JP2002191367A

JP2002191367A - コエンザイムｑ１０の製造法

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Publication number: JP2002191367A
Application number: JP2000398658A
Authority: JP
Inventors: Hideyuki Matsuda; 英幸松田; Makoto Kawamuki; 誠川向; Reika Yajima; 麗嘉矢島; Yasuhiro Ikenaka; 康裕池中
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 2000-12-27
Filing date: 2000-12-27
Publication date: 2002-07-09
Also published as: WO2002052017A1; EP1354957A1; US7320883B2; CA2432079A1; EP1354957A4; US20040157286A1

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属及びＬｅｕｃｏｓ
ｐｏｒｉｄｉｕｍ属に属する真菌類由来のコエンザイム
Ｑ₁₀の側鎖合成遺伝子を利用することにより、微生物に
よってコエンザイムＱ₁₀を効率よく生産する方法の提
供。【解決手段】特定のＤＮＡ配列、又はこれら配列にお
いて１若しくは複数の塩基が欠失、追加、挿入、置換さ
れたＤＮＡ配列を有し、デカプレニル２燐酸合成酵素活
性を有するＬｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ及びＡｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ由来のタンパク質をコードするＤＮＡ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、医薬品等として用
いられているコエンザイムＱ₁₀の製造に関する。さらに
詳細には、コエンザイムＱ₁₀の生合成に関するキー酵素
であるコエンザイムＱ₁₀側鎖合成酵素、すなわちデカプ
レニル２燐酸合成酵素をコードする遺伝子をＬｅｕｃｏ
ｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属に
属する真菌より単離し、これを微生物に導入することに
よりコエンザイムＱ₁₀を生成させる方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来のコエンザイムＱ₁₀の製造法は、タ
バコなどの植物由来のコエンザイムを単離してその側鎖
長を合成法により調整する等によって工業的には生産さ
れている。

【０００３】また、コエンザイムＱ₁₀は細菌や酵母など
の微生物から高等動植物に至るきわめて幅広い生物によ
り生産されることが知られているが、微生物を培養して
その菌体より本物質を抽出する方法が最も有効な一つの
製造法であると考えられ、実際の工業的な生産にも用い
られている。しかしながら、これらの方法では、生成量
が少なかったり、操作が煩雑であったりする等、その生
産性は良好とは言い難い。

【０００４】また、コエンザイムＱ₁₀の生合成に関わる
遺伝子を単離し、遺伝子組換え技術により当該遺伝子を
増幅しコエンザイムＱ₁₀の生産増強に利用する試みもな
されている。生体内において、コエンザイムＱ₁₀は、多
くの酵素が関与した多段階の複雑な反応によって生成さ
れている。その生合成経路は、原核生物と真核生物では
一部異なっているが、いずれも基本的には大きく３つの
ステップ、すなわち、コエンザイムＱ₁₀のプレニル側鎖
のもとになるデカプレニル２燐酸を合成するステップ、
キノン環のもとになるパラヒドロキシ安息香酸を合成す
るステップ、そして、これらの２つの化合物を結合させ
て置換基を順次変換してコエンザイムＱ ₁₀を完成させる
ステップよりなっている。これらの反応の中で、生合成
反応全体の律速であると言われ、コエンザイムＱ₁₀の側
鎖の長さを決定している反応、すなわちデカプレニル２
燐酸合成酵素の反応は最も重要な反応であると考えられ
る。

【０００５】従って、コエンザイムＱ₁₀を効率よく生産
させる為には、生合成のキー遺伝子であるデカプレニル
２燐酸合成酵素の遺伝子を単離して生産増強に利用する
ことが有効であると考えられ、その遺伝子源としてはコ
エンザイムＱ₁₀を比較的多量に生産している真菌類が有
力な候補となる。

【０００６】これまでにデカプレニル２燐酸合成酵素の
遺伝子としては、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃhａｒｏｍｙｃ
ｅｓｐｏｍｂｅ（特開平９−１７３０７６）やＧｌｕ
ｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ（特開平
１０−５７０７２）などいくつかの種類の微生物より分
離されているが、本来これらの微生物ではコエンザイム
Ｑ₁₀の生産性が十分とはいえず、これらの微生物では効
率的な培養や分離精製などは出来ていなかった。そこ
で、さらにコエンザイムＱ₁₀を高生産する微生物由来の
本酵素遺伝子を単離することが望まれていた。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の生産
に関する問題を解決するべく、Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄ
ｉｕｍ属及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属に属する真菌由
来のコエンザイムＱ₁₀の側鎖合成遺伝子を単離してこれ
を利用することにより、微生物によってコエンザイムＱ
₁₀を効率よく生産することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成する為
に、本発明では、まず、Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕ
ｍ属及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属に属する真菌よりコ
エンザイムＱ₁₀の生合成に関与するキー遺伝子、デカプ
レニル２燐酸合成酵素の遺伝子を単離するための検討を
重ね、該遺伝子を単離することに成功し、本発明を完成
するに至った。

【０００９】即ち本発明は、以下の（ａ）、（ｂ）又は
（ｃ）のＤＮＡである：（ａ）塩基配列が配列番号１に記載のものであるＤＮ
Ａ：（ｂ）配列番号１に示す塩基配列において１若しくは数
個の塩基が欠失、追加、挿入及び／又は置換された塩基
配列を有し、かつデカプレニル２燐酸合成酵素活性を有
するタンパク質をコードするＤＮＡ：（ｃ）配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡとスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつデカプ
レニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコード
するＤＮＡ。

【００１０】本発明はまた、以下の（ｄ）、（ｅ）又は
（ｆ）のＤＮＡである：（ｄ）塩基配列が配列番号２に記載のものであるＤＮ
Ａ：（ｅ）配列番号２に示す塩基配列において１若しくは数
個の塩基が欠失、追加、挿入及び／又は置換されたＤＮ
Ａ配列を有し、かつデカプレニル２燐酸合成酵素活性を
有するタンパク質をコードするＤＮＡ：（ｆ）配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡとスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつデカプ
レニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコード
するＤＮＡ。

【００１１】本発明はまた、以下の（ｇ）又は（ｈ）の
タンパク質である：（ｇ）アミノ酸配列が配列番号３に記載のものであるタ
ンパク質：（ｈ）配列番号３に示すアミノ酸配列において１若しく
は数個のアミノ酸が欠失、追加、挿入及び／又は置換さ
れたアミノ酸配列からなり、かつデカプレニル２燐酸合
成酵素活性を有するタンパク質。

【００１２】本発明はまた、以下の（ｉ）又は（ｊ）の
タンパク質である：（ｉ）アミノ酸配列が配列番号４に記載のものであるタ
ンパク質：（ｊ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１若しく
は数個のアミノ酸が欠失、追加、挿入及び／又は置換さ
れたアミノ酸配列からなり、かつデカプレニル２燐酸合
成酵素活性を有するタンパク質。

【００１３】本発明はまた、上記（ｇ）〜（ｊ）のタン
パク質をコードするＤＮＡである。本発明はまた、上記
ＤＮＡをベクターに組み込んでなる発現ベクターであ
る。本発明はまた、宿主微生物を上記ＤＮＡ又は発現ベ
クターにて形質転換してなる形質転換体である。本発明
はさらに、上記形質転換体を培地中で培養し、培養物中
にコエンザイムＱ ₁₀を生成蓄積し、これを採取すること
を特徴とするコエンザイムＱ₁₀の製造方法でもある。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明者らは、コエンザイムＱ₁₀
を比較的多量に生産しているＬｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉ
ｕｍ属及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属に属する真菌から
本酵素遺伝子を分離するための検討を重ねたところ、Ｐ
ＣＲ法によって該遺伝子の断片を取得することに成功し
た。

【００１５】既知のデカプレニル２燐酸合成酵素、及び
本酵素と類縁で鎖長の違うコエンザイムＱの長鎖プレニ
ル鎖合成酵素であるポリプレニル２燐酸合成酵素の遺伝
子の配列を比較し、その相同性の高い領域についてＰＣ
Ｒプライマーを各種合成した。そしてこれらのプライマ
ーを種々組み合わせ、ＰＣＲの条件をいろいろ検討した
ところ、プライマーＤＰＳ−１（配列表配列番号５）及
びＤＰＳ−１１ＡＳ（配列表配列番号６）を用い、Ｐ
ＣＲを９４℃、３分間の熱処理の後、９４℃、１分→４
３℃、２分→７２℃、２分のサイクルを４０回繰り返す
ことにより、Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属に属する
真菌ＬｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｓｃｏｔｉｉＩＦ
Ｏ１２１２及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属に属する真
菌ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｃｌａｖａｔｕｓＪＣＭ
１７１８の染色体遺伝子から本酵素遺伝子の約２２０
ｂｐの断片が増幅してくることを、その遺伝子の塩基配
列を解析することにより明らかにした。

【００１６】次に本酵素遺伝子の全長を取得するために
は、Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｓｃｏｔｉｉ
ＩＦＯ１２１２及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｃｌａ
ｖａｔｕｓＪＣＭ１７１８の菌体からｍＲＮＡを調
製し、先に取得した内部配列を基にプライマーを作製し
５'ＲＡＣＥ法を用いれば５'末端側配列が、ｍＲＮＡ
に特異的なポリＡ配列に対するオリゴｄＴプライマーで
ＲＴ−ＰＣＲを行えば３'末端側配列が取得することが
出来る。

【００１７】得られた配列について塩基配列の決定を行
ったところ、配列表の配列番号１及び２に示した配列を
持つことが明らかとなり、この配列から予想できるアミ
ノ酸配列にはデカプレニル２燐酸合成酵素の遺伝子とし
て特徴的な配列がみられた。

【００１８】本発明のＤＮＡは、塩基配列が配列番号１
又は配列番号２に記載のものであるＤＮＡであってもよ
いし、配列番号１又は配列番号２に示す塩基配列におい
て１若しくは数個の塩基が欠失、追加、挿入及び／又は
置換された塩基配列を有し、かつデカプレニル２燐酸合
成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであ
ってもよいし、配列番号１または配列番号２に示す塩基
配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブ
リダイズし、かつデカプレニル２燐酸合成酵素活性を有
するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。な
お、多くのアミノ酸は１種以上のコドンで規定される
（遺伝暗号の縮重）ことから、配列番号３又は配列番号
４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする
ＤＮＡとしては、配列番号１又は配列番号２で示す塩基
配列からなるＤＮＡ以外にも多数存在する。従って、本
発明のＤＮＡには、配列番号３又は配列番号４で示すア
ミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡも含
まれる。

【００１９】ここで、「１若しくは数個の塩基が欠失、
追加、挿入及び／又は置換された塩基配列」とは、蛋白
核酸酵素増刊遺伝子増幅ＰＣＲ法ＴＡＫＫＡＪ
３５（１７），２９５１−３１７８（１９９０）又はＨ
ｅｎｒｙＡ．Ｅｒｌｉｃｈ編加藤郁之進鑑訳ＰＣ
Ｒテクノロジー（１９９０）等に記載の当業者に周知の
方法により欠失、追加、挿入及び／又は置換できる程度
の数の塩基が欠失、追加、挿入及び／又は置換されてな
る塩基配列を意味する。

【００２０】「配列番号１（又は配列番号２）に示す塩
基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイ
ブリダイズするＤＮＡ」とは、配列番号１（又は配列番
号２）に示す塩基配列からなるＤＮＡをプローブとし
て、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・
ハイブリダイゼーション法、又はサザン・ハイブリダイ
ゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡのこ
とをいう。当業者であれば、該ハイブリダイゼーション
をＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ２ｎｄＥｄ
ｔ．（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａ
ｂｏｒａｔｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９）に記載されて
いる方法に準じて実施して、目的とするＤＮＡを容易に
取得できる。

【００２１】また、「デカプレニル２燐酸合成酵素活性
を有するタンパク質」とは、配列番号３又は配列番号４
に示すアミノ酸配列からなるタンパク質を用いた場合の
１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６
０％以上、さらに好ましくは８０％以上の収率でデカプ
レニル２燐酸を合成する能力を持つタンパク質のことを
いう。このような測定は、ＦＰＰ（ファルネシル２燐
酸）と¹⁴Ｃ−ＩＰＰ（放射ラベルしたイソペンテニル２
燐酸）を用いて対象酵素と反応させ、生成した¹⁴Ｃ−Ｄ
ＰＰ（デカプレニル２燐酸）をホスファターゼにより加
水分解後、ＴＬＣにて分離して、各鎖長のスポットへの
取り込みによって確定する（Ｏｋａｄａｅｔａｌ．，
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５５，５
２−５９）。

【００２２】本発明のタンパク質は、アミノ酸配列が配
列番号３又は配列番号４に記載のものであるタンパク質
であってもよいし、配列番号３又は配列番号４に示すア
ミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、
追加、挿入及び／又は置換されたアミノ酸配列からな
り、かつデカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタン
パク質であってもよい。

【００２３】「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、追
加、挿入及び／又は置換されたアミノ酸配列」は、部分
特異的突然変異誘発法など当業者に周知の方法により、
アミノ酸を欠失、追加、挿入及び／又は置換することに
より取得可能である。具体的には、ＮｕｃｌｅｉｃＡ
ｃｉｄＲｅｓ．１０，６４８７（１９８２）、Ｍ
ｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１００，
４４８（１９８３）等の文献に記載されている。

【００２４】デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子を発現
させるためには、適当なプロモーターの下流に該遺伝子
を接続することが必要であるが、例えば遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片を制限酵素によって切り出したり、ＰＣＲによ
って酵素をコードする遺伝子部分のみを増幅させたりし
た後、プロモーターを持つベクターに挿入することによ
り発現ベクターとすることができる。

【００２５】本発明において、デカプレニル２燐酸合成
酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを組み
込む発現用ベクターとしては特に限定されず、例えば、
大腸菌由来のプラスミドに、適当なプロモーターを組み
込んだものが挙げられる。大腸菌由来のプラスミドとし
ては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１
９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１９等が挙げられ、プロモー
ターとしては、例えば、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロ
モーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、
λＰＬプロモーター等が挙げられる。

【００２６】また、本発明においては発現用ベクターと
して、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＧＥＸ−３Ｔ、ｐＧＥＸ−３
Ｘ（以上、ファルマシア社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔII、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、（東洋紡社製）、ｐＭ
ＡＬＣ２、ｐＥＴ−３Ｔ、ｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４/ ０３
６１３に記載）等を用いることもできる。このうち、ｐ
ＵＣＮＴ及びｐＵＣ１８が好適に用いられ、具体的な例
としては、発現用ベクターｐＵＣＮＴに配列番号１に示
すＤＮＡ配列を有する遺伝子を挿入すれば、デカプレニ
ル２燐酸合成酵素遺伝子の発現ベクター、ｐＮＴＬ１を
作製することができ、発現用ベクターｐＵＣ１８に配列
番号２に示すＤＮＡ配列を有する遺伝子を挿入すれば、
デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子の発現ベクター、ｐ
ＵＣＡ１を作製することができる。

【００２７】そして、該酵素遺伝子の発現ベクターを適
当な微生物に導入することによりコエンザイムＱ₁₀の生
産に利用することが可能となる。宿主微生物としては特
に限定されず、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉが好
適に用いられる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉと
しては特に限定されず、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＢＬ−２
１、ＪＭ１０９、ＮＭ５２２、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、
ＤＨ５等が挙げられる。このうちＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａｃｏｌｉＤＨ５α及びＪＭ１０９が好適に用いら
れ、例えば、デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子の発現
ベクター、ｐＮＴＬ１を大腸菌に導入した場合には、
大腸菌が本来は生産しないコエンザイムＱ ₁₀を生産する
ように変換できる。この大腸菌菌株Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ
５α（ｐＮＴＬ１）は通商産業省、工業技術院、生命工
学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）
にＦＥＲＭＢＰ−７３５３として寄託されている。ま
た、デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子の発現ベクタ
ー、ｐＵＣＡ１を大腸菌に導入した場合には、大腸菌
が本来は生産しないコエンザイムＱ₁₀を生産するように
変換できる。この大腸菌菌株Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９
（ｐＵＣＡ１）は通商産業省、工業技術院、生命工学
工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に
ＦＥＲＭＢＰ−７３５２として寄託されている。

【００２８】本発明で得られた形質転換体を、常法に従
い、培養し、培養物中からコエンザイムＱ₁₀を採取する
ことにより、コエンザイムＱ₁₀を製造することができ
る。宿主微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉで
ある場合は、培地として、ＬＢ培地や、グルコースやカ
ザミノ酸を含むＭ９培地を用いることができる。プロモ
ーターを効率よく働かせるために、例えば、イソプロピ
ルチオガラクトシドやインドリル−３−アクリル酸のよ
うな薬剤を培地に加えてもよい。培養は例えば、３７℃
で１７〜２４時間行い、この際必要により通気や攪拌を
行ってもよい。

【００２９】本発明において、得られたコエンザイムＱ
₁₀は精製を行ってもよく、粗精製物として用いてもよ
く、用途により適宜選択することができる。得られた培
養物からコエンザイムＱ₁₀を単離するには公知の分離・
精製法を適宜組み合わせることができる。公知の分離・
精製法としては、塩析や溶媒沈殿等の溶解度を利用する
方法、透析法、限外濾過法、ゲル濾過法、及び、（ＳＤ
Ｓ−）ポリアクリルアミドゲル電気泳動法等の主として
分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフ
ィー等の荷電の差を利用する方法、アフィニティークロ
マトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相
高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する
方法、等電点電気泳動法等の等電点の差を利用する方法
等が挙げられる。

【００３０】本発明において得られたコエンザイムＱ₁₀
の用途は特に限定されず、医薬品等に好適に用いること
ができる。

【００３１】

【実施例】（実施例１）Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ
ｓｃｏｔｉｉＩＦＯ１２１２及びＡｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓｃｌａｖａｔｕｓＪＣＭ１７１８の染色
体ＤＮＡをＣ．Ｓ．Ｈｏｆｆｍａｎらの方法（Ｇｅｎ
ｅ、５７（１９８７）２６７−２７２）で調製した。既
知の長鎖プレニル２燐酸合成酵素の遺伝子との相同性か
らＰＣＲに用いるプライマーＤＰＳ−１（配列表配列番
号５）及びＤＰＳ−１１ＡＳ（配列表配列番号６）を
設計した。これらを用いてＰＣＲを９４℃、３分間の熱
処理の後、９４℃、１分→４３℃、２分→７２℃、２分
のサイクルを４０回繰り返すことにより行い、１．２％
アガロースゲル電気泳動により分析した。そして得られ
た約２２０ｂｐの断片をゲルより切り出してＤＮＡ抽出
キット（Ｓｅｐｈａｇｌａｓ（商標）ＢｒａｎｄＰｒ
ｅｐＫｉｔ、アマシャムファルマシアバイオテク社
製）を用いて精製した後、ＰＣＲ産物ダイレクトクロー
ニングキット（ｐＴ７ＢｌｕｅＴ−ＶｅｃｔｏｒＫｉ
ｔ、ＮＯＶＡＧＥＮ社製）を用いて大腸菌発現用ベクタ
ーにクローニングし、ｐＴ７−Ｌ１ＤＰＳ及びｐＴ７−
Ａ１ＤＰＳを得た。ＤＮＡ塩基配列をＤＮＡシークエン
サー（３７７型、パーキンエルマー社製）を用い、ＤＮ
Ａシークエンスキット（パーキンエルマー社製、ＡＢＩ
ＰＲＩＳＭ（商標）ＢｉｇＤｙｅ（商標）Ｔｅｒｍ
ｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｅＲｅａ
ｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔＷｉｔｈＡｍｐｔ
ｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓ
ｅ、ＦＳ）を使用して、その取り扱い説明書に従って反
応を行い配列を決定した。その結果、Ｌｅｕｃｏｓｐｏ
ｒｉｄｉｕｍｓｃｏｔｉｉＩＦＯ１２１２からは
配列表の配列番号１の７０９から９１５までの塩基配列
を有するＤＮＡ断片が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｃｌ
ａｖａｔｕｓＪＣＭ１７１８からは配列番号２の６
１６から８２２までの塩基配列を有するＤＮＡ断片が得
られた。これらＤＮＡ断片は、翻訳配列に長鎖プレニル
鎖を持つプレニル２燐酸合成酵素に特徴的な領域のアミ
ノ酸配列「ＧＤＦＬＬＸＲＡ」（Ｘは、ＡまたはＧ）が
見出せたことにより、デカプレニル２燐酸合成酵素の遺
伝子の一部であることが確認された。

【００３２】（実施例２）Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕ
ｍｓｃｏｔｉｉＩＦＯ１２１２及びＡｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓｃｌａｖａｔｕｓＪＣＭ１７１８を５
０ｍＬの７０３培地（５ｇ/Ｌペプトン、３ｇ/Ｌイー
ストエキス、３ｇ/Ｌマルトエキス、１ｇ/Ｌグルコース
ｐＨ６．０）で２５℃、４８時間培養後３０００回転
２０分で集菌し、菌体を液体窒素で直ぐに凍結させた。
凍結した菌体を凍結状態のまま、−７０℃で冷やしてあ
った乳鉢に入れて液体窒素を時折入れて溶けないように
しながら乳棒にて粉砕した。十分に粉になった菌体をＲ
ＮＡ精製キットＲＮｅａｓｙＭａｘｉＫｉｔ（キ
アゲン社製）を用いて全ＲＮＡを調製した。抽出した全
ＲＮＡをＲＮＡ精製キットＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫ
ｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製度を上げた。この精
製全ＲＮＡからｍＲＮＡ精製キット（Ｏｌｏｇｏｔｅｘ
−ｄＴ３０〈Ｓｕｐｅｒ〉（商標）ｍＲＮＡＰｕｒｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ、宝酒造製）を用いてｍＲＮ
Ａを調製した。

【００３３】（実施例３）Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕ
ｍｓｃｏｔｉｉＩＦＯ１２１２のデカプレニル２
燐酸合成酵素遺伝子の、実施例１で取得したＤＮＡより
３'側を含むＤＮＡ断片取得を行った。実施例１で取得
したＤＮＡ断片の内部配列に基づき作成したプライマー
Ｌ１Ｓ（配列表配列番号７）とＲＴ−ＰＣＲキット（Ｈ
ｉｇｈｆｉｄｅｌｉｔｙＲＮＡＰＣＲＫｉｔ、
宝酒造製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。そして得ら
れた約８５０ｂｐの断片をゲルより切り出してＤＮＡ抽
出キット（Ｓｅｐｈａｇｌａｓ（商標）ＢｒａｎｄＰ
ｒｅｐＫｉｔ、アマシャムファルマシアバイオテク社
製）を用いて精製した後、ＰＣＲ産物ダイレクトクロー
ニングキット（ｐＴ７ＢｌｕｅＴ−ＶｅｃｔｏｒＫｉ
ｔ、ＮＯＶＡＧＥＮ社製）を用いて大腸菌発現用ベクタ
ーにクローニングし、ｐＴ７−Ｌ２ＤＰＳを得た。ＤＮ
Ａ塩基配列をＤＮＡシークエンサー（３７７型、パーキ
ンエルマー社製）を用い、ＤＮＡシークエンスキット
（パーキンエルマー社製、ＡＢＩＰＲＩＳＭ（商標）
ＢｉｇＤｙｅ（商標）ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃ
ｌｅＳｅｑｕｅｎｃｅＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏ
ｎＫｉｔＷｉｔｈＡｍｐｔｉＴａｑ（登録商標）
ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＦＳ）を使用して、
その取り扱い説明書に従って反応を行い配列を決定し
た。

【００３４】（実施例４）Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕ
ｍｓｃｏｔｉｉＩＦＯ１２１２のデカプレニル２
燐酸合成酵素遺伝子の、実施例１で取得したＤＮＡより
５'側を含むＤＮＡ断片取得を行った。実施例２で調製
したｍＲＮＡを鋳型にして、実施例３で取得したＤＮＡ
断片の内部配列を基に作成したプライマーＬ７ＡＳＰ
（配列表配列番号８ “５'側リン酸化修飾”）を用
い、５'-ＦｕｌｌＲＡＣＥＣｏｒｅＳｅｔ（宝酒造
製）を用いて逆転写反応を行い、実施例３で取得した断
片の一部を含む該遺伝子の５'領域のｃＤＮＡを合成さ
せた。さらに同キットを用いてｃＤＮＡを環化させた。
この環化ｃＤＮＡを鋳型にして、実施例３で既知部分の
配列を基に作成したプライマーＬ５Ｓ（配列表配列番号
９）及びプライマーＬ４ＡＳ（配列表配列番号１０）で
ＰＣＲを行った。さらにこのＰＣＲ反応物に対して、プ
ライマーＬ６Ｓ（配列表配列番号１１）とプライマーＬ
３ＡＳ（配列表配列番号１２）でＰＣＲを行い約９５０
ｂｐの断片を取得した。そして得られた約９５０ｂｐの
断片をゲルより切り出してＤＮＡ抽出キット（Ｓｅｐｈ
ａｇｌａｓ（商標）ＢｒａｎｄＰｒｅｐＫｉｔ、ア
マシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて精製し
た後、ＰＣＲ産物ダイレクトクローニングキット（ｐＴ
７ＢｌｕｅＴ−ＶｅｃｔｏｒＫｉｔ、ＮＯＶＡＧＥＮ社
製）を用いて大腸菌発現用ベクターにクローニングし、
ｐＴ７−Ｌ３ＤＰＳを得た。ＤＮＡ塩基配列をＤＮＡシ
ークエンサー（３７７型、パーキンエルマー社製）を用
い、ＤＮＡシークエンスキット（パーキンエルマー社
製、ＡＢＩＰＲＩＳＭ（商標）ＢｉｇＤｙｅ（商
標）ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅ
ｎｃｅＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔＷｉ
ｔｈＡｍｐｔｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡｐｏｌ
ｙｍｅｒａｓｅ、ＦＳ）を使用して、その取り扱い説明
書に従って反応を行い配列を決定した。

【００３５】（実施例５）Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕ
ｍｓｃｏｔｉｉＩＦＯ１２１２のデカプレニル２
リン酸合成酵素遺伝子の全長を得るため、ｐＴ７−Ｌ
３ＤＰＳを鋳型にして、該遺伝子の５'末端の配列を基
に作成したプライマーＬＮ１−２（配列表配列番号１
３）と前記のプライマーＬ３ＡＳ（配列表配列番号１
２）でＰＣＲを行い５'末端側約７００ｂｐの断片を取
得した。またｐＴ７−Ｌ２ＤＰＳを鋳型にして、前記
のプライマーＬ１Ｓ（配列表配列番号７）と該遺伝子の
３'末端の配列を基に作成したプライマーＬＣＨ（配列
表配列番号１４）でＰＣＲを行い３'末端側約７７０ｂ
ｐの断片を取得した。両断片を混合して変性後徐冷して
アニーリングさせＤＮＡポリメラーゼで二本鎖を合成さ
せた。そして、これを鋳型にしてプライマーＬＮ１−２
とプライマーＬＣＨでＰＣＲを行い該遺伝子の全長を含
むＤＮＡを取得した。ＤＮＡシークエンサー（３７７
型、パーキンエルマー社製）を用い、ＤＮＡシークエン
スキット（パーキンエルマー社製、ＡＢＩＰＲＩＳＭ
（商標）ＢｉｇＤｙｅ（商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ
ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｅＲｅａｄｙＲｅａｃ
ｔｉｏｎＫｉｔＷｉｔｈＡｍｐｔｉＴａｑ（登録
商標）ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＦＳ）を使用
して、その取り扱い説明書に従って塩基配列を決定し、
ＬｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｓｃｏｔｉｉＩＦ
Ｏ１２１２のデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子の全
配列を明らかにすることができた。約１. ５ｋｂｐのＤ
ＮＡについてその塩基配列を決定したが、その結果を配
列表の配列番号１に示す。また、この塩基配列から予測
されるアミノ酸配列を配列番号３に示した。

【００３６】（実施例６）実施例５で得られたＤＮＡを
制限酵素ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断した後、発
現用ベクターｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４/ ０３６１３に記
載）に挿入してデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子の発
現ベクター、ｐＮＴＬ１を作製した。得られた発現ベク
ター、ｐＮＴＬ１の制限酵素地図を図１に示す。なお、
ＤＰＳとは、デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子のコー
ド領域を意味する。

【００３７】（実施例７）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｃ
ｌａｖａｔｕｓＪＣＭ１７１８のデカプレニル２燐
酸合成酵素遺伝子の、実施例１で取得したＤＮＡ断片よ
り３'側を含むＤＮＡ断片の取得を行った。実施例１で
取得したＤＮＡ断片の内部配列に基づき作成したプライ
マーＡ１Ｓ（配列表配列番号１５）とＲＴ−ＰＣＲキッ
ト（ＨｉｇｈｆｉｄｅｌｉｔｙＲＮＡＰＣＲＫ
ｉｔ、宝酒造製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。そし
て得られた約８５０ｂｐの断片をゲルより切り出してＤ
ＮＡ抽出キット（Ｓｅｐｈａｇｌａｓ（商標）Ｂｒａ
ｎｄＰｒｅｐＫｉｔ、アマシャムファルマシアバイオ
テク社製）を用いて精製した後、ＰＣＲ産物ダイレクト
クローニングキット（ｐＴ７ＢｌｕｅＴ−Ｖｅｃｔｏｒ
Ｋｉｔ、ＮＯＶＡＧＥＮ社製）を用いて大腸菌発現用
ベクターにクローニングし、ｐＴ７−Ａ２ＤＰＳを得
た。ＤＮＡ塩基配列をＤＮＡシークエンサー（３７７
型、パーキンエルマー社製）を用い、ＤＮＡシークエン
スキット（パーキンエルマー社製、ＡＢＩＰＲＩＳＭ
（商標）ＢｉｇＤｙｅ（商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ
ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｅＲｅａｄｙＲｅａｃ
ｔｉｏｎＫｉｔＷｉｔｈＡｍｐｔｉＴａｑ（登録
商標）ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＦＳ）を使用
して、その取り扱い説明書に従って反応を行い配列を決
定した。

【００３８】（実施例８）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｃ
ｌａｖａｔｕｓＪＣＭ１７１８のデカプレニル２燐
酸合成酵素遺伝子の、実施例１で取得したＤＮＡ断片よ
り５'側を含むＤＮＡ断片の取得を行った。実施例２で
調製したｍＲＮＡを鋳型にして、実施例７で取得したＤ
ＮＡ断片の内部配列を基に作成したプライマーＡ７ＡＳ
Ｐ（配列表配列番号１６“５'側リン酸化修飾”）を用
い、５'-ＦｕｌｌＲＡＣＥＣｏｒｅＳｅｔ（宝酒
造製）を用いて逆転写反応を行い、実施例７で取得した
断片の一部を含む該遺伝子の５'領域のｃＤＮＡを合成
させた。さらに同キットを用いてｃＤＮＡを環化させ
た。この環化ｃＤＮＡを鋳型にして、実施例３で既知部
分の配列を基に作成したプライマーＡ５Ｓ（配列表配列
番号１７）及びプライマーＡ２ＡＳ（配列表配列番号１
８）でＰＣＲを行った。さらにこのＰＣＲ反応物に対し
て、プライマーＡ６Ｓ（配列表配列番号１９）とプライ
マーＡ３ＡＳ（配列表配列番号２０）でＰＣＲを行い約
８５０ｂｐの断片を取得した。得られた断片をゲルより
切り出してＤＮＡ抽出キット（Ｓｅｐｈａｇｌａｓ（商
標）ＢｒａｎｄＰｒｅｐＫｉｔ、アマシャムファル
マシアバイオテク社製）を用いて精製した後、ＰＣＲ産
物ダイレクトクローニングキット（ｐＴ７ＢｌｕｅＴ−
ＶｅｃｔｏｒＫｉｔ、ＮＯＶＡＧＥＮ社製）を用いて
大腸菌発現用ベクターにクローニングし、ｐＴ７−Ａ３
ＤＰＳを得た。ＤＮＡ塩基配列をＤＮＡシークエンサー
（３７７型、パーキンエルマー社製）を用い、ＤＮＡシ
ークエンスキット（パーキンエルマー社製、ＡＢＩＰＲ
ＩＳＭ（商標）ＢｉｇＤｙｅ（商標）Ｔｅｒｍｉｎａ
ｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｅＲｅａｄｙ
ＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔＷｉｔｈＡｍｐｔｉＴａ
ｑ（登録商標）ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｆ
Ｓ）を使用して、その取り扱い説明書に従って反応を行
い配列を決定した。

【００３９】（実施例９）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｃ
ｌａｖａｔｕｓＪＣＭ１７１８のデカプレニル２リ
ン酸合成酵素遺伝子の全長を得るため、ｐＴ７−Ａ３
ＤＰＳを鋳型にして、該遺伝子の５'末端の配列を基に
作成したプライマーＡＮ２（配列表配列番号２１）と前
記のプライマーＡ３ＡＳ（配列表配列番号２０）でＰＣ
Ｒを行い５'末端側約７００ｂｐの断片を取得し、ま
た、ｐＴ７−Ｌ２ＤＰＳを鋳型にして、前記のプライマ
ーＡ１Ｓ（配列表配列番号１５）と該遺伝子の３'末端
の配列を基に作成したプライマーＡＣＨ（配列表配列番
号２２）でＰＣＲを行い３'末端側約７７０ｂｐの断片
を取得した。両フラグメント混合して変性後徐冷してア
ニーリングさせＤＮＡポリメラーゼで二本鎖を合成させ
た。そして、これを鋳型にしてプライマーＡＮ２とプラ
イマーＡＣＨでＰＣＲを行い取得した。ＤＮＡシークエ
ンサー（３７７型、パーキンエルマー社製）を用い、Ｄ
ＮＡシークエンスキット（パーキンエルマー社製、ＡＢ
ＩＰＲＩＳＭ（商標）ＢｉｇＤｙｅ（商標）Ｔｅｒ
ｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｅＲｅ
ａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔＷｉｔｈＡｍｐｔ
ｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓ
ｅ、ＦＳ）を使用して、その取り扱い説明書に従って反
応を行い塩基配列を決定し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｃｌａｖａｔｕｓＪＣＭ１７１８のデカプレニル２
燐酸合成酵素遺伝子の全配列を明らかにすることができ
た。約１. ４ｋｂｐのＤＮＡについてその塩基配列を決
定したが、その結果を配列表の配列番号２に示す。ま
た、このＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列を配列
番号４に示した。

【００４０】（実施例１０）実施例９で得られたＤＮＡ
を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断した
後、発現用ベクターｐＵＣ１８に挿入してデカプレニル
２燐酸合成酵素遺伝子の発現ベクターｐＵＣＡ１を作製
した。得られた発現ベクター、ｐＵＣＡ１の制限酵素地
図を図２に示す。なお、ＤＰＳとは、デカプレニル２燐
酸合成酵素遺伝子のコード領域を意味する。

【００４１】（実施例１１）デカプレニル２燐酸合成酵
素遺伝子の発現ベクターｐＮＴＬ１を大腸菌ＤＨ５α
に、ｐＵＣＡ１をＪＭ１０９に導入し、組換え大腸菌
Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＮＴＬ１）及びＥ．ｃｏｌ
ｉＪＭ１０９（ｐＵＣＡ１）を作製した。それぞれの
組換え大腸菌を１０ｍＬのＬＢ培地で３７℃、一晩振と
う培養し、菌を遠心分離（３０００回転、２０分間）で
集めた。菌体を１ｍＬの３％硫酸水溶液に懸濁し、１２
０℃、３０分間熱処理後、２ｍＬの１４％水酸化ナトリ
ウム水溶液を添加して更に１２０℃、１５分間熱処理し
た。この処理液に３ｍＬのヘキサン・イソプロパノール
（１０：２）を添加して抽出し、遠心分離の後、その有
機溶媒層１. ５ｍＬを分離し、減圧条件で溶媒を蒸発さ
せて乾固した。これを２００μＬのエタノールに溶解
し、その２０μＬを高速液体クロマトグラフィー（島津
製作所製、ＬＣ−１０Ａ）により分析した。分離には逆
相カラム（ＹＭＣ−ｐａｃｋＯＤＳ−Ａ、２５０×
４. ６ｍｍ、Ｓ−５μｍ、１２０Ａ）を用い、２７５ｎ
ｍの波長の吸光度で生成したコエンザイムＱ₁₀を検出し
た。Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＮＴＬ１）の結果（移
動相：メタノール／ヘキサン＝８５／１５で分析）を図
３に、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐＵＣＡ１）の結果
（移動相：エタノール／メタノール＝２／１で分析）を
図４に示した。図３，４に示すように、デカプレニル２
燐酸合成酵素遺伝子を導入して発現させることによっ
て、組換え大腸菌では、大腸菌が本来生産しないコエン
ザイムＱ₁₀を、生産するようになった。得られた組換え
大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＮＴＬ１）（受託
番号ＦＥＲＭＢＰ−７３５３）とＥ．ｃｏｌｉＪ
Ｍ１０９（ｐＵＣＡ１）（受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７
３５２）は通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究
所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に平成１２年１
１月９日に寄託した。

【００４２】

【発明の効果】コエンザイムＱ₁₀の生合成に関するキー
酵素、デカプレニル２燐酸合成酵素をコードする遺伝子
をＬｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属及びＡｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ属の真菌より単離し、配列決定を行った。ま
た、これを大腸菌に導入して発現させることに成功し
た。さらに遺伝子配列を改良することにより著量生産に
成功した。本発明の方法を用いることにより医薬品等と
して用いられているコエンザイムＱ₁₀を効率的に製造す
ることができる。

【００４３】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 鐘淵化学工業株式会社 <120> コエンザイムＱ１０の製造法 <130> TKS-4346 <160> 22 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1506 <212> DNA <213> Leucosporidium scottii <400> 1 atg tcg cgg aca ctg ccg ata tct cgc ttg aga gga cgt gca cgg cca 48 Met Ser Arg Thr Leu Pro Ile Ser Arg Leu Arg Gly Arg Ala Arg Pro 1 5 10 15 tct tcg agt cta cta cag ctc cca act gag ctg caa aag ctc tcc tcc 96 Ser Ser Ser Leu Leu Gln Leu Pro Thr Glu Leu Gln Lys Leu Ser Ser 20 25 30 tcc cca acc tca tcc ctc cgt cat gct tcc cct tcc cgc tcc gcc tgg 144 Ser Pro Thr Ser Ser Leu Arg His Ala Ser Pro Ser Arg Ser Ala Trp 35 40 45 act tca gcc atc ccc ggt ctc tcg tct gcc acc cca ttc gct tcg act 192 Thr Ser Ala Ile Pro Gly Leu Ser Ser Ala Thr Pro Phe Ala Ser Thr 50 55 60 tca acc tct tcc tcc ctc ctc gct ggc tca tcc aaa gta gcg ttg caa 240 Ser Thr Ser Ser Ser Leu Leu Ala Gly Ser Ser Lys Val Ala Leu Gln 65 70 75 80 gat ccc ctc aag ccg cta ggc gca gag atg ggc ttg ctg agg tcc aac 288 Asp Pro Leu Lys Pro Leu Gly Ala Glu Met Gly Leu Leu Arg Ser Asn 85 90 95 gtc cag cac ctc ctt ggt tca ggt cat cca gca ctg gat acc atc gcc 336 Val Gln His Leu Leu Gly Ser Gly His Pro Ala Leu Asp Thr Ile Ala 100 105 110 aag tac tac ttt caa gcc gaa ggg aag cat gtt cga ccg atg ctc atc 384 Lys Tyr Tyr Phe Gln Ala Glu Gly Lys His Val Arg Pro Met Leu Ile 115 120 125 ttg ctc atg agc caa gcg acg aat gga ctc gca ccc ggc tgg gaa cag 432 Leu Leu Met Ser Gln Ala Thr Asn Gly Leu Ala Pro Gly Trp Glu Gln 130 135 140 agg cgg gat caa gcg gca gca gcg gaa ctg aag agg gag caa ggc gac 480 Arg Arg Asp Gln Ala Ala Ala Ala Glu Leu Lys Arg Glu Gln Gly Asp 145 150 155 160 gaa gga tta gga ggg gac gat atc gac gaa cct cta agc cca cct tcc 528 Glu Gly Leu Gly Gly Asp Asp Ile Asp Glu Pro Leu Ser Pro Pro Ser 165 170 175 gtc ctc aac gac caa aac ccc tcg atg ctc gct tcg gcc aaa tcg ttc 576 Val Leu Asn Asp Gln Asn Pro Ser Met Leu Ala Ser Ala Lys Ser Phe 180 185 190 ttc tcc gac cct ctc gct tcg ctc cga ccc gct ccc act ccc act tcc 624 Phe Ser Asp Pro Leu Ala Ser Leu Arg Pro Ala Pro Thr Pro Thr Ser 195 200 205 atc gcc caa tca atc cat caa act cac ctc ctt ccc tcc caa cgt cgt 672 Ile Ala Gln Ser Ile His Gln Thr His Leu Leu Pro Ser Gln Arg Arg 210 215 220 ctc gcc gaa atc acc gaa atg att cac gtc gcc tcg ttg ctg cac gac 720 Leu Ala Glu Ile Thr Glu Met Ile His Val Ala Ser Leu Leu His Asp 225 230 235 240 gat gtt att gac ctc gca gag acg agg cga tcg gcc ccc tca gct cct 768 Asp Val Ile Asp Leu Ala Glu Thr Arg Arg Ser Ala Pro Ser Ala Pro 245 250 255 tcg ctc ttt ggc aac aag ctc tcc atc ctc gcg gga gat ttc ttg ctc 816 Ser Leu Phe Gly Asn Lys Leu Ser Ile Leu Ala Gly Asp Phe Leu Leu 260 265 270 gcc cga gct tcc ctc gct ctc tcg agg ttg ggg agc aat gag gta gtc 864 Ala Arg Ala Ser Leu Ala Leu Ser Arg Leu Gly Ser Asn Glu Val Val 275 280 285 gag ctc gtc gct tcc gtt ctc gcc aac ttg gtc gag ggg gag gtt atg 912 Glu Leu Val Ala Ser Val Leu Ala Asn Leu Val Glu Gly Glu Val Met 290 295 300 cag atg aag ggg aac gta ccg ggc aag gaa ggg ctg ttg gca ggg gca 960 Gln Met Lys Gly Asn Val Pro Gly Lys Glu Gly Leu Leu Ala Gly Ala 305 310 315 320 gga gga gga tca aca gcc aag gga ccg aca ccc gag atc ttc gac cac 1008 Gly Gly Gly Ser Thr Ala Lys Gly Pro Thr Pro Glu Ile Phe Asp His 325 330 335 tac atg aag aag acg tac ctc aag acg gcg agc ctg att gcc aaa agt 1056 Tyr Met Lys Lys Thr Tyr Leu Lys Thr Ala Ser Leu Ile Ala Lys Ser 340 345 350 acg agg gcg acg acg att cta ggt gga tgt gga gtc aag cag gga tgg 1104 Thr Arg Ala Thr Thr Ile Leu Gly Gly Cys Gly Val Lys Gln Gly Trp 355 360 365 gca gag gga gag aag gtc aag gat atc gcc tac tcg tat ggt cgt aac 1152 Ala Glu Gly Glu Lys Val Lys Asp Ile Ala Tyr Ser Tyr Gly Arg Asn 370 375 380 ttg ggc atc gcc ttc cag ctc gtg gac gac atg ctc gac ttt acg gca 1200 Leu Gly Ile Ala Phe Gln Leu Val Asp Asp Met Leu Asp Phe Thr Ala 385 390 395 400 tca gca gca caa ctc ggc aaa cca gga gga gga gcc gac ctc aaa ctc 1248 Ser Ala Ala Gln Leu Gly Lys Pro Gly Gly Gly Ala Asp Leu Lys Leu 405 410 415 ggt ctc gct acc gca cca gca ctc tac gcg tgg gag gaa ttc ccc gaa 1296 Gly Leu Ala Thr Ala Pro Ala Leu Tyr Ala Trp Glu Glu Phe Pro Glu 420 425 430 ttg ggg gcg atg att gag cgc aag ttt gct ggc gag gac gat gtc gag 1344 Leu Gly Ala Met Ile Glu Arg Lys Phe Ala Gly Glu Asp Asp Val Glu 435 440 445 cag gcc cga cac ctc atc tcg cgc tcc tcc ggg gcc gaa cga acg gcc 1392 Gln Ala Arg His Leu Ile Ser Arg Ser Ser Gly Ala Glu Arg Thr Ala 450 455 460 gct ctc gcc gcc gag cac tca aaa ttg gcg cgt caa gcg ctc gaa ggt 1440 Ala Leu Ala Ala Glu His Ser Lys Leu Ala Arg Gln Ala Leu Glu Gly 465 470 475 480 ctc ccc gat agc gag gcg agg aca gca ttg gat aac atg gcg agg gat 1488 Leu Pro Asp Ser Glu Ala Arg Thr Ala Leu Asp Asn Met Ala Arg Asp 485 490 495 aca ttg tcg agg aag aag 1506 Thr Leu Ser Arg Lys Lys 500 <210> 2 <211> 1353 <212> DNA <213> Aspergillus clavatus <400> 2 atg aga gct cga acg gtc tcg gcc tct ggc ctc att ctc tca tcg cga 48 Met Arg Ala Arg Thr Val Ser Ala Ser Gly Leu Ile Leu Ser Ser Arg 1 5 10 15 acg acg acc tcg acc tcg ata tgc tgg caa tgc ctt cgt gaa gat ctc 96 Thr Thr Thr Ser Thr Ser Ile Cys Trp Gln Cys Leu Arg Glu Asp Leu 20 25 30 ctc tca aat caa gtt caa atc cac gtt cga aaa tac cat ccc acc cgc 144 Leu Ser Asn Gln Val Gln Ile His Val Arg Lys Tyr His Pro Thr Arg 35 40 45 cgg aaa gat gtc tct ccc ttc ggt gcc gcc gtt tct gca gcg cag acc 192 Arg Lys Asp Val Ser Pro Phe Gly Ala Ala Val Ser Ala Ala Gln Thr 50 55 60 atc ttc aaa ggc ctg cca aag gct cct ccg ggg atc tcg gta gat cca 240 Ile Phe Lys Gly Leu Pro Lys Ala Pro Pro Gly Ile Ser Val Asp Pro 65 70 75 80 ttg agg atc gtg ggg aaa gag ctc aag ttt ttg acg aag aat ata cgc 288 Leu Arg Ile Val Gly Lys Glu Leu Lys Phe Leu Thr Lys Asn Ile Arg 85 90 95 caa ttg ctg ggt tcg ggc cac ccg act ctt gat aaa gtg gcc aaa tat 336 Gln Leu Leu Gly Ser Gly His Pro Thr Leu Asp Lys Val Ala Lys Tyr 100 105 110 tac acc cgc agc gag ggc aaa cat atg cgt ccg ctt ttg gtc ctg ctc 384 Tyr Thr Arg Ser Glu Gly Lys His Met Arg Pro Leu Leu Val Leu Leu 115 120 125 atg tca cag gcg acg gcg ttg act ccg cgg cag agt cgt tca aac ttc 432 Met Ser Gln Ala Thr Ala Leu Thr Pro Arg Gln Ser Arg Ser Asn Phe 130 135 140 acc cct tca cag atg gtc aat gat ccc att agc tcg cct tcc gtc ctc 480 Thr Pro Ser Gln Met Val Asn Asp Pro Ile Ser Ser Pro Ser Val Leu 145 150 155 160 gcc gat acg aac ccg gat ctc agc ccg ctt gtc tcg aaa tcg gcc gaa 528 Ala Asp Thr Asn Pro Asp Leu Ser Pro Leu Val Ser Lys Ser Ala Glu 165 170 175 gcg caa tat gat ttt gcg ggg gat gag aat acc ctg cct acg cag cgc 576 Ala Gln Tyr Asp Phe Ala Gly Asp Glu Asn Thr Leu Pro Thr Gln Arg 180 185 190 cga ctc gct gag atc acg gaa ttg atc cat acc gcc tcg ctc ctc cac 624 Arg Leu Ala Glu Ile Thr Glu Leu Ile His Thr Ala Ser Leu Leu His 195 200 205 gac gac gtg atc gac aac gct gtt act cgg agg tcg tct aac tcc gca 672 Asp Asp Val Ile Asp Asn Ala Val Thr Arg Arg Ser Ser Asn Ser Ala 210 215 220 aac ctc cag ttt gga aat aag atg gcc gtc ctg gcc gga gat ttc ctg 720 Asn Leu Gln Phe Gly Asn Lys Met Ala Val Leu Ala Gly Asp Phe Leu 225 230 235 240 ctc ggc cga gct tcc gtc gcc ctg gcg cgc ctg aga gac ccc gag gtc 768 Leu Gly Arg Ala Ser Val Ala Leu Ala Arg Leu Arg Asp Pro Glu Val 245 250 255 aca gaa ctg ctt gca act gtc att gcc aac ctg gtg gag gga gag ttc 816 Thr Glu Leu Leu Ala Thr Val Ile Ala Asn Leu Val Glu Gly Glu Phe 260 265 270 atg caa ttg aag aat acc gcc gcg gat gag aag aac ccc gtg ttc acc 864 Met Gln Leu Lys Asn Thr Ala Ala Asp Glu Lys Asn Pro Val Phe Thr 275 280 285 gac ggg acc atc tcg tac tac ttg caa aag acg tac ctc aag acc gcc 912 Asp Gly Thr Ile Ser Tyr Tyr Leu Gln Lys Thr Tyr Leu Lys Thr Ala 290 295 300 agt ctg atc agc aag tcg tgc cgt gca gcg gca ttg cta ggt ggc agt 960 Ser Leu Ile Ser Lys Ser Cys Arg Ala Ala Ala Leu Leu Gly Gly Ser 305 310 315 320 acg cct gag gtt gtc gat gct gct tat gcc tat gga cgc aac ctg ggc 1008 Thr Pro Glu Val Val Asp Ala Ala Tyr Ala Tyr Gly Arg Asn Leu Gly 325 330 335 ctg gca ttc cag ctg gtg gat gat ctg ctg gat tac acc gtg agt ggg 1056 Leu Ala Phe Gln Leu Val Asp Asp Leu Leu Asp Tyr Thr Val Ser Gly 340 345 350 gtt gag tta ggc aag cct gcc gga gcc gat ctg gag ctg ggt ctt gcg 1104 Val Glu Leu Gly Lys Pro Ala Gly Ala Asp Leu Glu Leu Gly Leu Ala 355 360 365 act gct ccg ctg ctc ttt gcc tgg aag cag aac cct gag ctg ggc ccc 1152 Thr Ala Pro Leu Leu Phe Ala Trp Lys Gln Asn Pro Glu Leu Gly Pro 370 375 380 ttg gtc ggt cgg aag ttc agc cga gag ggg gat gta caa atg gct cgt 1200 Leu Val Gly Arg Lys Phe Ser Arg Glu Gly Asp Val Gln Met Ala Arg 385 390 395 400 gaa ctg gtg tac aag agc gat ggc gtt gaa cag acc cgc gct ctg gcc 1248 Glu Leu Val Tyr Lys Ser Asp Gly Val Glu Gln Thr Arg Ala Leu Ala 405 410 415 cag gag tac gcc gac aag gcc att acc gcc gtc agc aac ttc cct gac 1296 Gln Glu Tyr Ala Asp Lys Ala Ile Thr Ala Val Ser Asn Phe Pro Asp 420 425 430 agt gaa gcc aag gct ggt ctc atc caa atg tgc gag aaa gcc atg aac 1344 Ser Glu Ala Lys Ala Gly Leu Ile Gln Met Cys Glu Lys Ala Met Asn 435 440 445 cgg aga aag 1353 Arg Arg Lys 450 <210> 3 <211> 502 <212> PRT <213> Leucosporidium scottii <400> 3 Met Ser Arg Thr Leu Pro Ile Ser Arg Leu Arg Gly Arg Ala Arg Pro 1 5 10 15 Ser Ser Ser Leu Leu Gln Leu Pro Thr Glu Leu Gln Lys Leu Ser Ser 20 25 30 Ser Pro Thr Ser Ser Leu Arg His Ala Ser Pro Ser Arg Ser Ala Trp 35 40 45 Thr Ser Ala Ile Pro Gly Leu Ser Ser Ala Thr Pro Phe Ala Ser Thr 50 55 60 Ser Thr Ser Ser Ser Leu Leu Ala Gly Ser Ser Lys Val Ala Leu Gln 65 70 75 80 Asp Pro Leu Lys Pro Leu Gly Ala Glu Met Gly Leu Leu Arg Ser Asn 85 90 95 Val Gln His Leu Leu Gly Ser Gly His Pro Ala Leu Asp Thr Ile Ala 100 105 110 Lys Tyr Tyr Phe Gln Ala Glu Gly Lys His Val Arg Pro Met Leu Ile 115 120 125 Leu Leu Met Ser Gln Ala Thr Asn Gly Leu Ala Pro Gly Trp Glu Gln 130 135 140 Arg Arg Asp Gln Ala Ala Ala Ala Glu Leu Lys Arg Glu Gln Gly Asp 145 150 155 160 Glu Gly Leu Gly Gly Asp Asp Ile Asp Glu Pro Leu Ser Pro Pro Ser 165 170 175 Val Leu Asn Asp Gln Asn Pro Ser Met Leu Ala Ser Ala Lys Ser Phe 180 185 190 Phe Ser Asp Pro Leu Ala Ser Leu Arg Pro Ala Pro Thr Pro Thr Ser 195 200 205 Ile Ala Gln Ser Ile His Gln Thr His Leu Leu Pro Ser Gln Arg Arg 210 215 220 Leu Ala Glu Ile Thr Glu Met Ile His Val Ala Ser Leu Leu His Asp 225 230 235 240 Asp Val Ile Asp Leu Ala Glu Thr Arg Arg Ser Ala Pro Ser Ala Pro 245 250 255 Ser Leu Phe Gly Asn Lys Leu Ser Ile Leu Ala Gly Asp Phe Leu Leu 260 265 270 Ala Arg Ala Ser Leu Ala Leu Ser Arg Leu Gly Ser Asn Glu Val Val 275 280 285 Glu Leu Val Ala Ser Val Leu Ala Asn Leu Val Glu Gly Glu Val Met 290 295 300 Gln Met Lys Gly Asn Val Pro Gly Lys Glu Gly Leu Leu Ala Gly Ala 305 310 315 320 Gly Gly Gly Ser Thr Ala Lys Gly Pro Thr Pro Glu Ile Phe Asp His 325 330 335 Tyr Met Lys Lys Thr Tyr Leu Lys Thr Ala Ser Leu Ile Ala Lys Ser 340 345 350 Thr Arg Ala Thr Thr Ile Leu Gly Gly Cys Gly Val Lys Gln Gly Trp 355 360 365 Ala Glu Gly Glu Lys Val Lys Asp Ile Ala Tyr Ser Tyr Gly Arg Asn 370 375 380 Leu Gly Ile Ala Phe Gln Leu Val Asp Asp Met Leu Asp Phe Thr Ala 385 390 395 400 Ser Ala Ala Gln Leu Gly Lys Pro Gly Gly Gly Ala Asp Leu Lys Leu 405 410 415 Gly Leu Ala Thr Ala Pro Ala Leu Tyr Ala Trp Glu Glu Phe Pro Glu 420 425 430 Leu Gly Ala Met Ile Glu Arg Lys Phe Ala Gly Glu Asp Asp Val Glu 435 440 445 Gln Ala Arg His Leu Ile Ser Arg Ser Ser Gly Ala Glu Arg Thr Ala 450 455 460 Ala Leu Ala Ala Glu His Ser Lys Leu Ala Arg Gln Ala Leu Glu Gly 465 470 475 480 Leu Pro Asp Ser Glu Ala Arg Thr Ala Leu Asp Asn Met Ala Arg Asp 485 490 495 Thr Leu Ser Arg Lys Lys 500 <210> 4 <211> 451 <212> PRT <213> Aspergillus clavatus <400> 4 Met Arg Ala Arg Thr Val Ser Ala Ser Gly Leu Ile Leu Ser Ser Arg 1 5 10 15 Thr Thr Thr Ser Thr Ser Ile Cys Trp Gln Cys Leu Arg Glu Asp Leu 20 25 30 Leu Ser Asn Gln Val Gln Ile His Val Arg Lys Tyr His Pro Thr Arg 35 40 45 Arg Lys Asp Val Ser Pro Phe Gly Ala Ala Val Ser Ala Ala Gln Thr 50 55 60 Ile Phe Lys Gly Leu Pro Lys Ala Pro Pro Gly Ile Ser Val Asp Pro 65 70 75 80 Leu Arg Ile Val Gly Lys Glu Leu Lys Phe Leu Thr Lys Asn Ile Arg 85 90 95 Gln Leu Leu Gly Ser Gly His Pro Thr Leu Asp Lys Val Ala Lys Tyr 100 105 110 Tyr Thr Arg Ser Glu Gly Lys His Met Arg Pro Leu Leu Val Leu Leu 115 120 125 Met Ser Gln Ala Thr Ala Leu Thr Pro Arg Gln Ser Arg Ser Asn Phe 130 135 140 Thr Pro Ser Gln Met Val Asn Asp Pro Ile Ser Ser Pro Ser Val Leu 145 150 155 160 Ala Asp Thr Asn Pro Asp Leu Ser Pro Leu Val Ser Lys Ser Ala Glu 165 170 175 Ala Gln Tyr Asp Phe Ala Gly Asp Glu Asn Thr Leu Pro Thr Gln Arg 180 185 190 Arg Leu Ala Glu Ile Thr Glu Leu Ile His Thr Ala Ser Leu Leu His 195 200 205 Asp Asp Val Ile Asp Asn Ala Val Thr Arg Arg Ser Ser Asn Ser Ala 210 215 220 Asn Leu Gln Phe Gly Asn Lys Met Ala Val Leu Ala Gly Asp Phe Leu 225 230 235 240 Leu Gly Arg Ala Ser Val Ala Leu Ala Arg Leu Arg Asp Pro Glu Val 245 250 255 Thr Glu Leu Leu Ala Thr Val Ile Ala Asn Leu Val Glu Gly Glu Phe 260 265 270 Met Gln Leu Lys Asn Thr Ala Ala Asp Glu Lys Asn Pro Val Phe Thr 275 280 285 Asp Gly Thr Ile Ser Tyr Tyr Leu Gln Lys Thr Tyr Leu Lys Thr Ala 290 295 300 Ser Leu Ile Ser Lys Ser Cys Arg Ala Ala Ala Leu Leu Gly Gly Ser 305 310 315 320 Thr Pro Glu Val Val Asp Ala Ala Tyr Ala Tyr Gly Arg Asn Leu Gly 325 330 335 Leu Ala Phe Gln Leu Val Asp Asp Leu Leu Asp Tyr Thr Val Ser Gly 340 345 350 Val Glu Leu Gly Lys Pro Ala Gly Ala Asp Leu Glu Leu Gly Leu Ala 355 360 365 Thr Ala Pro Leu Leu Phe Ala Trp Lys Gln Asn Pro Glu Leu Gly Pro 370 375 380 Leu Val Gly Arg Lys Phe Ser Arg Glu Gly Asp Val Gln Met Ala Arg 385 390 395 400 Glu Leu Val Tyr Lys Ser Asp Gly Val Glu Gln Thr Arg Ala Leu Ala 405 410 415 Gln Glu Tyr Ala Asp Lys Ala Ile Thr Ala Val Ser Asn Phe Pro Asp 420 425 430 Ser Glu Ala Lys Ala Gly Leu Ile Gln Met Cys Glu Lys Ala Met Asn 435 440 445 Arg Arg Lys 450 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:プライマー DPS-1 <400> 5 aaggatcctn ytncaygayg aygt 24 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:プライマー DPS-1 1AS <400> 6 arytgnadra aytcncc 17 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:プライマー L1S <400> 7 gcagagacga ggcgatcggc c 21 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:プライマー L7ASP <400> 8 ggcctgctcg acatc 15 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:プライマー L5S <400> 9 tgggcagagg gagagaaggt c 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:プライマー L4AS <400> 10 gttggcgaga acggaagcga c 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:プライマー L6S <400> 11 gcaccagcac tctacgcgtg g 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:プライマー L3AS <400> 12 gttgccaaag agcgaaggag c 21 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:プライマー LN1-2 <400> 13 ttgcttctct cgcatatgtc gcggacactg ccg 33 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:プライマー LCH <400> 14 acaagcttct acttcttcct cgacaatgt 29 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:プライマー A1S <400> 15 gttactcgga ggtcgtctaa c 21 <210> 16 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:プライマー A7ASP <400> 16 caccagttca cgagc 15 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:プライマー A5S <400> 17 gttgtcgatg ctgcttatgc c 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:プライマー A2AS <400> 18 aatgacagtt gcaagcagtt c 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:プライマー A6S <400> 19 gcctggaagc agaaccctga g 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:プライマー A3AS <400> 20 caggacggcc atcttatttc c 21 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:プライマー AN2 <400> 21 aaggatccga tgagagctcg aacggtctcg gcc 33 <210> 22 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:プライマー ACH <400> 22 acaagcttct actttctccg gttcatggc 29

【図面の簡単な説明】

【図１】発現ベクターｐＮＴＬ１の制限酵素地図。

【図２】発現ベクターｐＵＣＡ１の制限酵素地図。

【図３】組換え大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＮＴ
Ｌ１）による補酵素Ｑ１０生産を示すＨＰＬＣチャー
ト。

【図４】組換え大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐＵ
ＣＡ１）による補酵素Ｑ１０生産を示すＨＰＬＣチャー
ト。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/12 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 7/66 Ｃ１２Ｒ 1:19） //(Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｐ 7/66 ＡＣ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 7/66 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:19） 5/00 ＡＦターム(参考） 4B024 AA01 BA07 CA04 DA06 EA04 GA11 HA01 4B050 CC03 DD03 DD04 FF06E LL01 4B064 AD92 CA02 CA19 CC24 DA01 4B065 AA26X AA60Y AA72Y AB01 BA02 CA09 CA44

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮ
Ａ：（ａ）塩基配列が配列番号１に記載のものであるＤＮ
Ａ：（ｂ）配列番号１に示す塩基配列において１若しくは数
個の塩基が欠失、追加、挿入及び／又は置換された塩基
配列を有し、かつデカプレニル２燐酸合成酵素活性を有
するタンパク質をコードするＤＮＡ：（ｃ）配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡとスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつデカプ
レニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコード
するＤＮＡ。
【請求項２】以下の（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のＤＮ
Ａ：（ｄ）塩基配列が配列番号２に記載のものであるＤＮ
Ａ：（ｅ）配列番号２に示す塩基配列において１若しくは数
個の塩基が欠失、追加、挿入及び／又は置換された塩基
配列を有し、かつデカプレニル２燐酸合成酵素活性を有
するタンパク質をコードするＤＮＡ：（ｆ）配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡとスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつデカプ
レニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコード
するＤＮＡ。
【請求項３】以下の（ｇ）又は（ｈ）のタンパク質：（ｇ）アミノ酸配列が配列番号３に記載のものであるタ
ンパク質：（ｈ）配列番号３に示すアミノ酸配列において１若しく
は数個のアミノ酸が欠失、追加、挿入及び／又は置換さ
れたアミノ酸配列からなり、かつデカプレニル２燐酸合
成酵素活性を有するタンパク質。
【請求項４】以下の（ｉ）又は（ｊ）のタンパク質：（ｉ）アミノ酸配列が配列番号４に記載のものであるタ
ンパク質：（ｊ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１若しく
は数個のアミノ酸が欠失、追加、挿入及び／又は置換さ
れたアミノ酸配列からなり、かつデカプレニル２燐酸合
成酵素活性を有するタンパク質。
【請求項５】請求項３記載のタンパク質をコードする
ＤＮＡ。
【請求項６】請求項４記載のタンパク質をコードする
ＤＮＡ。
【請求項７】発現用ベクターに請求項１又は５記載の
ＤＮＡを組み込んでなる発現ベクター。
【請求項８】発現用ベクターに請求項２又は６記載の
ＤＮＡを組み込んでなる発現ベクター。
【請求項９】発現用ベクターは、ｐＵＣＮＴである請
求項７記載の発現ベクター。
【請求項１０】発現用ベクターは、ｐＵＣ１８である
請求項８記載の発現ベクター。
【請求項１１】発現ベクターは、ｐＮＴＬ１である請
求項９記載の発現ベクター。
【請求項１２】発現ベクターは、ｐＵＣＡ１である請
求項１０記載の発現ベクター。
【請求項１３】宿主微生物を請求項１、２、５又は６
記載のＤＮＡにて形質転換してなる形質転換体。
【請求項１４】宿主微生物を請求項７、８、９、１
０、１１又は１２記載の発現ベクターにて形質転換して
なる形質転換体。
【請求項１５】宿主微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａｃｏｌｉである請求項１３又は１４記載の形質転換
体。
【請求項１６】Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
は、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＨ５αまた
はＪＭ１０９である請求項１５記載の形質転換体。
【請求項１７】形質転換体は、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５
α（ｐＮＴＬ１）（ＦＲＰＭＢＰ−７３５３）である
請求項１６記載の形質転換体。
【請求項１８】形質転換体は、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１
０９（ｐＵＣＡ１）（ＦＲＰＭＢＰ−７３５２）であ
る請求項１６記載の形質転換体。
【請求項１９】請求項１１、１２、１３、１４、１
５、１６、１７又は１８記載の形質転換体を培地中で培
養し、培養物中にコエンザイムＱ₁₀を生成蓄積し、これ
を採取することを特徴とするコエンザイムＱ₁₀の製造方
法。