JP2000078982A - 安定なヘキソキナ―ゼおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 フルクトースに対して実質的に作用せず、長
期保存安定の優れた新規なヘキソキナーゼを得るもので
ある。 【解決手段】 ２５℃、６週間の５０ｍＭのイミダゾー
ル緩衝液（ｐＨ６．５）中保存において、少なくとも８
０％以上の残存活性を有し、かつ次の理化学的性質
（１）〜（３）を有するヘキソキナーゼ （１）作用 グルコースを基質として用いたときの反応式が下記の通
りである。 【化１】 （２）至適ｐＨ ｐＨ７．５〜８．５（トリス−塩酸緩衝液）のｐＨ範囲
に至適ｐＨを持つ。 （３）熱安定性 ８０℃、１０分間の熱処理後の残存活性が少なくとも８
０％以上である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は臨床診断薬分野にお
けるグルコース、マグネシウムまたはクレアチンキナー
ゼ活性の測定に用いられる溶液状態での安定性の優れた
新規なヘキソキナーゼおよびその製造法に関する。

【０００２】

【従来技術】ヘキソキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１）
は、ＡＴＰの存在下、グルコースその他のヘキソースを
リン酸化してヘキソース−６−リン酸とする反応を触媒
する酵素である。従来より高等動物のさまざまな細胞内
やサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ・ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アスペルギルス・
オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ・ｏｒｙｚａｅ）、
ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏ
ｓｔｏｃ・ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、エシェリヒ
ア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ・ｃｏｌｉ）、エア
ロバクター・エアロゲネス（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ・ａ
ｅｒｏｇｅｎｅｓ）由来の酵素が知られている（蛋白質
核酸 酵素、２２，１５０７−１５０９，１５１０−
１５１４，１５１５−１５１９，１９７７、Ａｄｖ．Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．３４，２４９−３２６，１９７３、Ｔｈ
ｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ ３ｒｄ Ｅｄ．，４，１−４８，
１９７３）。

【０００３】しかしながら、これらの酵素は室温におけ
る溶液状態での安定性が悪く、臨床診断薬分野における
グルコース、マグネシウムまたはクレアチンキナーゼ活
性の測定に用いられる溶液状態での保存に満足のいくも
のではなかった。また、溶液状での保存安定性に優れた
クルベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）に
属する高温性酵母由来のヘキソキナーゼが報告されたが
（特開平９−２２００８８号公報）、クルベロマイセス
属由来ヘキソキナーゼは、従来のヘキソキナーゼと同様
にグルコースの他にフルクトースにも作用することか
ら、血液中のフルクトースの影響を受けるという問題点
があった。このため、グルコースの測定用にはフルクト
ースに対する反応性の低いバチルス・ステアロサーモフ
ィルス由来のグルコキナーゼが用いられているが、この
酵素も溶液状での保存安定性が十分ではなかった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、フルクトー
スに対して実質的に作用せず、長期保存安定性の優れた
新規なヘキソキナーゼを提供することを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決するため、鋭意検討した結果、ロドサーマス・オ
バメンシス ＪＣＭ９７８５（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕ
ｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ ＪＣＭ９７８５、理化学研究
所保存株；茨城県つくば市東１丁目３番３号所在の通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所、ＦＥＲＭ
ＢＰ−６３８４，平成１０年６月４日寄託日）菌株、サ
ーモトーガ・ネアポリタナ ＤＳＭ４３５９菌株および
エアロパイラム・ペルニックス ＪＣＭ９８２０菌株な
どの好熱菌が安定なヘキソキナーゼを生産することを見
いだし、さらにこれらの好熱菌由来のヘキソキナーゼに
ついて詳細に性質検討を行った結果、ロドサーマス・オ
バメンシス ＪＣＭ９７８５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３８
４）菌株の菌体内に２５℃、６週間の５０ｍＭのイミダ
ゾール緩衝液（ｐＨ６．５）中保存において、少なくと
も８０％以上の残存活性を有し、かつ次の理化学的性質
（１）〜（３）を有する新規なヘキソキナーゼを見い出
した。

【０００６】（１）作用 グルコースを基質として用いたときの反応式が下記の通
りである。

【０００７】

【化２】 （２）至適ｐＨ ｐＨ７．５〜８．５（トリス−塩酸緩衝液）のｐＨ範囲
に至適ｐＨを持つ。 （３）熱安定性 ８０℃、１０分間の熱処理後の残存活性が少なくとも８
０％以上である。

【０００８】また当該ヘキソキナーゼを精製し、その構
成するポリペプチドのＮ末端から４０アミノ酸の配列を
決定することに成功し、このＮ末端アミノ酸配列を基に
ヘキソキナーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを分
離し、ヘキソキナーゼ遺伝子の塩基配列を決定した。ま
た、該ヘキソキナーゼ遺伝子を任意のベクターに導入
し、好ましい宿主−ベクター系にて宿主微生物を形質転
換体とし、該形質転換体を培養して、該培養物からヘキ
ソキナーゼを確認し、優れた工業的生産方法を確立し、
本発明を完成するに至った。

【０００９】ヘキソキナーゼ遺伝子の塩基配列、および
塩基配列から明らかとなったヘキソキナーゼのアミノ酸
配列は明らかに新規であり、ＤＮＡ ＤＡＴＡ ＢＡＳ
Ｅｏｆ ＪＡＰＡＮ（ＤＤＢＪ）の核酸配列及び蛋白質
データベースからは、同じ配列を有する遺伝子および蛋
白質は見い出されなかった。本発明は上記の知見に基づ
いて完成されたもので、２５℃、６週間の５０ｍＭのイ
ミダゾール緩衝液（ｐＨ６．５）中保存において、少な
くとも８０％以上の残存活性を有し、かつ次の理化学的
性質（１）〜（３）を有するヘキソキナーゼ

【００１０】（１）作用 グルコースを基質として用いたときの反応式が下記の通
りである。

【００１１】

【化３】 （２）至適ｐＨ ｐＨ７．５〜８．５（トリス−塩酸緩衝液）のｐＨ範囲
に至適ｐＨを持つ。 （３）熱安定性

【００１２】８０℃、１０分間の熱処理後の残存活性が
少なくとも８０％以上である。配列表の配列番号１のア
ミノ酸配列の１から３３２で表されるアミノ酸配列を有
するヘキソキナーゼ、ヘキソキナーゼ蛋白質をコードす
るＤＮＡ、ヘキソキナーゼの生産能を有する遺伝子組み
換え微生物、ロドサーマス属に属するヘキソキナーゼ生
産菌または外来性のヘキソキナーゼの生産能を有する遺
伝子組み換え微生物を培養し、培養物から当該ヘキソキ
ナーゼを採取することを特徴とするヘキソキナーゼの製
造法、ロドサーマス・オバメンシス ＪＣＭ９７８５
（ＦＥＲＭＢＰ−６３８４）を培養し、培養物から当該
ヘキソキナーゼを採取することを特徴とするヘキソキナ
ーゼの製造法である。すなわち、本発明はフルクトース
に対して実質的に作用せず、長期保存安定性の優れた新
規なヘキソキナーゼおよびその製造法に関するものであ
る。

【００１３】以下に本発明について詳細に説明する。ま
ず、本発明のヘキソキナーゼ生産菌について、ロドサー
マス属に属する当該ヘキソキナーゼを生産する能力を有
する微生物であれば何ら限定されるものではなく、ヘキ
ソキナーゼを生産する能力を有する変種や変異株であっ
てもよく、好ましくはロドサーマス・オバメンシス Ｊ
ＣＭ９７８５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３８４）菌株が挙げ
られる。本発明者らはロドサーマス属の菌株がフルクト
ースに対して実質的に作用せず、長期保存安定性の優れ
た新規なヘキソキナーゼを生産することを見い出し、該
酵素の精製、および諸性質の検討を行った。本発明にお
ける使用菌株はロドサーマス属に属するヘキソキナーゼ
生産菌であるが、例えばロドサーマス・オバメンシス
ＪＣＭ９７８５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３８４）株が挙げ
られる。

【００１４】また本発明の配列表の配列番号１のアミノ
酸配列の１から３３２で表されるヘキソキナーゼ蛋白の
アミノ酸配列をコードするＤＮＡにおいて、その配列番
号１のアミノ酸配列の１から３３２で表記されるアミノ
酸配列のＮ末端側及びＣ末端側はアミノ酸残基又はポリ
ペプチド残基を含む場合であってもよく、Ｎ末端側であ
るメチオニンの上流にはさらに一個又は複数のアミノ酸
残基を有してもよく、そのアミノ酸残基としては開始コ
ドン又はシグナルペプチドが挙げられ、またＣ末端側の
アラニンの下流には、さらに一個以上のアミノ酸残基を
有してもよい。

【００１５】さらに、本発明のヘキソキナーゼを構成す
るアミノ酸配列は、配列表の配列番号１のアミノ酸配列
の１から３３２で表されるアミノ酸配列からなるポリペ
プチドによる酵素活性発現と同様の効果を発現する、配
列番号１のアミノ酸配列の１から３３２のアミノ酸配列
の一部から実質的になるアミノ酸配列や酵素活性発現に
関与しない一部のアミノ酸の配列を変異、欠損又は付加
したものの均等物も含まれる。

【００１６】本発明の配列表の配列番号１のアミノ酸配
列の１から３３２で表されるアミノ酸配列をコードする
新規なＤＮＡは、そのＮ末端側及びＣ末端側のアミノ酸
残基又はポリペプチド残基を含めたアミノ酸配列の各ア
ミノ酸に対応する一連のコドンのうちいずれか１個のコ
ドンからなるＤＮＡであればよい。

【００１７】さらに、本発明のヘキソキナーゼを構成す
るアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、配列表の配列番
号１のアミノ酸配列の１から３３２で表されるアミノ酸
配列からなるポリペプチドによる酵素活性発現と同様の
効果を発現する、配列番号１のアミノ酸配列の１から３
３２中の一部分からなる実質的になるアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡであってもよく、また酵素活性発現に関
与しない一部のアミノ酸の配列を変異、欠損又は付加し
たものの均等物のアミノ酸配列をコードするＤＮＡであ
ってもよい。

【００１８】上記のＤＮＡの好適な例として、配列表の
配列番号１の塩基配列の１８から１０１３で表される塩
基配列を有するＤＮＡを挙げることができる。該ＤＮＡ
は、５’末端の上流側にアミノ酸をコードするコドンを
１個以上有したものでもよく、ＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴ
ＧＡ以外のコドンであればよい。さらに、好ましくはＡ
ＴＧ、ＧＴＧ、それら以外の開始コドン又はシグナルペ
プチドに対応するコドンを有したものを挙げることがで
きる。３’末端のＧＣＣ下流側には、アミノ酸をコード
するコドンを１個以上有するか、又は翻訳終止コドンを
有するかのいずれでもよく、更に、その３’末端側にア
ミノ酸をコードするコドンを１個以上有する場合には、
このアミノ酸をコードするコドンの３’末端側に翻訳終
止コドンを有することが好ましい。

【００１９】ヘキソキナーゼ蛋白質をコードするＤＮＡ
は、例えば、ヘキソキナーゼ遺伝子の供与体である、ヘ
キソキナーゼを生産する微生物よりＤＮＡを分離精製し
た後、制限酵素などを用いて切断した該ＤＮＡと、同じ
く切断して直鎖状にした発現ベクターとを、両ＤＮＡの
末端部をＤＮＡリガーゼなどにより結合閉環させ、かく
して得られた組み換えＤＮＡプラスミドを宿主微生物に
導入し、発現ベクターのマーカーと、ヘキソキナーゼの
活性発現若しくはＤＮＡプローブを指標としてスクリー
ニングを行い、ヘキソキナーゼ遺伝子を含有する組み換
えＤＮＡプラスミドを保持する微生物を分離し、該遺伝
子組み換え微生物を培養し、該培養菌体から該組み換え
ＤＮＡプラスミドを分離精製し、次いで該組み換えＤＮ
Ａプラスミドからヘキソキナーゼ遺伝子であるＤＮＡを
取得することにより得られる。

【００２０】ＤＮＡの供与体である微生物としては、ヘ
キソキナーゼを生産する微生物であれば、なんら限定さ
れるものではないが、好ましくはロドサーマス・オバメ
ンシス ＪＣＭ９７８５株が挙げられる。本発明を実施
するにあたり、ロドサーマス属の培養形態としては液体
培養、固体培養いずれも可能であるが工業的には通気攪
拌培養を行うのが有利である。また、使用する培養源と
しては一般に微生物培養に用いられる炭素源、窒素源、
無機塩およびその他の微量栄養源の他、ロドサーマス属
に属する微生物の利用できる栄養源であればすべて使用
できる。

【００２１】炭素源としてはグルコース、サッカロー
ス、キシロース、マルトース、グリセロール、デキスト
リン、デンプン、アミノ酸などの他、脂肪酸、油脂、有
機酸などが単独でまたは組み合わせて用いられる。窒素
源としては無機窒素源、有機窒素源のいずれも使用可能
であり、無機窒素源としては硫酸アンモニウム、硝酸ア
ンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム、塩化アンモニウム
などがあげられる。また、有機窒素源としては大豆、
米、トウモロコシ、小麦などの粉、コーンスティープリ
カー、ペプトン、肉エキス、カゼインアミノ酸、酵母エ
キスなどがあげられる。無機塩および微量栄養素として
はリン酸、マグネシウム、カリウム、鉄、カルシウム、
亜鉛などの塩類の他ビタミン、非イオン性界面活性剤、
消泡剤などの菌の生育やヘキソキナーゼの生産を促進す
るものであれば必要に応じて使用できる。

【００２２】培養は好気的条件で、培養温度は菌が発育
し、ヘキソキナーゼが生産する範囲であればよく、通常
６５〜８０℃、好ましくは７０〜７５℃である。培養時
間は条件により異なるがヘキソキナーゼが最も生産され
る時間まで培養すればよく、通常８〜２４時間程度であ
る。またヘキソキナーゼ蛋白質をコードするＤＮＡを得
るためには、具体的には以下のように行えばよいが、そ
の操作法のうち常法とされるものは、例えばマニアティ
スらの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８
２，１９８９）や、市販の各種酵素、キット類に添付さ
れた手順に従えば実施できるものである。

【００２３】ヘキソキナーゼを生産する微生物に由来す
るＤＮＡ（ｔｏｔａｌＤＮＡと略称する）を採取するに
は、例えばヘキソキナーゼを生産する微生物を培養し、
得られる培養菌液から菌体を集菌し、次いでこれを溶菌
させることによってヘキソキナーゼ遺伝子を含有する溶
菌物を調製する。溶菌方法としては、例えばリゾチーム
などの細胞壁溶解酵素による処理が施され、必要により
プロテアーゼなどの他の酵素やラウリル硫酸ナトリウム
などの界面活性剤が併用され、さらに細胞壁の物理的破
壊法である凍結融解（特開昭６３−１８５３７１号公報
参照）やフレンチプレス処理を上述の溶菌法と組合せで
行ってもよい。

【００２４】この様にして得られた溶菌物からｔｏｔａ
ｌＤＮＡを分離精製するには、常法に従って、例えばフ
ェノール抽出による除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リ
ボヌクレアーゼ処理、アルコール沈澱、遠心分離などの
方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。
ｔｏｔａｌＤＮＡを分離する菌株としては、ヘキソキナ
ーゼを生産する微生物なら何でもよいが、好ましくはロ
ドサーマス・オバメンシス ＪＣＭ９７８５株を使用す
ればよい。

【００２５】分離精製されたｔｏｔａｌＤＮＡを切断す
る方法は、常法に従って制限酵素処理により行えばよ
く、特に得られるｔｏｔａｌＤＮＡ断片とベクターとの
結合を容易ならしめるため、制限酵素、とりわけ特定ヌ
クレオチド配列に作用する、例えば、ＳａｌＩ、Ｂｇｌ
ＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＭｌｕＩなどのＩＩ形制
限酵素が適している。

【００２６】ｔｏｔａｌＤＮＡ断片を組み込むベクター
としては、宿主微生物体内で自律的に増殖しうるファー
ジ又はプラスミドから遺伝子組み換え用として構築され
たものが適しており、ファージベクターとしては、例え
ば、エシェリヒア・コリに属する微生物を宿主微生物と
する場合にはλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢなどが使用で
きる。また、プラスミドベクターとしては、例えば、エ
シェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、プラス
ミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、
ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐ
ＵＣ１１８、ｐＩＮ Ｉ、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ
＋、枯草菌を宿主とする場合にはｐＵＢ１１０、ｐＫＨ
３００ＰＬＫ、放線菌を宿主とする場合にはｐＩＪ６８
０、ｐＩＪ７０２、酵母特にサッカロマイセス・セレビ
ジアエを宿主とする場合にはＹＲｐ７、ｐＹＣ１、ＹＥ
ｐ１３などが使用できる。このようなベクターを、ｔｏ
ｔａｌＤＮＡの切断に使用した制限酵素で生成するＤＮ
Ａ末端と、同じ末端を生成する制限酵素で切断してベク
ター断片を作成し、ｔｏｔａｌＤＮＡ断片とベクター断
片とを、ＤＮＡリガーゼ酵素により常法に従って結合さ
せればよい。

【００２７】ｔｏｔａｌＤＮＡの断片を結合したプラス
ミドを移入する宿主微生物としては、組み換えＤＮＡが
安定かつ自律的に増殖可能であればよく、例えば宿主微
生物がエシェリヒア・コリに属する微生物の場合、エシ
ェリヒア・コリ ＤＨ１、エシェリヒア・コリ ＪＭ１
０９、エシェリヒア・コリ Ｗ３１１０、エシェリヒア
・コリ Ｃ６００などが利用できる。また、微生物宿主
が枯草菌に属する微生物の場合、バチルス・サチリス
ＩＳＷ１２１４など、放線菌に属する微生物の場合、ス
トレプトマイセス・リビダンス ＴＫ２４など、サッカ
ロマイセス・セルビシエに属する微生物の場合、サッカ
ロマイセス・セルビシエ ＩＮＶＳＣ１などが使用でき
る。

【００２８】宿主微生物に組み換えＤＮＡを移入する方
法としては、例えば、宿主微生物がエシェリヒア・コリ
やサッカロマイセス・セルビシエ、ストレプトマイセス
・リビダンスに属する微生物の場合には、常法に従って
コンピテントセル化した宿主菌株に組み換えＤＮＡの移
入を行えばよく、菌株によっては電気穿孔法を使用して
もよい。

【００２９】宿主微生物への目的組み換えＤＮＡ移入の
有無についての選択は、上記方法により組み換えＤＮＡ
を移入した宿主微生物により作成した遺伝子ライブラリ
ーから、３２Ｐや蛍光体などでラベルした、ヘキソキナ
ーゼの部分アミノ酸配列を基に設計し、あらかじめ合成
したヘキソキナーゼのＤＮＡプローブで、コロニーハイ
ブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーション
などを行うことによりポジティブ株を選択し、この株を
目的の形質転換体とすればよい。

【００３０】形質転換体からのヘキソキナーゼ遺伝子を
含むＤＮＡの分離は、常法に従って行えばよい。上述の
方法によって得られたヘキソキナーゼ遺伝子のＤＮＡの
塩基配列は、ジデオキシ法（Ｓａｎｇａｒ，Ｆ．（１９
８１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１２０５−１２１０）
で解読すればよく、またヘキソキナーゼを構成するポリ
ペプチドの全アミノ酸配列は、塩基配列より予測決定で
きる。この様にして一度選択された組み換えＤＮＡは、
該組み換えＤＮＡを保持する形質転換微生物から取り出
され、他の宿主微生物に移入することも容易に実施でき
る。また、さらに、該組み換えＤＮＡから制限酵素など
により切断してヘキソキナーゼを構成するポリペプチド
のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを切り出し、前記と
同様な方法により切断して得られる他の開環ベクターの
末端に結合させて新規な特徴を有する組み換えＤＮＡを
作製して、他の宿主微生物に移入することも容易に実施
できる。

【００３１】かくして得られた形質転換体である微生物
は、栄養培地に培養されることによりヘキソキナーゼを
産生し得るが、宿主微生物によってはヘキソキナーゼ遺
伝子を移入するだけではヘキソキナーゼ生産性を有しな
い場合がありうる。このような場合、得られたヘキソキ
ナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、ゾラーの方法による
部位特異的変異法（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ Ｓ
ｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３６７）による制限酵素
認識部位の作製や、制限酵素による切り出しなどにより
適切な形態で分離し、該宿主微生物に適合する遺伝子プ
ロモーター下流にヘキソキナーゼ遺伝子を結合したＤＮ
Ａを組み込んだプラスミドにより、新たな形質転換体を
作成し、ヘキソキナーゼを産生させればよい。

【００３２】例えば、上記宿主微生物がエシェリヒア・
コリに属する微生物の場合、ヘキソキナーゼ遺伝子を接
続する遺伝子プロモーターとしては、ｌａｃＺプロモー
ター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ピルビ
ン酸オキシダーゼ遺伝子プロモーター（特開平１−１４
４９７６号公報）などが例示され、これらのプロモータ
ーの下流にリボソーム結合部位を介在して、開始コドン
ＡＴＧやＧＴＧを有するヘキソキナーゼ構造遺伝子を接
続し、大腸菌を宿主とするベクターに組み込み、かくの
ごとくして作成されたプラスミドで大腸菌を形質転換す
ればよい。

【００３３】上記の遺伝子操作に一般的に使用される量
的関係は、供与微生物からのＤＮＡ及びプラスミドＤＮ
Ａを０．１〜１０μｇに対し、制限酵素を約１〜１０
ｕ、リガーゼ約３００ｕ、その他の酵素約１〜１０ｕ、
程度が例示される。

【００３４】また、本発明のヘキソキナーゼは公知の遺
伝子操作手段により、本来の反応を触媒する性質を損な
わないペプチドの変異をなしてもよく、このような変異
体ヘキソキナーゼ遺伝子は、本発明のヘキソキナーゼ遺
伝子から遺伝子工学的手法により作製される人工変異遺
伝子を意味し、この人工変異遺伝子は前出の部位特異的
変異法や、目的遺伝子の特定ＤＮＡ断片を人工変異ＤＮ
Ａで置換するなどの種々なる遺伝子工学的方法を使用し
て得られる。かくして取得された人工変異ヘキソキナー
ゼ遺伝子をベクターに挿入して宿主微生物に移入させる
ことによって変異体ヘキソキナーゼを発現させることが
可能であり、優れた性質を有する変異体ヘキソキナーゼ
ができればそれを製造することも可能である。

【００３５】ヘキソキナーゼ遺伝子を含み、ヘキソキナ
ーゼを産生し得る形質転換微生物の具体的な例示として
は、エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９株にヘキソキナー
ゼ遺伝子を含有するプラスミドｐｃＨＫＲ２（その制限
酵素地図を図９に示した）を導入した形質転換微生物が
挙げられる。

【００３６】また形質転換微生物により該ヘキソキナー
ゼを製造するに当たっては、該形質転換微生物を栄養培
地で培養して菌体内又は培養液中に該ヘキソキナーゼを
産生せしめ、培養終了後、得られた培養物を濾過又は遠
心分離などの手段により菌体を採集し、次いでこの菌体
を機械的方法又はリゾチームなどの酵素的方法で破壊
し、又、必要に応じてＥＤＴＡ及び／又は適当な界面活
性剤などを添加して該ヘキソキナーゼの水溶液を濃縮す
るか、又は濃縮する事なく硫安分画、ゲル濾過、アフィ
ニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィーにより処理して、純
度のよい該ヘキソキナーゼを得ることができる。

【００３７】形質転換微生物の培養条件はその栄養生理
的性質を考慮して培養条件を選択すれば良く、通常多く
の場合は、液体培養で行うが、工業的には深部通気撹拌
培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては、微
生物の培養に通常用いられるものが広く使用されうる。
炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、
例えばグルコース、サッカロース、ラクトース、マルト
ース、フラクトース、糖蜜などが使用される。窒素源と
しては利用可能な窒素化合物であれば良く、例えばペプ
トン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物など
が使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マ
グネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜
鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが
必要に応じて使用される。

【００３８】培養温度は微生物が発育し、ヘキソキナー
ゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・
コリの場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養
条件は、条件によって多少異なるが、ヘキソキナーゼが
最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を
終了すればよく、エシェリヒア・コリの場合、通常は１
２〜４８時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し、ヘキ
ソキナーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェ
リヒア・コリの場合、好ましくはｐＨ６〜８程度であ
る。

【００３９】ヘキソキナーゼは主としてその菌体内に含
有、蓄積されており、その菌体内から抽出すればよい。
ヘキソキナーゼの抽出法を例示すればまず培養物を固液
分離し、得られた湿潤菌体をリン酸緩衝液やトリス−塩
酸緩衝液などの溶液に分散し、リゾチーム処理、超音波
処理、フレンチプレス処理、ダイノミル処理などの菌体
破砕手段を適宜選択組み合わせて、粗製のヘキソキナー
ゼ含有液を得る。

【００４０】粗製のヘキソキナーゼ含有液から公知の蛋
白質や酵素などの単離、精製手段を用いて精製ヘキソキ
ナーゼを得る。例えば、粗製のヘキソキナーゼ含有液に
アセトン、メタノール、エタノールなどの有機溶媒によ
る分別沈殿法、硫酸アンモニウム、食塩などによる塩析
法などを適用してヘキソキナーゼを沈殿させ、回収す
る。さらに、この沈殿物を必要に応じて透析、等電点沈
殿を行った後、電気泳動法などで単一の帯を示すまで、
イオン交換体、ゲルろ過剤、吸着体などを用いるカラム
クロマトグラフィーなどにより精製する。また、これら
の方法を適当に組み合わせることによりヘキソキナーゼ
の精製度が上がる場合は適宜組み合わせて行うことがで
きる。

【００４１】これらの方法によって得られる酵素は安定
化剤として、各種の塩類、糖類、タンパク質、脂質、海
面活性化剤などを加え、あるいは加えることなく、限外
ろ過濃縮、凍結乾燥などの方法により、液状または固形
のヘキソキナーゼを得ることができ、また、適宜凍結乾
燥を行ってもよく、この場合安定化剤としてサッカロー
ス、マンニトール、食塩、アルブミンなどを０．５〜１
０％程度添加してもよい。

【００４２】つぎに本発明で得られるヘキソキナーゼの
理化学的性質および酵素活性測定法を述べる。 ヘキソキナーゼの酵素活性測定法 測定試薬 ５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ グルコース ４ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １ｍＭ ＮＡＤＰ ５Ｕ／ｍｌ グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ） （東洋紡社製）

【００４３】測定試薬１ｍｌを光路長１ｃｍのセルに入
れ３７℃で５分間予備加温した後、０．０２ｍｌの酵素
液添加後０．５分後の波長３４０ｎｍにおける吸光度
（Ａａ）と酵素液添加後１．５分後の吸光度（Ａｂ）を
測定する。この吸光度（Ａａ）と（Ａｂ）の吸光度差
（Ａｂ−Ａａ）より酵素活性を求める。なお、吸光度
（Ａｂ）が０．２以上になる時は酵素液を５０ｍＭのト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で希釈して測定するも
のとする。酵素活性１単位は３７℃で１分間に１μモル
の還元型ＮＡＤＰを生成させる酵素量とし、計算式は下
記の通りである。 酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝（Ａｂ−Ａａ）×８．１×酵素
の希釈倍率

【００４４】理化学的性質 （１）酵素作用 基質としてグルコースを用いたときの酵素作用を以下に
示す。

【００４５】

【化４】 （２）Ｋｍ値 本発明のヘキソキナーゼ（以下、本発明ヘキソキナーゼ
もしくは本発明ＨＫともいう）、酵母由来ヘキソキナー
ゼ（オリエンタル酵母社製、以下、酵母由来ＨＫともい
う）、バチルス・ステアロサーモフィルス由来グルコキ
ナーゼ（ユニチカ社製、以下、バチルス由来ＧＫともい
う）、サーモトーガ・ネアポリタナ ＤＳＭ４３５９
［サーモトーガ・ネアポリタナ（ＤＳＭ４３５９）菌株
由来ＨＫともいう］およびエアロパイラム・ペルニクス
ＪＣＭ９８２０［エアロパイラム・ペルニクス（ＪＣ
Ｍ９８２０）菌株由来ＨＫともいう］のグルコースおよ
びＡＴＰに対するＫｍ値は表１の通りである。

【００４６】

【表１】

【００４７】（３）基質特異性 本発明ヘキソキナーゼ、酵母由来ＨＫおよびバチルス由
来ＧＫの各種糖類に対する特異性は表２の通りである。
本酵素はグルコースに対して最も高い反応性を示し、フ
ルクトースには全く作用しない点で酵母由来の酵素とは
異なり、また、１，５−アンヒドログルシトールに対す
る反応性がバチルス由来の酵素の７．５倍であることか
らバチルス由来酵素とも異なっていた。

【００４８】

【表２】

【００４９】（４）リン酸基供与体 本発明ヘキソキナーゼの各種リン酸基供与体に対する特
異性は表３の通りである。

【００５０】

【表３】

【００５１】（５）等電点 ５．０±０．２（キャリアーアンフォライを用いた電気
泳動法にて）

【００５２】（６）分子量 １１５，０００±５，０００（ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ
ＸＬを用いたゲルろ過法にて） （７）至適ｐＨ 前記酵素活性測定法にしたがって至適ｐＨを求めたもの
で、その結果を図１に示した。ｐＨ４．５〜５．５の範
囲は１００ｍＭの酢酸緩衝液（図中、○）、ｐＨ５〜６
の範囲は１００ｍＭのクエン酸緩衝液（図中、□）、ｐ
Ｈ６〜７．５の範囲は１００ｍＭのリン酸緩衝液（図
中、△）、ｐＨ７．５〜９の範囲は１００ｍＭのトリス
−塩酸緩衝液（図中、●）、ｐＨ９．５〜１０の範囲は
１００ｍＭのグリシン緩衝液（図中、■）を使用した場
合の活性値を示すもので、至適ｐＨは７．５〜９にあっ
た。

【００５３】（８）ｐＨ安定性 １Ｕ／ｍｌの本発明ヘキソキナーゼを１００ｍＭの各種
緩衝液中で３７℃、１時間処理し、その残存活性を前記
酵素活性測定法に従って測定した。その結果を図２に示
した。ｐＨ４．５〜５．５の範囲は１００ｍＭの酢酸緩
衝液（図中、○）、ｐＨ５〜６の範囲は１００ｍＭのク
エン酸緩衝液（図中、□）、ｐＨ６〜７．５の範囲は１
００ｍＭのリン酸緩衝液（図中、△）、ｐＨ７．５〜９
の範囲は１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（図中、
●）、ｐＨ９．５〜１０の範囲は１００ｍＭのグリシン
緩衝液（図中、■）を使用した。ｐＨ４．５〜１０の範
囲で良好な安定性を示した。

【００５４】（９）至適温度 前記酵素活性測定法に従って、温度３７〜９５℃の範囲
で変化させて至適温度をもとめた結果は図３に示す通り
であり、本酵素の至適温度は測定の範囲内においては９
５℃であった。 （１０）熱安定性 ０．５Ｕ／ｍｌの本発明ヘキソキナーゼを１００ｍＭの
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）中で各温度で１０分
間加熱処理した後の残存活性を前記酵素活性測定法に従
って測定した。その結果、図４に示す通り、少なくとも
８０℃、１０分間処理における残存活性が少なくとも８
０％以上を示す安定なものであった。

【００５５】（１１）各種２価の金属イオンの活性にお
よぼす影響 前記酵素活性測定法においてマグネシウムイオンの代わ
りに各種２価の金属イオンを添加して活性測定を行った
結果を表４に示した。

【００５６】

【表４】 その結果、本発明ヘキソキナーゼはマグネシウムイオン
によって最も強く活性化され、コバルトイオン、マンガ
ンイオンによって少し活性化され、ニッケルイオンによ
ってわずかに活性化を受けた。 （１２）各種金属イオンおよび阻害剤の影響 各種１価の金属イオンおよび阻害剤の影響を表５に示し
た。

【００５７】

【表５】 その結果、検討を行った金属イオンおよび阻害剤で影響
を受けるものは無かった。尚、表中ＡＰ5 ＡはＰ1 ，Ｐ
5 −ジ（アデノシン−５’）ペンタリン酸（シグマ社
製）、ＮＡＣはＮ−アセチル−Ｌ−システイン（シグマ
社製）を示す。また以上の結果から、、クルベルマイセ
ス属由来のヘキソキナーゼは、分子量が６０，０００
で、グルコースに対する活性を１００とした時のフルク
トースに対する相対活性が１８９．４％であり、明らか
に本発明ヘキソキナーゼとは異なる性質のものである。

【００５８】

【発明実施の形態】以下、本発明の実施例を詳しく述べ
るが、本発明は何らこれらにより限定されるものではな
い。なお、実施例中、常法に従い、と記述した遺伝子操
作技術は、例えば前出のマニアティスらの方法や、市販
の各種酵素、キット類に添付された手順に従えば実施で
きるものである。また、実験に使用した組み換えＤＮＡ
実験酵素試薬（制限酵素など）、ベクターＤＮＡ、キッ
ト類は特に指摘しない限り宝酒造株式会社より購入した
ものである。

【００５９】

【実施例１】＜ロドサーマスの培養＞ロドサーマス・オ
バメンシス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎ
ｓｉｓ） ＪＣＭ９７８５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３８
４）菌株をトリプティカーゼペプトン（ＢＢＬ社製）を
０．４％、酵母エキス（ディフコ社製）を０．４％、ジ
ャマリンＳ（ジャマリン ラボラトリー社製）１００ｍ
ｌ、ニトリロトリ酢酸を０．１５％、ＭｎＳＯ4 ・Ｈ2
Ｏを０．０５％、ＦｅＳＯ4 を０．１４％、ＮｉＣl 2
を０．０２％、ＣｏＳＯ4 を０．０１％、ＺｎＳＯ4 ・
７Ｈ2 Ｏを０．０１％、ＣｕＳＯ4 を０．００１％、Ｎ
ａ2 ＷＯ4 ・２Ｈ2 Ｏを０．０００３％、Ｎａ2 ＭｏＯ
4 ・２Ｈ2 Ｏを０．００１％からなる培地（ｐＨ７．
０）を５００ｍｌの三角フラスコ２本に分注したものに
接種し、７５℃、１５時間培養し、得られた種培養液を
上記と同一組成培地に消泡剤を加えた培地２０Ｌに添加
し、７５℃で１５時間培養した。培養終了後、培養物を
４，５００ｒｐｍで３０分間、遠心し、菌体０．４３ｋ
ｇを回収した。

【００６０】

【実施例２】＜ヘキソキナーゼの精製法＞この菌体を５
０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、
全量を２，０００ｍｌとした後、超音波破砕装置を用い
て、氷中で３０分間超音波処理を行った。その後、７，
５００ｒｐｍで２０分間、遠心分離して不溶物を除去し
て、その上清１，８００ｍｌ（７５０Ｕ）を得た。つい
でこの上清を１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
５）にて、１５時間透析し、ＤＥＡＥ−セファロース・
ファーストフロー（２．７×３０ｃｍ）（ファルマシア
社製）イオン交換クロマトグラフィを行った。溶出はＮ
ａＣｌの０〜１Ｍのリニアグラジエントにより行い、
０．２Ｍ〜０．３ＭのＮａＣｌの溶出画分（６００Ｕ）
を回収した。この酵素液に１５％（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 の
濃度となるように（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 を溶解し、フェニ
ルセファロース・ファーストフロー（２．７×１９．５
ｃｍ）（ファルマシア社製）の疎水クロマトグラフィー
を行った。溶出は１５％〜０％の（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 の
リニアグラジエントにより行い、５〜２％の（ＮＨ4 ）
2 ＳＯ4 の溶出画分（４５０Ｕ）を回収した。

【００６１】ついで、この酵素液を１０ｍＭのトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）にて１５時間透析し、Ｑ−セ
ファロース・ファーストフロー（２．７×１９．５ｃ
ｍ）（ファルマシア社製）のイオン交換クロマトグラフ
ィを行った。溶出は０〜０．５ＭのＮａＣｌのリニアグ
ラジエントにより行い、０．２〜０．３ＭのＮａＣｌの
溶出画分（３２０Ｕ）を回収した。さらに、この酵素液
を１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて１
５時間透析し、ハイドロキシアパタイト（ペンタックス
社製）（１．６×２６．５ｃｍ）クロマトグラフィーを
行った。溶出は０〜０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）によるリニアグラジエントにより行い、０．０３〜
０．０４Ｍのリン酸緩衝液の溶出画分（２４０Ｕ）を回
収し、精製ヘキソキナーゼを得た。

【００６２】

【実施例３】＜本発明ヘキソキナーゼの保存安定性＞本
発明ヘキソキナーゼ、酵母由来ヘキソキナーゼおよびバ
チルス・ステアロサーモフィルス由来グルコキナーゼを
各０．５Ｕ／ｍｌ濃度で５０ｍＭのイミダゾール緩衝液
（ｐＨ６．７）中で４℃および２５℃、８週間保存し、
残存活性を前記活性測定法により測定した。その結果を
図５（４℃における保存安定性）および図６（２５℃に
おける保存安定性）に示した。（図中、○は本発明ヘキ
ソキナーゼ、□は酵母由来ヘキソキナーゼ、△はバチル
ス・ステアロサーモフィルス由来グルコキナーゼを示
す）。４℃の保存では酵母由来ヘキソキナーゼおよびバ
チルス・ステアロサーモフィルス由来グルコキナーゼは
８週間の保存で残存活性が約４０％まで低下したが、本
発明ヘキソキナーゼは９５％以上の残存活性を示した。
また２５℃の保存ではバチルス・ステアロサーモフィル
ス由来グルコキナーゼは４週間で、酵母由来のヘキソキ
ナーゼは６週間で残存活性が０％になったが、本発明ヘ
キソキナーゼは６週間後でも８０％以上の残存活性を示
した。

【００６３】

【実施例４】＜ヘキソキナーゼのＮ末端アミノ酸配列の
解析＞実施例２により得られた精製ヘキソキナーゼのＮ
末端アミノ酸配列を、エドマン分解法により決定した。
決定されたＮ末端アミノ酸配列は、配列表の配列番号１
のアミノ酸配列の１から４０で表される。

【００６４】

【実施例５】＜放射性ＤＮＡプローブの作製＞判明した
部分アミノ酸配列をコードするヘキソキナーゼ遺伝子の
塩基配列を予想した。この配列を基に設計されるオリゴ
ヌクレオチドプローブには無数の形状があるが、本発明
ではそのうち、配列表の配列番号２で表される塩基配列
を有するＨＫ３と命名したオリゴヌクレオチドを使用し
た。

【００６５】このオリゴヌクレオチドを外部機関（ベッ
クス社）に合成依託して作成し、完成したオリゴヌクレ
オチド２００ｎｇをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼバッ
ファー（５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭの２−メ
ルカプトエタノール）、及び７４０ｋＢｑ（キロベクレ
ル）の［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（第一化学薬品社販売）存
在下、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ ８．５ｕで３７
℃、３０分間反応せしめ、ラジオアイソトープ３２Ｐを
取り込ませ放射性オリゴヌクレオチドプローブとした。

【００６６】

【実施例６】＜ロドサーマス・オバメンシスからのＤＮ
Ａの抽出＞実施例１で培養したロドサーマス・オバメン
シス ＪＣＭ９７８５株の菌体を５０ｍＭのトリス−塩
酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＥＤＴＡ、１５％シュー
クロースを含む１ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液で３７℃、
１０分処理した後、ＳＤＳを最終濃度０．２５％になる
よう添加して菌体を溶解した。さらに等量のフェノール
／クロロホルム＝１：１混合液を加え、３０分攪拌した
後、１２，０００ｒｐｍで１５分遠心分離処理をして水
層を回収した。

【００６７】回収した水層に１０分の１量の３Ｍの酢酸
ナトリウム（ｐＨ５．５）を混合後、２倍量のエタノー
ルを静かに重層し、ゲノムＤＮＡをガラス棒に巻き付か
せて分離した。分離したゲノムＤＮＡを、１０ｍＭトリ
ス−塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ水溶液（Ｔ
Ｅバッファー）２０ｍｌに溶解し、２０ｍｇ／ｍｌのＲ
ＮａｓｅＡを２００μｌ加え、３７℃で１時間保温し、
混在しているＲＮＡを分解した。次いで、等量のフェノ
ール／クロロホルム混合液を加え、前記と同様に処理し
て、水層を分取した。分取した水層に１０分の１量の３
Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）と２倍量のエタノー
ルを加えて前記の方法でもう一度ゲノムＤＮＡを分離し
た。

【００６８】この染色体を５０ｍｌのＴＥ（１０ｍＭの
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ
（ｐＨ８．０））に溶解し、ＴＥ飽和のフェノールとク
ロロホルムの１対１混和液２０ｍｌを加え、全体を懸濁
した後、同様の遠心分離を繰り返し、上層を再び別の容
器に移した。この分離した上層２０ｍｌに３Ｍの酢酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ５．５）２ｍｌとエタノール５０
ｍｌを加え、撹拌後−７０℃で５分間冷却した後、遠心
分離（２，０００Ｇ、４℃、１５分）し、沈澱した染色
体を７５％ エタノールで洗い、減圧乾燥した。以上の
操作によりロドサーマス・オバメンシス ＪＣＭ９７８
５株の染色体標品１ｍｇを得た。

【００６９】

【実施例７】＜ヘキソキナーゼ遺伝子含有ＤＮＡフラグ
メントの検定＞実施例６の操作で得られたロドサーマス
・オバメンシス ＪＣＭ９７８５株の染色体ＤＮＡから
遺伝子ライブラリーを作成するため、本染色体を各種制
限酵素で切断し、目的遺伝子が含有されるＤＮＡフラグ
メントの鎖長を検定する操作を行った。即ち、ロドサー
マス・オバメンシス ＪＣＭ９７８５株の染色体ＤＮＡ
（１０μｇ）を各種制限酵素で切断し、１．５％アガロ
ースゲル（宝酒造社製Ｈ１４、４０ｍＭのトリス−酢酸
緩衝液（ｐＨ７．４）、２ｍＭのＥＤＴＡ）で１５０
Ｖ、１．５時間電気泳動し、常法に従ってサザンブロッ
ティングを行い、アガロースゲルからナイロンメンブレ
ン（ＰＡＬＬ社製：バイオダインＡ）にＤＮＡを移行さ
せた。

【００７０】このメンブレンを風乾後、ナイロンメンブ
レン添付のマニュアルに従ってプレハイブリダイゼーシ
ョンを行い、さらに実施例５で作成したＨＫ３放射性プ
ローブを使用したハイブリダイゼーションを４５℃で１
晩行った。ハイブリダイゼーション後、メンブレンを５
５℃の洗浄液（６×ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸ナト
リウム〔１×ＳＳＣ：０．１５Ｍの塩化ナトリウム，１
５ｍＭのクエン酸ナトリウム〕：メンブレン１００平方
ｃｍ当り約５０ｍｌ）で１０分洗った後、メンブレンを
自然乾燥した。この乾燥したメンブレンをＸ線フィルム
（富士写真フィルム社製 Ｎｅｗ ＲＸＯ−Ｈ）に重
ね、遮光下、−７０℃で２４時間オートラジオグラフィ
ーを行った。

【００７１】オートラジオグラフィー終了後、フィルム
を現像し、各制限酵素による切断染色体が示すポジティ
ブバンドのサイズを観察した。その結果、ＥｃｏＲＩ切
断により約４ｋｂ（キロベース：ＤＮＡ鎖長の単位、
１，０００塩基対）のＤＮＡフラグメント上にヘキソキ
ナーゼ遺伝子が含有されることが明らかとなり、Ｅｃｏ
ＲＩで切断した染色体ＤＮＡの４ｋｂフラグメントから
遺伝子ライブラリーを作成することとした。

【００７２】

【実施例８】＜遺伝子ライブラリーの作成＞実施例６の
操作で得られたロドサーマス・オバメンシス ＪＣＭ９
７８５株の染色体ＤＮＡ１０μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ
で切断し、常法に従い約４ｋｂのＤＮＡフラグメントを
分離した。このＤＮＡフラグメントを、制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで切断しアルカリフォスファターゼ（以下ＢＡＰと
略称）１ｕで切断末端を脱リン酸化したｐＵＣ１１９
１μｇと、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造
社製）で連結させた。これを用いて、常法に従ってコン
ピテント細胞としたエシェリヒア・コリ ＪＭ１０９
（東洋紡績社製）（ｒｅｃＡ１，△（ｌａｃ−ｐｒｏＡ
Ｂ），ｅｎｄＡ１，ｇｙｒＡ９６，ｔｈｉ−１，ｈｓｄ
Ｒ１７，ｒｅｌＡ１，ｓｕｐＥ４４，〔Ｆ’ｔｒａＤ３
６，ｐｒｏＡＢ，ｌａｃｌｑＺ△Ｍ１５〕）をトランス
フォーメーションし、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有
ＬＢ（バクトトリプトン（ＤＩＦＣＯ社製）１０ｇ／
ｌ、酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製）５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ
１０ｇ／ｌ）１．５％寒天平板培地にて一夜培養し、
約２，６００個のアンピシリン耐性コロニーを得、遺伝
子ライブラリーとした。

【００７３】

【実施例９】＜ヘキソキナーゼ遺伝子含有クローンのス
クリーニング＞実施例８により得た遺伝子ライブラリー
を、ナイロンメンブレン（ＰＡＬＬ社製：バイオダイン
Ａ）にレプリカし、このフィルターに添付のマニュアル
に従って菌体のＤＮＡを固定した。このフィルターを添
付のマニュアルに従ってプレハイブリダイゼーションお
よび、実施例５で調製したＨＫ３プローブを使用したハ
イブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーショ
ン後、メンブレンを実施例７に示した５５℃の洗浄液で
１０分洗った後メンブレンを自然乾燥した。この乾燥メ
ンブレンをＸ線フィルムに重ね、遮光下、−７０℃で２
４時間オートラジオグラフィーを行った。オートラジオ
グラフィー終了後、フィルムを現像し、ポジティブシグ
ナルをしめすコロニーを４個確認した。

【００７４】

【実施例１０】＜組み換えプラスミドの抽出＞実施例９
で選ばれたポジティブシグナルを示すコロニーを５０μ
ｇ／ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ液体培地１．５ｍｌに
植菌し３７℃で１６時間振盪培養した後、常法に従って
プラスミドを抽出した。その結果、４つのコロニーより
抽出されたプラスミドは同じ染色体ＤＮＡ断片を含むも
のであり、このプラスミドのうちの１つをｐｃＨＫＲ１
と命名した。

【００７５】

【実施例１１】＜ヘキソキナーゼ遺伝子塩基配列の決定
＞実施例１０で得られたプラスミドｐｃＨＫＲ１より、
ヘキソキナーゼ構造遺伝子部分についてジデオキシ法に
より塩基配列を決定した。

【００７６】

【実施例１２】＜ヘキソキナーゼ発現プラスミドの構築
＞ｐｃＨＫＲ１にゾラーらの部位特異的変異法により変
異を行い、ヘキソキナーゼ構造遺伝子上流に制限酵素Ｘ
ｂａＩ認識部位とリボソーム結合部位を、下流部に制限
酵素ＳａｃＩ認識部位を作製した。ヘキソキナーゼの構
造遺伝子とその変異した上流と下流域の塩基配列、およ
びヘキソキナーゼ構造遺伝子がコードするアミノ酸配列
を配列表の配列番号１に示した。変異したｐｃＨＫＲ１
をＸｂａＩとＳａｃＩで切断し、ヘキソキナーゼの構造
遺伝子を含む約１ｋｂのＤＮＡ断片を分離した。これを
ｐＵＣ１１９のＸｂａＩとＳａｃＩの切断部位に挿入
し、ｐＵＣ１１９のｌａｃプロモーター下流にＳＤ配列
とヘキソキナーゼ遺伝子が連結されたプラスミドを構築
し、本プラスミドをｐｃＨＫＲ２と命名した。プラスミ
ドｐｃＨＫＲ２の構造を図９に示す。なお、図中の「ｈ
ｋ」はヘキソキナーゼ構造遺伝子を、「ａｐ」はアンピ
シリン耐性構造遺伝子を、「ｏｒｉ」は大腸菌プラスミ
ドの複製起点領域を、「ｌａｃ」はβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝子プロモーター領域をそれぞれ表す。このｐｃＨ
ＫＲ２をエシェリヒア・コリ ＪＭ１０９株に導入し
た。

【００７７】

【実施例１３】＜ｐｃＨＫＲ２保持大腸菌の培養とその
細胞抽出液の調製＞ｐｃＨＫＲ２を導入したエシェリヒ
ア・コリ ＪＭ１０９株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリ
ンとｌａｃプロモーター誘導剤である１ｍＭのＩＰＴＧ
（和光純薬社製）を含有した３．７％ＢＨＩ（ＤＩＦＣ
Ｏ社製）液体培地１．５ｍｌで３７℃、１６時間培養
し、そのうち１ｍｌを遠心分離（１５，０００Ｇ、１
分、４℃）により集菌し、２００μｌの１０ｍＭのトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、超音波破砕機を
用いて菌体を破砕した後、遠心分離（１４，０００Ｇ、
５分、４℃）し、上清を取得して細胞抽出液とした。同
様に、ヘキソキナーゼ遺伝子を含まないクローニングベ
クターｐＵＣ１１９により形質転換されたエシェリヒア
・コリ ＪＭ１０９の抽出液も調製した。

【００７８】

【実施例１４】＜細胞抽出液中のヘキソキナーゼ酵素活
性の確認＞実施例１３で調製したエシェリヒア・コリ
ＪＭ１０９・ｐｃＨＫＲ２、およびエシェリヒア・コリ
ＪＭ１０９・ｐＵＣ１１９の細胞抽出液中のヘキソキ
ナーゼ酵素活性を、参考例１の方法に従って測定した。
その結果、エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９・ｐｃＨＫ
Ｒ２では、培養液１ｍｌあたり０．１ユニットの活性が
検出され、ｐＵＣ１１９を導入したエシェリヒア・コリ
ＪＭ１０９には活性は検出されなかった。これにより
ｐｃＨＫＲ２を導入したエシェリヒア・コリＪＭ１０９
でのヘキソキナーゼの活性発現が確認された。以上の方
法で作成した本発明組み換え体ヘキソキナーゼを実施例
２の方法で精製し諸性質を測定したところ、天然物ヘキ
ソキナーゼと同じ性質を有することが確認された。

【００７９】

【参考例１】＜本発明ヘキソキナーゼを用いたグルコー
スの定量＞ 測定試薬 ５０ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５） ４ｍＭ ＡＴＰ １０Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ １ｍＭ ＮＡＤＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １０Ｕ／ｍｌ 本発明ヘキソキナーゼ

【００８０】測定方法 グルコースを０．４ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭの水
溶液に調整し、グルコースサンプルを作成した。測定試
薬１ｍｌにグルコースサンプル０．０５ｍｌ加え、３７
℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブランク
を対照に測定した。図７に示すようにグルコースが定量
的に測定できた。

【００８１】

【参考例２】＜本発明ヘキソキナーゼを用いたマグネシ
ウムの定量＞ 測定試薬 ５０ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５） ４ｍＭ ＡＴＰ １０Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ １ｍＭ ＮＡＤＰ ２０ｍＭ グルコース １０Ｕ／ｍｌ 本発明ヘキソキナーゼ

【００８２】測定方法 塩化マグネシウムを５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０
ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭの水溶液に調整し、塩化マグ
ネシウムサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌに塩化マ
グネシウムサンプル０．０１ｍｌ加え、３７℃、２分間
〜３分間後の３４０ｎｍの吸光度差を試薬ブランクを対
照に測定した。図８に示すようにマグネシウムが定量的
に測定できた。

【００８３】

【参考例３】＜サーモトーガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒ
ｍｏｔｏｇａ・ｎａｐｏｌｉｔａｎａ；ＤＳＭ４３５
９）菌株由来ＨＫの取得方法＞ ０．１％ 酵母エキス ０．５％ トリプトン ０．７２％ マルトース ２．３９％ ＮａＣｌ ０．４％ Ｎａ2 ＳＯ4 ０．０７％ ＫＣｌ ０．０２％ ＮａＨＣＯ3 ０．０１％ ＫＢｒ ０．０３％ Ｈ3 ＢＯ4 １．０８％ ＭｇＣｌ2 ０．１５％ ＣａＣｌ2 ０．００２５％ ＳｒＣｌ2 ０．０２５％ ＮＨ4 Ｃｌ ０．０１４％ Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．１％ ＣＨ3 ＣＯＯＮａ ０．００１５％ Ｎ（ＣＯＯＨ）3 ０．０００５％ ＭｎＳＯ4 ０．００１４％ ＦｅＳＯ4 ０．０００２％ ＮｉＣｌ2 ０．０００１％ ＣｏＳＯ4 ０．０００１％ ＺｎＳＯ4 ０．００００１％ ＣｕＳＯ4 ０．０００００１％ Ｎａ2 ＷＯ4 ０．０００００１％ Ｎａ2 ＭｏＯ4 ０．１％ システイン塩酸塩

【００８４】上記培地成分を含む液体培地（ｐＨ７．
５）５００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコ２本に分注
し、１２０℃、２０分間、加熱滅菌した後、これにサー
モトーガ・ネアポリタナ株の菌体懸濁液１０ｍｌを移植
し、攪拌させながら、９５℃で２０時間培養を行った。
得られた培養液を８，０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離
を行い、５ｇの湿潤菌体を得た。この菌体を１０ｍｌの
１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁
し、超音波破砕により、菌体破砕を行った。得られた菌
体破砕液を１５，０００ｒｐｍ、３０分間、遠心分離を
行った後、１０Ｌの１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）に２０時間透析し、粗酵素液とした（６．５
Ｕ、１０ｍｌ）。

【００８５】

【参考例４】 ＜エアロパイラム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ・ｐｅｒｎｉｘ；ＪＣ Ｍ９８２０）菌株由来ＨＫの取得方法＞ 培地組成 ０．１％ バクトイストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製） ０．１％ トリプチカーゼペプトン（ＢＢＬ社製） ０．１％ チオ硫酸ナトリウム １Ｌ 人工海水（Ｊａｍａｒｉｎ Ｓ、ジャマリンラボラ トリー社製）

【００８６】上記培地成分を含む液体培地（ｐＨ７．
０）１００ｍｌを５００ｍｌ容の坂口フラスコ２０本に
分注し、１２０℃、２０分間、加熱滅菌した後、これに
エアロパイラム・ペルニクス菌株を移植し、振盪させな
がら９０℃で２０時間培養を行った。得られた培養液を
８，０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離を行い、４．２ｇ
の湿潤菌体を得た。この菌体を１０ｍｌの１０ｍＭのト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、超音波破砕
により、菌体破砕を行った。得られた菌体破砕液を１
５，０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離を行った後、１０
Ｌの１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に２
０時間透析し、粗酵素液を得た（４．５Ｕ、１０ｍ
ｌ）。

【００８７】

【発明の効果】本発明により、新規なヘキソキナーゼお
よびロドサーマス属に属する微生物よるヘキソキナーゼ
の新規な製造法を提供できるものであり、本酵素を用い
るグルコースまたはＣＰＫの測定用酵素をして提供でき
た。

【００８８】

【配列表】 <110> 旭化成工業株式会社 <120> 安定なヘキソキナーゼおよびその製造法 <150> 日本 平成１０年特許願第１７５４９２号 <151> 平成１０年６月２４日 <160> 2 <210> 1 <211> 1020 <212> DNA <213> ロドサーマス・オバメンシス(Rhodothermus obamensis) <220> <221> RBS <222> 4..10 <220> <221> CDS <222> 18..1013 <400> 1 tctagaggaa taacacc atg gct tcc att ccg tct ttt gcc gtt ggc gtc 50 Met Ala Ser Ile Pro Ser Phe Ala Val Gly Val 1 5 10 gat ctg ggg ggt acc acc atc aag gcc gcg ctg gtg gag cgc ggt gtg 98 Asp Leu Gly Gly Thr Thr Ile Lys Ala Ala Leu Val Glu Arg Gly Val 15 20 25 ggc atc cag cac gaa ctg agc cgc ccc acc gag gcc gaa gaa gga ccg 146 Gly Ile Gln His Glu Leu Ser Arg Pro Thr Glu Ala Glu Glu Gly Pro 30 35 40 gcg cac gtc att cgc cgg atg gcc gag atg gtg cag gca ctc atc gaa 194 Ala His Val Ile Arg Arg Met Ala Glu Met Val Gln Ala Leu Ile Glu 45 50 55 cgt gcc ccc aac cgg gag atg gcg ggc atc ggg atc ggc gcc ccg ggc 242 Arg Ala Pro Asn Arg Glu Met Ala Gly Ile Gly Ile Gly Ala Pro Gly 60 65 70 75 acc gtc aac tgg gaa cgc acc gcc gtc atc tat ccc ccc aac ctg ccc 290 Thr Val Asn Trp Glu Arg Thr Ala Val Ile Tyr Pro Pro Asn Leu Pro 80 85 90 ggc tgg ggt atc gtc gat ttg cgg aag gaa ctg cag gaa gcc ctg ggg 338 Gly Trp Gly Ile Val Asp Leu Arg Lys Glu Leu Gln Glu Ala Leu Gly 95 100 105 ctg gcg ctg ccg atc ttc gtc gag aac gac gcg aac ctg gcc gga ctg 386 Leu Ala Leu Pro Ile Phe Val Glu Asn Asp Ala Asn Leu Ala Gly Leu 110 115 120 ggc tcg gcg cac tac ggg gcc ggc cga ccg ttc gac tcg ttc atc atg 434 Gly Ser Ala His Tyr Gly Ala Gly Arg Pro Phe Asp Ser Phe Ile Met 125 130 135 gtc acg ctg ggc acc ggc gtg ggc ggg gcc atc att tat cgg aac cgt 482 Val Thr Leu Gly Thr Gly Val Gly Gly Ala Ile Ile Tyr Arg Asn Arg 140 145 150 155 att ttt cga ggc gct acg ggc ggt gcc ggc gag atc ggc cac atg agc 530 Ile Phe Arg Gly Ala Thr Gly Gly Ala Gly Glu Ile Gly His Met Ser 160 165 170 atc gac tac gaa ggg ccg ctc gac cgc tac ggc atc gcc ggc tcc atc 578 Ile Asp Tyr Glu Gly Pro Leu Asp Arg Tyr Gly Ile Ala Gly Ser Ile 175 180 185 gag gcc tac atc ggc cag cgt ttt ctc tca cac tac gcc cgc tat cgc 626 Glu Ala Tyr Ile Gly Gln Arg Phe Leu Ser His Tyr Ala Arg Tyr Arg 190 195 200 ctg ctc acg caa cgg gac agc ctc gtg cat cag atg gcc ggc gag gac 674 Leu Leu Thr Gln Arg Asp Ser Leu Val His Gln Met Ala Gly Glu Asp 205 210 215 ctg cgc gac atc aat ccg cgc atc ctc ttc gag gcg gca cag gcc ggc 722 Leu Arg Asp Ile Asn Pro Arg Ile Leu Phe Glu Ala Ala Gln Ala Gly 220 225 230 235 gac gag ccg gcc cgc gag gtg ctg gcc tgg gcc ggc cac aaa ctc ggc 770 Asp Glu Pro Ala Arg Glu Val Leu Ala Trp Ala Gly His Lys Leu Gly 240 245 250 tgc gtg ctg gcg gcg gcc gtc aac ctg ctc gac atc cac aag atc gta 818 Cys Val Leu Ala Ala Ala Val Asn Leu Leu Asp Ile His Lys Ile Val 255 260 265 gtg ggt ggt ggc gtg tcg gcc gcg ggc gat ttc atc ctg gag ccg gcc 866 Val Gly Gly Gly Val Ser Ala Ala Gly Asp Phe Ile Leu Glu Pro Ala 270 275 280 cgc cag acg ctt cgc cgc tac gtg atc ccc gcc ctg cgc gac cgt gtg 914 Arg Gln Thr Leu Arg Arg Tyr Val Ile Pro Ala Leu Arg Asp Arg Val 285 290 295 gaa atc gtc cgc gaa acg ctg ggt aac gag gcc ggt atg ctg ggc gcc 962 Glu Ile Val Arg Glu Thr Leu Gly Asn Glu Ala Gly Met Leu Gly Ala 300 305 310 315 gcg caa ctg gtc ttt caa ctt ctg gaa cat ccc cgc gaa gac ctg gaa 1010 Ala Gln Leu Val Phe Gln Leu Leu Glu His Pro Arg Glu Asp Leu Glu 320 325 330 gcc tga gctc 1020 Ala <210> 2 <211> 53 <212> RNA <220> <221> DNA <222> 1..53 <400> 2 ggw acy acy aty aar gcw gcw ctw gtw gar cgw ggw gtw ggw aty car 48 Gly Thr Thr Ile Lys Ala Ala Leu Val Glu Arg Gly Val Gly Ile Gln 1 5 10 15 cay ga 53 His Glu

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のヘキソキナーゼの至適ｐＨ曲線を示す
ものである。

【図２】本発明のヘキソキナーゼのｐＨ安定曲線を示す
ものである。

【図３】本発明のヘキソキナーゼの至適温度曲線を示す
ものである。

【図４】本発明のヘキソキナーゼの熱安定曲線を示すも
のである。

【図５】本発明ヘキソキナーゼおよび従来のヘキソキナ
ーゼの４℃における保存安定曲線を示すものである。

【図６】本発明ヘキソキナーゼおよび従来のヘキソキナ
ーゼの２５℃における保存安定曲線を示すものである。

【図７】本発明ヘキソキナーゼを用いたグルコースの定
量曲線を示すものである。

【図８】本発明ヘキソキナーゼを用いたマグネシウムの
定量曲線を示すものである。

【図９】本発明プラスミドヘキソキナーゼ遺伝子の発現
プラスミドｐｃＨＫＲ２の制限酵素地図を示すものであ
る。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ２５℃、６週間の５０ｍＭのイミダゾー
   ル緩衝液（ｐＨ６．５）中保存において、少なくとも８
   ０％以上の残存活性を有し、かつ次の理化学的性質
   （１）〜（３）を有するヘキソキナーゼ （１）作用 グルコースを基質として用いたときの反応式が下記の通
   りである。 【化１】 （２）至適ｐＨ ｐＨ７．５〜８．５（トリス−塩酸緩衝液）のｐＨ範囲
   に至適ｐＨを持つ。 （３）熱安定性 ８０℃、１０分間の熱処理後の残存活性が少なくとも８
   ０％以上である。
2. 【請求項２】 ヘキソキナーゼが配列表の配列番号１の
   １から３３２のアミノ酸配列を有するヘキソキナーゼで
   ある、請求項１に記載のヘキソキナーゼ。
3. 【請求項３】 請求項１または２に記載のヘキソキナー
   ゼをコードするＤＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項１または２に記載の外来性のヘキ
   ソキナーゼの生産能を有することを特徴とする実質的に
   純粋な遺伝子組み換え微生物。
5. 【請求項５】 ロドサーマス属に属する請求項１又は２
   に記載のヘキソキナーゼ生産菌、または請求項１または
   ２に記載の外来性のヘキソキナーゼの生産能を有するこ
   とを特徴とする実質的に純粋な遺伝子組み換え微生物を
   培地に培養し、その培養物から当該ヘキソキナーゼを採
   取することを特徴とする請求項１または２に記載のヘキ
   ソキナーゼの製造法。
6. 【請求項６】 ロドサーマス属に属するヘキソキナーゼ
   生産菌が、ロドサーマス・オバメンシス（Ｒｈｏｄｏｔ
   ｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ） ＪＣＭ９７８５
   （ＦＥＲＭ ＢＰ−６３８４）菌株である請求項５に記
   載のヘキソキナーゼの製造法。