CN105368852A

CN105368852A - 一种萤火虫荧光素酶的编码基因及制备方法

Info

Publication number: CN105368852A
Application number: CN201510964506.9A
Authority: CN
Inventors: 高静; 蔡亦梅; 吴超; 徐潇; 张睿; 王者馥; 王绪敏; 殷金龙; 任鲁风
Original assignee: Beijing Zhongkezixin Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Zhongkezixin Technology Co Ltd
Priority date: 2015-12-21
Filing date: 2015-12-21
Publication date: 2016-03-02
Anticipated expiration: 2035-12-21
Also published as: CN105368852B

Abstract

本发明提供一种高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因及制备方法。该基因是通过对来源于Photinuspyralis的萤火虫荧光素酶基因进行分子改造后，通过化学合成获得。本发明提供的高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因目前未见报道，其在大肠杆菌中表达的荧光素酶占全细胞内可溶性蛋白质的72.1％～83.5％，荧光素酶的表达量为481～739mg/10g湿菌。本发明提供的高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因的表达产物是一种荧光素酶，该荧光素酶热稳定性高，在40℃下保温20min，仍能够保持95％左右的相对活性。

Description

一种萤火虫荧光素酶的编码基因及制备方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种高效表达的高热稳定性萤火虫荧光素酶的编码基因，还涉及该萤火虫荧光素酶的制备方法。

背景技术

萤火虫荧光素酶(EC1.13.12.5～7)属于氧化还原酶类，其中最典型的为北美萤火虫荧光素酶(EC1.13.12.7)。北美萤火虫荧光素酶由单一多肽链组成，含有511个氨基酸残基，相对分子量约为62KD，不含辅因子并且大部分氨基酸为非极性氨基酸。北美萤火虫荧光素酶的高级结构中含有两对二硫键和两个色氨酸，其发射光波长范围为552～582nm，最大吸收波长为562nm。

萤火虫荧光素酶在腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、O₂以及Mg²⁺的参与下，能够催化D-荧光素氧化脱羧，并将化学能转化为光能，同时释放黄绿色荧光。具体反应过程及发光机制如下：萤火虫荧光素酶先将荧光素和Mg-ATP复合物转化为相应的过渡态产物虫荧光素腺苷酸；过渡态产物迅速与O₂反应，释放出腺嘌呤核苷一磷酸(AMP)后，形成激发态产物氧化荧光素；激发态产物释放光量子回到基态。

萤火虫荧光素酶在许多领域存在重要应用性。例如用于病原微生物的快速检测：当催化体系中的荧光素和其他成分过量时，催化发光的强度与ATP的量成正比，另一方面研究人员发现细菌中ATP的含量固定，因此可通过利用荧光素酶测定样品中的ATP含量来间接估测样品中细菌的数量。该方法被广泛应用于临床医学以及法医学检测、环境监测、生命科学研究等领域。此外，荧光素酶基因还能够作为报告基因用于检测目的基因的表达情况：利用荧光素酶基因与目的基因的平行表达，能够显示目的基因在什么时间、部位以及诱因下进行表达。荧光素酶的另一个重要应用是用于核酸序列的测序分析：荧光素酶、DNA聚合酶、ATP硫酸化酶和腺苷三磷酸双磷酸酶四种酶催化的同一反应体系中的酶级联反应构成了焦磷酸测序技术的核心。

虽然萤火虫荧光素酶存在着重要的应用价值，但其热稳定性差一定程度限制了其应用。尤其是当应用于焦磷酸测序技术中，测序反应体系需要进行高温延伸步骤，对萤火虫荧光素酶的热稳定性有相对更高的要求。

早期主要是利用亲和层析和分级沉淀技术从各种萤火虫的发光器官中提取萤火虫荧光素酶，该方法需要人工繁殖和捕捉萤火虫，受到季节和地域的限制，制备周期长、成本高。随着基因工程技术的发展，研发人员开始采用基因工程的方法，将萤火虫荧光素酶基因克隆到大肠杆菌中，用于表达重组萤火虫荧光素酶，经过体外检测，重组酶具有与野生型荧光素酶相当的催化特性与活性。

一方面，有研究公开了以萤火虫荧光素酶植物表达报告载体pXP2为模板，扩增得到编码萤火虫荧光素酶的基因(luc)，构建了诱导型表达载体pQE30-luc；转化其宿主菌E.coliM15，获得高效诱导表达萤火虫荧光素酶基因的重组菌M15/pQE30-luc，表达量占全菌胞内可溶性蛋白的50.9％；并利用Ni柱纯化表达具有活性的萤火虫荧光素酶,纯化后比酶活达到1.43×109RFU/mg(夏蕾，饶志明，沈微，等.荧光素酶编码基因luc在大肠杆菌中的克隆、表达及纯化[J].食品与生物技术学报，2008,27(5):62-66)。

另有研究公开通过PCR扩增技术获得萤火虫荧光素酶基因，然后利用DNA重组技术将荧光素酶基因连接到表达载体pET28a中。经过酶切和测序鉴定获得重组荧光素酶的高效表达载体。并利用离子交换层析和亲和层析对荧光素酶进行分离纯化，最终4g湿菌分离纯化出了50mL荧光素酶，利用Braford法测得其浓度为2.5mg/mL。即4g湿菌分离纯化出125mg荧光素酶(刘艳杰.重组萤火虫荧光素酶及其稳定性研究[D].天津大学,2010.)。

另一方面，中国专利申请CN102191213A中公开了在北美萤火虫荧光素酶基因中通过overlapPCR引入突变，连接于表达载体，生产高热稳定性及高酶活特性的萤火虫荧光素酶突变酶，该突变酶的发光强度是野生型的15-20倍左右，并且较野生型具有良好的热稳定性。

上述研究或是直接利用现有荧光素酶基因报告载体作为模板直接扩增荧光素酶基因，用于构建重组载体和重组工程菌，并通过对重组工程菌发酵条件的优化提高重组荧光素酶的产量，虽然构建的重组载体能够表达具有活性的重组荧光素酶，但其热稳定性相对于实际需求仍亟待提高。或是通过分子生物学技术对野生型萤火虫荧光素酶基因进行突变，以提高其热稳定性，虽然其热稳定性获得提高，但其蛋白产量仍无法满足实际需求。在实际应用中，商品化的荧光素酶价格仍比较昂贵并且多为从萤火虫中直接提取，例如，SIGMA-ALDRICH公司生产的萤火虫荧光素酶价格高达2371元/mg。因此，提供一种能够高效表达的，同时具备相对较高的热稳定性的荧光素酶是其商品化生产以及实际应用中需要解决的重要问题。

发明内容

术语

本发明中出现的英文名称“hluc”代表本发明所述“一种高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因”；本发明中出现的英文名称“luc”代表本发明所述“来源于Photinuspyralis的萤火虫荧光素酶原始基因”；本发明中出现的英文名称“HLUC”代表本发明所述“一种高效表达的高热稳定性荧光素酶”；本发明中出现的英文名称“LUC”代表本发明所述“来源于Photinuspyralis的萤火虫荧光素酶原始基因所表达的荧光素酶”；

本发明要解决的一个问题是提供一种高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因。所述高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因是以来源于Photinuspyralis的萤火虫荧光素酶基因为原始基因luc，通过分子改造获得。

本发明采取的技术方案是：

上述高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示：

ATGGAAGACGCTAAAAACATCAAAAAAGGTCCGGCTCCGTTCTACCCGCTGGAAGACGGTACTGCTGGTGAACAGCTGCACAAAGCTATGAAACGTTACGCTCTGGTTCCGGGTACTATCGCTTTCACCGACGCTCACATCGAAGTTAACATCACCTACGCTGAATACTTCGAAATGTCTGTTCGTCTGGCTGAAGCTATGAAACGTTACGGTCTGAACACCAACCACCGTATAGTTGTATGCAGCGAAAACTCTCTGCAATTCTTCATGCCGGTTCTGGGTGCTCTGTTCATCGGTGTTGCTGTTGCTCCGGCTAACGACATCTACAACGAACGTGAACTGCTGAACTCTATGAACATCTCTCAGCCGACCGTTGTTTTCGTTTCTAAAAAAGGTCTGCAAAAAATCCTGAACGTTCAGAAAAAACTGCCGATCATCCAGAAAATCATCATCATGGACTCTAAAACCGACTACCAGGGTTTCCAGTCTATGTACACCTTCGTTACCTCTCACCTGCCACCCGGCTTCAACGAATACGACTTCGTTCCAGAGAGCTTCGACCGTGACAAGACCATCGCTCTGATCATGAACTCTTCTGGTTCTACCGGTCTGCCGAAAGGTGTTGCTCTGCCGCACCGTACCGCTTGCGTTCGTTTCTCTCACGCTCGTGACCCGATCTTCGGTAACCAGATCATCCCGGACACCGCTATCCTGTCTGTTGTTCCGTTCCATCATGGCTTCGGTATGTTCACTACCCTGGGTTACCTGATCTGCGGTTTCCGTGTTGTTCTGATGTACCGTTTCGAAGAAGAACTGTTCCTGCGTTCTCTGCAAGACTACAAAATCCAGTCTGCTCTGCTGGTTCCGACCCTGTTCTCTTTCTTCGCTAAATCTACCCTGATCGACAAATACGACCTGTCTAACCTGCACGAAATCGCTTCTGGTGGTGCTCCGCTGTCTAAAGAAGTTGGTGAAGCTGTTGCTAAACGTTTCCACCTGCCGGGTATCCGTCAGGGTTACGGTCTGACCGAAACCACCTCTGCTATCCTGATCACCCCGAAAGGTGACGACAAACCGGGTGCTGTTGGTAAAGTTGTTCCGTTCTTCGAAGCTAAAGTTGTTGACCTGGACACCGGTAAAACCCTGGGTGTTAACCAGCGTGGTGAACTGTGCGTTCGTGGTCCGATGATCATGTCTGGTTACGTTAACAACCCGGAAGCTACCAACGCTCTGATCGACAAAGACGGTTGGCTGCACTCTGGTGACATCGCTTACTGGGACGAAGACGAACACTTCTTCATCGTTGACCGTCTGAAATCTCTGATCAAATACAAAGGTTACCAGGTTGCTCCGGCTGAACTGGAATCTATCCTGCTGCAACACCCGAACATCTTCGACGCTGGTGTTGCTGGTCTGCCGGACGACGACGCTGGTGAACTGCCGGCTGCTGTTGTTGTTCTGGAACACGGTAAAACCATGACCGAAAAAGAAATCGTTGACTACGTTGCTTCTCAGGTTACCACCGCTAAAAAACTGCGTGGTGGTGTTGTTTTCGTTGACGAAGTTCCGAAAGGTCTGACCGGTAAACTGGACGCTCGTAAAATCCGTGAAATCCTGATCAAAGCTAAAAAAGGTGGTAAATCTAAACTGTAA

上述高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示：

MEDAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVNITYAEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGVAVAPANDIYNERELLNSMNISQPTVVFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQKIIIMDSKTDYQGFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPESFDRDKTIALIMNSSGSTGLPKGVALPHRTACVRFSHARDPIFGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMFTTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLIDKYDLSNLHEIASGGAPLSKEVGEAVAKRFHLPGIRQGYGLTETTSAILITPKGDDKPGAVGKVVPFFEAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSGYVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYWDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVAPAELESILLQHPNIFDAGVAGLPDDDAGELPAAVVVLEHGKTMTEKEIVDYVASQVTTAKKLRGGVVFVDEVPKGLTGKLDARKIREILIKAKKGGKSKL

本发明要解决的另一个问题是提供一种能够高效表达高热稳定性荧光素酶的重组基因工程菌的构建方法：

⑴.采用化学全合成的方法合成所述的高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因，同时在该基因的上、下游各引入一个酶切位点以及相应保护碱基；

⑵.将步骤⑴获得的带有上下游酶切位点与保护碱基的高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因构建到大肠杆菌表达载体中，获得荧光素酶重组表达载体；

⑶.用步骤⑵获得的重组表达载体转化大肠杆菌宿主菌，得到所述的能够高效表达高热稳定性荧光素酶的重组基因工程菌。

本发明所述基因工程菌构建方法中步骤⑴中所述上游或下游酶切位点可以从限制性内切酶AatII、AvaI、KpnI、NdeI、NcoI、NotI、EcoRV、SalI、SbfI、SacI、SacII、BamHI、BglII、EcoRI、PstI、XhoI、XbaI和HindIII中选择；优选的酶切位点从NdeI、NcoI、NotI、BamHI、EcoRI、PstI、XhoI、XbaI和HindIII中选择。所选择的上游和下游酶切位点应当不同，且应当同时位于所选用的表达载体的多克隆位点区(MCS)；在同一表达载体上，所选择的上下游酶切位点之间应至少具有6个碱基的距离。

本发明所述的重组基因工程菌构建方法步骤⑴中所述的保护碱基可以根据所使用的限制性内切酶的商品说明书进行选择。

本发明所述的重组基因工程菌构建方法步骤⑵中所述大肠杆菌表达载体可以为pMAL-p5E、pMAL-p5X、pMAL-p4E、pMAL-p4X、pET-42a(+)、pET-39b(+)、pET-28a(+)或pET-32a(+)中的任意一个；优选为pMAL-p5E、pMAL-p4E、pET-32a(+)或pET-28a(+)中的任意一个；进一步优选为pMAL-p5E、pET-32a(+)或pET-28a(+)中的任意一个。

本发明所述的重组基因工程菌构建方法步骤⑶中所述大肠杆菌宿主菌可以为E.coliK12或E.coliBL21(DE3)。

本发明要解决的再一个问题是提供一种利用上述高效表达高热稳定性荧光素酶的重组基因工程菌制备重组高热稳定性荧光素酶的方法：

⑴.以所述高效表达高热稳定性荧光素酶的重组基因工程菌作为生产菌株，挑取其单菌落至10mL灭菌种子培养基，37℃培养16h，获得种子液；

⑵.以1～5％(v/v)的接种量将步骤⑴获得的种子液接种于灭菌发酵培养基，37℃培养2～4h后，加入终浓度为0.1～0.4mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，25℃诱导培养20～36h；

⑶.将步骤⑵诱导培养后所得菌液于4℃,7500rpm离心30min收集菌体，用pH值7.0、浓度为0.1mM的磷酸钾缓冲液离心洗涤菌体2次，获得湿菌体；

⑷.用pH值7.0、浓度为0.1mM的磷酸钾缓冲液重悬步骤⑶所得湿菌体后，破碎重悬菌液，于4℃、12000rpm，离心30分钟，收集上清液，此上清液为粗酶液；

⑸.利用亲和层析柱纯化步骤⑷所得粗酶液，获得本发明所述的重组高热稳定性荧光素酶。

本发明所述重组高热稳定性荧光素酶制备方法中步骤⑴中所述种子培养基配方为，每100mL含有：蛋白胨0.7g，酵母粉1g，氯化钠1g，20％甘油溶液5mL，余量为去离子水。

本发明所述重组高热稳定性荧光素酶制备方法中步骤⑵中所述接种量优选为2～4％；进一步优选为3％(v/v)。

本发明所述重组高热稳定性荧光素酶制备方法中步骤⑵中所述发酵培养基配方为，每1000mL含有：蛋白胨5～15g，酵母粉20～30g，20％(v/v)甘油溶液20～50mL，20％(w/v)葡萄糖溶液5～10mL，氯化钠2～3g，氯化铵2～3g，十二水合磷酸氢二钠24～36g，磷酸二氢钠2.2～6.3g，余量为去离子水。

本发明所述的重组高热稳定性荧光素酶制备方法步骤⑵中所述IPTG的终浓度优选为0.2～0.3mM；进一步优选为0.2mM

本发明所述的重组高热稳定性荧光素酶制备方法步骤⑵中所述25℃诱导培养时间优选为22h～30h；进一步优选为24h。

本发明所述的重组高热稳定性荧光素酶制备方法步骤⑷中所述破碎重选菌液的方法可以为超声波破碎法或高压均质机破碎法。

本发明所述的重组高热稳定性荧光素酶制备方法步骤⑸中所述亲和层析柱可以为组氨酸标记亲和层析柱或Amylose亲和层析柱。当选择的表达载体为pET-42a(+)、pET-39b(+)或pET-28a(+)时，可采用组氨酸亲和层析柱；当选择的表达载体为pMAL-p5E、pMAL-p5X、pMAL-p4E或pMAL-p4X时，可采用Amylose亲和层析柱。

本发明的有益效果：本发明提供的如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列是一种能够在大肠杆菌宿主中高效表达高热稳定性荧光素酶的编码基因，该核苷酸序列目前未见报道。本发明所述的高效表达高热稳定性荧光素酶的编码基因在大肠杆菌中表达的荧光素酶占全细胞内可溶性蛋白质的72.1％～83.5％，荧光素酶的表达量为481～739mg/10g湿菌；原始基因序列luc在相同的重组载体和宿主细胞中和相同的发酵条件下，表达的荧光素酶占全细胞内可溶性蛋白质的49.6％～50.8％，荧光素酶的表达量仅为244～379mg/10g湿菌；与原始基因相比，荧光素酶表达量提高了45％以上。本发明提供的发酵培养基用于培养荧光素酶重组基因工程菌，获得的菌体产量高，能够达到12～17g湿菌/L培养基。

本发明提供的高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因的表达产物是一种具有SEQIDNO：2所示的核苷酸序列的荧光素酶HLUC，该荧光素酶热稳定性高，在30、35和40℃下保温20min，均能够保持95％左右的相对活性；而原始荧光素酶基因序列的表达产物LUC在40℃下保温20min，仅能够保持65％左右的相对活性。

附图说明

图1为高效表达高热稳定性荧光素酶的编码基因hluc与荧光素酶原始基因luc的核苷酸序列比对结果。其中序列1为hluc基因；序列2为luc基因。蓝色背景部分为引入的核苷酸替换位点。

图2为纯化后的高热稳定性荧光素酶的SDS-PAGE电泳图，胶浓度为8％。

图3为高热稳定性荧光素酶HLUC与原始基因表达的荧光素酶LUC在不同温度下的热稳定性。

具体实施方式

以下实施例中未作具体说明的分子生物学试验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂盒生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明所用菌株E.coliK12或E.coliBL21(DE3)感受态细胞购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心；质粒pMAL-p5E、pMAL-p5X、pMAL-p4E、pMAL-p4X购自NEB公司；质粒pET-42a(+)、pET-39b(+)、pET-28a(+)购自Novagen公司；限制性内切酶购于NEB公司；核酸序列的化学合成由上海生工生物工程公司完成；DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen公司；组氨酸亲和层析柱购自通用医疗公司；Amylose亲和层析柱购自NEB公司；荧光素酶标准底物试剂购自Promega公司_；液体闪烁记录仪购自BECKMAN公司；其余试剂购自Sigma-Aldrich公司。

实施例1一种高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因

以来源于Photinuspyralis的萤火虫荧光素酶基因为原始基因luc，通过引入372个核苷酸位点的替换，获得一种高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因，该基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。引入的核苷酸替换位点如附图1所示。

实施例2能够高效表达高热稳定性荧光素酶的重组基因工程菌的构建

⑴.在SEQIDNO：1所示的核苷酸序列的上游和下游分别引入限制性内切酶EcoRI和HindIII的酶切位点以及相应保护碱基，得到如SEQIDNO：3所示的核苷酸序列，化学全合成该核苷酸序列，并命名为hluc1；

⑵.用限制性内切酶EcoRI和HindIII消化实施例2步骤⑴中所述带有酶切位点以及相应保护碱基的荧光素酶编码基因hluc1和pET-28a(+)质粒，并用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切产物；将酶切后的荧光素酶编码基因与经过相同酶切的质粒pET-28a(+)片段于16℃连接过夜，获得重组表达载体pET-28a(+)-hluc1；

⑶.利用化学转化法将实施例2步骤⑵所得重组表达载体pET-28a(+)-hluc1转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞，获得重组基因工程菌E.coliBL21(DE3)-pET-28a(+)-hluc1；

实施例3高效表达的高热稳定性荧光素酶的制备

⑴.以根据实施例2的方法构建的重组基因工程菌作为生产菌株，挑取重组基因工程菌E.coliBL21(DE3)-pET-28a(+)-hluc1单菌落，接种于10mL含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的灭菌种子培养基中，37℃培养16h，获得种子液，种子培养基配方为，每100mL含有：蛋白胨0.7g，酵母粉1g，氯化钠1g，20％(v/v)甘油溶液5mL，余量为去离子水；

⑵.以1％(v/v)接种量将实施例3步骤⑴所得种子液接种于1000mL含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的灭菌发酵培养基，37℃培养4h后，加入终浓度为0.1mMIPTG，25℃诱导培养36h，发酵培养基配方为，每1000mL含有：蛋白胨5g，酵母粉20g，20％(v/v)甘油溶液20mL，20％(w/v)葡萄糖溶液5mL，氯化钠2g，氯化铵2g，十二水合磷酸氢二钠24g，磷酸二氢钠2.2g，余量为去离子水；

⑶.将实施例3步骤⑵诱导培养后所得菌液于4℃,7500rpm离心30min收集菌体，用pH值7.0、浓度为0.1mM的磷酸钾缓冲液离心洗涤菌体2次，获得湿菌体并称重，约为12g；

⑷.用pH值7.0、浓度为0.1mM的磷酸钾缓冲液重悬实施例3步骤⑶所得湿菌体后，超声波破碎重悬菌液，于4℃、12000rpm，离心30分钟，收集上清液，此上清液为粗酶液；

⑸.利用组氨酸亲和层析柱纯化实施例3步骤⑷所得粗酶液，得到高热稳定性荧光素酶，纯化方法为：

①使用5倍柱床体积的平衡缓冲液(50mMpH8.0磷酸钠缓冲液+300mM氯化钠+5mM咪唑)平衡组氨酸亲和层析柱；

②将粗酶液以1mL/min的流速加入10mL的组氨酸亲和层析柱，使荧光素酶目的蛋白挂柱；

③用20～25倍柱床体积的漂洗缓冲液(50mMpH8.0磷酸钠缓冲液+300mM氯化钠+10mM咪唑)漂洗层析柱至基本无杂蛋白；

④用洗脱缓冲液液(50mMpH8.0磷酸钠缓冲液+300mM氯化钠+100mM咪唑)洗脱目的蛋白，并以1mL/tube的体积收集目的蛋白；

⑤SDS-PAGE检测步骤④中所得各管目的蛋白纯度，合并无杂带目的蛋白，约37mL，利用Nanodrop超微量蛋白浓度测定仪测定蛋白浓度为15.6mg/mL，目的蛋白总量为577.2mg。

实施例4能够高效表达高热稳定性荧光素酶的重组基因工程菌的构建

⑴.在SEQIDNO：1所示的核苷酸序列的上游和下游分别引入限制性内切酶NotI和BamHI的酶切位点以及相应保护碱基，得到如SEQIDNO：4所示的核苷酸序列，化学全合成该核苷酸序列并命名为hluc2；

⑵.用限制性内切酶NotI和BamHI消化实施例4步骤⑴中所述带有酶切位点以及相应保护碱基的荧光素酶编码基因hluc2和pMAL-p5X质粒，并用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切产物；将酶切后的荧光素酶编码基因与经过相同酶切的质粒pET-28a(+)质粒片段于16℃连接过夜，获得重组表达载体pMAL-p5X-hluc2。

⑶.利用化学转化法将实施例4步骤⑵所得重组表达载体pMAL-p5X-hluc2转化至E.coliK12感受态细胞，获得重组基因工程菌E.coliK12-pMAL-p5X-hluc2；

实施例5高效表达的高热稳定性荧光素酶的制备

⑴.以根据实施例4的方法构建的重组基因工程菌作为生产菌株，挑取实施例4步骤⑶中所述重组基因工程菌E.coliK12-pMAL-p5X-hluc2单菌落，接种于10mL含有终浓度为100μg/mL氨苄青霉素的灭菌种子培养基中，37℃培养16h，获得种子液，种子培养基配方为，每100mL含有：蛋白胨0.7g，酵母粉1g，氯化钠1g，20％(v/v)甘油溶液5mL，余量为去离子水；

⑵.以5％(v/v)接种量将实施例5步骤⑴所得种子液接种于1000mL含有终浓度为100μg/mL氨苄青霉素的灭菌发酵培养基，37℃培养2h后，加入终浓度为0.4mMIPTG，25℃诱导培养20h，发酵培养基配方为，每1000mL含有：蛋白胨15g，酵母粉30g，20％(v/v)甘油溶液50mL，20％(w/v)葡萄糖溶液10mL，氯化钠3g，氯化铵3g，十二水合磷酸氢二钠36g，磷酸二氢钠6.3g，余量为去离子水；

⑶.将实施例5步骤⑵诱导培养后所得菌液于4℃,7500rpm离心30min收集菌体，用pH值7.0、浓度为0.1mM的磷酸钾缓冲液离心洗涤菌体2次，获得湿菌体并称重，约为17g；

⑷.用pH值7.0、浓度为0.1mM的磷酸钾缓冲液重悬实施例5步骤⑶所得湿菌体后，超声波破碎重悬菌液，于4℃、12000rpm，离心30分钟，收集上清液，此上清液为粗酶液；

⑸.利用Amylose亲和层析柱纯化实施例5步骤⑷所得粗酶液，得到高热稳定性荧光素酶，纯化方法为：

①使用5倍柱床体积的平衡缓冲液(终浓度20mMTris-HCl+终浓度200mMNaCl+终浓度1mMEDTA)平衡Amylose亲和层析柱；

②将粗酶液以1mL/min的流速加入10mL的Amylose亲和层析柱，使荧光素酶目的蛋白挂柱；

③用15～20倍柱床体积的平衡缓冲液漂洗至基本无杂蛋白；

④用洗脱缓冲液液(平衡缓冲液+终浓度10mM麦芽糖)洗脱目的蛋白，并以1mL/tube的体积收集目的蛋白；

⑤SDS-PAGE检测步骤④中所得各管目的蛋白纯度，合并无杂带目的蛋白，约78mL，利用Nanodrop超微量蛋白浓度测定仪测定蛋白浓度为16.1mg/mL，目的蛋白总量为1255.8mg。

实施例6荧光素酶活性测定

将待测荧光素酶样品与荧光素酶标准底物试剂按1：10的体积比在1.5mL离心管中混合均匀，立即放入闪烁瓶中；于BECKMANLS6500液体闪烁记录仪中记录数值，荧光素酶相对活性定义为每分钟的计数值。

实施例7荧光素酶热稳定性检测

将利用本发明提供的荧光素酶编码基因与制备方法制备的高热稳定性荧光素酶以及本发明所述的原始基因表达的荧光素酶置于1.5mL离心管中，分别在30、35、40、45、50、55℃水浴中保温20min；取出后立即于冰上冷却20s；进行荧光素酶活性测定。

按下式计算荧光素酶相对活性：

荧光素酶相对活性(a_r)＝100％x保温后的活性/保温前的活性。

Claims

1.一种高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因，其特征在于：所述高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因的序列为SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。

2.一种荧光素酶重组表达载体，其特征在于：所述荧光素酶重组表达载体携带如权利要求1所述高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因。

3.一种荧光素酶重组基因工程菌，其特征在于：所述荧光素酶重组基因工程菌携带如权利要求1所述高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因。

4.一种权利要求3所述的荧光素酶重组基因工程菌的构建方法，其特征在于所述构建方法包括以下步骤：

⑴.采用化学全合成的方法合成高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因，同时在上、下游各引入一个酶切位点以及相应保护碱基；

⑶.用步骤⑵获得的重组表达载体转化大肠杆菌宿主菌，得到荧光素酶重组基因工程菌。

5.如权利要求4所述构建方法，其特征在于：所述的上游或下游酶切位点是AatII、AvaI、KpnI、NdeI、NcoI、NotI、EcoRV、SalI、SbfI、SacI、SacII、BamHI、BglII、EcoRI、PstI、XhoI、XbaI和HindIII中的任意一个；上游与下游酶切位点应当不同，且应当同时位于所选用的表达载体的多克隆位点区。

6.如权利要求4所述构建方法，其特征在于：所述的表达载体是pMAL-p5E、pMAL-p5X、pMAL-p4E、pMAL-p4X、pET-42a(+)、pET-39b(+)、pET-28a(+)中的任意一个。

7.一种利用权利要求3所述荧光素酶重组基因工程菌制备重组高热稳定性荧光素酶的方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：

⑴.以权利要求3所述的荧光素酶重组基因工程菌作为生产菌株，挑取其单菌落至10mL灭菌种子培养基，37℃培养16h，获得种子液；

⑸.利用亲和层析柱纯化步骤⑷所得粗酶液，获得重组高热稳定性荧光素酶。

8.如权利要求7所述制备方法，其特征在于：所述的种子培养基配方为,每100mL含有：蛋白胨0.7g，酵母粉1g，氯化钠1g，20％甘油溶液5mL，余量为去离子水。

9.如权利要求7所述制备方法，其特征在于：所述的发酵培养基配方为，每1000mL含有：蛋白胨5～15g，酵母粉20～30g，20％甘油溶液20～50mL，20％葡萄糖溶液5～10mL，氯化钠2～3g，氯化铵2～3g，十二水合磷酸氢二钠24～36g，磷酸二氢钠2.2～6.3g，余量为去离子水。

10.一种热稳定性提高的荧光素酶，其特征在于：所述热稳定性提高的荧光素酶的氨基酸序列为SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。