CN106479992A - 诊断用己糖激酶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于酶制剂的生产，特别是指一种诊断用己糖激酶的制备方法。包括菌种的纯化及复壮、发酵制备含有己糖激酶的发酵液、对发酵制备的己糖激酶粗酶液进行纯化等工艺步骤，本发明解决了目前国内尚无自主知识产权的诊断用己糖激酶出售、进口酶制剂价格偏高且使用不便等问题，具有菌种来源及制备方法可行且适于工业化生产、填补了国内尚无自主知识产权诊断用己糖激酶产品的空白、所制备的产品主要性能指标高于进口产品等优点。

Description

诊断用己糖激酶的制备方法
技术领域
本发明属于酶制剂的生产，特别是指一种诊断用己糖激酶的制备方法。
背景技术
己糖激酶(Hexokinase)是以己糖为特异性底物的六碳糖磷酸化酶，在生物体的糖酵解过程中起重要作用。己糖激酶是一种别构酶，催化葡萄糖从稳定状态变为活跃状态，其Km值小，对底物亲和性强，专一性不强，可针对多种六碳糖进行作用。利用其作用原理和特点，该酶主要用于临床诊断试剂。
随着生活水平的提高，糖尿病患者的数量也在急剧上升。目前血液中葡萄糖在临床上检测方法有两种，分别是葡萄糖氧化酶(GOD)法和己糖激酶(HK)法。GOD法作用特点是葡萄糖氧化酶酶的专一性强，作用底物专一，但干扰因素较多，尤以作用于α-D-葡萄糖能力很弱，配成成品试剂盒测定时间较长，均在10分钟以上。HK法因具有己糖激酶专一性不强、干扰因素较少、作用于α-D-葡萄糖能力很强、Km值很小、对底物亲和力很强、配成成品试剂盒测定时间短、反应均在10分钟内完成、测定线性范围宽(2-750mg/dL)等特点，尤其适用于全自动分析仪，为此己糖激酶法被临床检验界公认是检测血糖和尿糖的参考方法。基于两种检测方法各具优势，目前市场占有率约各占50％。
就申请人了解的范围而言，未检索到关于己糖激酶的相关标准或规范。
申请人检索到的相关专利文献包括：
专利号为5948665、名称为Hexokinase obtained from thermophilic yeastKluyveromyces fragilis的美国专利中公开了一种己糖激酶，该酶是从嗜热酵母中分离菌株后发酵得到，具有耐高温特性，其酶活为59U/g(g为细胞湿重)，耐热温度为37℃。由于该己糖激酶耐热性较其他己糖激酶产品高，解决了试剂盒使用过程中因温度限制带来的不宜长时间储存的问题,延长试剂盒的使用时间。但其酶活力不是很高，且在实际使用过程中，耐受温度还有一定的局限性。
专利号为201510554930.6的文献中公开了一种血清葡萄糖检测试剂，是利用己糖激酶配制出较为稳定的己糖激酶法血糖试剂盒来检测血清中葡萄糖的含量，不涉及己糖激酶的制备。
专利号为201610126969.2的文献中公开了一种稳定的酶法血清镁离子检测试剂盒，提供了一种稳定的酶法血清镁离子检测试剂盒，己糖激酶是构成试剂盒的一种组成成分，也不涉及己糖激酶的制备。
申请人未在其他专利中查阅到相关己糖激酶的制备研究。
目前国内对己糖激酶的研究主要集中在植物体代谢途径和人体肿瘤上，而诊断用己糖激酶因应用局限性大、市场需求量小等因素导致国内关于其工业化生产的研究进展缓慢，就申请人了解的范围而言目前未见有自主知识产权的诊断用己糖激酶产品。市售己糖激酶试剂盒的原料HK均源于进口，国内尚无自主知识产权的诊断用HK制剂出售。而进口酶因价格昂贵、进口途径复杂、遇质量问题难以解决等原因，给试剂盒生产厂家带来诸多不便。为采用国产试剂级己糖激酶试剂替代进口产品，普及HK法血糖测试盒在临床中的应用，以满足临床对高精度检验的需要，为医生诊断疾病提供可靠的数字依据。筛选产己糖激酶的微生物菌株，对其进行发酵、提取和纯化获得诊断用己糖激酶，从而替代进口产品，不仅是国内市场亟待填补的产品空白，同时也是本领域技术人员的主要研发方向和所面临的技术难题之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种诊断用己糖激酶的制备方法，所制备的诊断用己糖激酶具有比活力、酶活及纯度较高。
本发明的整体技术构思是：
诊断用己糖激酶的制备方法，包括如下工艺步骤：
A、菌种的纯化及复壮
A1、将酿酒酵母溶于无菌水后划线于孟加拉红培养基上，于30-35℃恒温培养2-3天，选取长势良好的单菌落划线培养，于32-37℃继续培养，挑取长势良好的菌株发酵并进行酶活力检测。最终选取酶活较高的菌株作为后续发酵用菌株；
将筛选出的酿酒酵母单菌落接种于灭菌后的试管培养基中，在温度为28-30℃条件下培养12-16小时，试管培养基采用如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨1％-3％；酵母粉0.5％-1.5％；葡萄糖1％-3％；余量为水；pH＝6.5-7.5；
酿酒酵母为安琪酵母股份有限公司生产，产品标准代码为GB/T20886；
A2、纯化及复壮后菌种的保藏
按质量比为1：1-3的比例，将步骤A1培养后的菌种置于质量百分含量为30％-50％的无菌甘油溶液中于-20℃保藏；
B、发酵制备含有己糖激酶的发酵液
将步骤A2中保藏的菌种活化后接种于灭菌后的发酵培养基中，在温度为28℃-30℃、压力为0.03MPa-0.05MPa、搅拌转速为150rpm-200rpm的条件下发酵制成含有己糖激酶的发酵液；
发酵培养基采用如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨1％-3％；酵母粉0.5％-1.5％；葡萄糖1％-3％，余量为水；pH＝6.5-7.5；
C、对发酵液进行后处理制备己糖激酶粗酶液；
D、对己糖激酶粗酶液进行纯化。
其中步骤的活化的主要目的是为保证低温保藏下的菌种尽快恢复活性以应用于工业生产，因其属于本技术领域普通技术人员的应知应会内容，申请人在此对其工艺步骤及工艺条件不再赘述。
本发明的具体技术构思还有：
发酵主要目的是便于在发酵过程中合成己糖激酶，同时满足工业化生产的需要，优选的技术方案是，所述的步骤B包括如下工序：
B1、摇瓶种子的制备
将步骤A2中保存的菌种活化后，按质量百分含量为1％-4％的接种量接种于灭菌后的摇瓶种子培养基中，在温度为28℃-30℃，转速为180-220rpm的条件下培养12-16小时制成摇瓶种子液；
摇瓶种子培养基采用如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨1％-3％；酵母粉0.5％-1.5％；葡萄糖1％-3％；余量为水；pH＝6.5-7.5；
摇瓶装液量为15％-25％；
B2、发酵罐发酵
将步骤B1中制成的摇瓶种子液按照体积百分含量为1％-4％的接种量接种于灭菌后的发酵培养基中，在温度为28℃-30℃、压力为0.03MPa-0.05MPa、搅拌转速为150rpm-200rpm的条件下发酵36-40小时制成含有己糖激酶的发酵液；
发酵培养基采用如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨1％-3％；酵母粉0.5％-1.5％；葡萄糖1％-3％，余量为水；pH＝6.5-7.5；
发酵罐装量为60％-70％。
对发酵液进行后处理制备己糖激酶粗酶液的主要目的是便于从发酵液中提取己糖激酶，因其主要包含与菌体细胞内，为获得更好的提取效果，优选的步骤C的工艺步骤如下：
将步骤B2制成的含有己糖激酶的发酵液离心弃上清后收集菌体，将收集到的菌体溶解于pH＝7.6、浓度为40-50mmoL的TEA-HCl中并置于碎冰上用超声波对菌体破壁，将破壁后的溶液体系离心后收集上清制成己糖激酶粗酶液。
对己糖激酶粗酶液进行纯化的主要目的是去除己糖激酶粗酶液中的杂质，以满足临床诊断的需要，结合己糖激酶及粗酶液中所含有杂质的特点，优选的技术方案是，所述的步骤D包括如下工艺步骤：
D1、将步骤C制备的己糖激酶粗酶液经过中空纤维超滤滤除小分子杂质；
D2、利用阴离子交换柱对步骤D1超滤处理后的粗酶液纯化，包括如下步骤：
D2-1、上样缓冲液Tris-HCl平衡4-5个柱体积后进行样品上样，流速为1-2mL/min；
D2-2、用上样缓冲液Tris-HCl洗3-4个柱体积，使未与填料结合的杂蛋白完全去除；
D2-3、用含有浓度为0-0.5mol/L的NaCl溶液的上样缓冲液Tris-HCl线性洗脱15-25个柱体积，流速为1-3mL/min，收集洗脱液；
D2-4、将洗脱液中有己糖激酶酶活力的样品合并，进行下一步纯化；
步骤D2-1、D2-2中所述的上样缓冲液Tris-HCl浓度为0.01-0.05mol/L，pH＝6.0-7.0，步骤D2-3中所述的上样缓冲液Tris-HCl浓度为0.01-0.05mol/L，pH＝7.0-8.0；
D3、用Tris-HCl缓冲液平衡4-5个柱体积的Sephadex凝胶柱，然后将步骤D2-4纯化后的样品浓缩液上样0.3-0.6mL，洗脱速度0.5-1mL/min，收集有己糖激酶酶活性的洗脱液，进行SDS-PAGE凝胶电泳，所述的Tris-HCl缓冲液浓度为6-12mmol/L、pH＝6.0-8.0、其中NaCl 0.05-0.2mol/L；
更为优选的技术方案是，为检测纯化的效果，还包括一步骤D4，即对纯化后得到的酶液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行验证。
为便于菌种的生长，优选的技术方案是，所述的步骤B2中是将步骤B1中制成的摇瓶种子液接种于灭菌后温度为25℃-32℃的发酵培养基。
为更好地滤除小分子杂质，优选的技术方案是，所述的步骤D1中的中空纤维的截留分子量为10KD-15KD。
为取得更好的破壁效果，优选的技术方案是，所述的步骤C中破壁体系的装液量为容器总体积的50％-80％，选用6mm变幅杆、200W-300W的功率破壁7-15分钟，破壁过程采用间歇破壁，即每破壁1-1.5秒间歇1-1.5秒。
优选的技术方案是，所述的步骤D2中阴离子交换柱的规格为DEAE Sepharose FF。
为检测本发明中所制备的诊断用己糖激酶的性能指标，申请人采用如下方法：
一、酶活检测：(参照Sigma己糖激酶的测定方法)
1、测定方法：分别添加1ml 0.05mol/L的TEA-HCL，1ml 0.555mol/L的D-葡萄糖溶液，0.1ml 0.019mol/L的ATP，0.2ml0.1mol/L的MgCl2溶液,0.2ml 0.014mol/L的NADP+，0.02ml 125U/mL的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶到试验管和空白管。混匀后于25℃水浴1min，于波长340nm处读取吸光值A1。然后试验管加入0.05mL待测酶液，空白管加入0.05mL ddH2O，于25℃继续反应5min，后读取吸光值A2。
酶活计算公式(U/mL)＝〔(ΔA试验管-ΔA空白管)×2.57×Df〕÷〔6.22×0.05〕。
注：2.57：反应液总体积；
Df：稀释倍数；
6.22：β-NADPH在340nm处的吸光系数；
0.05：比色皿体积；
2、测定设备：TU-1901双光束紫外可见分光光度计
3、测定人员：罗同阳
4、测定场所：河北省微生物研究所检测中心
5、测定时间：2016年07月
二、比活力的测定
1、测定方法：Bradford法
2、测定设备：721分光光度计
3、测定人员：罗同阳
4、测定场所：河北省微生物研究所检测中心
5、测定时间：2016年07月
三、分子量及纯度的测定
1、测定方法：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
2、测定设备：电泳仪
3、测定人员：罗同阳
4、测定场所：河北省微生物研究所分子实验室
5、测定时间：2016年07月
本发明所具备的实质性特点和显著的技术进步在于：
1、本发明创造性地从现有菌种中筛选出己糖激酶的生产菌种，并结合发酵生产的特点构建了后续纯化的方法，其菌种来源及制备方法可行，产品纯度高，适于工业化生产。
2、采用本发明的方法所制备的诊断用己糖激酶填补了国内尚无自主知识产权的诊断用己糖激酶产品的空白。
3、采用本发明的方法所制备的诊断用己糖激酶酶活力为70-82U/g(最高可达82U/g)，耐受温度35-40℃(最高可达40℃)，高于专利号为5948665的美国专利中的己糖激酶(酶活为59U/g，耐热温度为37℃。)
4、采用本发明的方法制备的诊断用己糖激酶比活力为0.5-0.65U/mg(最高可达0.65U/mg)，高于现有文献及进口产品中公开的相应指标，能够有效满足配制试剂盒的工业化需要。
附图说明
图1是本发明中纯化后的己糖激酶SDS-PAGE。
附图中M：marker；E1-2：纯化洗脱液；E2为获得的单一条带的电泳级纯酶液。图1说明采用本发明的方法制备的产品能达到纯度能达到电泳级纯。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书做出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
实施例1
诊断用己糖激酶的制备方法，包括如下工艺步骤：
A、菌种的纯化及复壮
A1、将酿酒酵母溶于无菌水后划线于孟加拉红培养基上，于30-35℃恒温培养2-3天，选取长势良好的单菌落划线培养，于32-37℃继续培养，选取长势良好的菌株发酵并进行酶活力检测。最终选取酶活较高的菌株作为后续发酵用菌株。
将筛选出的酿酒酵母单菌落接种于灭菌后的试管培养基中，在温度为28℃条件下培养16小时，试管培养基采用如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨1％；酵母粉0.5％；葡萄糖1％；余量为水；pH＝6.5；
酿酒酵母为安琪酵母股份有限公司生产，产品标准代码为GB/T20886；
A2、纯化及复壮后菌种的保藏
按质量比为1：1的比例，将步骤A1培养后的菌种置于质量百分含量为30％的无菌甘油溶液中于-20℃保藏；
B、发酵制备含有己糖激酶的发酵液,包括如下工艺步骤：
B1、摇瓶种子的制备
将步骤A2中保存的菌种活化后，按质量百分含量为1％的接种量接种于灭菌后的摇瓶种子培养基中，在温度为28℃，转速为180rpm的条件下培养16小时制成摇瓶种子液；
摇瓶种子培养基采用如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨1％；酵母粉0.5％；葡萄糖1％；余量为水；pH＝6.5；
摇瓶装液量为15％-25％；
B2、发酵罐发酵
将步骤B1中制成的摇瓶种子液按照体积百分含量为1％的接种量接种于灭菌后温度为25℃的发酵培养基中，在温度为28℃、压力为0.03MPa、搅拌转速为150rpm的条件下发酵40小时制成含有己糖激酶的发酵液；
发酵培养基采用如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨1％；酵母粉0.5％；葡萄糖1％，余量为水；pH＝6.5-7.5；
发酵罐装量为60％。
C、对发酵液进行后处理制备己糖激酶粗酶液
将步骤B制成的含有己糖激酶的发酵液离心弃上清后收集菌体，将收集到的菌体溶解于pH＝7.6、浓度为40mmoL的TEA-HCl中并置于碎冰上用超声波对菌体破壁，破壁体系的装液量为容器总体积的50％，选用6mm变幅杆、200W的功率破壁8分钟，破壁过程采用间歇破壁，即每破壁1秒间歇1秒，将破壁后的溶液体系离心后收集上清制成己糖激酶粗酶液。
D、对己糖激酶粗酶液进行纯化,包括如下工艺步骤：
D1、将步骤C制备的己糖激酶粗酶液经过截留分子量为10KD-15KD中空纤维超滤滤除小分子杂质；
D2、利用阴离子交换柱DEAE Sepharose FF对步骤D1超滤处理后的粗酶液纯化，包括如下步骤：
D2-1、上样缓冲液Tris-HCl平衡4个柱体积后进行样品上样，流速为1mL/min；
D2-2、用上样缓冲液Tris-HCl洗3个柱体积，使未与填料结合的杂蛋白完全去除；
D2-3、用上样缓冲液Tris-HCl线性洗脱15个柱体积，流速为1mL/min，收集洗脱液；
D2-4、将洗脱液中有己糖激酶酶活力的样品合并，进行下一步纯化；
步骤D2-1、D2-2中所述的上样缓冲液Tris-HCl浓度为0.01mol/L，pH＝6.0，步骤D2-3中所述的上样缓冲液Tris-HCl浓度为0.01mol/L，pH＝7.0；
D3、用Tris-HCl缓冲液平衡4个柱体积的Sephadex凝胶柱，然后将步骤D2-4纯化后的样品浓缩液上样0.3mL，洗脱速度0.5mL/min，收集有己糖激酶酶活性的洗脱液，进行SDS-PAGE凝胶电泳，所述的Tris-HCl缓冲液浓度为6mmol/L、pH＝6.0、其中NaCl 0.05mol/L；
D4、对纯化后得到的酶液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行验证。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于：
诊断用己糖激酶的制备方法，包括如下工艺步骤：
A、菌种的纯化及复壮
A1、将筛选出的酿酒酵母单菌落接种于灭菌后的试管培养基中，在温度为30℃条件下培养12小时，试管培养基采用如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨3％；酵母粉1.5％；葡萄糖3％；余量为水；pH＝6.5-7.5；
A2、纯化及复壮后菌种的保藏
按质量比为1：3的比例，将步骤A1培养后的菌种置于质量百分含量为50％的无菌甘油溶液中于-20℃保藏；
B、发酵制备含有己糖激酶的发酵液,包括如下工艺步骤：
B1、摇瓶种子的制备
将步骤A2中保存的菌种活化后，按质量百分含量为4％的接种量接种于灭菌后的摇瓶种子培养基中，在温度为30℃，转速为220rpm的条件下培养12小时制成摇瓶种子液；
摇瓶种子培养基采用如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨3％；酵母粉1.5％；葡萄糖3％；余量为水；pH＝7.5；
摇瓶装液量为25％；
B2、发酵罐发酵
将步骤B1中制成的摇瓶种子液按照体积百分含量为4％的接种量接种于灭菌后温度为32℃的发酵培养基中，在温度为30℃、压力为0.05MPa、搅拌转速为200rpm的条件下发酵36小时制成含有己糖激酶的发酵液；
发酵培养基采用如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨3％；酵母粉1.5％；葡萄糖3％，余量为水；pH＝7.5；
发酵罐装量为70％。
C、对发酵液进行后处理制备己糖激酶粗酶液
将步骤B制成的含有己糖激酶的发酵液离心弃上清后收集菌体，将收集到的菌体溶解于pH＝7.6、浓度为50mmoL的TEA-HCl中并置于碎冰上用超声波对菌体破壁，破壁体系的装液量为容器总体积的80％，选用6mm变幅杆、240W的功率破壁7分钟，破壁过程采用间歇破壁，即每破壁1.5秒间歇1.5秒，将破壁后的溶液体系离心后收集上清制成己糖激酶粗酶液。
D、对己糖激酶粗酶液进行纯化,包括如下工艺步骤：
D2、利用阴离子交换柱DEAE Sepharose FF对步骤D1超滤处理后的粗酶液纯化，包括如下步骤：
D2-1、上样缓冲液Tris-HCl平衡5个柱体积后进行样品上样，流速为2mL/min；
D2-2、用上样缓冲液Tris-HCl洗4个柱体积，使未与填料结合的杂蛋白完全去除；
D2-3、用含有浓度为0.5mol/L的NaCl溶液的上样缓冲液Tris-HCl线性洗脱25个柱体积，流速为3mL/min，收集洗脱液；
D2-4、将洗脱液中有己糖激酶酶活力的样品合并，进行下一步纯化；
步骤D2-1、D2-2中所述的上样缓冲液Tris-HCl浓度为0.05mol/L，pH＝7.0，步骤D2-3中所述的上样缓冲液Tris-HCl浓度为0.05mol/L，pH＝8.0；
D3、用Tris-HCl缓冲液平衡5个柱体积的Sephadex凝胶柱，然后将步骤D2-4纯化后的样品浓缩液上样0.6mL，洗脱速度1mL/min，收集有己糖激酶酶活性的洗脱液，进行SDS-PAGE凝胶电泳，所述的Tris-HCl缓冲液浓度为12mmol/L、pH＝8.0、其中NaCl 0.2mol/L。
其余内容与实施例1相同。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：
诊断用己糖激酶的制备方法，包括如下工艺步骤：
A、菌种的纯化及复壮
A1、将筛选出的酿酒酵母单菌落接种于灭菌后的试管培养基中，在温度为29℃条件下培养14小时，试管培养基采用如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨2％；酵母粉1％；葡萄糖2％；余量为水；pH＝7.0；
A2、纯化及复壮后菌种的保藏
按质量比为1：2的比例，将步骤A1培养后的菌种置于质量百分含量为40％的无菌甘油溶液中于-20℃保藏；
B、发酵制备含有己糖激酶的发酵液,包括如下工艺步骤：
B1、摇瓶种子的制备
将步骤A2中保存的菌种活化后，按质量百分含量为2.5％的接种量接种于灭菌后的摇瓶种子培养基中，在温度为29℃，转速为200rpm的条件下培养14小时制成摇瓶种子液；
摇瓶种子培养基采用如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨2％；酵母粉1％；葡萄糖2％；余量为水；pH＝7.0；
摇瓶装液量为20％；
B2、发酵罐发酵
将步骤B1中制成的摇瓶种子液按照体积百分含量为2.5％的接种量接种于灭菌后温度为28℃的发酵培养基中，在温度为29℃、压力为0.04MPa、搅拌转速为175rpm的条件下发酵38小时制成含有己糖激酶的发酵液；
发酵培养基采用如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨2％；酵母粉1％；葡萄糖2％，余量为水；pH＝6.5-7.5；
发酵罐装量为65％。
C、对发酵液进行后处理制备己糖激酶粗酶液
将步骤B制成的含有己糖激酶的发酵液离心弃上清后收集菌体，将收集到的菌体溶解于pH＝7.6、浓度为45mmoL的TEA-HCl中并置于碎冰上用超声波对菌体破壁，破壁体系的装液量为容器总体积的65％，选用6mm变幅杆、275W的功率破壁12分钟，破壁过程采用间歇破壁，即每破壁1秒间歇1秒，将破壁后的溶液体系离心后收集上清制成己糖激酶粗酶液。
D、对己糖激酶粗酶液进行纯化,包括如下工艺步骤：
D2、利用阴离子交换柱DEAE Sepharose FF对步骤D1超滤处理后的粗酶液纯化，包括如下步骤：
D2-1、上样缓冲液Tris-HCl平衡5个柱体积后进行样品上样，流速为1-2mL/min；
D2-2、用上样缓冲液Tris-HCl洗3个柱体积，使未与填料结合的杂蛋白完全去除；
D2-3、用含有浓度为0.25mol/L的NaCl溶液的上样缓冲液Tris-HCl线性洗脱20个柱体积，流速为2mL/min，收集洗脱液；
D2-4、将洗脱液中有己糖激酶酶活力的样品合并，进行下一步纯化；
步骤D2-1、D2-2中所述的上样缓冲液Tris-HCl浓度为0.03mol/L，pH＝6.5，步骤D2-3中所述的上样缓冲液Tris-HCl浓度为0.03mol/L，pH＝7.5；
D3、用Tris-HCl缓冲液平衡5个柱体积的Sephadex凝胶柱，然后将步骤D2-4纯化后的样品浓缩液上样0.4mL，洗脱速度0.75mL/min，收集有己糖激酶酶活性的洗脱液，进行SDS-PAGE凝胶电泳，所述的Tris-HCl缓冲液浓度为9mmol/L、pH＝7.0、其中NaCl 0.12mol/L。
其余内容与实施例1相同。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于：
诊断用己糖激酶的制备方法，包括如下工艺步骤：
A、菌种的纯化及复壮
A1、将筛选出的酿酒酵母单菌落接种于灭菌后的试管培养基中，在温度为28℃条件下培养15小时，试管培养基采用如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨1.5％；酵母粉0.75％；葡萄糖1.5％；余量为水；pH＝7.0；
A2、纯化及复壮后菌种的保藏
按质量比为1：1.5的比例，将步骤A1培养后的菌种置于质量百分含量为35％的无菌甘油溶液中于-20℃保藏；
B、发酵制备含有己糖激酶的发酵液,包括如下工艺步骤：
B1、摇瓶种子的制备
将步骤A2中保存的菌种活化后，按质量百分含量为1.5％的接种量接于灭菌后的摇瓶种子培养基中，在温度为28℃，转速为190rpm的条件下培养13小时制成摇瓶种子液；
摇瓶种子培养基采用如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨1.5％；酵母粉0.75％；葡萄糖1.5％；余量为水；pH＝6.8；
摇瓶装液量为15％-25％；
B2、发酵罐发酵
将步骤B1中制成的摇瓶种子液按照体积百分含量为1.5％的接种量接种于灭菌后温度为26℃的发酵培养基中，在温度为28℃、压力为0.035MPa、搅拌转速为160rpm的条件下发酵37小时制成含有己糖激酶的发酵液；
发酵培养基采用如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨1.5％；酵母粉0.75％；葡萄糖1.5％，余量为水；pH＝6.8；
发酵罐装量为60％-70％。
C、对发酵液进行后处理制备己糖激酶粗酶液
将步骤B制成的含有己糖激酶的发酵液离心弃上清后收集菌体，将收集到的菌体溶解于pH＝7.6、浓度为42mmoL的TEA-HCl中并置于碎冰上用超声波对菌体破壁，破壁体系的装液量为容器总体积的60％，选用6mm变幅杆、260W的功率破壁13分钟，破壁过程采用间歇破壁，即每破壁1.5秒间歇1秒，将破壁后的溶液体系离心后收集上清制成己糖激酶粗酶液。
D、对己糖激酶粗酶液进行纯化,包括如下工艺步骤：
D2、利用阴离子交换柱DEAE Sepharose FF对步骤D1超滤处理后的粗酶液纯化，包括如下步骤：
D2-1、上样缓冲液Tris-HCl平衡5个柱体积后进行样品上样，流速为1-2mL/min；
D2-2、用上样缓冲液Tris-HCl洗3个柱体积，使未与填料结合的杂蛋白完全去除；
D2-3、用含有浓度为0.1mol/L的NaCl溶液的上样缓冲液Tris-HCl线性洗脱18个柱体积，流速为1.5mL/min，收集洗脱液；
D2-4、将洗脱液中有己糖激酶酶活力的样品合并，进行下一步纯化；
步骤D2-1、D2-2中所述的上样缓冲液Tris-HCl浓度为0.02mol/L，pH＝6.5，步骤D2-3中所述的上样缓冲液Tris-HCl浓度为0.02mol/L，pH＝7.2；
D3、用Tris-HCl缓冲液平衡4-5个柱体积的Sephadex凝胶柱，然后将步骤D2-4纯化后的样品浓缩液上样0.35mL，洗脱速度0.6mL/min，收集有己糖激酶酶活性的洗脱液，进行SDS-PAGE凝胶电泳，所述的Tris-HCl缓冲液浓度为7mmol/L、pH＝6.5、其中NaCl 0.08mol/L。
其余内容与实施例1相同。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于：
诊断用己糖激酶的制备方法，包括如下工艺步骤：
A、菌种的纯化及复壮
A1、将筛选出的酿酒酵母单菌落接种于灭菌后的试管培养基中，在温度为30℃条件下培养15小时，试管培养基采用如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨2.5％；酵母粉1.2％；葡萄糖2.5％；余量为水；pH＝7.2；
A2、纯化及复壮后菌种的保藏
按质量比为1：2.5的比例，将步骤A1培养后的菌种置于质量百分含量为45％的无菌甘油溶液中于-20℃保藏；
B、发酵制备含有己糖激酶的发酵液,包括如下工艺步骤：
B1、摇瓶种子的制备
将步骤A2中保存的菌种活化后，按质量百分含量为3％的接种量接种于灭菌后的摇瓶种子培养基中，在温度为28℃，转速为210rpm的条件下培养15小时制成摇瓶种子液；
摇瓶种子培养基采用如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨2.5％；酵母粉1.3％；葡萄糖2.5％；余量为水；pH＝7.5；
摇瓶装液量为22％；
B2、发酵罐发酵
将步骤B1中制成的摇瓶种子液按照体积百分含量为为3％的接种量接种于灭菌后温度为31℃的发酵培养基中，在温度为30℃、压力为0.045MPa、搅拌转速为190rpm的条件下发酵39小时制成含有己糖激酶的发酵液；
发酵培养基采用如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨2.5％；酵母粉1.3％；葡萄糖2.5％，余量为水；pH＝6.5-7.5；
发酵罐装量为68％。
C、对发酵液进行后处理制备己糖激酶粗酶液
将步骤B制成的含有己糖激酶的发酵液离心弃上清后收集菌体，将收集到的菌体溶解于pH＝7.6、浓度为48mmoL的TEA-HCl中并置于碎冰上用超声波对菌体破壁，破壁体系的装液量为容器总体积的75％，选用6mm变幅杆、300W的功率破壁15分钟，破壁过程采用间歇破壁，即每破壁1秒间歇1.5秒，将破壁后的溶液体系离心后收集上清制成己糖激酶粗酶液。
D、对己糖激酶粗酶液进行纯化,包括如下工艺步骤：
D2、利用阴离子交换柱DEAE Sepharose FF对步骤D1超滤处理后的粗酶液纯化，包括如下步骤：
D2-1、上样缓冲液Tris-HCl平衡4个柱体积后进行样品上样，流速为1mL/min；
D2-2、用上样缓冲液Tris-HCl洗4个柱体积，使未与填料结合的杂蛋白完全去除；
D2-3、用含有浓度为0.4mol/L的NaCl溶液的上样缓冲液Tris-HCl线性洗脱22个柱体积，流速为2.5mL/min，收集洗脱液；
D2-4、将洗脱液中有己糖激酶酶活力的样品合并，进行下一步纯化；
步骤D2-1、D2-2中所述的上样缓冲液Tris-HCl浓度为0.04mol/L，pH＝6.0-7.0，步骤D2-3中所述的上样缓冲液Tris-HCl浓度为0.04mol/L，pH＝8.0；
D3、用Tris-HCl缓冲液平衡5个柱体积的Sephadex凝胶柱，然后将步骤D2-4纯化后的样品浓缩液上样0.5mL，洗脱速度0.9mL/min，收集有己糖激酶酶活性的洗脱液，进行SDS-PAGE凝胶电泳，所述的Tris-HCl缓冲液浓度为11mmol/L、pH＝8.0、其中NaCl 0.18mol/L。
其余内容与实施例1相同。
为验证本发明的效果，申请人对本发明实施例1-5中制备的产品进行了如下检测：
一、比活力测定
表一、比活力测定结果
实施例 比活力(U/mg)
实施例1制备的产品 0.50
实施例2制备的产品 0.65
实施例3制备的产品 0.57
实施例4制备的产品 0.60
实施例5制备的产品 0.55
由检测结果可知，采用本发明实施例1-5中的方法制备的诊断用己糖激酶的比活力均高于购自南京建成的成品己糖激酶(南京建成的成品酶比活力为0.28U/mg)。
二、酶活测定
表二、酶活测定结果
实施例 酶活(U/g)
实施例1制备的产品 72
实施例2制备的产品 82
实施例3制备的产品 74
实施例4制备的产品 79
实施例5制备的产品 76
由检测结果可知，采用本发明实施例1-5中的方法制备的诊断用己糖激酶酶活高于专利号为5948665的美国专利中用于诊断试剂用己糖激酶的酶活。
三、其他检测结果
温度耐受性
分别设置不同的温度梯度对本发明实施例1-5所制备的己糖激酶的耐温度进行检测，结果表明，本产品在40℃时保持60％左右的酶活。
温度 25℃ 30℃ 35℃ 40℃ 45℃
实施例1制备的产品酶活(U/g) 72 70 56 44 -
实施例2制备的产品酶活(U/g) 82 78 60 50 -
实施例3制备的产品酶活(U/g) 74 69 53 43 -
实施例4制备的产品酶活(U/g) 79 74 55 45 -
实施例5制备的产品酶活(U/g) 76 71 52 42 -
综上一至三的检测结果，采用本发明方法制备的诊断用己糖激酶的各项主要指标均高于专利号为5948665的美国专利或现有市售产品中公开的用于诊断用己糖激酶的活力和耐热性。

Claims (8)

1.诊断用己糖激酶的制备方法，其特征在于包括如下工艺步骤：
A、菌种的纯化及复壮
A1、将酿酒酵母溶于无菌水后划线于孟加拉红培养基上，于30-35℃恒温培养2-3天，选取长势良好的单菌落划线培养，于32-37℃继续培养，挑取长势良好的菌株发酵并进行酶活力检测，最终选取酶活较高的菌株作为后续发酵用菌株；
将筛选出的酿酒酵母单菌落接种于灭菌后的试管培养基中，在温度为28-30℃条件下培养12-16小时，试管培养基采用如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨1％-3％；酵母粉0.5％-1.5％；葡萄糖1％-3％；余量为水；pH＝6.5-7.5；
酿酒酵母为安琪酵母股份有限公司生产，产品标准代码为GB/T20886；
A2、纯化及复壮后菌种的保藏
按质量比为1：1-3的比例，将步骤A1培养后的菌种置于质量百分含量为30％-50％的无菌甘油溶液中于-20℃保藏；
B、发酵制备含有己糖激酶的发酵液
将步骤A2中保藏的菌种活化后接种于灭菌后的发酵培养基中，在温度为28℃-30℃、压力为0.03MPa-0.05MPa、搅拌转速为150rpm-200rpm的条件下发酵制成含有己糖激酶的发酵液；
发酵培养基采用如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨1％-3％；酵母粉0.5％-1.5％；葡萄糖1％-3％，余量为水；pH＝6.5-7.5；
C、对发酵液进行后处理制备己糖激酶粗酶液；
D、对己糖激酶粗酶液进行纯化。
2.根据权利要求1所述的诊断用己糖激酶的制备方法，其特征在于所述的步骤B包括如下工序：
B1、摇瓶种子的制备
将步骤A2中保存的菌种活化后，按质量百分含量为1％-4％的接种量接种于灭菌后的摇瓶种子培养基中，在温度为28℃-30℃，转速为180-220rpm的条件下培养12-16小时制成摇瓶种子液；
摇瓶种子培养基采用如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨1％-3％；酵母粉0.5％-1.5％；葡萄糖1％-3％；余量为水；pH＝6.5-7.5；
摇瓶装液量为15％-25％；
B2、发酵罐发酵
将步骤B1中制成的摇瓶种子液按照体积百分含量为1％-4％的接种量接种于灭菌后的发酵培养基中，在温度为28℃-30℃、压力为0.03MPa-0.05MPa、搅拌转速为150rpm-200rpm的条件下发酵36-40小时制成含有己糖激酶的发酵液；
发酵培养基采用如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨1％-3％；酵母粉0.5％-1.5％；葡萄糖1％-3％，余量为水；pH＝6.5-7.5；
发酵罐装量为60％-70％。
3.根据权利要求1所述的诊断用己糖激酶的制备方法，其特征在于所述的步骤C的工艺步骤如下：
将步骤B制成的含有己糖激酶的发酵液离心弃上清后收集菌体，将收集到的菌体溶解于pH＝7.6、浓度为40-50mmoL的TEA-HCl中并置于碎冰上用超声波对菌体破壁，将破壁后的溶液体系离心后收集上清制成己糖激酶粗酶液。
4.根据权利要求1所述的诊断用己糖激酶的制备方法，其特征在于所述的步骤D包括如下工艺步骤：
D1、将步骤C制备的己糖激酶粗酶液经过中空纤维超滤滤除小分子杂质；
D2、利用阴离子交换柱对步骤D1超滤处理后的粗酶液纯化，包括如下步骤：
D2-1、上样缓冲液Tris-HCl平衡4-5个柱体积后进行样品上样，流速为1-2mL/min；
D2-2、用上样缓冲液Tris-HCl洗3-4个柱体积，使未与填料结合的杂蛋白完全去除；
D2-3、用含有浓度为0-0.5mol/L的NaCl溶液的上样缓冲液Tris-HCl线性洗脱15-25个柱体积，流速为1-3mL/min，收集洗脱液；
D2-4、将洗脱液中有己糖激酶酶活力的样品合并，进行下一步纯化；
步骤D2-1、D2-2中所述的上样缓冲液Tris-HCl浓度为0.01-0.05mol/L，pH＝6.0-7.0，步骤D2-3中所述的上样缓冲液Tri s-HCl浓度为0.01-0.05mol/L，pH＝7.0-8.0；
D3、用Tris-HCl缓冲液平衡4-5个柱体积的Sephadex凝胶柱，然后将步骤D2-4纯化后的样品浓缩液上样0.3-0.6mL，洗脱速度0.5-1mL/min，收集有己糖激酶酶活性的洗脱液，进行SDS-PAGE凝胶电泳，所述的Tris-HCl缓冲液浓度为6-12mmol/L、pH＝6.0-8.0、其中NaCl0.05-0.2mol/L。
5.根据权利要求2所述的诊断用己糖激酶的制备方法，其特征在于所述的步骤B2中是将步骤B1中制成的摇瓶种子液接种于灭菌后温度为25℃-32℃的发酵培养基。
6.根据权利要求3所述的诊断用己糖激酶的制备方法，其特征在于所述的步骤C中破壁体系的装液量为容器总体积的50％-80％，选用6mm变幅杆、200W-300W的功率破壁7-15分钟，破壁过程采用间歇破壁，即每破壁1-1.5秒间歇1-1.5秒。
7.根据权利要求4所述的诊断用己糖激酶的制备方法，其特征在于所述的步骤D1中中空纤维的截留分子量为10KD-15KD。
8.根据权利要求4所述的诊断用己糖激酶的制备方法，其特征在于所述的步骤D2中阴离子交换柱的规格为DEAE Sepharose FF。
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