CN113846072A - 一种己糖激酶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种己糖激酶表达及纯化方法，包括己糖激酶基因的克隆与分子构建、重组表达菌株的构建、重组己糖激酶的诱导表达、纯化与活力检测方法和己糖激酶高密度发酵放大等步骤。本发明第一次从酿酒酵母中克隆己糖激酶基因重组在大肠杆菌中表达，大大的提高了蛋白表达量和降低了蛋白纯化的难度，极大地简化了己糖激酶生产工艺；在实现己糖激酶的高效稳定表达的同时，通过优化诱导温度、诱导剂浓度、和诱导添加Mg2+浓度等提高了己糖激酶的蛋白比活力。

Description

一种己糖激酶的制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种己糖激酶的表达和纯化的方法。
背景技术
己糖激酶(Hexokinase，HK)是以己糖为特异性底物的六碳糖磷酸化酶，在生物体的糖酵解过程中起重要作用，其Km值小，对底物亲和性强，专一性不强，可针对多种六碳糖进行作用，可以催化葡萄糖从稳定状态变为活跃状态，为肿瘤细胞提供能量以及物质合成所必须的重要碳源，从而促进恶性肿瘤的生长和增值，利用其作用原理和特点，该酶主要用于临床诊断试剂，特别是血液中葡萄糖的临床检测。
目前可工业化的己糖激酶大都来源于原始菌发酵，或者动植物细胞培养，产量有限；纯化相对困难，后处理工艺成本较高；国内一些产品性质不够稳定，国外竞品性质相对较稳定，但价格昂贵。故己糖激酶试剂端应用受限明显，为此我们从酿酒酵母中克隆了己糖激酶基因在大肠中进行重组表达，以期获得性质优良的纯品酶粉，代替进口产品，并且期待用大肠杆菌表达体系提高己糖激酶的产量。
发明内容
为实现上述目的，本发明提供了一种己糖激酶的制备方法，具体步骤如下：
S1、己糖激酶基因的克隆
从酿酒酵母菌中提取总DNA，根据编码己糖激酶蛋白的基因HXK1序列设计F引物和R引物，进行PCR扩增反应；
PCR反应体系：5μL LA-Taq缓冲液，5μL 2.5mM dNTP，1μL基因组DNA，1μL10mM F引物，1μL10mM R引物，0.5μL 2.5UμL-1LA-Taq聚合酶，加水至50μL；
扩增条件：95℃预变性5min，30个循环：94℃变性30s，65℃退火1.5min，72℃延伸1min；72℃再延伸10min；
S2、重组表达菌株的构建
通过S1得到带有酶切位点和载体同源序列的HXK1基因，通过双酶切和T4连接酶反应，将HXK1基因片段插入到表达质粒中，得到HXK1的表达载体；
将构建的HXK1的表达载体转化到表达宿主细胞中，得到重组HXK1的表达菌株；
S3、重组HXK1表达菌株的诱导表达
在严格的无菌条件下，将S2得到的重组HXK1表达菌株接种至含卡那霉素的LB培养基中，加入IPTG，诱导表达后收集菌体；
S4、纯化与活力检测方法
将S3收集的菌体用15mL pH 8.0 20mM的Tris-HCl缓冲液重悬，冰浴，超声破碎，10000rpm下离心细胞破碎液10min，收集上清液，过0.22um滤膜，采用镍离子亲和层析柱对进行纯化，得到纯化HXK1蛋白；
S5、己糖激酶高密度发酵放大
将S2获得的种子液以1％～2％的比例接种于灭过菌的发酵罐中进行通气搅拌培养；
高密度发酵产出的己糖激酶菌体按照质量体积比1:10的浓度，用20mM pH8.0Tris-HCl进行重悬，均质机破碎，絮凝剂絮凝后离心过膜备用；
镍离子亲和层析柱对进行纯化，洗脱后的酶液通过Millipore超滤系统置换和浓缩。
优选的，S1中HXK1基因的N端添加纯化标签，所述纯化标签选自His-tag、MBP、GST、Sumo。
优选的，表达质粒载体选自pET系列表达载体。
进一步，优选的，表达质粒载体选自pET28a、pET15b、pET21a、pET30a、pGEX。
其中，所述S3具体步骤包括：
S3.1、在严格的无菌条件下，将重组表达菌株接种至含卡那霉素的LB培养基中，37℃，220rpm振荡培养12h；
S3.2、按照体积比0.5％接种量取1mL种子液接种到含200mL卡那霉素的500mL LB液体培养基中，37℃培养3h左右，保证OD至0.8～1.0左右，温度降至25℃加入终浓度0.5mM的IPTG，保持25℃，诱导表达16h后收集菌体。
优选的，所述S4中超声破碎条件为200W，超声3S，停2S，共计15min。
所述S4中镍离子亲和层析具体步骤包括：取2mL填料的镍柱先用超纯水冲洗保存在柱料中的20％乙醇20个柱体积，用20mM pH 8.0的Tris-HCl 5个柱体积后开始上样，收集流穿酶液，依次在平衡液中添加20mM、400mM、500mM咪唑终浓度进行洗杂、洗脱和洗柱操作，各5个柱体积，收集不同梯度的样品，进行活力分析和SDS-page纯度分析。
所述S5中发酵罐中进行通气搅拌培养培养条件为：转速100～120rpm，通气量0.5～1.0vvm，温度37℃，罐压0.03～0.06MPa，当溶氧低于20％后，逐步提高转速至400rpm，通气量至2.0vvm，控制pH 7.0～7.1，根据pH调整补料，发酵OD600至30以上时，加入诱导剂，降温并继续培养10～16h诱导结束下罐，最终下罐OD在80左右。
优选的，所述S5通过控制补料培养基中葡萄糖的加入速度控制培养基的碳氮比，通过补碱泵控制发酵罐内的pH以及诱导过程通过加入Mg2+以提高己糖激酶的产量和比活力。
所述Mg2+优选的来源为MgCl2，MgSO4，MgCO3。
本发明的技术优点在于：
1、克隆了来源酿酒酵母的己糖激酶基因，重组在大肠杆菌中表达，大大提高了己糖激酶的产量；
2、解决了从原始菌株中提取或者细胞组织中大批量提取的难度，重组表达在基因的N端添加了6个His-tag纯化标签，为工艺化生产极大地简化了纯化步骤。
3、在大肠重组表达获得己糖激酶解决目前部分己糖激酶比活低和稳定性差的问题。
附图说明
图1：本发明己糖激酶表达及纯化过程样品电泳图；
图2：本发明发酵工艺前发酵OD和单位比活力示意图；
图3：本发明工艺优化后发酵OD和单位比活力示意图；
图4：本发明发酵工艺优化前后己糖激酶蛋白性质对比示意图。
具体实施方式
以下是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
本发明实施例中使用的限制性内切酶购自TaKaRa，宝生物工程(大连)有限公司；基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒购自Axygen杭州有限公司；E.coli BL21(DE3)、质粒pET-30a(+)、pET-21a(+),pET-22b(+)等购自Novagen公司。
实施例1己糖激酶基因的克隆与分子构建
从实验室保存的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae，ATCC 204508)中采用细菌基因组抽提试剂盒提取该菌株总DNA，根据编码己糖激酶蛋白的基因(HXK1)序列设计引物F/R，以基因组DNA为模板，扩增目的基因HXK1。
PCR反应体系(50μL)包含5μL LA-Taq缓冲液，5μL dNTP(2.5mM)，1μL基因组DNA，1μL F引物(10mM)，1μLR引物(10mM)，0.5μL LA-Taq聚合酶(2.5UμL-1)，加水至50μL。
扩增条件：95℃预变性5min，30个循环：94℃变性30s，65℃退火1.5min，72℃延伸1min；72℃再延伸10min。用1％的琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，然后将PCR产物连接到pET28a载体上。
并送测序验证，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
实施例2、重组表达菌株的构建
采用相应引物扩增得到带有酶切位点和载体同源序列的HXK1基因，并分别将其成功克隆到表达载体pET15b、pET30a、pGEX等其他载体上，同时在表达质粒构建过程中在基因的N端均添加有6个His标签。
将成功构建的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，记为E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-HXK1。
实施例3、重组己糖激酶的诱导表达(以pET28a为例)、纯化与活力检测方法
在严格的无菌条件下，将重组表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-HXK1接种至含卡那霉素的LB培养基中，37℃，220rpm振荡培养12h。
按照0.5％(V/V)的接种量取1mL种子液接种到含卡那霉素的200mL(500mL锥形瓶)LB液体培养基中，37℃培养3h左右，保证OD至0.8～1.0左右，温度降至25℃加入终浓度0.5mM的IPTG，保持此温度诱导表达16h后收集菌体。
将收集后的菌体用15mL pH 8.0 20mM的Tris-HCl缓冲液重悬，冰浴下超声破碎(破碎条件：200W，超3S，停2S，共计15min)，10000rpm下离心细胞破碎液10min，过0.22um滤膜后备用。
取2mL填料的镍柱先用超纯水冲洗保存在柱料中的20％乙醇大约20个柱体积，然后用20mM pH 8.0的Tris-HCl 5个柱体积后开始上样，收集流穿酶液，然后依次在平衡液中添加20mM、400mM、500mM咪唑终浓度进行洗杂、洗脱和洗柱操作，各5个柱体积，均收集不同梯度的样品，并进行活力分析和SDS-page纯度分析，见附图1所示。
将500mM咪唑洗脱下来的酶液透析除去咪唑后检测蛋白浓度和活力，得到纯化蛋白的比活力82U/mg，60℃半衰期为384min。
活力检测方法：葡萄糖(100mM)和ATP(0.5mM)在己糖激酶的加入下会生成葡萄糖-6-磷酸和ADP，葡萄糖-6-磷酸和NAD(0.2mM)在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(1U/mL)的作用下生成Glucono-δ-lactone-6-phosphate和NADH，反应生成的NADH的量可用分光光度计在340nm处检测。
单位酶活定义为在上述反应条件下每分钟生成1微摩尔NADH所需的酶量。
实施例4、己糖激酶高密度发酵放大过程调控
此专利所述的重组大肠杆菌高密度发酵的方法，所述的5L发酵罐培养是将种子罐中种子液以1％-2％的比例接种于灭过菌的发酵罐中进行通气搅拌培养。
初始培养条件：转速100-120rpm，通气量0.5～1.0vvm，温度37℃，罐压0.03～0.06MPa，当溶氧低于20％后，逐步提高转速至400rpm，通气量至2.0vvm，控制pH 7.0～7.1，根据pH调整补料，发酵OD600至30以上时，加入诱导剂，降温并继续培养10～16h诱导结束下罐，最终下罐OD在80左右。
主要通过控制补料培养基中葡萄糖的加入速度控制培养基的碳氮比，同时通过补碱泵控制发酵罐内的pH以达到提高己糖激酶的生产水平。
最终发现通过发酵培养基碳氮比和pH的调整优化及诱导过程Mg2+的加入提高己糖激酶的产量和比活力，实验结果如附图2、附图3所示。
高密度发酵产出的己糖激酶菌体按照质量体积比1:10的浓度，用20mM pH8.0Tris-HCl进行重悬，均质机破碎，絮凝剂絮凝后离心过膜备用。
准备大的镍柱(500mL填料)按照实施例3中小柱子的处理方法进行纯化，最终洗脱后的酶液通过Millipore超滤系统置换和浓缩后检测性质，纯化的蛋白比活力可以达到110U/mg，60℃孵育后半衰期可以达到390min，高密度发酵出来的己糖激酶和摇瓶表达出来的酶稳定性一致，比活力在流加诱导流加补料Mg2+后活力有所增加，纯化后的蛋白比活力略有提升，可以达到118.7U/mg，同时稳定性和比活力不逊于其他来源的己糖激酶；发酵工艺优化前后的己糖激酶蛋白性质如表1和附图4所示。
表1发酵工艺优化前后HK比活力和半衰期对比
序号 发酵表达条件 蛋白比活力(U/mg) 60℃半衰期(min)
1 优化前 110.0 390
2 优化后 118.7 401.2
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种己糖激酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、己糖激酶基因的克隆
从酿酒酵母菌中提取总DNA，根据编码己糖激酶蛋白的基因HXK1序列设计F引物和R引物，进行PCR扩增反应；
PCR反应体系：5μL LA-Taq缓冲液，5μL 2.5mM dNTP，1μL基因组DNA，1μL10mM F引物，1μL10mM R引物，0.5μL 2.5UμL-1LA-Taq聚合酶，加水至50μL；
扩增条件：95℃预变性5min，30个循环：94℃变性30s，65℃退火1.5min，72℃延伸1min；72℃再延伸10min；
S2、重组表达菌株的构建
通过S1得到带有酶切位点和载体同源序列的HXK1基因，通过双酶切和T4连接酶反应，将HXK1基因片段插入到表达质粒中，得到HXK1的表达载体；
将构建的HXK1的表达载体转化到表达宿主细胞中，得到重组HXK1的表达菌株；
S3、重组HXK1表达菌株的诱导表达
在严格的无菌条件下，将S2得到的重组HXK1表达菌株接种至含卡那霉素的LB培养基中，加入IPTG，诱导表达后收集菌体；
S4、纯化与活力检测方法
将S3收集的菌体用15mL pH 8.0 20mM的Tris-HCl缓冲液重悬，冰浴，超声破碎，10000rpm下离心细胞破碎液10min，收集上清液，过0.22um滤膜，采用镍离子亲和层析柱对进行纯化，得到纯化HXK1蛋白；
S5、己糖激酶高密度发酵放大
将S2获得的种子液以1％～2％的比例接种于灭过菌的发酵罐中进行通气搅拌培养；
高密度发酵产出的己糖激酶菌体按照质量体积比1:10的浓度，用20mM pH 8.0Tris-HCl进行重悬，均质机破碎，絮凝剂絮凝后离心过膜备用；
镍离子亲和层析柱对进行纯化，洗脱后的酶液通过Millipore超滤系统置换和浓缩。
2.根据权利要求1所述的己糖激酶的制备方法，其特征在于，所述S1中HXK1基因的N端添加有纯化标签，所述纯化标签选自His-tag、MBP、GST、Sumo，优选6个His标签。
3.根据权利要求1所述的己糖激酶的制备方法，其特征在于，所述S2中表达质粒载体选自pET系列表达载体。
4.根据权利要求1所述的己糖激酶的制备方法，其特征在于，所述S2中表达质粒载体选自pET28a、pET15b、pET21a、pET30a、pGEX。
5.根据权利要求1所述的己糖激酶的制备方法，其特征在于，所述S3具体步骤包括：
S3.1、在严格的无菌条件下，将重组表达菌株接种至含卡那霉素的LB培养基中，37℃，220rpm振荡培养12h；
S3.2、按照体积比0.5％接种量取1mL种子液接种到含200mL卡那霉素的500mL LB液体培养基中，37℃培养3h左右，保证OD至0.8～1.0左右，温度降至25℃加入终浓度0.5mM的IPTG，保持25℃，诱导表达16h后收集菌体。
6.根据权利要求1所述的己糖激酶的制备方法，其特征在于，所述S4中超声破碎条件为200W，超声3S，停2S，共计15min。
7.根据权利要求1所述的己糖激酶的制备方法，其特征在于，所述S4中镍离子亲和层析具体步骤包括：取2mL填料的镍柱先用超纯水冲洗保存在柱料中的20％乙醇20个柱体积，用20mM pH 8.0的Tris-HCl 5个柱体积后开始上样，收集流穿酶液，依次在平衡液中添加20mM、400mM、500mM咪唑终浓度进行洗杂、洗脱和洗柱操作，各5个柱体积，收集不同梯度的样品，进行活力分析和SDS-page纯度分析。
8.根据权利要求1所述的己糖激酶的制备方法，其特征在于，所述S5己糖激酶高密度发酵放大过程包括：转速100～120rpm，通气量0.5～1.0vvm，温度37℃，罐压0.03～0.06MPa，当溶氧低于20％后，逐步提高转速至400rpm，通气量至2.0vvm，控制pH 7.0～7.1，根据pH调整补料，发酵OD600至30以上时，加入诱导剂，降温并继续培养10～16h诱导结束下罐，下罐OD在80左右。
9.根据权利要求1或8所述的己糖激酶的制备方法，其特征在于，所述S5通过控制补料培养基中葡萄糖的加入速度控制培养基的碳氮比，通过控制发酵罐内的pH以及加入诱导剂Mg2+以提高己糖激酶的产量和比活力。
10.根据权利要求9所述的己糖激酶的制备方法，其特征在于，所述Mg2+优选的来源为MgCl2，MgSO4，MgCO3。
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