩하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 단편을 얻는 방법.
  14. (a) 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 13, 서열 15, 서열 17 및 서열 19로 구성된 군으로부터 선택된 서열의 일부에 대응하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 1종 이상을 합성하는 단계;
    (b) (a) 단계의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 클로닝 벡터 내에 존재하는 cDNA 인서트를 증폭시키는 단계 (증폭된 cDNA 인서트는 식물 시스-프레닐트랜스퍼라제 단백질을 코딩함)
    를 포함하는, 식물 시스-프레닐트랜스퍼라제 단백질을 코딩하는 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산 단편을 얻는 방법.
  15. 제13항 또는 제14항의 방법에 의한 산물.
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