JPH09327297A

JPH09327297A - ヘキソキナーゼ遺伝子

Info

Publication number: JPH09327297A
Application number: JP9057330A
Authority: JP
Inventors: Kazuo Houriyou; 一生芳陵; Shinji Koga; 晋治古賀
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1996-03-15
Filing date: 1997-03-12
Publication date: 1997-12-22
Anticipated expiration: 2017-03-12
Also published as: JP3335287B2

Abstract

(57)【要約】【課題】ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを効率よく生産
する手段を得るものである。【解決手段】ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ遺伝子ＤＮ
ＡとＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを導入した遺伝子組換
え微生物である。【効果】ヘキソキナーゼのＮ末端アミノ酸配列に基づ
いて合成したオリゴヌクレオチドを使用して、ヘキソキ
ナーゼ生産菌株に由来する染色体ＤＮＡライブラリーか
らヘキソキナーゼ遺伝子ＤＮＡの全塩基配列を明確とし
た新規なヘキソキナーゼ遺伝子を分離できる。該ヘキソ
キナーゼ遺伝子を導入した遺伝子組換え微生物を利用す
れば、高効率なヘキソキナーゼの生産が可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アデノシン３リン
酸（以下、ＡＴＰと略称する）を利用せず、少なくとも
アデノシン２リン酸（以下、ＡＤＰと略称する）存在
下、ヘキソースの６位の水酸基をリン酸基に置換し、ヘ
キソース６リン酸とアデノシン１リン酸（以下、ＡＭＰ
と略称する）を生成する反応を触媒するＡＤＰ依存性の
ヘキソキナーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子ＤＮ
Ａ、および該ヘキソキナーゼの生産能を有する実質的に
純粋な遺伝子組換え微生物に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、ＡＴＰを利用せず、少なくともＡ
ＤＰ存在下、ヘキソースの６位の水酸基をリン酸基に置
換し、ヘキソース６リン酸とＡＭＰを生成する反応を触
媒する特殊なヘキソキナーゼ（以後、該ヘキソキナーゼ
をＡＤＰＨＫ、該ヘキソキナーゼの酵素活性をＡＤＰＨ
Ｋ活性と略称する）が、超高度好熱性古細菌ピロコッカ
ス・フリオサスＤＳＭ３６３８株（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ
ＳａｍｍｌｕｎｇｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓ
ｍｅｎｕｎｄＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎＧｍｂ
Ｈ）により生産されていることが報告された（Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９（２６）１９９４，１７５３
７−１７５４１）。

【０００３】このＡＤＰＨＫは、ＡＤＰを利用し、ＡＴ
Ｐを利用せず、少なくともＡＤＰ存在下、このＡＤＰと
ヘキソースからヘキソース６リン酸とＡＭＰを生成する
反応を触媒する特性から、血清、尿、唾液などの生体体
液を被検液とするＡＤＰ濃度の定量において、例えば、
グルコース、グリセライド、クレアチニン、ウレアなど
の種々の生体成分をＡＤＰ生成、遊離反応系に導くこと
により、これらの生体成分の測定への応用が、臨床診断
の分野で期待されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかし超高度好熱性古
細菌は、培地中に特殊な成分が必要であったり、生育温
度が非常な高温（８５〜１００℃）であるなど、培養法
が非常に煩雑で、また生産されるＡＤＰＨＫの量もごく
微量であり、実用化への妨げとなっていた。またこのよ
うに微量しか得られないＡＤＰＨＫの精製は困難であ
り、ＡＤＰＨＫを構成するポリペプチドの部分アミノ酸
配列を解析し、解析結果に基づきＡＤＰＨＫ遺伝子ＤＮ
Ａを分離することも困難であった。

【０００５】なお、ピロコッカス・フリオサスＤＳＭ３
６３８株のＡＤＰＨＫのＮ末端から１０アミノ酸の配列
がＳ．Ｋｅｎｇｅｎらにより報告されているが（Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７０（５１）１９９５，３０４５
３−３０４５７）、この配列データは、本発明により明
らかとなったピロコッカス・フリオサスＤＳＭ３６３８
株のＡＤＰＨＫのＮ末端アミノ酸配列と比較して、途中
の２アミノ酸が不明であり、さらにＮ末端のメチオニン
後のプロリンが欠落しているなど、不完全かつ不正確で
あり、遺伝子ＤＮＡを分離するには全く不十分であっ
た。従って、本発明は効率的なＡＤＰＨＫの製造を提供
することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記のよ
うな種々の問題点に関し鋭意研究の結果、ピロコッカス
・フリオサスＤＳＭ３６３８株よりＡＤＰＨＫを分離・
精製し、その構成するポリペプチドのＮ末端から３９ア
ミノ酸の完全な配列を決定することに成功し、このＮ末
端アミノ酸配列を基にＡＤＰＨＫのアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡを分離し、ＡＤＰＨＫ遺伝子ＤＮＡの塩基
配列を決定した。

【０００７】ＡＤＰＨＫ遺伝子ＤＮＡの塩基配列、およ
び塩基配列から明らかとなったＡＤＰＨＫのアミノ酸配
列は明らかに新規であり、ＥｕｒｏｐｉａｎＢｉｏｉ
ｎｆｏｒｍａｔｉｃｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅの核酸配列
データベース、ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｍｅｄｉｃａ
ｌＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎの蛋白質
データベースからは、類似な配列を有する他の遺伝子お
よび蛋白質は見い出されなかった。

【０００８】また、ピロコッカス・フリオサスのＡＤＰ
ＨＫ遺伝子ＤＮＡの一部を含むＤＮＡを基に作製したプ
ローブを使用したハイブリダイゼーション操作により、
ピロコッカスとは別属の超高度好熱性古細菌サーモコッ
カス・リトラリスＡＴＣＣ５１８５０株（Ａｍｅｒｉｃ
ａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ）からもＡＤＰＨＫ遺伝子ＤＮＡを分離し、その塩基
配列を決定すると共にそのコードする全アミノ酸配列を
明らかにした。以下、ピロコッカス・フリオサス由来の
ＡＤＰＨＫをＰｆｕＨＫ、サーモコッカス・リトラリス
由来のＡＤＰＨＫをＴｌｉＨＫと略称する。

【０００９】また、これらのＡＤＰＨＫ遺伝子ＤＮＡを
任意のベクターに導入し、好ましい宿主−ベクター系に
て宿主微生物を形質転換体とし、該形質転換体を培養し
て、ＡＤＰＨＫ遺伝子ＤＮＡ情報を発現させ、該培養物
からＡＤＰＨＫを確認し、優れた工業的生産方法を確立
し、本発明を完成するに至った。

【００１０】本発明は、上記の知見に基づいてなされた
もので、ＡＴＰを利用せず、少なくともＡＤＰの存在
下、このＡＤＰとヘキソースからヘキソース６リン酸と
ＡＭＰを生成する反応を触媒するＡＤＰＨＫのアミノ酸
配列をコードするＤＮＡ、配列表１のアミノ酸配列の１
から４５５で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａ、配列表１の塩基配列の１から１３６５で表される塩
基配列を有するＤＮＡ、配列表２のアミノ酸配列の１か
ら４６７で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡで
ある。

【００１１】また本発明は、配列表１のアミノ酸配列の
１から４５５で表されるアミノ酸配列をコードする塩基
配列を有するＤＮＡをプローブ作製に使用したハイブリ
ダイゼーション操作により陽性となるＤＮＡ、配列表１
の塩基配列の１から１３６５で表される塩基配列を有す
るＤＮＡをプローブ作製に使用したハイブリダイゼーシ
ョン操作により陽性となるＤＮＡ、配列表２の塩基配列
の１から１４０１で表される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列表２のアミノ酸配列の１から４６７で表されるアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡをプロー
ブ作製に使用したハイブリダイゼーション操作により陽
性となるＤＮＡである。

【００１２】更に本発明、配列表２の塩基配列の１から
１４０１で表される塩基配列を有するＤＮＡをプローブ
作製に使用したハイブリダイゼーション操作により陽性
となるＤＮＡ、配列表１のアミノ酸配列の１から４５５
で表されるアミノ酸配列に削除、付加、または置換を行
うことによって得られるアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａ、配列表２のアミノ酸配列の１から４６７で表される
アミノ酸配列に削除、付加、または置換を行うことによ
って得られるアミノ酸配列をコードするＤＮＡである。

【００１３】更にまた本発明は、エシェリヒア・コリに
属する微生物であって、宿主にとって外来性である配列
表１のアミノ酸配列の１から４５５で表されるアミノ酸
配列をコードするヌクレオチド配列から実質的になるＡ
ＤＰＨＫのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを保持し、
かつ、ＡＤＰＨＫ生産能を有することを特徴とする実質
的に純粋な微生物、微生物エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＪＭ１０９・ｐｃＨＫ
１、微生物エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａｃｏｌｉ）ＪＭ１０９・ｐｃＨＫ２である。

【００１４】本発明の配列表１のアミノ酸配列の１から
４５５および配列表２のアミノ酸配列の１から４６７で
表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、そのＮ末
端側及びＣ末端側のアミノ酸残基又はポリペプチド残基
を含めたアミノ酸配列の各アミノ酸に対応する一連のコ
ドンのうちいずれか１個のコドンからなるＤＮＡであれ
ばよい。

【００１５】また、本発明の配列表１のアミノ酸配列の
１から４５５で表されるＰｆｕＨＫのアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡ、及び配列表２のアミノ酸配列の１から
４６７で表されるＴｌｉＨＫのアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡにおいて、その５’端側及び３’端側には１個
以上のアミノ酸残基又はポリペプチド残基をコードする
塩基配列を有するＤＮＡを有してもよい。また、該ＤＮ
Ａの５’端にはＡＴＧ、ＧＴＧなどの開始コドンが、
３’端にはＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡなどの終始コドンが
存在するのが通常である。

【００１６】また、自然界においてはＤＮＡの塩基配列
の変異がしばしば発生しており、これにより１個または
複数のアミノ酸が削除、付加または置換したアミノ酸配
列をコードする変異ＤＮＡが発生しうる。さらに、いわ
ゆる遺伝子工学的手法を用いれば、任意にアミノ酸が削
除、付加または置換したアミノ酸配列をコードする変異
ＤＮＡを作製することが可能である。このようにしてＡ
ＤＰＨＫ遺伝子ＤＮＡから生じる変異ＤＮＡのうち、そ
のコードするアミノ酸配列を有するペプチドがＡＤＰＨ
Ｋ活性を有するものを変異ＡＤＰＨＫ遺伝子ＤＮＡと定
義する。配列表１のアミノ酸配列の１から４５５および
配列表２のアミノ酸配列の１から４６７で表されるアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡより生じる変異ＡＤＰＨＫ
遺伝子ＤＮＡは全て本発明の範囲に含まれる。

【００１７】さらに、ＡＤＰＨＫ活性を有するペプチド
のアミノ酸配列をコードするＤＮＡのうち、配列表１の
アミノ酸配列の１から４５５または配列表２のアミノ酸
配列の１から４６７で表されるアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡの一部をプローブ作製に使用したハイブリダイ
ゼーション操作により陽性となるＤＮＡは全て本発明の
範囲に含まれる。なお、ハイブリダイゼーション操作に
より陽性となるＤＮＡとは、ハイブリダイゼーション操
作にプローブとして使用されるＤＮＡ鎖と塩基配列に相
同性を有することにより、二重鎖ＤＮＡ断片の正鎖ある
いは相補鎖の少なくともいずれかが、プローブとして使
用されたＤＮＡ鎖と塩基の相補的な結合を起こし得るＤ
ＮＡを表す。

【００１８】ＡＤＰＨＫのアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡは、例えば、ＡＤＰＨＫ遺伝子ＤＮＡの供与体であ
る、ＡＤＰＨＫを生産する微生物に由来するＤＮＡ（ｔ
ｏｔａｌＤＮＡと略称する）を分離精製した後、制限酵
素などを用いて切断し、作製したｔｏｔａｌＤＮＡの断
片と、同じく切断してリニヤーにした発現ベクターと
を、両ＤＮＡの末端部をＤＮＡリガーゼなどにより結合
閉環させ、かくして得られた組み換えＤＮＡベクターを
宿主微生物に導入し、発現ベクターのマーカーと、ＡＤ
ＰＨＫの活性発現もしくはＤＮＡプローブを指標として
スクリーニングを行い、ＡＤＰＨＫ遺伝子ＤＮＡを含有
する組換えＤＮＡベクターを保持する微生物を分離し、
該遺伝子組換え微生物を培養し、該培養菌体から該組み
換えＤＮＡベクターを分離精製し、次いで該組み換えＤ
ＮＡベクターからＡＤＰＨＫ遺伝子ＤＮＡを取得するこ
とにより得られる。

【００１９】ＤＮＡの供与体である微生物としては、Ａ
ＤＰＨＫを生産する微生物であれば、なんら限定される
ものではないが、好ましくはピロコッカス・フリオサス
ＤＳＭ３６３８株またはサーモコッカス・リトラリスＡ
ＴＣＣ５１８５０が挙げられる。ＡＤＰＨＫのアミノ酸
配列をコードするＤＮＡを得るためには、具体的には以
下のように行えばよいが、その操作法のうち常法とされ
るものは、例えばマニアティスらの方法（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ，Ｔ．，ｅｔａｌ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎ
ｉｎｇ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ１９８２，１９８９）や、市販の各
種酵素、キット類に添付された手順に従えば実施できる
ものである。

【００２０】ＤＮＡ供与体として選択した微生物のｔｏ
ｔａｌＤＮＡを採取するには、例えばＡＤＰＨＫを生産
する微生物を培養し、得られる培養菌液から菌体を集菌
し、次いでこれを溶菌させることによってＡＤＰＨＫ遺
伝子ＤＮＡを含有する溶菌物を調製する。溶菌方法とし
ては、例えばリゾチームなどの細胞壁溶解酵素による処
理が施され、必要によりプロテアーゼなどの他の酵素や
ラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤が併用され、
さらに、細胞壁の物理的破壊法である凍結融解（特開昭
６３−１８５３７１号公報参照）やフレンチプレス処理
を上述の溶菌法と組合せで行ってもよい。

【００２１】この様にして得られた溶菌物からｔｏｔａ
ｌＤＮＡを分離精製するには、常法に従って、例えばフ
ェノール抽出による除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リ
ボヌクレアーゼ処理、アルコール沈澱、遠心分離などの
方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。
分離精製されたｔｏｔａｌＤＮＡを切断する方法は、常
法に従って制限酵素処理により行えばよく、特に得られ
るｔｏｔａｌＤＮＡ断片とベクターとの結合を容易なら
しめるため、制限酵素、とりわけ特定ヌクレオチド配列
に作用する、例えば、ＳａｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢａｍＨ
Ｉ、ＸｈｏＩ、ＭｌｕＩなどのII形制限酵素が適してい
る。

【００２２】ｔｏｔａｌＤＮＡ断片を組み込むベクター
としては、宿主微生物体内で自律的に増殖しうるファー
ジ又はプラスミド、コスミドから遺伝子組み換え用とし
て構築されたものが適しており、ファージベクターとし
ては、例えば、エシェリヒア・コリに属する微生物を宿
主微生物とする場合にはλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢな
どが使用できる。

【００２３】また、プラスミドベクターとしては、例え
ば、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、
プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１
８４、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１
９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＩＮＩ、Ｂｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔＫＳ⁺、枯草菌を宿主とする場合にはｐ
ＵＢ１１０、ｐＫＨ３００ＰＬＫ、放線菌を宿主とする
場合にはｐＩＪ６８０、ｐＩＪ７０２、酵母特にサッカ
ロマイセス・セルビシエを宿主とする場合にはＹＲｐ
７、ｐＹＣ１、ｐＹＥＳ２などが使用できる。またコス
ミドベクターとしては、例えば、エシェリヒア・コリを
宿主微生物として、ｐＷＥ１５などが使用できる。

【００２４】このようなベクターを、ｔｏｔａｌＤＮＡ
の切断に使用した制限酵素で生成するＤＮＡ末端と、同
じ末端を生成する制限酵素で切断してベクター断片を作
成し、ｔｏｔａｌＤＮＡ断片とベクター断片とを、ＤＮ
Ａリガーゼ酵素により常法に従って結合させればよい。
ｔｏｔａｌＤＮＡの断片を結合したベクターを移入する
宿主微生物としては、組み換えＤＮＡが安定かつ自律的
に増殖可能であればよく、例えば宿主微生物がエシェリ
ヒア・コリに属する微生物の場合、エシェリヒア・コリ
ＤＨ１、エシェリヒア・コリＪＭ１０９、エシェリヒア
・コリＷ３１１０、エシェリヒア・コリＣ６００などが
利用できる。また、微生物宿主が枯草菌に属する微生物
の場合、バチラス・サチリスＩＳＷ１２１４など、放線
菌に属する微生物の場合、ストレプトマイセス・リビダ
ンスＴＫ２４など、サッカロマイセス・セルビシエに属
する微生物の場合、サッカロマイセス・セルビシエＩＮ
ＶＳＣ１等が使用できる。

【００２５】宿主微生物に組み換えＤＮＡを移入する方
法としては、例えば、宿主微生物がエシェリヒア・コリ
やサッカロマイセス・セルビシエ、ストレプトマイセス
・リビダンスに属する微生物の場合には、常法に従って
コンピテントセル化した宿主菌株に組み換えＤＮＡの移
入を行えばよく、菌株によっては電気穿孔法を使用して
もよい。

【００２６】宿主微生物への目的組み換えＤＮＡ移入の
有無についての選択は、上記方法により組換えＤＮＡを
移入した宿主微生物により作成した遺伝子ライブラリー
から、ＡＤＰＨＫ活性の発現を指標としたスクリーニン
グを行ってもよいし、³²Ｐや蛍光体などでラベルした、
ＡＤＰＨＫの部分アミノ酸配列を基に設計し予め合成し
たＤＮＡプローブを使用して、コロニーハイブリダイゼ
ーションやプラークハイブリダイゼーションなどにより
ポジティブ株を選択し、この株を目的の形質転換体とし
てもよい。

【００２７】ＤＮＡプローブを作製する方法としては、
ＤＮＡ供与体として選択したＡＤＰＨＫを生産する微生
物の培養物から分離、精製したＡＤＰＨＫの部分アミノ
酸配列を解析し、そのアミノ酸配列の適当な部位をコー
ドするオリゴヌクレオチドを設計、合成し、常法に従っ
て³²Ｐや蛍光体などで標識すればよい。形質転換体から
のＡＤＰＨＫ遺伝子ＤＮＡを含むＤＮＡの分離は、常法
に従って行えばよい。上述の方法によって得られたＡＤ
ＰＨＫ遺伝子ＤＮＡの塩基配列は、ジデオキシ法（Ｓａ
ｎｇａｒ，Ｆ．（１９８１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，
１２０５−１２１０）で解読すればよく、またＡＤＰＨ
Ｋを構成するポリペプチドの全アミノ酸配列は、塩基配
列より予測決定できる。

【００２８】また本発明のＡＤＰＨＫ遺伝子ＤＮＡは、
そのコードするペプチドがＡＤＰＨＫ活性を損なわない
範囲で変異を生じさせることも可能である。この変異を
生じさせる方法としては、ＤＮＡの塩基配列の自然変異
によってもよいし、人工的な公知の遺伝子工学的手法に
よるものでもよい。遺伝子工学的手法による変異の具体
的な例としては、ゾラーの方法による部位特異的変異法
（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄＳｍｉｔｈ，Ｍ．
（１９８３）ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ，１５４，３６７）や、ランダム変異体群からのス
クリーニングによる分離、目的遺伝子中の特定ＤＮＡ断
片の合成ＤＮＡによる置換、また生物内で遺伝子進化を
人工的に促進させるいわゆる進化工学的手法（大嶋泰
郎、他、Ｍｉａｍｉ−Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｓｈｏｒ
ｔ−Ｒｅｐ．，（１９９５）６，３）などが挙げられ
る。

【００２９】このようにして、一度ＡＤＰＨＫ遺伝子Ｄ
ＮＡが分離されれば、分離されたＡＤＰＨＫ遺伝子ＤＮ
Ａの一部を使用してプローブを作製し、他の生物から新
たなＡＤＰＨＫ遺伝子ＤＮＡを分離することも可能であ
る。すでに分離したＡＤＰＨＫ遺伝子ＤＮＡから、新た
に別の生物由来のＡＤＰＨＫ遺伝子ＤＮＡを分離する例
としては、ピロコッカス・フリオサスのＡＤＰＨＫ遺伝
子ＤＮＡによるサーモコッカス・リトラリスのＡＤＰＨ
Ｋ遺伝子ＤＮＡの分離が挙げられる。また、この逆も当
然可能である。

【００３０】具体的には、取得したＡＤＰＨＫ遺伝子Ｄ
ＮＡの８０％以上を含むＤＮＡ断片を常法により調製
し、ランダムプライマー法（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．
Ｐ．ａｎｄＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．（１９８３）
Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２，６−１３）により
放射性同位元素や蛍光物質で標識したＤＮＡプローブを
作製し、本プローブを使用したハイブリダイゼーション
操作を、新たにＡＤＰＨＫ遺伝子ＤＮＡを分離しようと
する生物の染色体断片やｃＤＮＡなどから作製した遺伝
子ライブラリーに対して実施し、陽性反応を示すクロー
ンを選択すればよい。以上の操作により少なくとも５５
％以上の相同性を有した異なる生物由来のＡＤＰＨＫの
遺伝子ＤＮＡや、変異ＡＤＰＨＫの遺伝子ＤＮＡを分離
することができる。

【００３１】ランダムプライマー法により作成されるプ
ローブは、その鋳型となったＤＮＡ断片の塩基配列また
は相補塩基配列の一部を有するＤＮＡ断片の集合体であ
り、鋳型となるＤＮＡ断片としては、例えば配列表１の
アミノ酸配列の１から４５５で表されるアミノ酸配列を
コードする塩基配列を有するＤＮＡのうちの８０％以上
からなるＤＮＡ断片、具体的なアミノ酸配列をコードす
る塩基配列としては配列表１の塩基配列の１から１２５
５のＤＮＡ断片および配列表２のアミノ酸配列の１から
４６７で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を
有するＤＮＡのうちの８０％以上からなるＤＮＡ断片、
具体的なアミノ酸配列をコードする塩基配列としては配
列表２の塩基配列の１から１４０１で表される塩基配列
を有するＤＮＡの８０％以上からなるＤＮＡ断片を挙げ
ることができる。

【００３２】また、複数のＡＤＰＨＫ遺伝子ＤＮＡが分
離されれば、その保存性の高い遺伝子領域を基にして設
計したＤＮＡプローブによるハイブリダイゼーションに
より、より低い相同性を有する他種のＡＤＰＨＫ遺伝子
ＤＮＡや変異ＡＤＰＨＫ遺伝子ＤＮＡを分離することも
可能である。この様にして一度選択された組み換えＤＮ
Ａは、該組み換えＤＮＡを保持する形質転換微生物から
取り出され、他の宿主微生物に移入することも容易に実
施できる。

【００３３】また、さらに、該組み換えＤＮＡから制限
酵素などにより切断してＡＤＰＨＫを構成するポリペプ
チドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを切り出し、前
記と同様な方法により切断して得られる他の開環ベクタ
ーの末端に結合させて新規な特徴を有する組み換えＤＮ
Ａを作製して、他の宿主微生物に移入することも容易に
実施できる。

【００３４】以上の方法により取得できるＡＤＰＨＫ遺
伝子ＤＮＡの好適な例として、配列表１のアミノ酸配列
の１から４５５で表されるアミノ酸配列をコードする塩
基配列を有するＤＮＡをプローブ作製に使用したハイブ
リダイゼイション操作により陽性となるＤＮＡであり、
具体的なアミノ酸配列をコードする塩基配列としては配
列表１の塩基配列の１から１３６５および配列表２のア
ミノ酸配列の１から４６７で表されるアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列を有するＤＮＡをプローブ作製に使用
したハイブリダイゼイション操作により陽性となるＤＮ
Ａであり、具体的なアミノ酸配列をコードする塩基配列
としては配列表２の塩基配列の１から１４０１で表され
る塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができる。

【００３５】かくして得られた形質転換体である微生物
は、栄養培地に培養されることによりＡＤＰＨＫを産生
し得るが、宿主微生物によってはＡＤＰＨＫ遺伝子ＤＮ
Ａを移入するだけではＡＤＰＨＫ生産性を有しない場合
がありうる。このような場合、得られたＡＤＰＨＫ遺伝
子ＤＮＡを含むＤＮＡ断片を、前述のゾラーの方法によ
る部位特異的変異法による制限酵素認識部位の作製や、
制限酵素による切り出しなどにより適切な形態で分離
し、該宿主微生物に適合する遺伝子プロモーター下流に
ＡＤＰＨＫ遺伝子ＤＮＡを結合したＤＮＡを組み込んだ
ベクターにより、新たな形質転換体を作成し、ＡＤＰＨ
Ｋを産生させればよい。

【００３６】例えば、上記宿主微生物がエシェリヒア・
コリに属する微生物の場合、ＡＤＰＨＫ遺伝子ＤＮＡを
接続する遺伝子プロモーターとしては、ｌａｃＺプロモ
ーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ピル
ビン酸オキシダーゼ遺伝子プロモーター（特開平１−１
４４９７６号公報）などが例示され、これらのプロモー
ターの下流にリボソーム結合部位を介在して、開始コド
ンＡＴＧやＧＴＧを有するＡＤＰＨＫ遺伝子ＤＮＡを接
続し、大腸菌を宿主とするベクターに組み込み、かくの
ごとくして作成されたベクターで大腸菌を形質転換すれ
ばよい。

【００３７】上記の遺伝子操作に一般的に使用される量
的関係は、供与微生物からのＤＮＡ及びベクターＤＮＡ
を０．１〜１０μｇに対し、制限酵素を約１〜１０ｕ、
リガーゼ約３００ｕ、その他の酵素約１〜１０ｕ、程度
が例示される。ＡＤＰＨＫ遺伝子ＤＮＡを含み、ＡＤＰ
ＨＫを産生し得る形質転換微生物の具体的な例示として
は、エシェリヒア・コリに属する微生物を宿主微生物と
し、その内部にＡＤＰＨＫ遺伝子ＤＮＡを含有するプラ
スミドｐｃＨＫ１（制限酵素地図を図１に示した）を保
有する形質転換微生物、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＪＭ１０９・ｐｃＨＫ１
（ＦＥＲＭＢＰ−５４５３）、およびプラスミドｐｃ
ＨＫ２（制限酵素地図を図２に示した）を保有する形質
転換微生物、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｉ）ＪＭ１０９・ｐｃＨＫ２（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５８５１）が挙げられる。

【００３８】形質転換微生物により該ＡＤＰＨＫを製造
するに当たっては、該形質転換微生物を栄養培地で培養
して菌体内又は培養液中に該ＡＤＰＨＫを産生せしめ、
培養終了後、得られた培養物を濾過又は遠心分離などの
手段により菌体を採集し、次いでこの菌体を機械的方法
又はリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、又、必要に
応じてＥＤＴＡ及び／又は適当な界面活性剤などを添加
して該ＡＤＰＨＫの水溶液を濃縮するか、又は濃縮する
事なく硫安分画、ゲル濾過、アフィニティークロマトグ
ラフィー等の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロ
マトグラフィーにより処理して、純度のよい該ＡＤＰＨ
Ｋを得ることができる。

【００３９】形質転換微生物の培養条件はその栄養生理
的性質を考慮して培養条件を選択すれば良く、通常多く
の場合は、液体培養で行うが、工業的には深部通気撹拌
培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては、微
生物の培養に通常用いられるものが広く使用されうる。
炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、
例えばグルコース、サッカロース、ラクトース、マルト
ース、フラクトース、糖蜜などが使用される。窒素源と
しては利用可能な窒素化合物であれば良く、例えばペプ
トン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物など
が使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マ
グネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜
鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが
必要に応じて使用される。

【００４０】培養温度は微生物が発育し、ＡＤＰＨＫを
生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリ
の場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養条件
は、条件によって多少異なるが、ＡＤＰＨＫが最高収量
に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すれ
ばよく、エシェリヒア・コリの場合、通常は１２〜４８
時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し、ＡＤＰＨＫを
生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリ
の場合、好ましくはｐＨ６〜８程度である。

【００４１】培養物中のＡＤＰＨＫは、菌体を含む培養
液そのままを採取し、利用することもできるが、一般に
は常法に従って、ＡＤＰＨＫが培養液中に存在する場合
には、濾過、遠心分離などによりＡＤＰＨＫ含有溶液と
微生物菌体とを分離した後に利用される。ＡＤＰＨＫが
菌体内に存在する場合には、得られた培養物を濾過又は
遠心分離などの手段により、菌体を採取し、次いでこの
菌体を必要に応じて機械的方法又はリゾチームなどの酵
素的方法で破壊し、またＥＤＴＡなどのキレート剤及び
／又は界面活性剤を添加してＡＤＰＨＫを可溶化し水溶
液として分離採取する。この様にして得られたＡＤＰＨ
Ｋ含有溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に、硫
安、硫酸ナトリウムなどの塩析処理などによる分別沈澱
法により沈澱せしめればよい。

【００４２】次いでこの沈澱物を、水に溶解し、半透膜
にて透析せしめて、より低分子量の不純物を除去するこ
とができる。また、吸着剤あるいはゲル濾過剤などによ
るゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の吸
着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー
等により精製し、これらの手段を用いて得られるＡＤＰ
ＨＫ含有溶液から、減圧濃縮凍結乾燥等の処理により精
製されたＡＤＰＨＫが得られる。

【００４３】また、ＡＤＰＨＫの活性測定は、以下の通
りである。測定試薬５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）２０ｍＭグルコース２ｍＭＡＤＰ２ｍＭＭｇＣｌ₂ ５Ｕ／ｍｌＧ６ＰＤＨ（グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ：東洋紡績社製）０．０２５％ＮＢＴ（ニトロテトラゾニウムブルー）１ｍＭＮＡＤＰ１％トリトンＸ−１００５Ｕ／ｍｌＤＩＰ（ジアホラーゼ：旭化成工業社製）

【００４４】測定試薬１ｍｌを３７℃で１分間予備加温
した後、０．０２ｍｌの酵素液を添加して１０分間反応
させる。反応後、０．１Ｎ塩酸を２ｍｌ添加して反応を
停止させ、５分以内に層長１．０ｃｍのセルを用いて、
波長５５０ｎｍにおける吸光度を測定する（Ａｓ）。ま
た、盲検として酵素液のかわりに蒸留水０．０２ｍｌを
用いて同一の操作を行って吸光度を測定する（Ａｂ）、
この酵素使用の吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）
の吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）より酵素活性を求める。酵素
活性１単位は３７℃で１分間に１μモルの還元型ＮＡＤ
Ｐを生成させる酵素量とし、計算式は下記の通りであ
る。酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝（Ａｓ−Ａｂ）×０．７９５×
酵素の希釈倍率

【００４５】以上の製造法により得られるＡＤＰＨＫと
して例えば下記の諸物性を有するＡＤＰＨＫが例示され
る。理化学的性質＜エシェリヒア・コリＪＭ１０９・ｐｃＨＫ１由来＞（１）酵素作用：基質としてグルコースを用いた酵素作
用を以下に示す。ヘキソース＋ＡＤＰ→ヘキソース−６−リン酸＋ＡＭＰ（２）分子量：１００，０００±５，０００ただし、トーソー社製ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ_XL（０．
７５×３０ｃｍ）を用いたゲル濾過法による。（３）至適ｐＨ：ｐＨ６．０〜７．０（リン酸緩衝液）（４）至適温度：８０〜１００℃

【００４６】＜エシェリヒア・コリＪＭ１０９・ｐｃＨ
Ｋ２由来＞（１）酵素作用：基質としてグルコースを用いた酵素作
用を以下に示す。ヘキソース＋ＡＤＰ→ヘキソース−６−リン酸＋ＡＭＰ（２）分子量：５０，０００±５，０００ただし、トーソー社製ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ_XL（０．
７５×３０ｃｍ）を用いたゲル濾過法による。（３）至適ｐＨ：ｐＨ７．０〜７．５（リン酸緩衝液）（４）至適温度：８０〜１００℃

【００４７】

【発明の実施の形態】以下、実施例に基づいて本発明を
より詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定
されるものではない。なお、実施例中、常法に従い、と
記述した操作は、例えば前出のマニアティスらの方法
や、市販の各種酵素、キット類に添付された手順に従え
ば実施できるものである。また、実験に使用した組換え
ＤＮＡ実験酵素試薬（制限酵素など）、ベクターＤＮ
Ａ、キット類は特に指摘しない限り宝酒造株式会社より
購入したものである。

【００４８】実施例１＜ピロコッカス・フリオサスの培養＞好熱菌培地（０．
１％酵母エキス、０．５％トリプトン、０．７２％マル
トース、２．３９％塩化ナトリウム、０．４％硫酸ナト
リウム、０．０７％塩化カリウム、０．０２％炭酸水素
ナトリウム、０．０１％臭化カリウム、０．０３％ホウ
酸、１．０８％塩化マグネシウム、０．１５％塩化カル
シウム、２５ｐｐｍ塩化ストロンチウム、０．０２５％
塩化アンモニウム、０．０１４％リン酸水素２カリウ
ム、０．１％酢酸ナトリウム、１５ｐｐｍニトリロ三酢
酸、５ｐｐｍ硫酸マンガン、１４ｐｐｍ硫酸第１鉄、２
ｐｐｍ塩化ニッケル、１ｐｐｍ硫酸コバルト、１ｐｐｍ
硫酸亜鉛、０．１ｐｐｍ硫酸銅、０．０１ｐｐｍタング
ステン酸ナトリウム、０．０１ｐｐｍモリブデン酸ナト
リウム、０．１％システイン塩酸塩、ｐＨ７）５００ｍ
ｌを５００ｍｌ容三角フラスコ１０本に５０ｍｌずつ分
注し、１２０℃、２０分間、加熱滅菌した後、これにピ
ロコッカス・フリオサスＤＳＭ３６３８株（Ｄｅｕｔｓ
ｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇ
ａｎｉｓｍｅｎｕｎｄＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ
ＧｍｂＨより分与）の菌体懸濁液１０ｍｌを移植し、攪
拌させながら、９５℃で２０時間培養し、種培養液とし
た。次に上記好熱菌培地２００ｌを３００ｌタンクに用
意し、滅菌した後、種培養液を移植し、攪拌させなが
ら、９５℃で１５時間培養し、５ｍＵ／ｍｌの培養液２
００l を得た。

【００４９】実施例２＜ＰｆｕＨＫの精製＞得られた培養液２００ｌを遠心分
離して、得られた菌体を０．９％のＮａＣｌを含む２０
ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で１回洗浄し
た。なお、後のＤＮＡの分離操作のために、培養液５０
０ｍｌ相当分の菌体は別に凍結保存した。洗浄菌体を２
０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁して
２ｌに調整し、クボタ社製の超音波破砕機（ＩＮＳＯＮ
ＡＴＯＲ２０１Ｍ）を用いて１８０Ｗ、３０分間処理
して、菌体破砕液を得た。

【００５０】この破砕液を８０００ｒｐｍ、３０分間遠
心分離し、１．８l （酵素活性９８０Ｕ）の上清を得
た。この上清を透析チューブを用いて１０ｍＭのトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）８l に対して５℃で一夜透
析した後、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）で緩衝化したＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ
（ファルマシア社製）２００ｍｌ（２．６×３８ｃｍ）
のカラムに通し、０〜１モルのＮａＣｌのリニアグラジ
エントで溶出を行った。その結果、０．０８〜０．１モ
ルのＮａＣｌ濃度で活性画分（９５０Ｕ）が溶出され
た。この得られた活性画分に４ＭとなるようにＮａＣｌ
を溶解し、４ＭのＮａＣｌで緩衝化されたＰｈｅｎｙｌ
−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（ファルマシア社製）２０
０ｍｌ（２．６×３８ｃｍ）のカラムに通し、４〜０Ｍ
のＮａＣｌのリニアグラジエントにより溶出を行った。

【００５１】その結果、０．０２から０．０７モルのＮ
ａＣｌ濃度で活性画分（９００Ｕ）が得られた。この得
られた活性画分を１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）
８lに５℃、一夜透析した後、１０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７．５）で緩衝化したヒドロキシアパタイト
（ペンタックス社製）１００ｍｌ（２．６×１９ｃｍ）
のカラムに通し、０〜０．５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ
７．５）のリニアグラジエントにより溶出を行った。そ
の結果、０．０２〜０．０３Ｍのリン酸緩衝液濃度で活
性画分（８５０Ｕ）が溶出された。この酵素液を凍結乾
燥して５ｍｇの酵素粉末（１７０Ｕ／ｍｇ）を得た。

【００５２】実施例３＜ＰｆｕＨＫのＮ末端アミノ酸配列の解析＞実施例２に
より得られた精製ＰｆｕＨＫのＮ末端アミノ酸配列を、
エドマン分解法により決定した。決定されたＮ末端アミ
ノ酸配列は、配列表１のアミノ酸配列の１から３９で表
される。

【００５３】実施例４＜ＰｆｕＨＫ遺伝子クローニング用放射性ＤＮＡプロー
ブの作製＞判明した部分アミノ酸配列をコードするＰｆ
ｕＨＫ遺伝子ＤＮＡの塩基配列を予想した。この配列を
基に設計されるＤＮＡプローブには無数の形状がある
が、本発明ではそのうち、配列表３で表される塩基配列
を有するＨＫ６と命名したオリゴヌクレオチドを使用し
た。

【００５４】このオリゴヌクレオチドを外部機関（ベッ
クス社）に合成依託して作成し、完成したオリゴヌクレ
オチド２００ｎｇをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼバッ
ファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭの２−メ
ルカプトエタノール）、及び７４０ｋＢｑ（キロベクレ
ル）の［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ（第一化学薬品社販売）存在
下、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ８．５ｕで３７℃、
３０分間反応せしめ、ラジオアイソトープ³²Ｐを取り込
ませ放射性ＤＮＡプローブとした。

【００５５】実施例５＜ピロコッカス・フリオサスからのＤＮＡの抽出＞実施
例２で凍結保存していたピロコッカス・フリオサスＤＳ
Ｍ３６３８株の菌体を解凍し、２０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム（ｐＨ７．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＳＤ
Ｓから成る溶液２０ｍｌに懸濁し、等量の水飽和フェノ
ールを加え、攪拌、６５℃５分保温した後、１２，００
０ｒｐｍで１５分遠心分離処理をして水層を回収した。
回収した水層に再度同様のフェノール処理を行った後、
２０ｍｌのクロロホルム・イソアミルアルコール２４対
１混合液を加え、５分撹拌後、１２，０００ｒｐｍで１
５分遠心分離処理をし、再度水層を回収した。

【００５６】回収した水層に１０分の１量の３Ｍ酢酸ナ
トリウム（ｐＨ５．５）を混合後、２倍量のエタノール
を静かに重層し、染色体ＤＮＡをガラス棒に巻き付かせ
て分離した。分離した染色体ＤＮＡを、１０ｍＭのトリ
ス−塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ水溶液（Ｔ
Ｅバッファー）２０ｍｌに溶解し、２０ｍｇ／ｍｌのＲ
ＮａｓｅＡを２００μｌ加え、３７℃で１時間保温し、
混在しているＲＮＡを分解した。次いで、等量のフェノ
ール／クロロホルム混合液を加え、前記と同様に処理し
て、水層を分取した。分取した水層に１０分の１量の３
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）と２倍量のエタノール
を加えて前記の方法でもう一度染色体ＤＮＡを分離し
た。

【００５７】この染色体を５０ｍｌのＴＥ（１０ｍＭの
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ
（ｐＨ８．０））に溶解し、ＴＥ飽和のフェノールとク
ロロホルムの１対１混和液２０ｍｌを加え、全体を懸濁
した後、同様の遠心分離を繰り返し、上層を再び別の容
器に移した。この分離した上層２０ｍｌに３Ｍ酢酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ５．５）２ｍｌとエタノール５０ｍ
ｌを加え、撹拌後−７０℃で５分間冷却した後、遠心分
離（２，０００Ｇ、４℃、１５分）し、沈澱した染色体
を７５％エタノールで洗い、減圧乾燥した。以上の操
作によりピロコッカス・フリオサスＤＳＭ３６３８株の
染色体標品１ｍｇを得た。

【００５８】実施例６＜ＰｆｕＨＫ遺伝子含有ＤＮＡフラグメントの検定＞実
施例５の操作で得られたピロコッカス・フリオサスＤＳ
Ｍ３６３８株の染色体ＤＮＡから遺伝子ライブラリーを
作成するため、本染色体を各種制限酵素で切断し、目的
遺伝子が含有されるＤＮＡフラグメントの鎖長を検定す
る操作を行った。即ち、ピロコッカス・フリオサスＤＳ
Ｍ３６３８株の染色体ＤＮＡ（１０μｇ）を各種制限酵
素で切断し、１．５％アガロースゲル（宝酒造社製Ｈ１
４、４０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸緩衝液（ｐＨ７．４）、
２ｍＭのＥＤＴＡ）で１５０Ｖ、１．５時間電気泳動
し、常法に従ってサザンブロッティングを行い、アガロ
ースゲルからナイロンメンブレン（ＰＡＬＬ社製：バイ
オダインＡ）にＤＮＡを移行させた。

【００５９】このメンブレンを風乾後、ナイロンメンブ
レン添付のマニュアルに従ってプレハイブリダイゼーシ
ョンを行い、さらに実施例４で作成したＨＫ６放射性プ
ローブを使用したハイブリダイゼーションを４５℃で１
晩行った。ハイブリダイゼーション後、メンブレンを５
５℃の洗浄液（６×ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸ナト
リウム〔１×ＳＳＣ：０．１５Ｍ塩化ナトリウム，１５
ｍＭクエン酸ナトリウム〕：メンブレン１００平方ｃｍ
当り約５０ｍｌ）で１０分洗った後、メンブレンを自然
乾燥した。この乾燥したメンブレンをＸ線フィルム（富
士写真フィルム社製、ＮｅｗＲＸＯ−Ｈ）に重ね、遮
光下、−７０℃で２４時間オートラジオグラフィーを行
った。

【００６０】オートラジオグラフィー終了後、フィルム
を現像し、各制限酵素による切断染色体が示すポジティ
ブバンドのサイズを観察した。その結果、ＢｇｌＩＩ切
断により約５ｋｂ（キロベース：ＤＮＡ鎖長の単位、
１，０００塩基対）のＤＮＡフラグメント上にＰｆｕＨ
Ｋ遺伝子が含有されることが明らかとなり、ＢｇｌＩＩ
で切断した染色体ＤＮＡの５ｋｂフラグメントから遺伝
子ライブラリーを作成することとした。

【００６１】実施例７＜遺伝子ライブラリーの作成＞実施例５の操作で得られ
たピロコッカス・フリオサスＤＳＭ３６３８株の染色体
ＤＮＡ１０μｇを制限酵素ＢｇｌＩＩで切断し、常法に
従い約５ｋｂのＤＮＡフラグメントを分離した。このＤ
ＮＡフラグメントを、制限酵素ＢｇｌＩＩで切断しアル
カリフォスファターゼ（以下、ＢＡＰと略称する）１ｕ
で切断末端を脱リン酸化した１μｇのｐＵＣ１１８と、
ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ（宝酒造社製）で連
結させた。これを用いて、常法に従ってコンピテント細
胞としたエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ＡＴＣＣ５３
３２３、東洋紡績社販売）をトランスフォーメーション
し、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有する３．７％のＢ
ＨＩ寒天培地（ＤＩＦＣＯ社製）にて一夜培養し、約
１，０００個のアンピシリン耐性コロニーを得、遺伝子
ライブラリーとした。

【００６２】実施例８＜ＰｆｕＨＫ遺伝子含有クローンのスクリーニング＞実
施例７により得た遺伝子ライブラリーを、ナイロンメン
ブレン（ＰＡＬＬ社製：バイオダインＡ）にレプリカ
し、このフィルターに添付のマニュアルに従って菌体の
ＤＮＡを固定した。このフィルターを添付のマニュアル
に従ってプレハイブリダイゼーションおよび、実施例４
で調製したＨＫ６プローブを使用したハイブリダイゼー
ションを行った。ハイブリダイゼーション後、メンブレ
ンを実施例６に示した５５℃の洗浄液で１０分洗った後
メンブレンを自然乾燥した。この乾燥メンブレンをＸ線
フィルムに重ね、遮光下、−７０℃で２４時間オートラ
ジオグラフィーを行った。オートラジオグラフィー終了
後、フィルムを現像し、ポジティブシグナルを示すコロ
ニーを２個確認した。

【００６３】実施例９＜組み換えプラスミドの抽出＞実施例８で選ばれたポジ
ティブシグナルを示すコロニーを５０μｇ／ｍｌのアン
ピシリン含有ＬＢ液体培地１．５ｍｌに植菌し３７℃で
１６時間振盪培養した後、常法に従ってプラスミドを抽
出した。その結果、２つのコロニーより抽出されたプラ
スミドは同じ染色体ＤＮＡ断片を含むものであり、この
プラスミドのうちの１つをｐｃＨＫ１と命名し、該プラ
スミドを保持するエシェリヒア・コリＪＭ１０９をエシ
ェリヒア・コリＪＭ１０９・ｐｃＨＫ１と命名した。プ
ラスミドｐｃＨＫ１の構造を図１に示す。なお図中の
「ｐｆｕｈｋ」はＰｆｕＨＫ構造遺伝子を、「ａｐ」は
アンピシリン耐性構造遺伝子を、「ｏｒｉ」は大腸菌プ
ラスミドの複製起点領域をそれぞれ表す。

【００６４】実施例１０＜ＰｆｕＨＫ遺伝子ＤＮＡ塩基配列の決定＞実施例９で
得られたプラスミドｐｃＨＫ１より、ＰｆｕＨＫ構造遺
伝子部分についてジデオキシ法により塩基配列を決定し
た。決定した塩基配列およびそのコードするアミノ酸配
列は配列表１に示した。

【００６５】実施例１１＜ＴｌｉＨＫ遺伝子クローニング用放射性ＤＮＡプロー
ブの作製＞次にピロコッカス・フリオサスと同様に超高
度好熱性古細菌であるサーモコッカス・リトラリスにお
ける、ＰｆｕＨＫと一次構造上の相同性を有しかつＡＤ
ＰＨＫ活性を有する酵素ＴｌｉＨＫの存非に着目し、こ
のＴｌｉＨＫの遺伝子をクローニングするために、Ｐｆ
ｕＨＫ遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を使用して、Ｔｌ
ｉＨＫの遺伝子の分離に使用するＤＮＡプローブを作製
することを計画し、以下のような操作を実施した。

【００６６】１μｇの実施例９で調製したプラスミドｐ
ｃＨＫ１を制限酵素ＥｃｏＲＶで切断し、ＰｆｕＨＫ遺
伝子の一部を含む約１．３ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従
って分離した。このＤＮＡ断片５０ｎｇに、ランダムプ
ライマーラベリングキット（宝酒造社：ＢｃａＢＥＳＴ
ＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ）と３７０ｋＢｑの［α−
³²Ｐ］ｄＣＴＰ（第一化学薬品社販売）を使用して、添
付のマニュアルに従って反応させ、³²Ｐで標識された放
射性ＤＮＡプローブを作製した。

【００６７】実施例１２＜サーモコッカス・リトラリスの培養＞好熱菌培地５０
０ｍｌを１０００ｍｌ容三角フラスコに準備し、１２０
℃、２０分間、加熱滅菌した後、これにサーモコッカス
・リトラリスＡＴＣＣ５１８５０株（Ａｍｅｒｉｃａｎ
ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎよ
り分与）を移植し、攪拌させながら、８５℃で２０時間
培養した。本培養液を６，０００ｒｐｍで３０分遠心し
て集菌した。

【００６８】実施例１３＜サーモコッカス・リトラリスからのＤＮＡの抽出＞実
施例１２で培養、集菌したサーモコッカス・リトラリス
ＡＴＣＣ５１８５０株の菌体を、２０ｍＭの酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ７．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＳ
ＤＳから成る溶液２０ｍｌに懸濁し、等量の水飽和フェ
ノールを加え、攪拌、６５℃５分保温した後、１２，０
００ｒｐｍで１５分遠心分離処理をして水層を回収し
た。回収した水層に再度同様のフェノール処理を行った
後、２０ｍｌのクロロホルム・イソアミルアルコール２
４対１混合液を加え、５分撹拌後、１２，０００ｒｐｍ
で１５分遠心分離処理をし、再度水層を回収した。

【００６９】回収した水層に１０分の１量の３Ｍの酢酸
ナトリウム（ｐＨ５．５）を混合後、２倍量のエタノー
ルを静かに重層し、染色体ＤＮＡをガラス棒に巻き付か
せて分離した。分離した染色体ＤＮＡを、ＴＥバッファ
ー（１０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭの
ＥＤＴＡ水溶液）２０ｍｌに溶解し、２０ｍｇ／ｍｌの
ＲＮａｓｅＡを２００μｌ加え、３７℃で１時間保温
し、混在しているＲＮＡを分解した。次いで、等量のフ
ェノール／クロロホルム混合液を加え、前記と同様に処
理して、水層を分取した。分取した水層に１０分の１量
の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）と２倍量のエタ
ノールを加えて前記の方法でもう一度染色体ＤＮＡを分
離した。

【００７０】この染色体を５０ｍｌのＴＥバッファーに
溶解し、ＴＥバッファー飽和のフェノールとクロロホル
ムの１対１混和液２０ｍｌを加え、全体を懸濁した後、
同様の遠心分離を繰り返し、上層を再び別の容器に移し
た。この分離した上層２０ｍｌに３Ｍの酢酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ５．５）２ｍｌとエタノール５０ｍｌを加
え、撹拌後−７０℃で５分間冷却した後、遠心分離
（２，０００Ｇ、４℃、１５分）し、沈澱した染色体を
７５％のエタノールで洗い、減圧乾燥した。以上の操作
によりサーモコッカス・リトラリスＡＴＣＣ５１８５０
株の染色体標品１ｍｇを得た。

【００７１】実施例１４＜ＰｆｕＨＫ遺伝子相同ＤＮＡフラグメントの検定＞実
施例１３の操作で得られたサーモコッカス・リトラリス
ＡＴＣＣ５１８５０株の染色体ＤＮＡから遺伝子ライブ
ラリーを作成するため、本染色体を各種制限酵素で切断
し、目的遺伝子が含有されるＤＮＡフラグメントの鎖長
を検定する操作を行った。すなわち、サーモコッカス・
リトラリスＡＴＣＣ５１８５０株の染色体ＤＮＡ（１０
μｇ）を各種制限酵素で切断し、１．５％アガロースゲ
ル（宝酒造社製Ｈ１４、４０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸緩衝
液（ｐＨ７．４）、２ｍＭのＥＤＴＡ）で１５０Ｖ、
１．５時間電気泳動し、常法に従ってサザンブロッティ
ングを行い、アガロースゲルからナイロンメンブレン
（ＰＡＬＬ社製：バイオダインＡ）にＤＮＡを移行させ
た。

【００７２】このメンブレンを風乾後、１平方ｃｍあた
り０．０５ｍｌのハイブリダイゼーション溶液（０．１
％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１
％ウシ胎児血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略称する）
（シグマ社製）、０．７５Ｍ塩化ナトリウム、７５ｍＭ
クエン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸３ナトリウム、
０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、２５０μｇ／ｍｌサ
ケ精子ＤＮＡ（ベーリンガー・マンハイム社製）、３０
％ホルムアミド）に浸し、４２℃で２時間プレハイブリ
ダイゼーション処理を行った。

【００７３】処理終了後、ハイブリダイゼーション溶液
を新しいものに交換し、実施例１１で作成した放射性Ｄ
ＮＡプローブを７４ｋＢｑ添加し、同じく４２℃でハイ
ブリダイゼーション処理を一晩行った。ハイブリダイゼ
ーション後、メンブレンを１００平方ｃｍ当り５０ｍｌ
の洗浄液（７５ｍＭの塩化ナトリウム，７．５ｍＭのク
エン酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ）で５０℃下、１
０分洗った後、メンブレンを自然乾燥した。この乾燥し
たメンブレンをＸ線フィルム（富士写真フィルム社製、
ＮｅｗＲＸＯ−Ｈ）に重ね、遮光下、−７０℃で７２
時間オートラジオグラフィーを行った。

【００７４】オートラジオグラフィー終了後、フィルム
を現像し、各制限酵素による切断染色体が示すポジティ
ブバンドのサイズを観察した。その結果、ＥｃｏＴ２２
Ｉによる切断により約２．５ｋｂのＤＮＡフラグメント
上にＰｆｕＨＫ遺伝子ＤＮＡと相同性を有する塩基配列
が含有されることを示唆するポジティブバンドが確認さ
れ、ＥｃｏＴ２２Ｉで切断した染色体ＤＮＡの２．５ｋ
ｂフラグメントから遺伝子ライブラリーを作成すること
とした。

【００７５】実施例１５＜遺伝子ライブラリーの作成＞実施例１３の操作で得ら
れたサーモコッカス・リトラリスＡＴＣＣ５１８５０株
の染色体ＤＮＡ１０μｇを制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉで切
断し、常法に従い約２．５ｋｂのＤＮＡフラグメントを
分離した。このＤＮＡフラグメントを、制限酵素Ｐｓｔ
Ｉで切断しアルカリフォスファターゼ（以下、ＢＡＰと
略称する）１ｕで切断末端を脱リン酸化した１μｇのｐ
ＵＣ１１９と、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造
社：ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ）で連結させ
た。これを用いて、常法に従ってコンピテント細胞とし
たエシェリヒア・コリＪＭ１０９をトランスフォーメー
ションし、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有する３．７
％のＢＨＩ寒天培地にて一夜培養し、約２，５００個の
アンピシリン耐性コロニーを得、遺伝子ライブラリーと
した。

【００７６】実施例１６＜ＰｆｕＨＫ遺伝子相同ＤＮＡ含有クローンのスクリー
ニング＞実施例１５により得た遺伝子ライブラリーを、
ナイロンメンブレン（ＰＡＬＬ社製：バイオダインＡ）
にレプリカし、このメンブレンに添付のマニュアルに従
って菌体のＤＮＡを固定した。このＤＮＡを固定したメ
ンブレンを実施例１４に示したハイブリダイゼーション
溶液（メンブレン１平方ｃｍ当たり２０μｌ）に浸し、
４２℃で２時間プレハイブリダイゼーション処理を行っ
た。処理終了後、ハイブリダイゼーション溶液を新しい
ものに交換し、実施例１１で作成した放射性ＤＮＡプロ
ーブを７４ｋＢｑ添加し、同じく４２℃でハイブリダイ
ゼーション処理を一晩行った。ハイブリダイゼーション
後、メンブレンを実施例１４に示した５０℃の洗浄液
（メンブレン１００平方ｃｍ当り５０ｍｌ）で１０分洗
った後、自然乾燥した。この乾燥したメンブレンをＸ線
フィルム（富士写真フィルム社製、ＮｅｗＲＸＯ−
Ｈ）に重ね、遮光下、−７０℃で２４時間オートラジオ
グラフィーを行った。オートラジオグラフィー終了後、
フィルムを現像し、ポジティブシグナルをしめすコロニ
ーを３個確認した。

【００７７】実施例１７＜組み換えプラスミドの抽出＞実施例１６で選ばれたポ
ジティブシグナルを示すコロニーを５０μｇ／ｍｌのア
ンピシリン含有ＬＢ液体培地１．５ｍｌに植菌し３７℃
で１６時間振盪培養した後、常法に従ってプラスミドを
抽出した。その結果、３つのコロニーより抽出されたプ
ラスミドは同じ染色体ＤＮＡ断片を含むものであり、こ
のプラスミドのうちの１つをｐｃＨＫＴと命名した。

【００７８】実施例１８＜ＴｌｉＨＫ遺伝子ＤＮＡ塩基配列の決定＞実施例１７
で得られたプラスミドｐｃＨＫＴに含有されるサーモコ
ッカス・リトラリス由来の２．５ｋｂのＤＮＡについて
ジデオキシ法により塩基配列を決定した。その結果、Ｄ
ＮＡ中に約１．４ｋｂの長さを有しＰｆｕＨＫ構造遺伝
子の塩基配列と６４．８％の相同性を有する（ソフトウ
ェア開発社製：ＧＥＮＥＴＹＸｖｅｒ．９．０によ
る）構造遺伝子を確認し、これをＴｌｉＨＫ遺伝子と認
定した。このことから、少なくとも６０％以上の塩基配
列の相同性を有する異なる生物由来のＡＤＰＨＫ遺伝子
ＤＮＡ、変異ＡＤＰＨＫ遺伝子ＤＮＡの取得が可能と認
められる。また該ＴｌｉＨＫ構造遺伝子がコードするア
ミノ酸配列は、ＰｆｕＨＫのアミノ酸配列と５８．９％
の相同性を有していた（同上）。このことから、少なく
とも５５％以上のアミノ酸の相同性を有する異なる生物
由来のＡＤＰＨＫの遺伝子ＤＮＡ、変異ＡＤＰＨＫの遺
伝子ＤＮＡの取得が可能と認められる。決定したＴｌｉ
ＨＫ遺伝子ＤＮＡの塩基配列およびそのコードするアミ
ノ酸配列は配列表２に示した。

【００７９】実施例１９＜ＴｌｉＨＫ発現用プラスミドの作製＞１μｇのｐｃＨ
ＫＴを用い、制限酵素ＳａｌＩ及びＳｐｈＩそれぞれ５
単位で添付のマニュアルに従って３７℃で２時間切断処
理し、０．７％アガロースゲル電気泳動で約２．０ｋｂ
のＴｌｉＨＫ遺伝子を含むＤＮＡ断片を分離回収した。
このＤＮＡフラグメントを、前記と同様に制限酵素で切
断した１μｇのｐＵＣ１１８とＤＮＡライゲーションキ
ットで連結させた。これを用いて、常法に従ってコンピ
テント細胞としたエシェリヒア・コリＪＭ１０９にトラ
ンスフォーメーションし、５０μｇ／ｍｌのアンピシリ
ンを含有する３．７％のＢＨＩ寒天培地にて一夜培養し
た。

【００８０】このようにして、ｐＵＣ１１８のＳａｌＩ
及びＳｐｈＩ部位にＴｌｉＨＫ遺伝子を含む約２．０ｋ
ｂのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを保持するエシ
ェリヒア・コリＪＭ１０９を取得し、該形質転換株をエ
シェリヒア・コリＪＭ１０９・ｐｃＨＫ２、本株が保持
するプラスミドをｐｃＨＫ２と命名した。さらにｐｃＨ
Ｋ２を常法により抽出した。プラスミドｐｃＨＫ２の構
造を図２に示す。なお図中の「ｔｌｉｈｋ」はＴｌｉＨ
Ｋ構造遺伝子を、「ａｐ」はアンピシリン耐性構造遺伝
子を、「ｏｒｉ」は大腸菌プラスミドの複製起点領域を
それぞれ表す。

【００８１】実施例２０＜ｐｃＨＫ１およびｐｃＨＫ２保持大腸菌の培養とその
細胞抽出液の調製＞エシェリヒア・コリＪＭ１０９・ｐ
ｃＨＫ１とエシェリヒア・コリＪＭ１０９・ｐｃＨＫ２
を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有した３．７％
ＢＨＩ（ＤＩＦＣＯ社製）液体培地１．５ｍｌで３７
℃、１６時間培養し、そのうち１ｍｌを遠心分離（１
５，０００Ｇ、１分、４℃）により集菌し、２００μｌ
の１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、
超音波破砕機を用いて菌体を破砕した後、遠心分離（１
４，０００Ｇ、５分、４℃）し、上清を取得して細胞抽
出液とした。同様に、ＡＤＰＨＫ遺伝子を含まないクロ
ーニングベクターｐＵＣ１１８により形質転換されたエ
シェリヒア・コリＪＭ１０９・ｐＵＣ１１８の抽出液も
調製した。

【００８２】実施例２１＜細胞抽出液中のＡＤＰＨＫ酵素活性の確認＞実施例２
０で調製したエシェリヒア・コリＪＭ１０９・ｐｃＨＫ
１、エシェリヒア・コリＪＭ１０９・ｐｃＨＫ２、およ
びエシェリヒア・コリＪＭ１０９・ｐＵＣ１１８の細胞
抽出液中のＡＤＰＨＫ酵素活性を、以下のＡＤＰＨＫ酵
素活性測定法によって測定した。測定試薬１５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）２０ｍＭグルコース２ｍＭＡＤＰ２ｍＭＭｇＣｌ₂ 測定試薬２５０Ｕ／ｍｌＧ６ＰＤＨ０．２５％ＮＢＴ（ニトロテトラゾニウムブルー）１０ｍＭＮＡＤＰ１０％トリトンＸ−１００５Ｕ／ｍｌＤＩＰ

【００８３】１ｍｌの測定試薬１を８０℃で５分間予備
加温した後、０．０２ｍｌの酵素液を添加して１０分間
反応させる。反応後、反応液を３７℃で５分間予備加温
した後、測定試薬２を０．１ｍｌ添加して１０分間反応
させる。反応後、０．１Ｎ塩酸を２ｍｌ添加して反応を
停止させ、５分以内に層長１．０ｃｍのセルを用いて、
波長５５０ｎｍにおける吸光度を測定する（Ａｓ）。ま
た盲検として酵素液のかわりに蒸留水０．０２ｍｌを用
いて同一の操作を行って吸光度を測定する（Ａｂ）、こ
の酵素使用の吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の
吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）より酵素活性を求める。酵素活
性１単位は３７℃で１分間に１μモルの還元型ＮＡＤＰ
を生成させる酵素量とし、計算式は下記の通りである。酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝（Ａｓ−Ａｂ）×０．７９５×
酵素の希釈倍率

【００８４】上記の方法により活性を測定した結果は、
エシェリヒア・コリＪＭ１０９・ｐｃＨＫ１では培養液
１ｍｌあたり０．１１ユニット、エシェリヒア・コリＪ
Ｍ１０９・ｐｃＨＫ２では培養液１ｍｌあたり０．１３
ユニット（ともに８０℃反応時）の活性が検出され、エ
シェリヒア・コリＪＭ１０９・ｐＵＣ１１８には活性は
検出されなかった。これによりエシェリヒア・コリＪＭ
１０９・ｐｃＨＫ１およびエシェリヒア・コリＪＭ１０
９・ｐｃＨＫ２でのＡＤＰＨＫの活性発現が確認され
た。

【００８５】

【発明の効果】ＡＤＰＨＫ活性を有するＰｆｕＨＫの部
分アミノ酸配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチド
を使用して、ＰｆｕＨＫ生産菌株に由来する染色体ＤＮ
ＡライブラリーからＰｆｕＨＫ遺伝子ＤＮＡの全塩基配
列を明確とした新規なＰｆｕＨＫ遺伝子を分離した、ま
たＰｆｕＨＫ遺伝子を基に、ＡＤＰＨＫ活性を有する別
の酵素ＴｌｉＨＫ遺伝子ＤＮＡを分離したもので、これ
らのＡＤＰＨＫ遺伝子ＤＮＡを利用して、高効率なＡＤ
ＰＨＫの生産が可能になった。

【００８６】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：１３６５配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ起源生物名：ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃ
ｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ）株名：ＤＳＭ３６３８配列の特徴ＰＣＤＳ配列 ATG CCC ACT TGG GAG GAG CTT TAT AAA AAT GCA ATA GAG AAG GCC ATA 48 Met Pro Thr Trp Glu Glu Leu Tyr Lys Asn Ala Ile Glu Lys Ala Ile 1 5 10 15 AAA TCA GTG CCA AAG GTT AAA GGG GTT CTG CTT GGA TAT AAC ACA AAC 96 Lys Ser Val Pro Lys Val Lys Gly Val Leu Leu Gly Tyr Asn Thr Asn 20 25 30 ATC GAC GCT ATA AAA TAC TTG GAC AGC AAG GAC CTT GAG GAA AGA ATA 144 Ile Asp Ala Ile Lys Tyr Leu Asp Ser Lys Asp Leu Glu Glu Arg Ile 35 40 45 ATA AAA GCT GGA AAA GAG GAA GTG ATA AAG TAT TCA GAA GAG CTC CCA 192 Ile Lys Ala Gly Lys Glu Glu Val Ile Lys Tyr Ser Glu Glu Leu Pro 50 55 60 GAT AAA ATC AAC ACT GTC TCT CAA CTC CTT GGT TCA ATA CTT TGG AGC 240 Asp Lys Ile Asn Thr Val Ser Gln Leu Leu Gly Ser Ile Leu Trp Ser 65 70 75 80 ATA AGA AGG GGA AAA GCT GCA GAA CTG TTC GTC GAA AGT TGC CCA GTG 288 Ile Arg Arg Gly Lys Ala Ala Glu Leu Phe Val Glu Ser Cys Pro Val 85 90 95 AGA TTT TAC ATG AAG AGA TGG GGC TGG AAT GAG CTC AGA ATG GGA GGC 336 Arg Phe Tyr Met Lys Arg Trp Gly Trp Asn Glu Leu Arg Met Gly Gly 100 105 110 CAA GCT GGA ATA ATG GCA AAT CTC TTG GGA GGA GTT TAT GGG GTT CCT 384 Gln Ala Gly Ile Met Ala Asn Leu Leu Gly Gly Val Tyr Gly Val Pro 115 120 125 GTA ATT GTT CAC GTT CCC CAG CTT TCA AGA CTC CAA GCT AAT CTA TTC 432 Val Ile Val His Val Pro Gln Leu Ser Arg Leu Gln Ala Asn Leu Phe 130 135 140 TTG GAC GGC CCG ATC TAC GTT CCA ACT TTG GAG AAT GGA GAA GTA AAA 480 Leu Asp Gly Pro Ile Tyr Val Pro Thr Leu Glu Asn Gly Glu Val Lys 145 150 155 160 TTG ATC CAT CCA AAG GAG TTT AGT GGA GAC GAA GAG AAC TGT ATC CAC 528 Leu Ile His Pro Lys Glu Phe Ser Gly Asp Glu Glu Asn Cys Ile His 165 170 175 TAC ATT TAT GAA TTC CCC AGG GGA TTC AGA GTT TTT GAG TTT GAA GCA 576 Tyr Ile Tyr Glu Phe Pro Arg Gly Phe Arg Val Phe Glu Phe Glu Ala 180 185 190 CCT AGA GAG AAT AGA TTC ATA GGC TCC GCC GAT GAT TAC AAC ACA ACT 624 Pro Arg Glu Asn Arg Phe Ile Gly Ser Ala Asp Asp Tyr Asn Thr Thr 195 200 205 CTC TTC ATA AGA GAG GAG TTT AGA GAA AGC TTT AGC GAA GTA ATA AAG 672 Leu Phe Ile Arg Glu Glu Phe Arg Glu Ser Phe Ser Glu Val Ile Lys 210 215 220 AAC GTC CAG TTA GCA ATA CTG AGT GGA CTG CAG GCT TTA ACA AAA GAG 720 Asn Val Gln Leu Ala Ile Leu Ser Gly Leu Gln Ala Leu Thr Lys Glu 225 230 235 240 AAC TAC AAG GAG CCT TTT GAG ATT GTC AAG TCG AAC TTG GAG GTT CTG 768 Asn Tyr Lys Glu Pro Phe Glu Ile Val Lys Ser Asn Leu Glu Val Leu 245 250 255 AAC GAG AGG GAA ATC CCA GTT CAC TTG GAA TTT GCA TTT ACG CCT GAC 816 Asn Glu Arg Glu Ile Pro Val His Leu Glu Phe Ala Phe Thr Pro Asp 260 265 270 GAA AAA GTT AGA GAA GAG ATA TTG AAC GTT CTT GGA ATG TTC TAC AGT 864 Glu Lys Val Arg Glu Glu Ile Leu Asn Val Leu Gly Met Phe Tyr Ser 275 280 285 GTA GGG CTT AAC GAG GTA GAG CTG GCA TCA ATA ATG GAA ATC TTG GGA 912 Val Gly Leu Asn Glu Val Glu Leu Ala Ser Ile Met Glu Ile Leu Gly 290 295 300 GAG AAG AAG CTC GCA AAA GAA CTA CTG GCC CAC GAT CCC GTA GAT CCA 960 Glu Lys Lys Leu Ala Lys Glu Leu Leu Ala His Asp Pro Val Asp Pro 305 310 315 320 ATA GCT GTG ACT GAA GCA ATG TTA AAG CTT GCC AAG AAG ACT GGG GTT 1008 Ile Ala Val Thr Glu Ala Met Leu Lys Leu Ala Lys Lys Thr Gly Val 325 330 335 AAG AGG ATA CAC TTC CAC ACG TAT GGT TAT TAT CTC GCA CTA ACC GAA 1056 Lys Arg Ile His Phe His Thr Tyr Gly Tyr Tyr Leu Ala Leu Thr Glu 340 345 350 TAC AAG GGA GAG CAC GTG AGG GAT GCT CTC CTA TTT GCA GCC CTA GCA 1104 Tyr Lys Gly Glu His Val Arg Asp Ala Leu Leu Phe Ala Ala Leu Ala 355 360 365 GCC GCT GCC AAG GCC ATG AAA GGA AAC ATA ACA AGC CTT GAA GAA ATA 1152 Ala Ala Ala Lys Ala Met Lys Gly Asn Ile Thr Ser Leu Glu Glu Ile 370 375 380 AGA GAA GCC ACA AGT GTT CCA GTC AAT GAA AAA GCC ACC CAG GTC GAA 1200 Arg Glu Ala Thr Ser Val Pro Val Asn Glu Lys Ala Thr Gln Val Glu 385 390 395 400 GAG AAA CTA AGA GCA GAG TAT GGA ATT AAG GAA GGA ATA GGA GAA GTG 1248 Glu Lys Leu Arg Ala Glu Tyr Gly Ile Lys Glu Gly Ile Gly Glu Val 405 410 415 GAG GGA TAT CAA ATA GCT TTC ATT CCA ACT AAA ATA GTG GCA AAA CCA 1296 Glu Gly Tyr Gln Ile Ala Phe Ile Pro Thr Lys Ile Val Ala Lys Pro 420 425 430 AAG AGC ACT GTC GGA ATT GGG GAC ACC ATC TCA AGC TCG GCA TTT ATT 1344 Lys Ser Thr Val Gly Ile Gly Asp Thr Ile Ser Ser Ser Ala Phe Ile 435 440 445 GGT GAG TTT TCA TTC ACT CTC 1365 Gly Glu Phe Ser Phe Thr Leu 450 455

【００８７】配列番号：２配列の長さ：１４０１配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ起源生物名：サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃ
ｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ）株名：ＡＴＣＣ５１８５０配列の特徴ＰＣＤＳ配列 ATG AAG GAA AGC CTT AAA GAT AGG ATA AGA TTG TGG AAA AGG CTG TAT 48 Met Lys Glu Ser Leu Lys Asp Arg Ile Arg Leu Trp Lys Arg Leu Tyr 1 5 10 15 GTA AAC GCC TTT GAG AAT GCC CTA AAC GCT ATC CCA AAC GTT AAG GGT 96 Val Asn Ala Phe Glu Asn Ala Leu Asn Ala Ile Pro Asn Val Lys Gly 20 25 30 GTT CTT CTG GCA TAT AAC ACC AAC ATT GAT GCC ATA AAA TAC TTA GAC 144 Val Leu Leu Ala Tyr Asn Thr Asn Ile Asp Ala Ile Lys Tyr Leu Asp 35 40 45 AAG GAC GAT CTA GAA AAG AGA GTA ACC GAA ATA GGG AAA GAG AAG GTT 192 Lys Asp Asp Leu Glu Lys Arg Val Thr Glu Ile Gly Lys Glu Lys Val 50 55 60 TTT GAA ATT ATT GAA AAT CCA CCT GAA AAG ATC TCC TCC ATT GAA GAG 240 Phe Glu Ile Ile Glu Asn Pro Pro Glu Lys Ile Ser Ser Ile Glu Glu 65 70 75 80 CTT CTT GGT GGA ATA TTG AGG AGC ATA AAA CTT GGC AAG GCT ATG GAG 288 Leu Leu Gly Gly Ile Leu Arg Ser Ile Lys Leu Gly Lys Ala Met Glu 85 90 95 TGG TTT GTA GAG AGT GAG GAA GTG AGG AGA TAC TTA AGG GAA TGG GGA 336 Trp Phe Val Glu Ser Glu Glu Val Arg Arg Tyr Leu Arg Glu Trp Gly 100 105 110 TGG GAT GAG CTG AGA ATA GGA GGG CAG GCA GGG ATA ATG GCG AAC CTT 384 Trp Asp Glu Leu Arg Ile Gly Gly Gln Ala Gly Ile Met Ala Asn Leu 115 120 125 CTT GGG GGA GTG TAT AGA ATT CCA ACG ATT GTT CAT GTT CCT CAG AAT 432 Leu Gly Gly Val Tyr Arg Ile Pro Thr Ile Val His Val Pro Gln Asn 130 135 140 CCA AAG CTT CAG GCG GAG TTG TTT GTA GAT GGT CCT ATT TAT GTC CCC 480 Pro Lys Leu Gln Ala Glu Leu Phe Val Asp Gly Pro Ile Tyr Val Pro 145 150 155 160 GTC TTT GAA GGA AAT AAG TTG AAG CTA GTT CAC CCT AAA GAT GCC ATT 528 Val Phe Glu Gly Asn Lys Leu Lys Leu Val His Pro Lys Asp Ala Ile 165 170 175 GCA GAG GAA GAA GAG TTA ATC CAC TAC ATA TAT GAA TTT CCC AGA GGT 576 Ala Glu Glu Glu Glu Leu Ile His Tyr Ile Tyr Glu Phe Pro Arg Gly 180 185 190 TTT CAG GTT TTT GAT GTT CAA GCA CCA AGA GAG AAT AGA TTC ATA GCC 624 Phe Gln Val Phe Asp Val Gln Ala Pro Arg Glu Asn Arg Phe Ile Ala 195 200 205 AAT GCC GAT GAC TAC AAC GCG AGG GTC TAC ATG AGA AGG GAA TTC AGA 672 Asn Ala Asp Asp Tyr Asn Ala Arg Val Tyr Met Arg Arg Glu Phe Arg 210 215 220 GAA GGC TTT GAG GAA ATT ACC AGA AAT GTT GAG CTA GCG ATA ATA AGC 720 Glu Gly Phe Glu Glu Ile Thr Arg Asn Val Glu Leu Ala Ile Ile Ser 225 230 235 240 GGG CTG CAG GTT TTA AAG GAA TAC TAT CCC GAC GGA ACA ACA TAC AGA 768 Gly Leu Gln Val Leu Lys Glu Tyr Tyr Pro Asp Gly Thr Thr Tyr Arg 245 250 255 GAT GTT CTT GAT AGA GTC GAA AGT CAT TTG AAT ATC CTC AAC CGC TAC 816 Asp Val Leu Asp Arg Val Glu Ser His Leu Asn Ile Leu Asn Arg Tyr 260 265 270 AAC GTG AAG AGC CAT TTT GAA TTT GCA TAT ACT GCA AAC AGA AGG GTT 864 Asn Val Lys Ser His Phe Glu Phe Ala Tyr Thr Ala Asn Arg Arg Val 275 280 285 AGG GAG GCA CTT GTA GAG CTT TTA CCG AAG TTC ACA AGC GTC GGC CTT 912 Arg Glu Ala Leu Val Glu Leu Leu Pro Lys Phe Thr Ser Val Gly Leu 290 295 300 AAT GAA GTA GAA CTT GCC TCA ATA ATG GAG ATA ATA GGA GAC GAG GAG 960 Asn Glu Val Glu Leu Ala Ser Ile Met Glu Ile Ile Gly Asp Glu Glu 305 310 315 320 CTG GCA AAA GAA GTT CTG GAG GGA CAT ATC TTC TCA GTC ATA GAT GCG 1008 Leu Ala Lys Glu Val Leu Glu Gly His Ile Phe Ser Val Ile Asp Ala 325 330 335 ATG AAT GTT TTA ATG GAC GAG ACA GGA ATT GAG AGA ATT CAC TTC CAC 1056 Met Asn Val Leu Met Asp Glu Thr Gly Ile Glu Arg Ile His Phe His 340 345 350 ACC TAC GGC TAC TAC CTC GCC CTA ACT CAA TAC AGA GGA GAA GAG GTA 1104 Thr Tyr Gly Tyr Tyr Leu Ala Leu Thr Gln Tyr Arg Gly Glu Glu Val 355 360 365 AGA GAT GCT CTG CTC TTT GCA TCC CTC GCT GCA GCT GCC AAA GCC ATG 1152 Arg Asp Ala Leu Leu Phe Ala Ser Leu Ala Ala Ala Ala Lys Ala Met 370 375 380 AAA GGA AAC CTT GAA AGA ATA GAG CAG ATT AGA GAT GCC CTA AGT GTA 1200 Lys Gly Asn Leu Glu Arg Ile Glu Gln Ile Arg Asp Ala Leu Ser Val 385 390 395 400 CCA ACA AAT GAA AGG GCA ATA GTG CTT GAA GAA GAA CTT GAA AAG GAG 1248 Pro Thr Asn Glu Arg Ala Ile Val Leu Glu Glu Glu Leu Glu Lys Glu 405 410 415 TTC ACA GAA TTT GAG AAC GGC CTT ATT GAT ATG GTG GAC AGA CAA CTT 1296 Phe Thr Glu Phe Glu Asn Gly Leu Ile Asp Met Val Asp Arg Gln Leu 420 425 430 GCT TTT GTG CCA ACA AAG ATT GTA GCA TCT CCC AAG AGC ACC GTT GGA 1344 Ala Phe Val Pro Thr Lys Ile Val Ala Ser Pro Lys Ser Thr Val Gly 435 440 445 ATT GGA GAT ACC ATT TCA AGC TCT GCT TTT GTC AGT GAA TTT GGC ATG 1392 Ile Gly Asp Thr Ile Ser Ser Ser Ala Phe Val Ser Glu Phe Gly Met 450 455 460 AGG AAA AGG 1401 Arg Lys Arg 465

【００８８】配列番号：３配列の長さ：３２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Ｏｔｈｅｒｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ
（合成ＤＮＡ）配列の特徴ＳＣＤＳ配列 GGW TAY AAC ACW AAC ATW GAY GCW ATW AAG TA 32 Gly Tyr Asn Thr Asn Ile Asp Ala Ile Lys Tyr 1 5 10

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明によるプラスミドｐｃＨＫ１の制限酵素
地図を示すものである。

【図２】本発明によるプラスミドｐｃＨＫ２の制限酵素
地図を示すものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アデノシン３リン酸を利用せず、少なく
ともアデノシン２リン酸存在下、このアデノシン２リン
酸とヘキソースからヘキソース６リン酸とアデノシン１
リン酸を生成する反応を触媒するヘキソキナーゼのアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡ。
【請求項２】アミノ酸配列が、配列表１のアミノ酸配
列の１から４５５で表される配列である請求項１に記載
のＤＮＡ。
【請求項３】ＤＮＡが、配列表１の塩基配列の１から
１３６５で表される塩基配列を有するＤＮＡである請求
項１に記載のＤＮＡ。
【請求項４】アミノ酸配列が、配列表２のアミノ酸配
列の１から４６７で表される配列である請求項１に記載
のＤＮＡ。
【請求項５】ＤＮＡが、配列表１のアミノ酸配列の１
から４５５で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配
列を有するＤＮＡをプローブ作製に使用したハイブリダ
イゼーション操作により陽性となるＤＮＡである請求項
１に記載のＤＮＡ。
【請求項６】請求項１記載のＤＮＡが、配列表１の塩
基配列の１から１３６５で表される塩基配列を有するＤ
ＮＡをプローブ作製に使用したハイブリダイゼーション
操作により陽性となるＤＮＡである請求項５に記載のＤ
ＮＡ。
【請求項７】請求項１記載のＤＮＡが、配列表２の塩
基配列の１から１４０１で表される塩基配列を有するＤ
ＮＡである請求項５に記載のＤＮＡ。
【請求項８】ＤＮＡが、配列表２のアミノ酸配列の１
から４６７で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配
列を有するＤＮＡをプローブ作製に使用したハイブリダ
イゼーション操作により陽性となるＤＮＡである請求項
１に記載のＤＮＡ。
【請求項９】請求項１記載のＤＮＡが、配列表２の塩
基配列の１から１４０１で表される塩基配列を有するＤ
ＮＡをプローブ作製に使用したハイブリダイゼーション
操作により陽性となるＤＮＡである請求項８に記載のＤ
ＮＡ。
【請求項１０】ＤＮＡが、配列表１のアミノ酸配列の
１から４５５で表されるアミノ酸配列に削除、付加、ま
たは置換を行うことによって得られるヘキソキナーゼ活
性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡである請求
項１に記載のＤＮＡ。
【請求項１１】ＤＮＡが、配列表２のアミノ酸配列の
１から４６７で表されるアミノ酸配列に削除、付加、ま
たは置換を行うことによって得られるヘキソキナーゼ活
性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡである請求
項１に記載のＤＮＡ。
【請求項１２】宿主にとって外来性である、アデノシ
ン３リン酸を利用せず、少なくともアデノシン２リン酸
存在下、このアデノシン２リン酸とヘキソースからヘキ
ソース６リン酸とアデノシン１リン酸を生成する反応を
触媒するヘキソキナーゼの生産能を有することを特徴と
する実質的に純粋な遺伝子組換え微生物。
【請求項１３】遺伝子組換え微生物が、エシェリヒア
属に属する微生物である請求項１２に記載の遺伝子組換
え微生物。
【請求項１４】遺伝子組換え微生物が、エシェリヒア
・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＪＭ１０
９・ｐｃＨＫ１「微工研寄託、ＦＥＲＭＢＰ−５４５
３」である請求項１２に記載の遺伝子組換え微生物。
【請求項１５】遺伝子組換え微生物が、エシェリヒア
・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＪＭ１０
９・ｐｃＨＫ２「微工研寄託、ＦＥＲＭＢＰ−５８５
１」である請求項１２に記載の遺伝子組換え微生物。