JP4271948B2

JP4271948B2 - 長鎖プレニル２燐酸合成酵素の発現方法

Info

Publication number: JP4271948B2
Application number: JP2002589678A
Authority: JP
Inventors: 英幸松田; 誠川向; 麗嘉矢島
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2001-05-11
Filing date: 2002-05-10
Publication date: 2009-06-03
Anticipated expiration: 2022-05-10
Also published as: EP1386964A1; US8163525B2; WO2002092811A1; CA2444977A1; US20090130727A1; US7402413B2; NO20034994D0; JPWO2002092811A1; EP1386964A4; CZ20033381A3; US20040137567A1

Description

技術分野
本発明は、真核生物由来の長鎖プレニル２燐酸合成酵素の発現に関与するタンパク質、該酵素をコードする遺伝子、該酵素遺伝子を含むベクター、該ベクターと長鎖プレニル２燐酸合成酵素遺伝子を含む発現ベクターとによって形質転換された形質転換体、並びに、長鎖プレニル２燐酸合成酵素（なかでもデカプレニル２燐酸合成酵素、ソラネシル２燐酸合成酵素）及び長鎖イソプレノイドを側鎖に有するコエンザイムＱ（なかでもコエンザイムＱ_９、コエンザイムＱ_１０）の製造方法に関する。
背景技術
イソプレノイドは多様な化合物群の総称であり、ステロール、カロチノイド、テルペン等が含まれる。この一群にコエンザイムＱの側鎖を含むプレニル２燐酸化合物群があり、その合成は炭素数５のイソプレン単位であるイソペンテニル２燐酸のプレニル２燐酸合成酵素による重合的縮合反応により決定される。
それぞれのプレニル２燐酸合成酵素は大きく４種類に分類される。
イソプレン単位３−４個の短鎖プレニル２燐酸合成酵素は、ホモダイマーとして触媒機能を有していることが知られている。例えば、ファルネシル２燐酸合成酵素（Ｅｂｅｒｔｈａｒｄｔ．Ｎ．Ｌ．，（１９７５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０，８６３−８６６）、ゲラニルゲラニル２燐酸合成酵素（Ｓａｇａｍｉ．Ｈ．，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２０５６１−２０５６６）等がそうである。
また、イソプレン単位６−７個の中鎖プレニル２燐酸合成酵素は、互いに単独では触媒活性を持たない２種類のタンパク質より形成されるヘテロ２量体の酵素であることが知られている。例えば、ヘキサプレニル２燐酸合成酵素（Ｆｕｊｉｉ．Ｈ．，（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７，１４６１０）、ヘプタプレニル２燐酸合成酵素（Ｔａｋａｈａｓｈｉ．Ｉ．，（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５，４５３９）がそうである。
さらに、イソプレン単位８−１０個の長鎖プレニル２燐酸合成酵素については、原核生物由来の酵素は、非解離性のホモダイマーでポリプレニル２燐酸キャリアータンパク質により活性化される（Ｏｈｎｕｍａ，Ｓ．，（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，２３７０６−２３７１３）との報告がなされている。しかしながら、真核生物由来の長鎖プレニル２燐酸合成酵素については、現在のところ報告はない。
また、コエンザイムＱは、キノン骨格とイソプレノイド側鎖から成り、細菌や酵母等の微生物から高等動植物に至るきわめて幅広い生物に広く存在する。原核生物では原形質膜に存在し、細胞膜の安定化やペリプラズマ膜タンパク質のジスルフィド結合形成の電子受容体として機能し、真核生物ではミトコンドリア膜や細胞質膜に存在し、ミトコンドリアの呼吸鎖の電子伝達系及び酸化的燐酸化の必須因子として、また抗酸化剤としての機能や生体膜の安定化に寄与している。
このうちイソプレン単位が８−１０個縮合したイソプレノイド側鎖を有するコエンザイムＱは、健康食品等の素材として注目されている。なかでも、イソプレン単位が１０個であるコエンザイムＱ_１０は、ヒトが本来有するものであることから特に有用であり、心臓薬としても使用されている。
このコエンザイムＱ_１０の製造法は、タバコ等の植物由来のコエンザイムＱを単離して、その側鎖長を合成法により調整する等によって工業的には生産されている。
また、コエンザイムＱ_１０は、細菌や酵母等の微生物から高等動植物に至るきわめて幅広い生物により生産されることが知られているが、微生物を培養してその菌体より本物質を抽出する方法が最も有効な一つの製造法であると考えられ、実際の工業的な生産にも用いられている。しかしながら、これらの方法では、生成量が少なかったり操作が煩雑であったりする等、その生産性は良好とは言い難い。
また、コエンザイムＱ_１０の生合成に関わる遺伝子を単離し、遺伝子組換え技術により当該遺伝子を増幅し、コエンザイムＱ_１０の生産増強に利用する試みもなされている。生体内において、コエンザイムＱ_１０は、多くの酵素が関与した多段階の複雑な反応によって生成されている。その生合成経路は、原核生物と真核生物では一部異なっているが、いずれも基本的には大きく３つのステップ、すなわち、コエンザイムＱ_１０のデカプレニル側鎖のもとになるデカプレニル２燐酸を合成するステップ、キノン環のもとになるパラヒドロキシ安息香酸を合成するステップ、そして、これらの２つの化合物を結合させて置換基を順次変換してコエンザイムＱ_１０を完成させるステップよりなっている。これらの反応の中で、生合成反応全体の律速であると言われ、コエンザイムＱ_１０の側鎖の長さを決定している反応、すなわちデカプレニル２燐酸合成酵素の反応は最も重要な反応であると考えられる。
コエンザイムＱ_１０を効率よく生産させる為には、生合成のキー遺伝子であるデカプレニル２燐酸合成酵素の遺伝子を単離して生産増強に利用することが有効であると考えられ、これまでにＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ（特開平９−１７３０７６）やＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ（特開平１０−５７０７２）等いくつかの種類の微生物より、デカプレニル２燐酸合成酵素の遺伝子が分離されて、コエンザイムＱ_１０生産に用いる研究がなされている。このコエンザイムＱ_１０生産の宿主微生物としては、生産性、安全性、組換え系の整備等から大腸菌等の原核生物を用いることが望まれる。
また、デカプレニル２燐酸合成酵素の遺伝子源としては、コエンザイムＱ_１０を比較的多量に生産している真核生物も利用可能で、例えば真菌類が有力な候補となる。しかし、真菌類に属するデカプレニル２燐酸合成酵素を、大腸菌等の原核生物に属する微生物に組み換えたときに、コエンザイムＱ_１０を生成しないか、又は、十分な量の生成を見なかった。この原因としては、長鎖プレニル２燐酸合成酵素の発現が十分でないためと考えられている。従って、コエンザイムＱ_１０を比較的多量に生産している真菌類由来のデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子を、原核生物で効率的に発現させる方法の開発が望まれていた。
発明の要約
本発明は、真核生物由来の長鎖プレニル２燐酸合成酵素の発現に関与するタンパク質、該酵素をコードする遺伝子、該酵素遺伝子を含むベクター、該ベクターと長鎖プレニル２燐酸合成酵素遺伝子を含む発現ベクターとによって形質転換された形質転換体、並びに、長鎖プレニル２燐酸合成酵素（なかでもデカプレニル２燐酸合成酵素、ソラネシル２燐酸合成酵素）及び長鎖イソプレノイドを側鎖に有するコエンザイムＱ（なかでもコエンザイムＱ_９、コエンザイムＱ_１０）の製造方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、長鎖のプレニル２燐酸合成酵素を生合成している真核生物群には、２種類の形態のプレニル２燐酸合成酵素が存在していると予想し、原核生物である大腸菌で遺伝子組み換え発現が確認されたＳａｉｔｏｅｌｌａ属のような酵素ではホモ型で発現し、大腸菌で遺伝子組み換え発現が確認できないＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属のような酵素ではヘテロ型で発現するのではないかと考えた。すなわち、これら遺伝子組み換え非発現長鎖プレニル２燐酸合成酵素遺伝子の発現にかかわる別の遺伝子が存在し、それと協同することによって長鎖プレニル２燐酸合成酵素遺伝子が発現されるため、大腸菌のような原核生物の宿主に、長鎖プレニル２燐酸合成酵素遺伝子のみを形質転換するだけでは、十分な活性が得られないと考えた。
そこで、真核生物の長鎖プレニル２燐酸合成酵素遺伝子の活性発現に関わる遺伝子を単離するための検討を重ね、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の微生物、高等動物のマウス及びヒトから、真核生物由来の長鎖プレニル２燐酸合成酵素遺伝子の大腸菌での発現を増強する遺伝子を単離することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡに関する。
（ａ）配列番号１，３又は５に示す塩基配列を有し、かつ真核生物由来の長鎖プレニル２燐酸合成酵素の宿主微生物での活性発現を可能とする或いは増強するタンパク質をコードするＤＮＡ：
（ｂ）配列番号１，３又は５に示す塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、追加、挿入及び／又は置換された塩基配列を有し、かつ真核生物由来の長鎖プレニル２燐酸合成酵素の宿主微生物での活性発現を可能とする或いは増強するタンパク質をコードするＤＮＡ：
（ｃ）配列番号１，３又は５に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ真核生物由来の長鎖プレニル２燐酸合成酵素の宿主微生物での活性発現を可能とする或いは増強するタンパク質をコードするＤＮＡ。
また、本発明は、以下の（ｄ）又は（ｅ）のタンパク質に関する。
（ｄ）配列番号２，４又は６に示すアミノ酸配列を有し、かつ真核生物由来の長鎖プレニル２燐酸合成酵素の宿主微生物での活性発現を可能とする或いは増強するタンパク質：
（ｅ）配列番号２，４又は６に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、追加、挿入及び／又は置換されたアミノ酸配列からなり、かつ真核生物由来の長鎖プレニル２燐酸合成酵素の宿主微生物での活性発現を可能とする或いは増強するタンパク質。
さらに、本発明は、上記（ｄ）又は（ｅ）のタンパク質をコードするＤＮＡに関する。
また、本発明は、発現用ベクターに上記ＤＮＡを組み込んでなる発現ベクター；発現用ベクターがｐＳＴＶ２８である上記発現ベクター；発現ベクターがｐＳＴＶＤＬＰ１である上記発現ベクター；発現ベクターがｐＳＴＶＫ２８−ｍＤＬＰ１である上記発現ベクター；発現ベクターがｐＳＴＶＫ２８−ｈＤＬＰ１である上記発現ベクターに関する。
さらに、本発明は、宿主微生物を上記ＤＮＡにて形質転換してなる形質転換体；宿主微生物を上記発現ベクターにて形質転換してなる形質転換体；宿主微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉである上記形質転換体；形質転換体が、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＤＬＰ１）（ＦＥＲＭＢＰ−７４３３）である上記形質転換体；形質転換体が、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＫ２８−ｍＤＬＰ１）である上記形質転換体；形質転換体が、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＫ２８−ｈＤＬＰ１）である上記形質転換体に関する。
また、本発明は、真核生物由来の長鎖プレニル２燐酸合成酵素遺伝子がさらに導入された上記形質転換体；真核生物由来のプレニル２燐酸合成酵素遺伝子が、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓａｉｔｏｅｌｌａ属、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属、Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属、Ａｓｐｅｒｕｇｉｌｌｕｓ属、Ｂｕｌｌｅｏｍｙｃｅｓ属に属する微生物由来の遺伝子、ヒト由来の遺伝子、又は、マウス由来の遺伝子である上記形質転換体；形質転換体が、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＤＬＰ１，ｐＢＳＤＰＳ）（ＦＥＲＭＢＰ−７５４８）である上記形質転換体；形質転換体が、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＤＬＰ１，ｐＵｈＤＰＳ１）（ＦＥＲＭＢＰ−８０２５）である上記形質転換体；形質転換体が、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＤＬＰ１，ｐＢｍＳＤＳ１）である上記形質転換体；形質転換体が、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＫ２８−ｍＤＬＰ１，ｐＵｈＤＰＳ１）である上記形質転換体；形質転換体が、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＫ２８−ｍＤＬＰ１，ｐＢｍＳＤＳ１）（ＦＥＲＭＢＰ−８０２７）である上記形質転換体；形質転換体が、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＫ２８−ｈＤＬＰ１，ｐＵｈＤＰＳ１）（ＦＥＲＭＢＰ−８０２６）である上記形質転換体；形質転換体が、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＫ２８−ｈＤＬＰ１，ｐＢｍＳＤＳ１）である上記形質転換体に関する。
さらに、本発明は、上記形質転換体を培地中で培養し、培養物中にコエンザイムＱを生成蓄積し、これを採取することを特徴とするコエンザイムＱの製造方法に関する。
発明の詳細な開示
以下に、本発明を詳述する。
本発明のＤＮＡは、以下のようにして単離した。
Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の染色体データーベースから、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属のデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子配列を用いて相同性検索を行い、比較的相同性の高い遺伝子を見いだした。また、該遺伝子配列を基に、マウス及びヒトの染色体データーベースからも比較的相同性の高い遺伝子を見いだした。
この遺伝子を、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の染色体から分離するため、ＰＣＲプライマーＮ−ｄｌｐ１（配列番号７）とＣ−ｄｌｐ１（配列番号８）を合成し、また、ヒト染色体から分離するため、ｈＤＬＰ１−Ｎ（配列番号９）とｈＤＬＰ１−Ｃ（配列番号１０）を合成し、さらに、マウス染色体から分離するため、ｍＤＬＰ１−Ｎ（配列番号１１）とｍＤＬＰ１−Ｃ（配列番号１２）を合成した。
そしてこれらのプライマーを用いて、ＰＣＲの条件を検討し、９４℃で２分間の熱処理の後、９４℃で１分→５６℃で１分→７２℃で２分のサイクルを２５回繰り返してＰＣＲを行うことにより、ＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅＩＦＯ１６２８の染色体遺伝子から約９００ｂｐのＤＮＡが、ヒト染色体から約１２００ｂｐのＤＮＡが、マウス染色体から約１２００ｂｐのＤＮＡが、それぞれ増幅してくることを、その遺伝子の塩基配列を解析することにより明らかにした。得られたＤＮＡの塩基配列を決定したところ、それぞれ配列表の配列番号１、３及び５に示した配列を持つことが明らかとなった。
本発明のＤＮＡは、真核生物由来の長鎖プレニル２燐酸合成酵素の宿主微生物での活性発現を可能とする或いは増強するタンパク質をコードするＤＮＡであって、配列番号１、３又は５に示す塩基配列を有するＤＮＡであってもよいし、また、配列番号１、３又は５に示す塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、追加、挿入及び／又は置換された塩基配列を有するＤＮＡであってもよいし、さらに、配列番号１、３又は５に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。
なお、多くのアミノ酸は１種以上のコドンで規定される（遺伝暗号の縮重）ことから、配列番号２、４又は６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号１、３又は５に示す塩基配列からなるＤＮＡ以外にも多数存在する。従って、本発明のＤＮＡには、配列番号２、４及び６で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。
ここで、「１若しくは数個の塩基が欠失、追加、挿入及び／又は置換された塩基配列」とは、蛋白核酸酵素増刊遺伝子増幅ＰＣＲ法ＴＡＫＫＡＪ３５（１７），２９５１−３１７８（１９９０）又はＨｅｎｒｙＡ．Ｅｒｌｉｃｈ編加藤郁之進鑑訳ＰＣＲテクノロジー（１９９０）等に記載の当業者に周知の方法により、欠失、追加、挿入及び／又は置換できる程度の数の塩基が、欠失、追加、挿入及び／又は置換されてなる塩基配列を意味する。
また、「配列番号１、３又は５に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、配列番号１、３又は５に示す塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、又はサザン・ハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡのことをいう。当業者であれば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ２ｎｄＥｄｔ．（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９）に記載されている方法に準じて、該ハイブリダイゼーションを実施して、目的とするＤＮＡを容易に取得できる。例えば、５０℃以上の温度にて、尿素を含まないＳＳＣの塩濃度が０．５Ｍ以下で、ハイブリダイズすることにより、目的とするＤＮＡが得られる。
さらに、「真核生物由来の長鎖プレニル２燐酸合成酵素の宿主微生物での活性発現を可能とする或いは増強するタンパク質」とは、真核生物由来の長鎖プレニル２燐酸合成酵素遺伝子を導入された宿主微生物内で発現させることによって、長鎖プレニル２燐酸合成酵素活性を発現可能とする或いは増強する（高活性化する）事により、該宿主微生物のコエンザイムＱ生産量を増加させるタンパク質を表す。
このようなタンパク質であるか否かは、長鎖プレニル２燐酸合成酵素遺伝子のみで形質転換された形質転換体と、長鎖プレニル２燐酸合成酵素遺伝子とともに該タンパク質をコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体とを調製し、両形質転換体の同一条件下でのコエンザイムＱ生産量を測定、比較することにより確認できる。つまり、長鎖プレニル２燐酸合成酵素遺伝子のみで形質転換された形質転換体では、コエンザイムＱ生産量は全く或いはほとんどないが、長鎖プレニル２燐酸合成酵素遺伝子とともに該タンパク質をコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体では、著量のコエンザイムＱが生産される場合は、上記タンパク質に相当するものである。
本発明のタンパク質は、真核生物由来の長鎖プレニル２燐酸合成酵素の宿主微生物での活性発現を可能とする或いは増強する（高活性化する）タンパク質であって、配列番号２、４又は６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよいし、また、配列番号２、４又は６に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、追加、挿入及び／又は置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。
ここで、「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、追加、挿入及び／又は置換されたアミノ酸配列」は、部分特異的突然変異誘発法等の当業者に周知の方法により、欠失、追加、挿入及び／又は置換できる程度の数のアミノ酸を、欠失、追加、挿入及び／又は置換することにより取得可能である。具体的には、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．１０，６４８７（１９８２）、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１００，４４８（１９８３）等の文献に記載されている。
本発明のタンパク質を発現させるためには、適当なプロモーターの下流に該タンパク質の遺伝子を接続することが必要である。例えば該遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素によって切り出したり、ＰＣＲによって酵素をコードする遺伝子部分のみを増幅させたりした後、これをプロモーターを持つ発現用ベクターに挿入することにより発現ベクターとすることができる。
本発明の発現ベクターは、発現用ベクターに上記ＤＮＡを組み込んでなるものである。
発現用ベクターとしては特に限定されず、例えば、大腸菌由来のプラスミドに、適当なプロモーターを組み込んだもの等が挙げられる。大腸菌由来のプラスミドとしては、例えば、ｐＳＴＶ２８、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９等が挙げられる。また、プロモーターとしては、例えば、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター等が挙げられる。
また、本発明においては、発現用ベクターとして、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＧＥＸ−３Ｔ、ｐＧＥＸ−３Ｘ（以上、ファルマシア社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＵＣ１９（東洋紡社製）、ｐＭＡＬＣ２、ｐＥＴ−３Ｔ、ｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３に記載）等を用いることもできる。
このうち、ｐＳＴＶ２８が好適に用いられる。具体的な例としては、発現用ベクターｐＳＴＶ２８に、配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡを挿入すれば、発現ベクターｐＳＴＶＤＬＰ１を；配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡを挿入すれば、発現ベクターｐＳＴＶＫ２８−ｈＤＬＰ１を；配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡを挿入すれば、発現ベクターｐＳＴＶＫ２８−ｍＤＬＰ１を、それぞれ作製することができる。
本発明の形質転換体は、宿主微生物を上記ＤＮＡにて形質転換してなる形質転換体であってもよいし；また、宿主微生物を上記発現ベクターにて形質転換してなる形質転換体であってもよいし；さらに、宿主微生物を、上記ＤＮＡ又は上記発現ベクターと共に、真核生物由来の長鎖プレニル２燐酸合成酵素遺伝子をさらに用いて形質転換してなる形質転換体であってもよい。
上記の発現ベクターを、真核生物由来の長鎖プレニル２燐酸合成酵素遺伝子を含む発現ベクターと共に適当な宿主微生物に導入することにより、コエンザイムＱの生産に利用することが可能となる。
長鎖プレニル２燐酸合成酵素遺伝子源となる真核生物は、特に制限されないが、例えば、デカプレニル２燐酸合成酵素を生産するＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓａｉｔｏｅｌｌａ属、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属、Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属、Ａｓｐｅｒｕｇｉｌｌｕｓ属、Ｂｕｌｌｅｏｍｙｃｅｓ属等に属する微生物或いはヒト、又は、ソラネシル２燐酸合成酵素を生産するマウス等が挙げられる。
宿主微生物としては特に限定されないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ等が好適に用いられる。また、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉとしては特に限定されないが、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＢＬ−２１、ＪＭ１０９、ＮＭ５２２、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＤＨ５等が挙げられる。このうちＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＨ５αが好適に用いられる。
例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属由来のデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子の発現ベクターと共に、上記発現ベクターｐＳＴＶＤＬＰ１を大腸菌に導入した場合には、大腸菌が本来は生産しないコエンザイムＱ_１０を著量生産するように変換できる。
本発明の形質転換体としては、例えば以下に示すもの等が挙げられる。
ｐＳＴＶＤＬＰ１で形質転換した大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＤＬＰ１）；
ｐＳＴＶＫ２８−ｍＤＬＰ１で形質転換した大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＫ２８−ｍＤＬＰ１）；
ｐＳＴＶＫ２８−ｈＤＬＰ１で形質転換した大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＫ２８−ｈＤＬＰ１）；
ｐＳＴＶＤＬＰ１及びｐＢＳＤＰＳで形質転換した大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＤＬＰ１，ｐＢＳＤＰＳ）；
ｐＳＴＶＤＬＰ１及びｐＵｈＤＰＳ１で形質転換した大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＤＬＰ１，ｐＵｈＤＰＳ１）；
ｐＳＴＶＤＬＰ１及びｐＢｍＳＤＳ１で形質転換した大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＤＬＰ１，ｐＢｍＳＤＳ１）；
ｐＳＴＶＫ２８−ｍＤＬＰ１及びｐＵｈＤＰＳ１で形質転換した大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＫ２８−ｍＤＬＰ１，ｐＵｈＤＰＳ１）；
ｐＳＴＶＫ２８−ｍＤＬＰ１及びｐＢｍＳＤＳ１で形質転換した大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＫ２８−ｍＤＬＰ１，ｐＢｍＳＤＳ１）；
ｐＳＴＶＫ２８−ｈＤＬＰ１及びｐＵｈＤＰＳ１で形質転換した大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＫ２８−ｈＤＬＰ１，ｐＵｈＤＰＳ１）；
ｐＳＴＶＫ２８−ｈＤＬＰ１及びｐＢｍＳＤＳ１で形質転換した大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＫ２８−ｈＤＬＰ１，ｐＢｍＳＤＳ１）。
このうち、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＤＬＰ１）は、平成１３年１月１８日に、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７４３３として、
Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＤＬＰ１，ｐＢＳＤＰＳ）は、平成１３年４月１７日に、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７５４８として、
Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＤＬＰ１，ｐＵｈＤＰＳ１）は、平成１４年４月１９日に、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−８０２５として、
Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＫ２８−ｍＤＬＰ１，ｐＢｍＳＤＳ１）は、平成１４年４月１９日に、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−８０２７として、
Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＫ２８−ｈＤＬＰ１，ｐＵｈＤＰＳ１）は、平成１４年４月１９日に、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−８０２６として、
それぞれ、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
本発明のＤＮＡは、真核生物由来の長鎖プレニル２燐酸合成酵素遺伝子の発現ベクターと共に用いるほか、コエンザイムＱの生合成に関与する他の遺伝子も同時に微生物に導入して発現させることにより、さらに良い効果が期待できる。
他の遺伝子としては、例えば、ポリプレニル２燐酸転移酵素遺伝子等が挙げられる。
本発明で得られた形質転換体を、常法に従い、培地中で培養し、培養物中からコエンザイムＱを採取することにより、コエンザイムＱを製造することができる。
宿主微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉである場合は、培地として、ＬＢ培地や、グルコースやカザミノ酸を含むＭ９培地等を用いることができる。プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、イソプロピルチオガラクトシドやインドリル−３−アクリル酸のような薬剤を培地に加えてもよい。培養は、例えば、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃、より好ましくは３７℃で、１７〜２４時間行い、この際必要により通気や攪拌等を行ってもよい。
本発明において、得られたコエンザイムＱは精製を行ってもよく、粗精製物として用いてもよく、用途により適宜選択することができる。
得られた培養物からコエンザイムＱを単離するには、公知の分離・精製法を適宜組み合わせることができる。公知の分離・精製法としては、イオン交換クロマトグラフィー等の荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法等が挙げられる。
本発明において得られたコエンザイムＱの用途は特に限定されず、医薬、食品等に好適に用いることができる。
発明を実施するための最良の形態
以下に、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅのデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子塩基配列を用いて、ＳａｎｇｅｒＣｅｎｔｅｒのデーターベースを相同検索した結果、ＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウェア開発株式会社）で２６％の相同性のある遺伝子を見いだした。この遺伝子を取得するためのＰＣＲプライマー、Ｎ−ｄｌｐ１（配列番号７）とＣ−ｄｌｐ１（配列番号８）を作成した。また、ＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅＩＦＯ１６２８の染色体ＤＮＡを、Ｃ．Ｓ．Ｈｏｆｆｍａｎらの方法（Ｇｅｎｅ、５７（１９８７）２６７−２７２）で調製した。これらを用いて、９４℃で２分間の熱処理の後、９４℃で１分→５６℃で１分→７２℃で２分のサイクルを２５回繰り返すことによりＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡを０．７％アガロース電気泳動により分析した。
そして得られた約９００ｂｐの断片をゲルより切り出して、ＤＮＡ抽出キット（Ｓｅｐｈａｇｌａｓ（商標）ＢａｎｄＰｒｅｐＫｉｔ、アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて精製した後、ＰＣＲ産物ダイレクトクローニングキット（ｐＴ７ＢｌｕｅＴ−ＶｅｃｔｏｒＫｉｔ、ＮＯＶＡＧＥＮ社製）を用いて大腸菌発現用ベクターにクローニングし、ｐＴ７−ＤＬＰ１を得た。ＤＮＡ塩基配列を、ＤＮＡシークエンサー（３７７型、パーキンエルマー社製）を用い、ＤＮＡシークエンスキット（パーキンエルマー社製、ＡＢＩＰＲＩＳＭ（商標）ＢｉｇＤｙｅ（商標）ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｅＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔＷｉｔｈＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＦＳ）を使用して、その取り扱い説明書に従って反応を行うことにより決定した。その結果、データーベース上に存在する全配列を得ることが出来た。
ｐＴ７−ＤＬＰ１を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶ（宝酒造製）で切断し、０．８％アガロース電気泳動を行い、約９００ｂｐの断片をゲルより切り出して、ＤＮＡ抽出キット（Ｓｅｐｈａｇｌａｓ（商標）ＢａｎｄＰｒｅｐＫｉｔ、アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて精製した後、このＤＮＡ断片をｐＳＴＶ２８（宝酒造製）のＥｃｏＲＩ―ＳｍａＩ部位に挿入した。ＤＮＡ塩基配列を、ＤＮＡシークエンサー（３７７型、パーキンエルマー社製）を用い、ＤＮＡシークエンスキット（パーキンエルマー社製、ＡＢＩＰＲＩＳＭ（商標）ＢｉｇＤｙｅ（商標）ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｅＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔＷｉｔｈＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＦＳ）を使用して、その取り扱い説明書に従って反応を行うことにより決定した。その結果、発現ベクターｐＳＴＶＤＬＰ１を得ることが出来た。図１に、発現ベクターｐＳＴＶＤＬＰ１の制限酵素地図を示す。
得られたｐＳＴＶＤＬＰ１で形質転換した大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＤＬＰ１）は、平成１３年１月１８日に、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７４３３として、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した。
（実施例２）
実施例１で取得したＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅのＤＬＰ１遺伝子塩基配列を用いて、Ｇｅｎｂａｎｋのデーターベースを相同検索した結果、ＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウェア開発株式会社）で２７％の相同性のある遺伝子を見いだした。この遺伝子を取得するためのＰＣＲプライマー、ｈＤＬＰ１―Ｎ（配列番号９）とｈＤＬＰ１―Ｃ（配列番号１０）を作成した。ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー（ｃＤＮＡＬｉｂｒａｒｙ、ＨｕｍａｎＬｉｖｅｒ、プラスミド型（宝酒造製））を鋳型として、９４℃で２分間の熱処理の後、９４℃で１分→５６℃で１分→７２℃で２分のサイクルを３５回繰り返すことによりＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡを０．７％アガロース電気泳動により分析した。
そして得られた約１２００ｂｐの断片をゲルより切り出して、ＤＮＡ抽出キット（Ｓｅｐｈａｇｌａｓ（商標）ＢａｎｄＰｒｅｐＫｉｔ、アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて精製した後、ＰＣＲ産物ダイレクトクローニングキット（ｐＴ７ＢｌｕｅＴ−ＶｅｃｔｏｒＫｉｔ、ＮＯＶＡＧＥＮ社製）を用いて大腸菌発現用ベクターにクローニングし、ｐＴ７−ｈＤＬＰ１を得た。ＤＮＡ塩基配列を、ＤＮＡシークエンサー（３７７型、パーキンエルマー社製）を用い、ＤＮＡシークエンスキット（パーキンエルマー社製、ＡＢＩＰＲＩＳＭ（商標）ＢｉｇＤｙｅ（商標）ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｅＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔＷｉｔｈＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＦＳ）を使用して、その取り扱い説明書に従って反応を行うことにより決定した。その結果、データーベース上に存在する全配列を得ることが出来た。
ｐＴ７−ｈＤＬＰ１を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造製）で切断し、０．８％アガロース電気泳動を行い、約１２００ｂｐの断片をゲルより切り出して、ＤＮＡ抽出キット（Ｓｅｐｈａｇｌａｓ（商標）ＢａｎｄＰｒｅｐＫｉｔ、アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて精製した後、このＤＮＡ断片をｐＳＴＶ２８（宝酒造製）のＢａｍＨＩ―ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。ＤＮＡ塩基配列を、ＤＮＡシークエンサー（３７７型、パーキンエルマー社製）を用い、ＤＮＡシークエンスキット（パーキンエルマー社製、ＡＢＩＰＲＩＳＭ（商標）ＢｉｇＤｙｅ（商標）ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｅＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔＷｉｔｈＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＦＳ）を使用して、その取り扱い説明書に従って反応を行うことにより決定した。その結果、発現ベクターｐＳＴＶＫ２８−ｈＤＬＰ１を得ることが出来た。図２に、発現ベクターｐＳＴＶＫ２８−ｈＤＬＰ１の制限酵素地図を示す。また、ｐＳＴＶＫ２８−ｈＤＬＰ１で形質転換した大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＫ２８−ｈＤＬＰ１）を得た。
（実施例３）
実施例１で取得したＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅのＤＬＰ１遺伝子塩基配列を用いてＧｅｎｂａｎｋのデーターベースを相同検索した結果、ＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウェア開発株式会社）で３１％の相同性のある遺伝子を見いだした。この遺伝子を取得するためのＰＣＲプライマー、ｍＤＬＰ１―Ｎ（配列番号１１）とｍＤＬＰ１―Ｃ（配列番号１２）を作成した。マウス肝臓ｃＤＮＡライブラリー（ｃＤＮＡＬｉｂｒａｒｙ、ＭｏｕｓｅＬｉｖｅｒ、プラスミド型（宝酒造製））を鋳型として、９４℃で２分間の熱処理の後、９４℃で１分→５６℃で１分→７２℃で２分のサイクルを３５回繰り返すことによりＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡを０．７％アガロース電気泳動により分析した。
そして得られた約１２００ｂｐの断片をゲルより切り出して、ＤＮＡ抽出キット（Ｓｅｐｈａｇｌａｓ（商標）ＢａｎｄＰｒｅｐＫｉｔ、アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて精製した後、ＰＣＲ産物ダイレクトクローニングキット（ｐＴ７ＢｌｕｅＴ−ＶｅｃｔｏｒＫｉｔ、ＮＯＶＡＧＥＮ社製）を用いて大腸菌発現用ベクターにクローニングし、ｐＴ７−ｍＤＬＰ１を得た。ＤＮＡ塩基配列を、ＤＮＡシークエンサー（３７７型、パーキンエルマー社製）を用い、ＤＮＡシークエンスキット（パーキンエルマー社製、ＡＢＩＰＲＩＳＭ（商標）ＢｉｇＤｙｅ（商標）ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｅＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔＷｉｔｈＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＦＳ）を使用して、その取り扱い説明書に従って反応を行うことにより決定した。その結果、データーベース上に存在する全配列を得ることが出来た。
ｐＴ７−ｍＤＬＰ１を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ（宝酒造製）で切断し、０．８％アガロース電気泳動を行い、約１２００ｂｐの断片をゲルより切り出して、ＤＮＡ抽出キット（Ｓｅｐｈａｇｌａｓ（商標）ＢａｎｄＰｒｅｐＫｉｔ、アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて精製した後、このＤＮＡ断片をｐＳＴＶ２８（宝酒造製）のＥｃｏＲＩ―ＢａｍＨＩ部位に挿入した。ＤＮＡ塩基配列を、ＤＮＡシークエンサー（３７７型、パーキンエルマー社製）を用い、ＤＮＡシークエンスキット（パーキンエルマー社製、ＡＢＩＰＲＩＳＭ（商標）ＢｉｇＤｙｅ（商標）ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｅＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔＷｉｔｈＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＦＳ）を使用して、その取り扱い説明書に従って反応を行うことにより決定した。その結果、発現ベクターｐＳＴＶＫ２８−ｍＤＬＰ１を得ることが出来た。図３に、発現ベクターｐＳＴＶＫ２８−ｍＤＬＰ１の制限酵素地図を示す。また、ｐＳＴＶＫ２８−ｍＤＬＰ１で形質転換した大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＫ２８−ｍＤＬＰ１）を得た。
（実施例４）
ＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅのｃＤＮＡ由来のデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子を持つｐＫＳ１８（ＳｕｚｕｋｉＫ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２１，４９６−５０５（１９９７））から、プライマーＮ−ｄｐｓ（配列番号１３）とＣ−ｄｐｓ（配列番号１４）を用い、９４℃で２分間の熱処理の後、９４℃で１分→５６℃で１分→７２℃で２分のサイクルを２５回繰り返すことによりＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡを０．７％アガロース電気泳動により分析した。
そして得られた約１１００ｂｐの断片をゲルより切り出して、ＤＮＡ抽出キット（Ｓｅｐｈａｇｌａｓ（商標）ＢａｎｄＰｒｅｐＫｉｔ、アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて精製した後、大腸菌発現ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩのＳａｌＩ−ＰｓｔＩ部位に挿入し、発現ベクターｐＢＳＤＰＳを得た。このベクターで大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＢＳＤＰＳ）を得た。
さらに、この形質転換体にｐＳＴＶＤＬＰ１を形質転換し、クロラムフェニコール３０μｇ／ｍｌかつアンピシリン５０μｇ／ｍｌでスクリーニングして、両ベクターを持つＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＤＬＰ１，ｐＢＳＤＰＳ）を得た。
（実施例５）
Ｇｅｎｂａｎｋのデーターベース上のヒトのデカプレニル２燐酸合成酵素の塩基配列を基に、ＰＣＲプライマー、ｈＤＰＳ１―Ｎ（配列番号１５）とｈＤＰＳ１―Ｃ（配列番号１６）を作成した。ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー（ｃＤＮＡＬｉｂｒａｒｙ、ＨｕｍａｎＬｉｖｅｒ、プラスミド型（宝酒造製））を鋳型として、９４℃で２分間の熱処理の後、９４℃で１分→５６℃で１分→７２℃で２分のサイクルを３５回繰り返すことによりＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡを０．７％アガロース電気泳動により分析した。
そして得られた約１２５０ｂｐの断片をゲルより切り出して、ＤＮＡ抽出キット（Ｓｅｐｈａｇｌａｓ（商標）ＢａｎｄＰｒｅｐＫｉｔ、アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて精製した後、ＰＣＲ産物ダイレクトクローニングキット（ｐＴ７ＢｌｕｅＴ−ＶｅｃｔｏｒＫｉｔ、ＮＯＶＡＧＥＮ社製）を用いて大腸菌発現用ベクターにクローニングし、ｐＴ７−ｈＤＰＳ１を得た。ＤＮＡ塩基配列を、ＤＮＡシークエンサー（３７７型、パーキンエルマー社製）を用い、ＤＮＡシークエンスキット（パーキンエルマー社製、ＡＢＩＰＲＩＳＭ（商標）ＢｉｇＤｙｅ（商標）ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｅＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔＷｉｔｈＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＦＳ）を使用して、その取り扱い説明書に従って反応を行うことにより決定した。その結果、データーベース上に存在する全配列を得ることが出来た。
ｐＴ７−ｈＤＰＳ１を制限酵素ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩ（宝酒造製）で切断し、０．８％アガロース電気泳動を行い、約１２５０ｂｐの断片をゲルより切り出して、ＤＮＡ抽出キット（Ｓｅｐｈａｇｌａｓ（商標）ＢａｎｄＰｒｅｐＫｉｔ、アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて精製した後、このＤＮＡ断片をｐＵＣ１１９（宝酒造製）のＳａｌＩ―ＢａｍＨＩ部位に挿入した。ＤＮＡ塩基配列を、ＤＮＡシークエンサー（３７７型、パーキンエルマー社製）を用い、ＤＮＡシークエンスキット（パーキンエルマー社製、ＡＢＩＰＲＩＳＭ（商標）ＢｉｇＤｙｅ（商標）ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｅＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔＷｉｔｈＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＦＳ）を使用して、その取り扱い説明書に従って反応を行うことにより決定した。その結果、発現ベクターｐＵｈＤＰＳ１を得ることが出来た。このベクターで大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＵｈＤＰＳ１）を得た。
（実施例６）
Ｇｅｎｂａｎｋのデーターベース上のマウスのソラネシル２燐酸合成酵素の塩基配列を基に、ＰＣＲプライマー、ｍＳＤＳ―Ｎ（配列番号１７）とｍＳＤＳ―Ｃ（配列番号１８）を作成した。マウス肝臓ｃＤＮＡライブラリー（ｃＤＮＡＬｉｂｒａｒｙ、ＭｏｕｓｅＬｉｖｅｒ、プラスミド型（宝酒造製））を鋳型として、９４℃で２分間の熱処理の後、９４℃で１分→５６℃で１分→７２℃で２分のサイクルを３５回繰り返すことによりＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡを０．７％アガロース電気泳動により分析した。
そして得られた約１２３０ｂｐの断片をゲルより切り出して、ＤＮＡ抽出キット（Ｓｅｐｈａｇｌａｓ（商標）ＢａｎｄＰｒｅｐＫｉｔ、アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて精製した後、ＰＣＲ産物ダイレクトクローニングキット（ｐＴ７ＢｌｕｅＴ−ＶｅｃｔｏｒＫｉｔ、ＮＯＶＡＧＥＮ社製）を用いて大腸菌発現用ベクターにクローニングし、ｐＴ７−ｍＳＤＳを得た。ＤＮＡ塩基配列を、ＤＮＡシークエンサー（３７７型、パーキンエルマー社製）を用い、ＤＮＡシークエンスキット（パーキンエルマー社製、ＡＢＩＰＲＩＳＭ（商標）ＢｉｇＤｙｅ（商標）ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｅＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔＷｉｔｈＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＦＳ）を使用して、その取り扱い説明書に従って反応を行うことにより決定した。その結果、データーベース上に存在する全配列を得ることが出来た。
ｐＴ７−ｍＳＤＳを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ（宝酒造製）で切断し、０．８％アガロース電気泳動を行い、約１２３０ｂｐの断片をゲルより切り出して、ＤＮＡ抽出キット（Ｓｅｐｈａｇｌａｓ（商標）ＢａｎｄＰｒｅｐＫｉｔ、アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて精製した後、このＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）（東洋紡製）のＥｃｏＲＩ―ＳａｌＩ部位に挿入した。ＤＮＡ塩基配列を、ＤＮＡシークエンサー（３７７型、パーキンエルマー社製）を用い、ＤＮＡシークエンスキット（パーキンエルマー社製、ＡＢＩＰＲＩＳＭ（商標）ＢｉｇＤｙｅ（商標）ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｅＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔＷｉｔｈＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＦＳ）を使用して、その取り扱い説明書に従って反応を行うことにより決定した。その結果、発現ベクターｐＢｍＳＤＳ１を得ることが出来た。このベクターで大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＢｍＳＤＳ１）を得た。
（実施例７）
実施例４から６で構築した長鎖プレニル２燐酸合成酵素発現ベクターを形質転換したＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＢＳＤＰＳ）、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＵｈＤＰＳ１）、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＢｍＳＤＳ１）形質転換体に、実施例１から３で構築した活性増強タンパク質を発現する発現ベクターをいろいろ組み合わせて、さらに形質転換した。
例えば、実施例４に記載のように、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＢＳＤＰＳ）形質転換体にｐＳＴＶＤＬＰ１を形質転換し、両ベクターを持つ形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＤＬＰ１，ｐＢＳＤＰＳ）を得た。これと同様にして、さらに以下に示す形質転換体を得た。
ｐＳＴＶＤＬＰ１及びｐＵｈＤＰＳ１で形質転換した大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＤＬＰ１，ｐＵｈＤＰＳ１）；
ｐＳＴＶＤＬＰ１及びｐＢｍＳＤＳ１で形質転換した大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＤＬＰ１，ｐＢｍＳＤＳ１）；
ｐＳＴＶＫ２８−ｍＤＬＰ１及びｐＵｈＤＰＳ１で形質転換した大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＫ２８−ｍＤＬＰ１，ｐＵｈＤＰＳ１）；
ｐＳＴＶＫ２８−ｍＤＬＰ１及びｐＢｍＳＤＳ１で形質転換した大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＫ２８−ｍＤＬＰ１，ｐＢｍＳＤＳ１）；
ｐＳＴＶＫ２８−ｈＤＬＰ１及びｐＵｈＤＰＳ１で形質転換した大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＫ２８−ｈＤＬＰ１，ｐＵｈＤＰＳ１）；
ｐＳＴＶＫ２８−ｈＤＬＰ１及びｐＢｍＳＤＳ１で形質転換した大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＫ２８−ｈＤＬＰ１，ｐＢｍＳＤＳ１）。
このうち、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＤＬＰ１，ｐＢＳＤＰＳ）は、平成１３年４月１７日に、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７５４８として、
Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＤＬＰ１，ｐＵｈＤＰＳ１）は、平成１４年４月１９日に、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−８０２５として、
Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＫ２８−ｍＤＬＰ１，ｐＢｍＳＤＳ１）は、平成１４年４月１９日に、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−８０２７として、
Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＫ２８−ｈＤＬＰ１，ｐＵｈＤＰＳ１）は、平成１４年４月１９日に、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−８０２６として、
それぞれ、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した。
（実施例８）
上記実施例で作成したＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＢＳＤＰＳ）、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＵｈＤＰＳ１）及びＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＢｍＳＤＳ１）は、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む２００ｍｌのＬＢ培地で、
Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＤＬＰ１）は、クロラムフェニコール３０μｇ／ｍｌを含む２００ｍｌのＬＢ培地で、
Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＫ２８−ｈＤＬＰ１）及びＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＫ２８−ｍＤＬＰ１）は、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含む２００ｍｌのＬＢ培地で、
Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＤＬＰ１，ｐＢＳＤＰＳ）、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＤＬＰ１，ｐＵｈＤＰＳ１）及びＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＤＬＰ１，ｐＢｍＳＤＳ１）は、クロラムフェニコール３０μｇ／ｍｌ及びアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む２００ｍｌのＬＢ培地で、
Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＫ２８−ｈＤＬＰ１，ｐＵｈＤＰＳ１）、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＫ２８−ｈＤＬＰ１，ｐＢｍＳＤＳ１）、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＫ２８−ｍＤＬＰ１，ｐＵｈＤＰＳ１）及びＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＫ２８−ｍＤＬＰ１，ｐＢｍＳＤＳ１）は、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ及びアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む２００ｍｌのＬＢ培地で、それぞれ３７℃で一晩振とう培養し、菌体を遠心分離（３０００回転、２０分間）で集めた。
この菌体に３ｍｌのアセトン・メタノール（７：２）を添加して、３０秒間超音波破砕をした後、３０秒間氷中に置く処理を６回繰り返すことにより抽出を行い、遠心分離（３０００回転、５分間）して抽出液を得た。この抽出液を真空乾燥させた後、１ｍｌのクロロホルム・メタノール（１：１）と等量の０．７％塩化ナトリウム水溶液を加えて、よく攪拌して溶解させ、１４０００回転で１分間遠心分離した。下層を抜き出して乾燥させ、５０μｌのクロロホルム・メタノール（２：１）に溶解させた。この試料をＴＬＣプレートにスポット後、ベンゼン１００％で展開した。標準としてコエンザイムＱ_１０を展開したスポットと同じくらいの位置のシリカゲルをかき取り、４００μｌのクロロホルム・メタノール（１：１）で抽出した。この内の２０μｌを高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製、ＬＣ−１０Ａ）により分析した。分離には逆相カラム（ＹＭＣ−ｐａｃｋＯＤＳ−Ａ、２５０×４．６ｍｍ、Ｓ−５μｍ、１２０Ａ）を用い、エタノール１００％を移動相の溶媒として使用して分離させ、２７５ｎｍの波長の吸光度で、生成したコエンザイムＱ_９及びコエンザイムＱ_１０を検出した。結果を図４−８に示す。図４−８に示すように、各ＤＬＰ１遺伝子をプレニル２燐酸合成酵素遺伝子と共に導入して発現させることによって、プレニル２燐酸合成酵素遺伝子単独で形質転換した大腸菌では発現しないコエンザイムＱ_９或いはコエンザイムＱ_１０を、生産するようになったことが分かった。
産業上の利用可能性
本発明により、真核生物由来の長鎖プレニル２燐酸合成酵素の発現に関与するタンパク質、該酵素をコードする遺伝子、該酵素遺伝子を含むベクター、該ベクターと長鎖プレニル２燐酸合成酵素遺伝子を含む発現ベクターとによって形質転換された形質転換体、並びに、長鎖プレニル２燐酸合成酵素（なかでもデカプレニル２燐酸合成酵素、ソラネシル２燐酸合成酵素）及び長鎖イソプレノイドを側鎖に有するコエンザイムＱ（なかでもコエンザイムＱ_９、コエンザイムＱ_１０）の製造方法が提供される。また、本発明により、真核生物由来の酵素生産及びコエンザイムＱ_９、コエンザイムＱ_１０等の生産をすることができる。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、発現ベクターｐＳＴＶＤＬＰ１の制限酵素地図である。
図２は、発現ベクターｐＳＴＶＫ２８−ｈＤＬＰ１の制限酵素地図である。
図３は、発現ベクターｐＳＴＶＫ２８−ｍＤＬＰ１の制限酵素地図である。
図４−図８は、宿主及び形質転換体生産物のＨＰＬＣ分析チャートである。

Claims

宿主微生物をＤＮＡにて形質転換してなり、真核生物由来の長鎖プレニル２燐酸合成酵素遺伝子がさらに導入された形質転換体であって、
前記ＤＮＡは以下の（ａ）、（ｂ）、（ｄ）又は（ｅ）：
（ａ）配列番号１，３又は５に示す塩基配列を有し、かつ真核生物由来の長鎖プレニル２燐酸合成酵素の宿主微生物での活性発現を可能とする或いは増強するタンパク質をコードするＤＮＡ：
（ｂ）配列番号１，３又は５に示す塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、追加、挿入及び／又は置換された塩基配列を有し、かつ真核生物由来の長鎖プレニル２燐酸合成酵素の宿主微生物での活性発現を可能とする或いは増強するタンパク質をコードするＤＮＡ：
（ｄ）配列番号２，４又は６に示すアミノ酸配列を有し、かつ真核生物由来の長鎖プレニル２燐酸合成酵素の宿主微生物での活性発現を可能とする或いは増強するタンパク質をコードするＤＮＡ：
（ｅ）配列番号２，４又は６に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、追加、挿入及び／又は置換されたアミノ酸配列からなり、かつ真核生物由来の長鎖プレニル２燐酸合成酵素の宿主微生物での活性発現を可能とする或いは増強するタンパク質をコードするＤＮＡ：
であって、前記真核生物由来のプレニル２燐酸合成酵素遺伝子が、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に属する微生物由来の遺伝子、ヒト由来の遺伝子、又は、マウス由来の遺伝子である形質転換体。
形質転換体が、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＤＬＰ１，ｐＢＳＤＰＳ）（ＦＥＲＭＢＰ−７５４８）である請求の範囲１記載の形質転換体。
形質転換体が、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＤＬＰ１，ｐＵｈＤＰＳ１）（ＦＥＲＭＢＰ−８０２５）である請求の範囲１記載の形質転換体。
形質転換体が、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＫ２８−ｍＤＬＰ１，ｐＢｍＳＤＳ１）（ＦＥＲＭＢＰ−８０２７）である請求の範囲１記載の形質転換体。
形質転換体が、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＳＴＶＫ２８−ｈＤＬＰ１，ｐＵｈＤＰＳ１）（ＦＥＲＭＢＰ−８０２６）である請求の範囲１記載の形質転換体。
請求の範囲１〜５のいずれかに記載の形質転換体を培地中で培養し、培養物中にコエンザイムＱを生成蓄積し、これを採取することを特徴とするコエンザイムＱの製造方法。