JP4245229B2 - 安定なヘキソキナーゼおよびその製造法 - Google Patents
安定なヘキソキナーゼおよびその製造法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は臨床診断薬分野におけるグルコース、マグネシウムまたはクレアチンキナーゼ活性の測定に用いられる溶液状態での安定性の優れた新規なヘキソキナーゼおよびその製造法に関する。
【０００２】
【従来技術】
ヘキソキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１）は、ＡＴＰの存在下、グルコースその他のヘキソースをリン酸化してヘキソース−６−リン酸とする反応を触媒する酵素である。従来より高等動物のさまざまな細胞内やサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ・ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ・ｏｒｙｚａｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ・ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ・ｃｏｌｉ）、エアロバクター・エアロゲネス（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ・ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）由来の酵素が知られている（蛋白質 核酸 酵素、２２，１５０７−１５０９，１５１０−１５１４，１５１５−１５１９，１９７７、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３４，２４９−３２６，１９７３、Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ ３ｒｄ Ｅｄ．，４，１−４８，１９７３）。
【０００３】
しかしながら、これらの酵素は室温における溶液状態での安定性が悪く、臨床診断薬分野におけるグルコース、マグネシウムまたはクレアチンキナーゼ活性の測定に用いられる溶液状態での保存に満足のいくものではなかった。
また、溶液状での保存安定性に優れたクルベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）に属する高温性酵母由来のヘキソキナーゼが報告されたが（特開平９−２２００８８号公報）、クルベロマイセス属由来ヘキソキナーゼは、従来のヘキソキナーゼと同様にグルコースの他にフルクトースにも作用することから、血液中のフルクトースの影響を受けるという問題点があった。このため、グルコースの測定用にはフルクトースに対する反応性の低いバチルス・ステアロサーモフィルス由来のグルコキナーゼが用いられているが、この酵素も溶液状での保存安定性が十分ではなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、フルクトースに対して実質的に作用せず、長期保存安定性の優れた新規なヘキソキナーゼを提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するため、鋭意検討した結果、ロドサーマス・オバメンシス ＪＣＭ９７８５（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ ＪＣＭ９７８５、理化学研究所保存株；茨城県つくば市東１丁目３番３号所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所、ＦＥＲＭ ＢＰ−６３８４，平成１０年６月４日寄託日）菌株、サーモトーガ・ネアポリタナ ＤＳＭ４３５９菌株およびエアロパイラム・ペルニックス ＪＣＭ９８２０菌株などの好熱菌が安定なヘキソキナーゼを生産することを見いだし、さらにこれらの好熱菌由来のヘキソキナーゼについて詳細に性質検討を行った結果、ロドサーマス・オバメンシス ＪＣＭ９７８５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３８４）菌株の菌体内に２５℃、６週間の５０ｍＭのイミダゾール緩衝液（ｐＨ６．５）中保存において、少なくとも８０％以上の残存活性を有し、かつ次の理化学的性質（１）〜（３）を有する新規なヘキソキナーゼを見い出した。
【０００６】
（１）作用
グルコースを基質として用いたときの反応式が下記の通りである。
【０００７】
【化２】
（２）至適ｐＨ
ｐＨ７．５〜８．５（トリス−塩酸緩衝液）のｐＨ範囲に至適ｐＨを持つ。
（３）熱安定性
８０℃、１０分間の熱処理後の残存活性が少なくとも８０％以上である。
【０００８】
また当該ヘキソキナーゼを精製し、その構成するポリペプチドのＮ末端から４０アミノ酸の配列を決定することに成功し、このＮ末端アミノ酸配列を基にヘキソキナーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを分離し、ヘキソキナーゼ遺伝子の塩基配列を決定した。また、該ヘキソキナーゼ遺伝子を任意のベクターに導入し、好ましい宿主−ベクター系にて宿主微生物を形質転換体とし、該形質転換体を培養して、該培養物からヘキソキナーゼを確認し、優れた工業的生産方法を確立し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
ヘキソキナーゼ遺伝子の塩基配列、および塩基配列から明らかとなったヘキソキナーゼのアミノ酸配列は明らかに新規であり、ＤＮＡ ＤＡＴＡ ＢＡＳＥｏｆ ＪＡＰＡＮ（ＤＤＢＪ）の核酸配列及び蛋白質データベースからは、同じ配列を有する遺伝子および蛋白質は見い出されなかった。
本発明は上記の知見に基づいて完成されたもので、２５℃、６週間の５０ｍＭのイミダゾール緩衝液（ｐＨ６．５）中保存において、少なくとも８０％以上の残存活性を有し、かつ次の理化学的性質（１）〜（３）を有するヘキソキナーゼ
【００１０】
（１）作用
グルコースを基質として用いたときの反応式が下記の通りである。
【００１１】
【化３】
（２）至適ｐＨ
ｐＨ７．５〜８．５（トリス−塩酸緩衝液）のｐＨ範囲に至適ｐＨを持つ。
（３）熱安定性
【００１２】
８０℃、１０分間の熱処理後の残存活性が少なくとも８０％以上である。
配列表の配列番号１のアミノ酸配列の１から３３２で表されるアミノ酸配列を有するヘキソキナーゼ、ヘキソキナーゼ蛋白質をコードするＤＮＡ、ヘキソキナーゼの生産能を有する遺伝子組み換え微生物、ロドサーマス属に属するヘキソキナーゼ生産菌または外来性のヘキソキナーゼの生産能を有する遺伝子組み換え微生物を培養し、培養物から当該ヘキソキナーゼを採取することを特徴とするヘキソキナーゼの製造法、ロドサーマス・オバメンシス ＪＣＭ９７８５（ＦＥＲＭＢＰ−６３８４）を培養し、培養物から当該ヘキソキナーゼを採取することを特徴とするヘキソキナーゼの製造法である。
すなわち、本発明はフルクトースに対して実質的に作用せず、長期保存安定性の優れた新規なヘキソキナーゼおよびその製造法に関するものである。
【００１３】
以下に本発明について詳細に説明する。
まず、本発明のヘキソキナーゼ生産菌について、ロドサーマス属に属する当該ヘキソキナーゼを生産する能力を有する微生物であれば何ら限定されるものではなく、ヘキソキナーゼを生産する能力を有する変種や変異株であってもよく、好ましくはロドサーマス・オバメンシス ＪＣＭ９７８５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３８４）菌株が挙げられる。
本発明者らはロドサーマス属の菌株がフルクトースに対して実質的に作用せず、長期保存安定性の優れた新規なヘキソキナーゼを生産することを見い出し、該酵素の精製、および諸性質の検討を行った。
本発明における使用菌株はロドサーマス属に属するヘキソキナーゼ生産菌であるが、例えばロドサーマス・オバメンシス ＪＣＭ９７８５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３８４）株が挙げられる。
【００１４】
また本発明の配列表の配列番号１のアミノ酸配列の１から３３２で表されるヘキソキナーゼ蛋白のアミノ酸配列をコードするＤＮＡにおいて、その配列番号１のアミノ酸配列の１から３３２で表記されるアミノ酸配列のＮ末端側及びＣ末端側はアミノ酸残基又はポリペプチド残基を含む場合であってもよく、Ｎ末端側であるメチオニンの上流にはさらに一個又は複数のアミノ酸残基を有してもよく、そのアミノ酸残基としては開始コドン又はシグナルペプチドが挙げられ、またＣ末端側のアラニンの下流には、さらに一個以上のアミノ酸残基を有してもよい。
【００１５】
さらに、本発明のヘキソキナーゼを構成するアミノ酸配列は、配列表の配列番号１のアミノ酸配列の１から３３２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドによる酵素活性発現と同様の効果を発現する、配列番号１のアミノ酸配列の１から３３２のアミノ酸配列の一部から実質的になるアミノ酸配列や酵素活性発現に関与しない一部のアミノ酸の配列を変異、欠損又は付加したものの均等物も含まれる。
【００１６】
本発明の配列表の配列番号１のアミノ酸配列の１から３３２で表されるアミノ酸配列をコードする新規なＤＮＡは、そのＮ末端側及びＣ末端側のアミノ酸残基又はポリペプチド残基を含めたアミノ酸配列の各アミノ酸に対応する一連のコドンのうちいずれか１個のコドンからなるＤＮＡであればよい。
【００１７】
さらに、本発明のヘキソキナーゼを構成するアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、配列表の配列番号１のアミノ酸配列の１から３３２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドによる酵素活性発現と同様の効果を発現する、配列番号１のアミノ酸配列の１から３３２中の一部分からなる実質的になるアミノ酸配列をコードするＤＮＡであってもよく、また酵素活性発現に関与しない一部のアミノ酸の配列を変異、欠損又は付加したものの均等物のアミノ酸配列をコードするＤＮＡであってもよい。
【００１８】
上記のＤＮＡの好適な例として、配列表の配列番号１の塩基配列の１８から１０１３で表される塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができる。該ＤＮＡは、５’末端の上流側にアミノ酸をコードするコドンを１個以上有したものでもよく、ＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡ以外のコドンであればよい。さらに、好ましくはＡＴＧ、ＧＴＧ、それら以外の開始コドン又はシグナルペプチドに対応するコドンを有したものを挙げることができる。３’末端のＧＣＣ下流側には、アミノ酸をコードするコドンを１個以上有するか、又は翻訳終止コドンを有するかのいずれでもよく、更に、その３’末端側にアミノ酸をコードするコドンを１個以上有する場合には、このアミノ酸をコードするコドンの３’末端側に翻訳終止コドンを有することが好ましい。
【００１９】
ヘキソキナーゼ蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、ヘキソキナーゼ遺伝子の供与体である、ヘキソキナーゼを生産する微生物よりＤＮＡを分離精製した後、制限酵素などを用いて切断した該ＤＮＡと、同じく切断して直鎖状にした発現ベクターとを、両ＤＮＡの末端部をＤＮＡリガーゼなどにより結合閉環させ、かくして得られた組み換えＤＮＡプラスミドを宿主微生物に導入し、発現ベクターのマーカーと、ヘキソキナーゼの活性発現若しくはＤＮＡプローブを指標としてスクリーニングを行い、ヘキソキナーゼ遺伝子を含有する組み換えＤＮＡプラスミドを保持する微生物を分離し、該遺伝子組み換え微生物を培養し、該培養菌体から該組み換えＤＮＡプラスミドを分離精製し、次いで該組み換えＤＮＡプラスミドからヘキソキナーゼ遺伝子であるＤＮＡを取得することにより得られる。
【００２０】
ＤＮＡの供与体である微生物としては、ヘキソキナーゼを生産する微生物であれば、なんら限定されるものではないが、好ましくはロドサーマス・オバメンシス ＪＣＭ９７８５株が挙げられる。
本発明を実施するにあたり、ロドサーマス属の培養形態としては液体培養、固体培養いずれも可能であるが工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。また、使用する培養源としては一般に微生物培養に用いられる炭素源、窒素源、無機塩およびその他の微量栄養源の他、ロドサーマス属に属する微生物の利用できる栄養源であればすべて使用できる。
【００２１】
炭素源としてはグルコース、サッカロース、キシロース、マルトース、グリセロール、デキストリン、デンプン、アミノ酸などの他、脂肪酸、油脂、有機酸などが単独でまたは組み合わせて用いられる。窒素源としては無機窒素源、有機窒素源のいずれも使用可能であり、無機窒素源としては硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム、塩化アンモニウムなどがあげられる。また、有機窒素源としては大豆、米、トウモロコシ、小麦などの粉、コーンスティープリカー、ペプトン、肉エキス、カゼインアミノ酸、酵母エキスなどがあげられる。無機塩および微量栄養素としてはリン酸、マグネシウム、カリウム、鉄、カルシウム、亜鉛などの塩類の他ビタミン、非イオン性界面活性剤、消泡剤などの菌の生育やヘキソキナーゼの生産を促進するものであれば必要に応じて使用できる。
【００２２】
培養は好気的条件で、培養温度は菌が発育し、ヘキソキナーゼが生産する範囲であればよく、通常６５〜８０℃、好ましくは７０〜７５℃である。培養時間は条件により異なるがヘキソキナーゼが最も生産される時間まで培養すればよく、通常８〜２４時間程度である。
またヘキソキナーゼ蛋白質をコードするＤＮＡを得るためには、具体的には以下のように行えばよいが、その操作法のうち常法とされるものは、例えばマニアティスらの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８２，１９８９）や、市販の各種酵素、キット類に添付された手順に従えば実施できるものである。
【００２３】
ヘキソキナーゼを生産する微生物に由来するＤＮＡ（ｔｏｔａｌＤＮＡと略称する）を採取するには、例えばヘキソキナーゼを生産する微生物を培養し、得られる培養菌液から菌体を集菌し、次いでこれを溶菌させることによってヘキソキナーゼ遺伝子を含有する溶菌物を調製する。溶菌方法としては、例えばリゾチームなどの細胞壁溶解酵素による処理が施され、必要によりプロテアーゼなどの他の酵素やラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤が併用され、さらに細胞壁の物理的破壊法である凍結融解（特開昭６３−１８５３７１号公報参照）やフレンチプレス処理を上述の溶菌法と組合せで行ってもよい。
【００２４】
この様にして得られた溶菌物からｔｏｔａｌＤＮＡを分離精製するには、常法に従って、例えばフェノール抽出による除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。
ｔｏｔａｌＤＮＡを分離する菌株としては、ヘキソキナーゼを生産する微生物なら何でもよいが、好ましくはロドサーマス・オバメンシス ＪＣＭ９７８５株を使用すればよい。
【００２５】
分離精製されたｔｏｔａｌＤＮＡを切断する方法は、常法に従って制限酵素処理により行えばよく、特に得られるｔｏｔａｌＤＮＡ断片とベクターとの結合を容易ならしめるため、制限酵素、とりわけ特定ヌクレオチド配列に作用する、例えば、ＳａｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＭｌｕＩなどのＩＩ形制限酵素が適している。
【００２６】
ｔｏｔａｌＤＮＡ断片を組み込むベクターとしては、宿主微生物体内で自律的に増殖しうるファージ又はプラスミドから遺伝子組み換え用として構築されたものが適しており、ファージベクターとしては、例えば、エシェリヒア・コリに属する微生物を宿主微生物とする場合にはλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢなどが使用できる。また、プラスミドベクターとしては、例えば、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＩＮ Ｉ、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋、枯草菌を宿主とする場合にはｐＵＢ１１０、ｐＫＨ３００ＰＬＫ、放線菌を宿主とする場合にはｐＩＪ６８０、ｐＩＪ７０２、酵母特にサッカロマイセス・セレビジアエを宿主とする場合にはＹＲｐ７、ｐＹＣ１、ＹＥｐ１３などが使用できる。
このようなベクターを、ｔｏｔａｌＤＮＡの切断に使用した制限酵素で生成するＤＮＡ末端と、同じ末端を生成する制限酵素で切断してベクター断片を作成し、ｔｏｔａｌＤＮＡ断片とベクター断片とを、ＤＮＡリガーゼ酵素により常法に従って結合させればよい。
【００２７】
ｔｏｔａｌＤＮＡの断片を結合したプラスミドを移入する宿主微生物としては、組み換えＤＮＡが安定かつ自律的に増殖可能であればよく、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリに属する微生物の場合、エシェリヒア・コリ ＤＨ１、エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリ Ｃ６００などが利用できる。また、微生物宿主が枯草菌に属する微生物の場合、バチルス・サチリス ＩＳＷ１２１４など、放線菌に属する微生物の場合、ストレプトマイセス・リビダンス ＴＫ２４など、サッカロマイセス・セルビシエに属する微生物の場合、サッカロマイセス・セルビシエ ＩＮＶＳＣ１などが使用できる。
【００２８】
宿主微生物に組み換えＤＮＡを移入する方法としては、例えば、宿主微生物がエシェリヒア・コリやサッカロマイセス・セルビシエ、ストレプトマイセス・リビダンスに属する微生物の場合には、常法に従ってコンピテントセル化した宿主菌株に組み換えＤＮＡの移入を行えばよく、菌株によっては電気穿孔法を使用してもよい。
【００２９】
宿主微生物への目的組み換えＤＮＡ移入の有無についての選択は、上記方法により組み換えＤＮＡを移入した宿主微生物により作成した遺伝子ライブラリーから、３２Ｐや蛍光体などでラベルした、ヘキソキナーゼの部分アミノ酸配列を基に設計し、あらかじめ合成したヘキソキナーゼのＤＮＡプローブで、コロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションなどを行うことによりポジティブ株を選択し、この株を目的の形質転換体とすればよい。
【００３０】
形質転換体からのヘキソキナーゼ遺伝子を含むＤＮＡの分離は、常法に従って行えばよい。上述の方法によって得られたヘキソキナーゼ遺伝子のＤＮＡの塩基配列は、ジデオキシ法（Ｓａｎｇａｒ，Ｆ．（１９８１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１２０５−１２１０）で解読すればよく、またヘキソキナーゼを構成するポリペプチドの全アミノ酸配列は、塩基配列より予測決定できる。
この様にして一度選択された組み換えＤＮＡは、該組み換えＤＮＡを保持する形質転換微生物から取り出され、他の宿主微生物に移入することも容易に実施できる。
また、さらに、該組み換えＤＮＡから制限酵素などにより切断してヘキソキナーゼを構成するポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを切り出し、前記と同様な方法により切断して得られる他の開環ベクターの末端に結合させて新規な特徴を有する組み換えＤＮＡを作製して、他の宿主微生物に移入することも容易に実施できる。
【００３１】
かくして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地に培養されることによりヘキソキナーゼを産生し得るが、宿主微生物によってはヘキソキナーゼ遺伝子を移入するだけではヘキソキナーゼ生産性を有しない場合がありうる。このような場合、得られたヘキソキナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、ゾラーの方法による部位特異的変異法（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３６７）による制限酵素認識部位の作製や、制限酵素による切り出しなどにより適切な形態で分離し、該宿主微生物に適合する遺伝子プロモーター下流にヘキソキナーゼ遺伝子を結合したＤＮＡを組み込んだプラスミドにより、新たな形質転換体を作成し、ヘキソキナーゼを産生させればよい。
【００３２】
例えば、上記宿主微生物がエシェリヒア・コリに属する微生物の場合、ヘキソキナーゼ遺伝子を接続する遺伝子プロモーターとしては、ｌａｃＺプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子プロモーター（特開平１−１４４９７６号公報）などが例示され、これらのプロモーターの下流にリボソーム結合部位を介在して、開始コドンＡＴＧやＧＴＧを有するヘキソキナーゼ構造遺伝子を接続し、大腸菌を宿主とするベクターに組み込み、かくのごとくして作成されたプラスミドで大腸菌を形質転換すればよい。
【００３３】
上記の遺伝子操作に一般的に使用される量的関係は、供与微生物からのＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡを０．１〜１０μｇに対し、制限酵素を約１〜１０ｕ、リガーゼ約３００ｕ、その他の酵素約１〜１０ｕ、程度が例示される。
【００３４】
また、本発明のヘキソキナーゼは公知の遺伝子操作手段により、本来の反応を触媒する性質を損なわないペプチドの変異をなしてもよく、このような変異体ヘキソキナーゼ遺伝子は、本発明のヘキソキナーゼ遺伝子から遺伝子工学的手法により作製される人工変異遺伝子を意味し、この人工変異遺伝子は前出の部位特異的変異法や、目的遺伝子の特定ＤＮＡ断片を人工変異ＤＮＡで置換するなどの種々なる遺伝子工学的方法を使用して得られる。かくして取得された人工変異ヘキソキナーゼ遺伝子をベクターに挿入して宿主微生物に移入させることによって変異体ヘキソキナーゼを発現させることが可能であり、優れた性質を有する変異体ヘキソキナーゼができればそれを製造することも可能である。
【００３５】
ヘキソキナーゼ遺伝子を含み、ヘキソキナーゼを産生し得る形質転換微生物の具体的な例示としては、エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９株にヘキソキナーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐｃＨＫＲ２（その制限酵素地図を図９に示した）を導入した形質転換微生物が挙げられる。
【００３６】
また形質転換微生物により該ヘキソキナーゼを製造するに当たっては、該形質転換微生物を栄養培地で培養して菌体内又は培養液中に該ヘキソキナーゼを産生せしめ、培養終了後、得られた培養物を濾過又は遠心分離などの手段により菌体を採集し、次いでこの菌体を機械的方法又はリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、又、必要に応じてＥＤＴＡ及び／又は適当な界面活性剤などを添加して該ヘキソキナーゼの水溶液を濃縮するか、又は濃縮する事なく硫安分画、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーにより処理して、純度のよい該ヘキソキナーゼを得ることができる。
【００３７】
形質転換微生物の培養条件はその栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すれば良く、通常多くの場合は、液体培養で行うが、工業的には深部通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用されうる。
炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコース、サッカロース、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖蜜などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であれば良く、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物などが使用される。
その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００３８】
培養温度は微生物が発育し、ヘキソキナーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリの場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養条件は、条件によって多少異なるが、ヘキソキナーゼが最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、エシェリヒア・コリの場合、通常は１２〜４８時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し、ヘキソキナーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリの場合、好ましくはｐＨ６〜８程度である。
【００３９】
ヘキソキナーゼは主としてその菌体内に含有、蓄積されており、その菌体内から抽出すればよい。ヘキソキナーゼの抽出法を例示すればまず培養物を固液分離し、得られた湿潤菌体をリン酸緩衝液やトリス−塩酸緩衝液などの溶液に分散し、リゾチーム処理、超音波処理、フレンチプレス処理、ダイノミル処理などの菌体破砕手段を適宜選択組み合わせて、粗製のヘキソキナーゼ含有液を得る。
【００４０】
粗製のヘキソキナーゼ含有液から公知の蛋白質や酵素などの単離、精製手段を用いて精製ヘキソキナーゼを得る。例えば、粗製のヘキソキナーゼ含有液にアセトン、メタノール、エタノールなどの有機溶媒による分別沈殿法、硫酸アンモニウム、食塩などによる塩析法などを適用してヘキソキナーゼを沈殿させ、回収する。さらに、この沈殿物を必要に応じて透析、等電点沈殿を行った後、電気泳動法などで単一の帯を示すまで、イオン交換体、ゲルろ過剤、吸着体などを用いるカラムクロマトグラフィーなどにより精製する。また、これらの方法を適当に組み合わせることによりヘキソキナーゼの精製度が上がる場合は適宜組み合わせて行うことができる。
【００４１】
これらの方法によって得られる酵素は安定化剤として、各種の塩類、糖類、タンパク質、脂質、海面活性化剤などを加え、あるいは加えることなく、限外ろ過濃縮、凍結乾燥などの方法により、液状または固形のヘキソキナーゼを得ることができ、また、適宜凍結乾燥を行ってもよく、この場合安定化剤としてサッカロース、マンニトール、食塩、アルブミンなどを０．５〜１０％程度添加してもよい。
【００４２】
つぎに本発明で得られるヘキソキナーゼの理化学的性質および酵素活性測定法を述べる。
ヘキソキナーゼの酵素活性測定法
測定試薬
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）
２０ｍＭ グルコース
４ｍＭ ＡＴＰ
１０ｍＭ ＭｇＣｌ2
１ｍＭ ＮＡＤＰ
５Ｕ／ｍｌ グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）（東洋紡社製）
【００４３】
測定試薬１ｍｌを光路長１ｃｍのセルに入れ３７℃で５分間予備加温した後、０．０２ｍｌの酵素液添加後０．５分後の波長３４０ｎｍにおける吸光度（Ａａ）と酵素液添加後１．５分後の吸光度（Ａｂ）を測定する。この吸光度（Ａａ）と（Ａｂ）の吸光度差（Ａｂ−Ａａ）より酵素活性を求める。なお、吸光度（Ａｂ）が０．２以上になる時は酵素液を５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で希釈して測定するものとする。酵素活性１単位は３７℃で１分間に１μモルの還元型ＮＡＤＰを生成させる酵素量とし、計算式は下記の通りである。
酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝（Ａｂ−Ａａ）×８．１×酵素の希釈倍率
【００４４】
理化学的性質
（１）酵素作用
基質としてグルコースを用いたときの酵素作用を以下に示す。
【００４５】
【化４】
（２）Ｋｍ値
本発明のヘキソキナーゼ（以下、本発明ヘキソキナーゼもしくは本発明ＨＫともいう）、酵母由来ヘキソキナーゼ（オリエンタル酵母社製、以下、酵母由来ＨＫともいう）、バチルス・ステアロサーモフィルス由来グルコキナーゼ（ユニチカ社製、以下、バチルス由来ＧＫともいう）、サーモトーガ・ネアポリタナ ＤＳＭ４３５９［サーモトーガ・ネアポリタナ（ＤＳＭ４３５９）菌株由来ＨＫともいう］およびエアロパイラム・ペルニクス ＪＣＭ９８２０［エアロパイラム・ペルニクス（ＪＣＭ９８２０）菌株由来ＨＫともいう］のグルコースおよびＡＴＰに対するＫｍ値は表１の通りである。
【００４６】
【表１】
【００４７】
（３）基質特異性
本発明ヘキソキナーゼ、酵母由来ＨＫおよびバチルス由来ＧＫの各種糖類に対する特異性は表２の通りである。本酵素はグルコースに対して最も高い反応性を示し、フルクトースには全く作用しない点で酵母由来の酵素とは異なり、また、１，５−アンヒドログルシトールに対する反応性がバチルス由来の酵素の７．５倍であることからバチルス由来酵素とも異なっていた。
【００４８】
【表２】
【００４９】
（４）リン酸基供与体
本発明ヘキソキナーゼの各種リン酸基供与体に対する特異性は表３の通りである。
【００５０】
【表３】
【００５１】
（５）等電点
５．０±０．２（キャリアーアンフォライを用いた電気泳動法にて）
【００５２】
（６）分子量
１１５，０００±５，０００（ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷＸＬを用いたゲルろ過法にて）
（７）至適ｐＨ
前記酵素活性測定法にしたがって至適ｐＨを求めたもので、その結果を図１に示した。ｐＨ４．５〜５．５の範囲は１００ｍＭの酢酸緩衝液（図中、○）、ｐＨ５〜６の範囲は１００ｍＭのクエン酸緩衝液（図中、□）、ｐＨ６〜７．５の範囲は１００ｍＭのリン酸緩衝液（図中、△）、ｐＨ７．５〜９の範囲は１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（図中、●）、ｐＨ９．５〜１０の範囲は１００ｍＭのグリシン緩衝液（図中、■）を使用した場合の活性値を示すもので、至適ｐＨは７．５〜９にあった。
【００５３】
（８）ｐＨ安定性
１Ｕ／ｍｌの本発明ヘキソキナーゼを１００ｍＭの各種緩衝液中で３７℃、１時間処理し、その残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。その結果を図２に示した。ｐＨ４．５〜５．５の範囲は１００ｍＭの酢酸緩衝液（図中、○）、ｐＨ５〜６の範囲は１００ｍＭのクエン酸緩衝液（図中、□）、ｐＨ６〜７．５の範囲は１００ｍＭのリン酸緩衝液（図中、△）、ｐＨ７．５〜９の範囲は１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（図中、●）、ｐＨ９．５〜１０の範囲は１００ｍＭのグリシン緩衝液（図中、■）を使用した。ｐＨ４．５〜１０の範囲で良好な安定性を示した。
【００５４】
（９）至適温度
前記酵素活性測定法に従って、温度３７〜９５℃の範囲で変化させて至適温度をもとめた結果は図３に示す通りであり、本酵素の至適温度は測定の範囲内においては９５℃であった。
（１０）熱安定性
０．５Ｕ／ｍｌの本発明ヘキソキナーゼを１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）中で各温度で１０分間加熱処理した後の残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。その結果、図４に示す通り、少なくとも８０℃、１０分間処理における残存活性が少なくとも８０％以上を示す安定なものであった。
【００５５】
（１１）各種２価の金属イオンの活性におよぼす影響
前記酵素活性測定法においてマグネシウムイオンの代わりに各種２価の金属イオンを添加して活性測定を行った結果を表４に示した。
【００５６】
【表４】
その結果、本発明ヘキソキナーゼはマグネシウムイオンによって最も強く活性化され、コバルトイオン、マンガンイオンによって少し活性化され、ニッケルイオンによってわずかに活性化を受けた。
（１２）各種金属イオンおよび阻害剤の影響
各種１価の金属イオンおよび阻害剤の影響を表５に示した。
【００５７】
【表５】
その結果、検討を行った金属イオンおよび阻害剤で影響を受けるものは無かった。尚、表中ＡＰ5 ＡはＰ1 ，Ｐ5 −ジ（アデノシン−５’）ペンタリン酸（シグマ社製）、ＮＡＣはＮ−アセチル−Ｌ−システイン（シグマ社製）を示す。
また以上の結果から、、クルベルマイセス属由来のヘキソキナーゼは、分子量が６０，０００で、グルコースに対する活性を１００とした時のフルクトースに対する相対活性が１８９．４％であり、明らかに本発明ヘキソキナーゼとは異なる性質のものである。
【００５８】
【発明実施の形態】
以下、本発明の実施例を詳しく述べるが、本発明は何らこれらにより限定されるものではない。なお、実施例中、常法に従い、と記述した遺伝子操作技術は、例えば前出のマニアティスらの方法や、市販の各種酵素、キット類に添付された手順に従えば実施できるものである。また、実験に使用した組み換えＤＮＡ実験酵素試薬（制限酵素など）、ベクターＤＮＡ、キット類は特に指摘しない限り宝酒造株式会社より購入したものである。
【００５９】
【実施例１】
＜ロドサーマスの培養＞
ロドサーマス・オバメンシス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ） ＪＣＭ９７８５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３８４）菌株をトリプティカーゼペプトン（ＢＢＬ社製）を０．４％、酵母エキス（ディフコ社製）を０．４％、ジャマリンＳ（ジャマリン ラボラトリー社製）１００ｍｌ、ニトリロトリ酢酸を０．１５％、ＭｎＳＯ4 ・Ｈ2 Ｏを０．０５％、ＦｅＳＯ4 を０．１４％、ＮｉＣl 2 を０．０２％、ＣｏＳＯ4 を０．０１％、ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏを０．０１％、ＣｕＳＯ4 を０．００１％、Ｎａ2 ＷＯ4 ・２Ｈ2 Ｏを０．０００３％、Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏを０．００１％からなる培地（ｐＨ７．０）を５００ｍｌの三角フラスコ２本に分注したものに接種し、７５℃、１５時間培養し、得られた種培養液を上記と同一組成培地に消泡剤を加えた培地２０Ｌに添加し、７５℃で１５時間培養した。培養終了後、培養物を４，５００ｒｐｍで３０分間、遠心し、菌体０．４３ｋｇを回収した。
【００６０】
【実施例２】
＜ヘキソキナーゼの精製法＞
この菌体を５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、全量を２，０００ｍｌとした後、超音波破砕装置を用いて、氷中で３０分間超音波処理を行った。その後、７，５００ｒｐｍで２０分間、遠心分離して不溶物を除去して、その上清１，８００ｍｌ（７５０Ｕ）を得た。
ついでこの上清を１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）にて、１５時間透析し、ＤＥＡＥ−セファロース・ファーストフロー（２．７×３０ｃｍ）（ファルマシア社製）イオン交換クロマトグラフィを行った。溶出はＮａＣｌの０〜１Ｍのリニアグラジエントにより行い、０．２Ｍ〜０．３ＭのＮａＣｌの溶出画分（６００Ｕ）を回収した。この酵素液に１５％（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 の濃度となるように（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 を溶解し、フェニルセファロース・ファーストフロー（２．７×１９．５ｃｍ）（ファルマシア社製）の疎水クロマトグラフィーを行った。溶出は１５％〜０％の（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 のリニアグラジエントにより行い、５〜２％の（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 の溶出画分（４５０Ｕ）を回収した。
【００６１】
ついで、この酵素液を１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）にて１５時間透析し、Ｑ−セファロース・ファーストフロー（２．７×１９．５ｃｍ）（ファルマシア社製）のイオン交換クロマトグラフィを行った。溶出は０〜０．５ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントにより行い、０．２〜０．３ＭのＮａＣｌの溶出画分（３２０Ｕ）を回収した。さらに、この酵素液を１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて１５時間透析し、ハイドロキシアパタイト（ペンタックス社製）（１．６×２６．５ｃｍ）クロマトグラフィーを行った。溶出は０〜０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）によるリニアグラジエントにより行い、０．０３〜０．０４Ｍのリン酸緩衝液の溶出画分（２４０Ｕ）を回収し、精製ヘキソキナーゼを得た。
【００６２】
【実施例３】
＜本発明ヘキソキナーゼの保存安定性＞
本発明ヘキソキナーゼ、酵母由来ヘキソキナーゼおよびバチルス・ステアロサーモフィルス由来グルコキナーゼを各０．５Ｕ／ｍｌ濃度で５０ｍＭのイミダゾール緩衝液（ｐＨ６．７）中で４℃および２５℃、８週間保存し、残存活性を前記活性測定法により測定した。その結果を図５（４℃における保存安定性）および図６（２５℃における保存安定性）に示した。（図中、○は本発明ヘキソキナーゼ、□は酵母由来ヘキソキナーゼ、△はバチルス・ステアロサーモフィルス由来グルコキナーゼを示す）。４℃の保存では酵母由来ヘキソキナーゼおよびバチルス・ステアロサーモフィルス由来グルコキナーゼは８週間の保存で残存活性が約４０％まで低下したが、本発明ヘキソキナーゼは９５％以上の残存活性を示した。また２５℃の保存ではバチルス・ステアロサーモフィルス由来グルコキナーゼは４週間で、酵母由来のヘキソキナーゼは６週間で残存活性が０％になったが、本発明ヘキソキナーゼは６週間後でも８０％以上の残存活性を示した。
【００６３】
【実施例４】
＜ヘキソキナーゼのＮ末端アミノ酸配列の解析＞
実施例２により得られた精製ヘキソキナーゼのＮ末端アミノ酸配列を、エドマン分解法により決定した。決定されたＮ末端アミノ酸配列は、配列表の配列番号１のアミノ酸配列の１から４０で表される。
【００６４】
【実施例５】
＜放射性ＤＮＡプローブの作製＞
判明した部分アミノ酸配列をコードするヘキソキナーゼ遺伝子の塩基配列を予想した。この配列を基に設計されるオリゴヌクレオチドプローブには無数の形状があるが、本発明ではそのうち、配列表の配列番号２で表される塩基配列を有するＨＫ３と命名したオリゴヌクレオチドを使用した。
【００６５】
このオリゴヌクレオチドを外部機関（ベックス社）に合成依託して作成し、完成したオリゴヌクレオチド２００ｎｇをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼバッファー（５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭの２−メルカプトエタノール）、及び７４０ｋＢｑ（キロベクレル）の［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（第一化学薬品社販売）存在下、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ ８．５ｕで３７℃、３０分間反応せしめ、ラジオアイソトープ３２Ｐを取り込ませ放射性オリゴヌクレオチドプローブとした。
【００６６】
【実施例６】
＜ロドサーマス・オバメンシスからのＤＮＡの抽出＞
実施例１で培養したロドサーマス・オバメンシス ＪＣＭ９７８５株の菌体を５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＥＤＴＡ、１５％シュークロースを含む１ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液で３７℃、１０分処理した後、ＳＤＳを最終濃度０．２５％になるよう添加して菌体を溶解した。さらに等量のフェノール／クロロホルム＝１：１混合液を加え、３０分攪拌した後、１２，０００ｒｐｍで１５分遠心分離処理をして水層を回収した。
【００６７】
回収した水層に１０分の１量の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を混合後、２倍量のエタノールを静かに重層し、ゲノムＤＮＡをガラス棒に巻き付かせて分離した。分離したゲノムＤＮＡを、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ水溶液（ＴＥバッファー）２０ｍｌに溶解し、２０ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを２００μｌ加え、３７℃で１時間保温し、混在しているＲＮＡを分解した。次いで、等量のフェノール／クロロホルム混合液を加え、前記と同様に処理して、水層を分取した。分取した水層に１０分の１量の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）と２倍量のエタノールを加えて前記の方法でもう一度ゲノムＤＮＡを分離した。
【００６８】
この染色体を５０ｍｌのＴＥ（１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））に溶解し、ＴＥ飽和のフェノールとクロロホルムの１対１混和液２０ｍｌを加え、全体を懸濁した後、同様の遠心分離を繰り返し、上層を再び別の容器に移した。この分離した上層２０ｍｌに３Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）２ｍｌとエタノール５０ｍｌを加え、撹拌後−７０℃で５分間冷却した後、遠心分離（２，０００Ｇ、４℃、１５分）し、沈澱した染色体を７５％ エタノールで洗い、減圧乾燥した。
以上の操作によりロドサーマス・オバメンシス ＪＣＭ９７８５株の染色体標品１ｍｇを得た。
【００６９】
【実施例７】
＜ヘキソキナーゼ遺伝子含有ＤＮＡフラグメントの検定＞
実施例６の操作で得られたロドサーマス・オバメンシス ＪＣＭ９７８５株の染色体ＤＮＡから遺伝子ライブラリーを作成するため、本染色体を各種制限酵素で切断し、目的遺伝子が含有されるＤＮＡフラグメントの鎖長を検定する操作を行った。即ち、ロドサーマス・オバメンシス ＪＣＭ９７８５株の染色体ＤＮＡ（１０μｇ）を各種制限酵素で切断し、１．５％アガロースゲル（宝酒造社製Ｈ１４、４０ｍＭのトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７．４）、２ｍＭのＥＤＴＡ）で１５０Ｖ、１．５時間電気泳動し、常法に従ってサザンブロッティングを行い、アガロースゲルからナイロンメンブレン（ＰＡＬＬ社製：バイオダインＡ）にＤＮＡを移行させた。
【００７０】
このメンブレンを風乾後、ナイロンメンブレン添付のマニュアルに従ってプレハイブリダイゼーションを行い、さらに実施例５で作成したＨＫ３放射性プローブを使用したハイブリダイゼーションを４５℃で１晩行った。ハイブリダイゼーション後、メンブレンを５５℃の洗浄液（６×ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム〔１×ＳＳＣ：０．１５Ｍの塩化ナトリウム，１５ｍＭのクエン酸ナトリウム〕：メンブレン１００平方ｃｍ当り約５０ｍｌ）で１０分洗った後、メンブレンを自然乾燥した。この乾燥したメンブレンをＸ線フィルム（富士写真フィルム社製 Ｎｅｗ ＲＸＯ−Ｈ）に重ね、遮光下、−７０℃で２４時間オートラジオグラフィーを行った。
【００７１】
オートラジオグラフィー終了後、フィルムを現像し、各制限酵素による切断染色体が示すポジティブバンドのサイズを観察した。
その結果、ＥｃｏＲＩ切断により約４ｋｂ（キロベース：ＤＮＡ鎖長の単位、１，０００塩基対）のＤＮＡフラグメント上にヘキソキナーゼ遺伝子が含有されることが明らかとなり、ＥｃｏＲＩで切断した染色体ＤＮＡの４ｋｂフラグメントから遺伝子ライブラリーを作成することとした。
【００７２】
【実施例８】
＜遺伝子ライブラリーの作成＞
実施例６の操作で得られたロドサーマス・オバメンシス ＪＣＭ９７８５株の染色体ＤＮＡ１０μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、常法に従い約４ｋｂのＤＮＡフラグメントを分離した。このＤＮＡフラグメントを、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断しアルカリフォスファターゼ（以下ＢＡＰと略称）１ｕで切断末端を脱リン酸化したｐＵＣ１１９ １μｇと、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）で連結させた。これを用いて、常法に従ってコンピテント細胞としたエシェリヒア・コリ ＪＭ１０９（東洋紡績社製）（ｒｅｃＡ１，△（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ），ｅｎｄＡ１，ｇｙｒＡ９６，ｔｈｉ−１，ｈｓｄＲ１７，ｒｅｌＡ１，ｓｕｐＥ４４，〔Ｆ’ｔｒａＤ３６，ｐｒｏＡＢ，ｌａｃｌｑＺ△Ｍ１５〕）をトランスフォーメーションし、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ（バクトトリプトン（ＤＩＦＣＯ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製）５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／ｌ）１．５％寒天平板培地にて一夜培養し、約２，６００個のアンピシリン耐性コロニーを得、遺伝子ライブラリーとした。
【００７３】
【実施例９】
＜ヘキソキナーゼ遺伝子含有クローンのスクリーニング＞
実施例８により得た遺伝子ライブラリーを、ナイロンメンブレン（ＰＡＬＬ社製：バイオダインＡ）にレプリカし、このフィルターに添付のマニュアルに従って菌体のＤＮＡを固定した。
このフィルターを添付のマニュアルに従ってプレハイブリダイゼーションおよび、実施例５で調製したＨＫ３プローブを使用したハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション後、メンブレンを実施例７に示した５５℃の洗浄液で１０分洗った後メンブレンを自然乾燥した。この乾燥メンブレンをＸ線フィルムに重ね、遮光下、−７０℃で２４時間オートラジオグラフィーを行った。
オートラジオグラフィー終了後、フィルムを現像し、ポジティブシグナルをしめすコロニーを４個確認した。
【００７４】
【実施例１０】
＜組み換えプラスミドの抽出＞
実施例９で選ばれたポジティブシグナルを示すコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ液体培地１．５ｍｌに植菌し３７℃で１６時間振盪培養した後、常法に従ってプラスミドを抽出した。その結果、４つのコロニーより抽出されたプラスミドは同じ染色体ＤＮＡ断片を含むものであり、このプラスミドのうちの１つをｐｃＨＫＲ１と命名した。
【００７５】
【実施例１１】
＜ヘキソキナーゼ遺伝子塩基配列の決定＞
実施例１０で得られたプラスミドｐｃＨＫＲ１より、ヘキソキナーゼ構造遺伝子部分についてジデオキシ法により塩基配列を決定した。
【００７６】
【実施例１２】
＜ヘキソキナーゼ発現プラスミドの構築＞
ｐｃＨＫＲ１にゾラーらの部位特異的変異法により変異を行い、ヘキソキナーゼ構造遺伝子上流に制限酵素ＸｂａＩ認識部位とリボソーム結合部位を、下流部に制限酵素ＳａｃＩ認識部位を作製した。ヘキソキナーゼの構造遺伝子とその変異した上流と下流域の塩基配列、およびヘキソキナーゼ構造遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示した。変異したｐｃＨＫＲ１をＸｂａＩとＳａｃＩで切断し、ヘキソキナーゼの構造遺伝子を含む約１ｋｂのＤＮＡ断片を分離した。これをｐＵＣ１１９のＸｂａＩとＳａｃＩの切断部位に挿入し、ｐＵＣ１１９のｌａｃプロモーター下流にＳＤ配列とヘキソキナーゼ遺伝子が連結されたプラスミドを構築し、本プラスミドをｐｃＨＫＲ２と命名した。プラスミドｐｃＨＫＲ２の構造を図９に示す。なお、図中の「ｈｋ」はヘキソキナーゼ構造遺伝子を、「ａｐ」はアンピシリン耐性構造遺伝子を、「ｏｒｉ」は大腸菌プラスミドの複製起点領域を、「ｌａｃ」はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子プロモーター領域をそれぞれ表す。このｐｃＨＫＲ２をエシェリヒア・コリ ＪＭ１０９株に導入した。
【００７７】
【実施例１３】
＜ｐｃＨＫＲ２保持大腸菌の培養とその細胞抽出液の調製＞
ｐｃＨＫＲ２を導入したエシェリヒア・コリ ＪＭ１０９株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンとｌａｃプロモーター誘導剤である１ｍＭのＩＰＴＧ（和光純薬社製）を含有した３．７％ＢＨＩ（ＤＩＦＣＯ社製）液体培地１．５ｍｌで３７℃、１６時間培養し、そのうち１ｍｌを遠心分離（１５，０００Ｇ、１分、４℃）により集菌し、２００μｌの１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、超音波破砕機を用いて菌体を破砕した後、遠心分離（１４，０００Ｇ、５分、４℃）し、上清を取得して細胞抽出液とした。同様に、ヘキソキナーゼ遺伝子を含まないクローニングベクターｐＵＣ１１９により形質転換されたエシェリヒア・コリ ＪＭ１０９の抽出液も調製した。
【００７８】
【実施例１４】
＜細胞抽出液中のヘキソキナーゼ酵素活性の確認＞
実施例１３で調製したエシェリヒア・コリ ＪＭ１０９・ｐｃＨＫＲ２、およびエシェリヒア・コリ ＪＭ１０９・ｐＵＣ１１９の細胞抽出液中のヘキソキナーゼ酵素活性を、参考例１の方法に従って測定した。その結果、エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９・ｐｃＨＫＲ２では、培養液１ｍｌあたり０．１ユニットの活性が検出され、ｐＵＣ１１９を導入したエシェリヒア・コリ ＪＭ１０９には活性は検出されなかった。これによりｐｃＨＫＲ２を導入したエシェリヒア・コリＪＭ１０９でのヘキソキナーゼの活性発現が確認された。以上の方法で作成した本発明組み換え体ヘキソキナーゼを実施例２の方法で精製し諸性質を測定したところ、天然物ヘキソキナーゼと同じ性質を有することが確認された。
【００７９】
【参考例１】
＜本発明ヘキソキナーゼを用いたグルコースの定量＞
測定試薬
５０ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
４ｍＭ ＡＴＰ
１０Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ ＮＡＤＰ
１０ｍＭ ＭｇＣｌ2
１０Ｕ／ｍｌ 本発明ヘキソキナーゼ
【００８０】
測定方法
グルコースを０．４ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭの水溶液に調整し、グルコースサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌにグルコースサンプル０．０５ｍｌ加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブランクを対照に測定した。図７に示すようにグルコースが定量的に測定できた。
【００８１】
【参考例２】
＜本発明ヘキソキナーゼを用いたマグネシウムの定量＞
測定試薬
５０ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
４ｍＭ ＡＴＰ
１０Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ ＮＡＤＰ
２０ｍＭ グルコース
１０Ｕ／ｍｌ 本発明ヘキソキナーゼ
【００８２】
測定方法
塩化マグネシウムを５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭの水溶液に調整し、塩化マグネシウムサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌに塩化マグネシウムサンプル０．０１ｍｌ加え、３７℃、２分間〜３分間後の３４０ｎｍの吸光度差を試薬ブランクを対照に測定した。図８に示すようにマグネシウムが定量的に測定できた。
【００８３】
【参考例３】
＜サーモトーガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ・ｎａｐｏｌｉｔａｎａ；ＤＳＭ４３５９）菌株由来ＨＫの取得方法＞
０．１％ 酵母エキス
０．５％ トリプトン
０．７２％ マルトース
２．３９％ ＮａＣｌ
０．４％ Ｎａ2 ＳＯ4
０．０７％ ＫＣｌ
０．０２％ ＮａＨＣＯ3
０．０１％ ＫＢｒ
０．０３％ Ｈ3 ＢＯ4
１．０８％ ＭｇＣｌ2
０．１５％ ＣａＣｌ2
０．００２５％ ＳｒＣｌ2
０．０２５％ ＮＨ4 Ｃｌ
０．０１４％ Ｋ2 ＨＰＯ4
０．１％ ＣＨ3 ＣＯＯＮａ
０．００１５％ Ｎ（ＣＯＯＨ）3
０．０００５％ ＭｎＳＯ4
０．００１４％ ＦｅＳＯ4
０．０００２％ ＮｉＣｌ2
０．０００１％ ＣｏＳＯ4
０．０００１％ ＺｎＳＯ4
０．００００１％ ＣｕＳＯ4
０．０００００１％ Ｎａ2 ＷＯ4
０．０００００１％ Ｎａ2 ＭｏＯ4
０．１％ システイン塩酸塩
【００８４】
上記培地成分を含む液体培地（ｐＨ７．５）５００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコ２本に分注し、１２０℃、２０分間、加熱滅菌した後、これにサーモトーガ・ネアポリタナ株の菌体懸濁液１０ｍｌを移植し、攪拌させながら、９５℃で２０時間培養を行った。得られた培養液を８，０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離を行い、５ｇの湿潤菌体を得た。この菌体を１０ｍｌの１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、超音波破砕により、菌体破砕を行った。得られた菌体破砕液を１５，０００ｒｐｍ、３０分間、遠心分離を行った後、１０Ｌの１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に２０時間透析し、粗酵素液とした（６．５Ｕ、１０ｍｌ）。
【００８５】
【参考例４】
＜エアロパイラム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ・ｐｅｒｎｉｘ；ＪＣＭ９８２０）菌株由来ＨＫの取得方法＞
培地組成
０．１％ バクトイストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）
０．１％ トリプチカーゼペプトン（ＢＢＬ社製）
０．１％ チオ硫酸ナトリウム
１Ｌ 人工海水（Ｊａｍａｒｉｎ Ｓ、ジャマリンラボラトリー社製）
【００８６】
上記培地成分を含む液体培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを５００ｍｌ容の坂口フラスコ２０本に分注し、１２０℃、２０分間、加熱滅菌した後、これにエアロパイラム・ペルニクス菌株を移植し、振盪させながら９０℃で２０時間培養を行った。得られた培養液を８，０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離を行い、４．２ｇの湿潤菌体を得た。この菌体を１０ｍｌの１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、超音波破砕により、菌体破砕を行った。得られた菌体破砕液を１５，０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離を行った後、１０Ｌの１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に２０時間透析し、粗酵素液を得た（４．５Ｕ、１０ｍｌ）。
【００８７】
【発明の効果】
本発明により、新規なヘキソキナーゼおよびロドサーマス属に属する微生物よるヘキソキナーゼの新規な製造法を提供できるものであり、本酵素を用いるグルコースまたはＣＰＫの測定用酵素をして提供できた。
【００８８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のヘキソキナーゼの至適ｐＨ曲線を示すものである。
【図２】本発明のヘキソキナーゼのｐＨ安定曲線を示すものである。
【図３】本発明のヘキソキナーゼの至適温度曲線を示すものである。
【図４】本発明のヘキソキナーゼの熱安定曲線を示すものである。
【図５】本発明ヘキソキナーゼおよび従来のヘキソキナーゼの４℃における保存安定曲線を示すものである。
【図６】本発明ヘキソキナーゼおよび従来のヘキソキナーゼの２５℃における保存安定曲線を示すものである。
【図７】本発明ヘキソキナーゼを用いたグルコースの定量曲線を示すものである。
【図８】本発明ヘキソキナーゼを用いたマグネシウムの定量曲線を示すものである。
【図９】本発明プラスミドヘキソキナーゼ遺伝子の発現プラスミドｐｃＨＫＲ２の制限酵素地図を示すものである。
【発明の属する技術分野】
本発明は臨床診断薬分野におけるグルコース、マグネシウムまたはクレアチンキナーゼ活性の測定に用いられる溶液状態での安定性の優れた新規なヘキソキナーゼおよびその製造法に関する。
【０００２】
【従来技術】
ヘキソキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１）は、ＡＴＰの存在下、グルコースその他のヘキソースをリン酸化してヘキソース−６−リン酸とする反応を触媒する酵素である。従来より高等動物のさまざまな細胞内やサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ・ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ・ｏｒｙｚａｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ・ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ・ｃｏｌｉ）、エアロバクター・エアロゲネス（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ・ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）由来の酵素が知られている（蛋白質 核酸 酵素、２２，１５０７−１５０９，１５１０−１５１４，１５１５−１５１９，１９７７、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３４，２４９−３２６，１９７３、Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ ３ｒｄ Ｅｄ．，４，１−４８，１９７３）。
【０００３】
しかしながら、これらの酵素は室温における溶液状態での安定性が悪く、臨床診断薬分野におけるグルコース、マグネシウムまたはクレアチンキナーゼ活性の測定に用いられる溶液状態での保存に満足のいくものではなかった。
また、溶液状での保存安定性に優れたクルベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）に属する高温性酵母由来のヘキソキナーゼが報告されたが（特開平９−２２００８８号公報）、クルベロマイセス属由来ヘキソキナーゼは、従来のヘキソキナーゼと同様にグルコースの他にフルクトースにも作用することから、血液中のフルクトースの影響を受けるという問題点があった。このため、グルコースの測定用にはフルクトースに対する反応性の低いバチルス・ステアロサーモフィルス由来のグルコキナーゼが用いられているが、この酵素も溶液状での保存安定性が十分ではなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、フルクトースに対して実質的に作用せず、長期保存安定性の優れた新規なヘキソキナーゼを提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するため、鋭意検討した結果、ロドサーマス・オバメンシス ＪＣＭ９７８５（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ ＪＣＭ９７８５、理化学研究所保存株；茨城県つくば市東１丁目３番３号所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所、ＦＥＲＭ ＢＰ−６３８４，平成１０年６月４日寄託日）菌株、サーモトーガ・ネアポリタナ ＤＳＭ４３５９菌株およびエアロパイラム・ペルニックス ＪＣＭ９８２０菌株などの好熱菌が安定なヘキソキナーゼを生産することを見いだし、さらにこれらの好熱菌由来のヘキソキナーゼについて詳細に性質検討を行った結果、ロドサーマス・オバメンシス ＪＣＭ９７８５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３８４）菌株の菌体内に２５℃、６週間の５０ｍＭのイミダゾール緩衝液（ｐＨ６．５）中保存において、少なくとも８０％以上の残存活性を有し、かつ次の理化学的性質（１）〜（３）を有する新規なヘキソキナーゼを見い出した。
【０００６】
（１）作用
グルコースを基質として用いたときの反応式が下記の通りである。
【０００７】
【化２】
（２）至適ｐＨ
ｐＨ７．５〜８．５（トリス−塩酸緩衝液）のｐＨ範囲に至適ｐＨを持つ。
（３）熱安定性
８０℃、１０分間の熱処理後の残存活性が少なくとも８０％以上である。
【０００８】
また当該ヘキソキナーゼを精製し、その構成するポリペプチドのＮ末端から４０アミノ酸の配列を決定することに成功し、このＮ末端アミノ酸配列を基にヘキソキナーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを分離し、ヘキソキナーゼ遺伝子の塩基配列を決定した。また、該ヘキソキナーゼ遺伝子を任意のベクターに導入し、好ましい宿主−ベクター系にて宿主微生物を形質転換体とし、該形質転換体を培養して、該培養物からヘキソキナーゼを確認し、優れた工業的生産方法を確立し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
ヘキソキナーゼ遺伝子の塩基配列、および塩基配列から明らかとなったヘキソキナーゼのアミノ酸配列は明らかに新規であり、ＤＮＡ ＤＡＴＡ ＢＡＳＥｏｆ ＪＡＰＡＮ（ＤＤＢＪ）の核酸配列及び蛋白質データベースからは、同じ配列を有する遺伝子および蛋白質は見い出されなかった。
本発明は上記の知見に基づいて完成されたもので、２５℃、６週間の５０ｍＭのイミダゾール緩衝液（ｐＨ６．５）中保存において、少なくとも８０％以上の残存活性を有し、かつ次の理化学的性質（１）〜（３）を有するヘキソキナーゼ
【００１０】
（１）作用
グルコースを基質として用いたときの反応式が下記の通りである。
【００１１】
【化３】
（２）至適ｐＨ
ｐＨ７．５〜８．５（トリス−塩酸緩衝液）のｐＨ範囲に至適ｐＨを持つ。
（３）熱安定性
【００１２】
８０℃、１０分間の熱処理後の残存活性が少なくとも８０％以上である。
配列表の配列番号１のアミノ酸配列の１から３３２で表されるアミノ酸配列を有するヘキソキナーゼ、ヘキソキナーゼ蛋白質をコードするＤＮＡ、ヘキソキナーゼの生産能を有する遺伝子組み換え微生物、ロドサーマス属に属するヘキソキナーゼ生産菌または外来性のヘキソキナーゼの生産能を有する遺伝子組み換え微生物を培養し、培養物から当該ヘキソキナーゼを採取することを特徴とするヘキソキナーゼの製造法、ロドサーマス・オバメンシス ＪＣＭ９７８５（ＦＥＲＭＢＰ−６３８４）を培養し、培養物から当該ヘキソキナーゼを採取することを特徴とするヘキソキナーゼの製造法である。
すなわち、本発明はフルクトースに対して実質的に作用せず、長期保存安定性の優れた新規なヘキソキナーゼおよびその製造法に関するものである。
【００１３】
以下に本発明について詳細に説明する。
まず、本発明のヘキソキナーゼ生産菌について、ロドサーマス属に属する当該ヘキソキナーゼを生産する能力を有する微生物であれば何ら限定されるものではなく、ヘキソキナーゼを生産する能力を有する変種や変異株であってもよく、好ましくはロドサーマス・オバメンシス ＪＣＭ９７８５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３８４）菌株が挙げられる。
本発明者らはロドサーマス属の菌株がフルクトースに対して実質的に作用せず、長期保存安定性の優れた新規なヘキソキナーゼを生産することを見い出し、該酵素の精製、および諸性質の検討を行った。
本発明における使用菌株はロドサーマス属に属するヘキソキナーゼ生産菌であるが、例えばロドサーマス・オバメンシス ＪＣＭ９７８５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３８４）株が挙げられる。
【００１４】
また本発明の配列表の配列番号１のアミノ酸配列の１から３３２で表されるヘキソキナーゼ蛋白のアミノ酸配列をコードするＤＮＡにおいて、その配列番号１のアミノ酸配列の１から３３２で表記されるアミノ酸配列のＮ末端側及びＣ末端側はアミノ酸残基又はポリペプチド残基を含む場合であってもよく、Ｎ末端側であるメチオニンの上流にはさらに一個又は複数のアミノ酸残基を有してもよく、そのアミノ酸残基としては開始コドン又はシグナルペプチドが挙げられ、またＣ末端側のアラニンの下流には、さらに一個以上のアミノ酸残基を有してもよい。
【００１５】
さらに、本発明のヘキソキナーゼを構成するアミノ酸配列は、配列表の配列番号１のアミノ酸配列の１から３３２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドによる酵素活性発現と同様の効果を発現する、配列番号１のアミノ酸配列の１から３３２のアミノ酸配列の一部から実質的になるアミノ酸配列や酵素活性発現に関与しない一部のアミノ酸の配列を変異、欠損又は付加したものの均等物も含まれる。
【００１６】
本発明の配列表の配列番号１のアミノ酸配列の１から３３２で表されるアミノ酸配列をコードする新規なＤＮＡは、そのＮ末端側及びＣ末端側のアミノ酸残基又はポリペプチド残基を含めたアミノ酸配列の各アミノ酸に対応する一連のコドンのうちいずれか１個のコドンからなるＤＮＡであればよい。
【００１７】
さらに、本発明のヘキソキナーゼを構成するアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、配列表の配列番号１のアミノ酸配列の１から３３２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドによる酵素活性発現と同様の効果を発現する、配列番号１のアミノ酸配列の１から３３２中の一部分からなる実質的になるアミノ酸配列をコードするＤＮＡであってもよく、また酵素活性発現に関与しない一部のアミノ酸の配列を変異、欠損又は付加したものの均等物のアミノ酸配列をコードするＤＮＡであってもよい。
【００１８】
上記のＤＮＡの好適な例として、配列表の配列番号１の塩基配列の１８から１０１３で表される塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができる。該ＤＮＡは、５’末端の上流側にアミノ酸をコードするコドンを１個以上有したものでもよく、ＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡ以外のコドンであればよい。さらに、好ましくはＡＴＧ、ＧＴＧ、それら以外の開始コドン又はシグナルペプチドに対応するコドンを有したものを挙げることができる。３’末端のＧＣＣ下流側には、アミノ酸をコードするコドンを１個以上有するか、又は翻訳終止コドンを有するかのいずれでもよく、更に、その３’末端側にアミノ酸をコードするコドンを１個以上有する場合には、このアミノ酸をコードするコドンの３’末端側に翻訳終止コドンを有することが好ましい。
【００１９】
ヘキソキナーゼ蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、ヘキソキナーゼ遺伝子の供与体である、ヘキソキナーゼを生産する微生物よりＤＮＡを分離精製した後、制限酵素などを用いて切断した該ＤＮＡと、同じく切断して直鎖状にした発現ベクターとを、両ＤＮＡの末端部をＤＮＡリガーゼなどにより結合閉環させ、かくして得られた組み換えＤＮＡプラスミドを宿主微生物に導入し、発現ベクターのマーカーと、ヘキソキナーゼの活性発現若しくはＤＮＡプローブを指標としてスクリーニングを行い、ヘキソキナーゼ遺伝子を含有する組み換えＤＮＡプラスミドを保持する微生物を分離し、該遺伝子組み換え微生物を培養し、該培養菌体から該組み換えＤＮＡプラスミドを分離精製し、次いで該組み換えＤＮＡプラスミドからヘキソキナーゼ遺伝子であるＤＮＡを取得することにより得られる。
【００２０】
ＤＮＡの供与体である微生物としては、ヘキソキナーゼを生産する微生物であれば、なんら限定されるものではないが、好ましくはロドサーマス・オバメンシス ＪＣＭ９７８５株が挙げられる。
本発明を実施するにあたり、ロドサーマス属の培養形態としては液体培養、固体培養いずれも可能であるが工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。また、使用する培養源としては一般に微生物培養に用いられる炭素源、窒素源、無機塩およびその他の微量栄養源の他、ロドサーマス属に属する微生物の利用できる栄養源であればすべて使用できる。
【００２１】
炭素源としてはグルコース、サッカロース、キシロース、マルトース、グリセロール、デキストリン、デンプン、アミノ酸などの他、脂肪酸、油脂、有機酸などが単独でまたは組み合わせて用いられる。窒素源としては無機窒素源、有機窒素源のいずれも使用可能であり、無機窒素源としては硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム、塩化アンモニウムなどがあげられる。また、有機窒素源としては大豆、米、トウモロコシ、小麦などの粉、コーンスティープリカー、ペプトン、肉エキス、カゼインアミノ酸、酵母エキスなどがあげられる。無機塩および微量栄養素としてはリン酸、マグネシウム、カリウム、鉄、カルシウム、亜鉛などの塩類の他ビタミン、非イオン性界面活性剤、消泡剤などの菌の生育やヘキソキナーゼの生産を促進するものであれば必要に応じて使用できる。
【００２２】
培養は好気的条件で、培養温度は菌が発育し、ヘキソキナーゼが生産する範囲であればよく、通常６５〜８０℃、好ましくは７０〜７５℃である。培養時間は条件により異なるがヘキソキナーゼが最も生産される時間まで培養すればよく、通常８〜２４時間程度である。
またヘキソキナーゼ蛋白質をコードするＤＮＡを得るためには、具体的には以下のように行えばよいが、その操作法のうち常法とされるものは、例えばマニアティスらの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８２，１９８９）や、市販の各種酵素、キット類に添付された手順に従えば実施できるものである。
【００２３】
ヘキソキナーゼを生産する微生物に由来するＤＮＡ（ｔｏｔａｌＤＮＡと略称する）を採取するには、例えばヘキソキナーゼを生産する微生物を培養し、得られる培養菌液から菌体を集菌し、次いでこれを溶菌させることによってヘキソキナーゼ遺伝子を含有する溶菌物を調製する。溶菌方法としては、例えばリゾチームなどの細胞壁溶解酵素による処理が施され、必要によりプロテアーゼなどの他の酵素やラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤が併用され、さらに細胞壁の物理的破壊法である凍結融解（特開昭６３−１８５３７１号公報参照）やフレンチプレス処理を上述の溶菌法と組合せで行ってもよい。
【００２４】
この様にして得られた溶菌物からｔｏｔａｌＤＮＡを分離精製するには、常法に従って、例えばフェノール抽出による除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。
ｔｏｔａｌＤＮＡを分離する菌株としては、ヘキソキナーゼを生産する微生物なら何でもよいが、好ましくはロドサーマス・オバメンシス ＪＣＭ９７８５株を使用すればよい。
【００２５】
分離精製されたｔｏｔａｌＤＮＡを切断する方法は、常法に従って制限酵素処理により行えばよく、特に得られるｔｏｔａｌＤＮＡ断片とベクターとの結合を容易ならしめるため、制限酵素、とりわけ特定ヌクレオチド配列に作用する、例えば、ＳａｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＭｌｕＩなどのＩＩ形制限酵素が適している。
【００２６】
ｔｏｔａｌＤＮＡ断片を組み込むベクターとしては、宿主微生物体内で自律的に増殖しうるファージ又はプラスミドから遺伝子組み換え用として構築されたものが適しており、ファージベクターとしては、例えば、エシェリヒア・コリに属する微生物を宿主微生物とする場合にはλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢなどが使用できる。また、プラスミドベクターとしては、例えば、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＩＮ Ｉ、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋、枯草菌を宿主とする場合にはｐＵＢ１１０、ｐＫＨ３００ＰＬＫ、放線菌を宿主とする場合にはｐＩＪ６８０、ｐＩＪ７０２、酵母特にサッカロマイセス・セレビジアエを宿主とする場合にはＹＲｐ７、ｐＹＣ１、ＹＥｐ１３などが使用できる。
このようなベクターを、ｔｏｔａｌＤＮＡの切断に使用した制限酵素で生成するＤＮＡ末端と、同じ末端を生成する制限酵素で切断してベクター断片を作成し、ｔｏｔａｌＤＮＡ断片とベクター断片とを、ＤＮＡリガーゼ酵素により常法に従って結合させればよい。
【００２７】
ｔｏｔａｌＤＮＡの断片を結合したプラスミドを移入する宿主微生物としては、組み換えＤＮＡが安定かつ自律的に増殖可能であればよく、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリに属する微生物の場合、エシェリヒア・コリ ＤＨ１、エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリ Ｃ６００などが利用できる。また、微生物宿主が枯草菌に属する微生物の場合、バチルス・サチリス ＩＳＷ１２１４など、放線菌に属する微生物の場合、ストレプトマイセス・リビダンス ＴＫ２４など、サッカロマイセス・セルビシエに属する微生物の場合、サッカロマイセス・セルビシエ ＩＮＶＳＣ１などが使用できる。
【００２８】
宿主微生物に組み換えＤＮＡを移入する方法としては、例えば、宿主微生物がエシェリヒア・コリやサッカロマイセス・セルビシエ、ストレプトマイセス・リビダンスに属する微生物の場合には、常法に従ってコンピテントセル化した宿主菌株に組み換えＤＮＡの移入を行えばよく、菌株によっては電気穿孔法を使用してもよい。
【００２９】
宿主微生物への目的組み換えＤＮＡ移入の有無についての選択は、上記方法により組み換えＤＮＡを移入した宿主微生物により作成した遺伝子ライブラリーから、３２Ｐや蛍光体などでラベルした、ヘキソキナーゼの部分アミノ酸配列を基に設計し、あらかじめ合成したヘキソキナーゼのＤＮＡプローブで、コロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションなどを行うことによりポジティブ株を選択し、この株を目的の形質転換体とすればよい。
【００３０】
形質転換体からのヘキソキナーゼ遺伝子を含むＤＮＡの分離は、常法に従って行えばよい。上述の方法によって得られたヘキソキナーゼ遺伝子のＤＮＡの塩基配列は、ジデオキシ法（Ｓａｎｇａｒ，Ｆ．（１９８１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１２０５−１２１０）で解読すればよく、またヘキソキナーゼを構成するポリペプチドの全アミノ酸配列は、塩基配列より予測決定できる。
この様にして一度選択された組み換えＤＮＡは、該組み換えＤＮＡを保持する形質転換微生物から取り出され、他の宿主微生物に移入することも容易に実施できる。
また、さらに、該組み換えＤＮＡから制限酵素などにより切断してヘキソキナーゼを構成するポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを切り出し、前記と同様な方法により切断して得られる他の開環ベクターの末端に結合させて新規な特徴を有する組み換えＤＮＡを作製して、他の宿主微生物に移入することも容易に実施できる。
【００３１】
かくして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地に培養されることによりヘキソキナーゼを産生し得るが、宿主微生物によってはヘキソキナーゼ遺伝子を移入するだけではヘキソキナーゼ生産性を有しない場合がありうる。このような場合、得られたヘキソキナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、ゾラーの方法による部位特異的変異法（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３６７）による制限酵素認識部位の作製や、制限酵素による切り出しなどにより適切な形態で分離し、該宿主微生物に適合する遺伝子プロモーター下流にヘキソキナーゼ遺伝子を結合したＤＮＡを組み込んだプラスミドにより、新たな形質転換体を作成し、ヘキソキナーゼを産生させればよい。
【００３２】
例えば、上記宿主微生物がエシェリヒア・コリに属する微生物の場合、ヘキソキナーゼ遺伝子を接続する遺伝子プロモーターとしては、ｌａｃＺプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子プロモーター（特開平１−１４４９７６号公報）などが例示され、これらのプロモーターの下流にリボソーム結合部位を介在して、開始コドンＡＴＧやＧＴＧを有するヘキソキナーゼ構造遺伝子を接続し、大腸菌を宿主とするベクターに組み込み、かくのごとくして作成されたプラスミドで大腸菌を形質転換すればよい。
【００３３】
上記の遺伝子操作に一般的に使用される量的関係は、供与微生物からのＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡを０．１〜１０μｇに対し、制限酵素を約１〜１０ｕ、リガーゼ約３００ｕ、その他の酵素約１〜１０ｕ、程度が例示される。
【００３４】
また、本発明のヘキソキナーゼは公知の遺伝子操作手段により、本来の反応を触媒する性質を損なわないペプチドの変異をなしてもよく、このような変異体ヘキソキナーゼ遺伝子は、本発明のヘキソキナーゼ遺伝子から遺伝子工学的手法により作製される人工変異遺伝子を意味し、この人工変異遺伝子は前出の部位特異的変異法や、目的遺伝子の特定ＤＮＡ断片を人工変異ＤＮＡで置換するなどの種々なる遺伝子工学的方法を使用して得られる。かくして取得された人工変異ヘキソキナーゼ遺伝子をベクターに挿入して宿主微生物に移入させることによって変異体ヘキソキナーゼを発現させることが可能であり、優れた性質を有する変異体ヘキソキナーゼができればそれを製造することも可能である。
【００３５】
ヘキソキナーゼ遺伝子を含み、ヘキソキナーゼを産生し得る形質転換微生物の具体的な例示としては、エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９株にヘキソキナーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐｃＨＫＲ２（その制限酵素地図を図９に示した）を導入した形質転換微生物が挙げられる。
【００３６】
また形質転換微生物により該ヘキソキナーゼを製造するに当たっては、該形質転換微生物を栄養培地で培養して菌体内又は培養液中に該ヘキソキナーゼを産生せしめ、培養終了後、得られた培養物を濾過又は遠心分離などの手段により菌体を採集し、次いでこの菌体を機械的方法又はリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、又、必要に応じてＥＤＴＡ及び／又は適当な界面活性剤などを添加して該ヘキソキナーゼの水溶液を濃縮するか、又は濃縮する事なく硫安分画、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーにより処理して、純度のよい該ヘキソキナーゼを得ることができる。
【００３７】
形質転換微生物の培養条件はその栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すれば良く、通常多くの場合は、液体培養で行うが、工業的には深部通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用されうる。
炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコース、サッカロース、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖蜜などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であれば良く、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物などが使用される。
その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００３８】
培養温度は微生物が発育し、ヘキソキナーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリの場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養条件は、条件によって多少異なるが、ヘキソキナーゼが最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、エシェリヒア・コリの場合、通常は１２〜４８時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し、ヘキソキナーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリの場合、好ましくはｐＨ６〜８程度である。
【００３９】
ヘキソキナーゼは主としてその菌体内に含有、蓄積されており、その菌体内から抽出すればよい。ヘキソキナーゼの抽出法を例示すればまず培養物を固液分離し、得られた湿潤菌体をリン酸緩衝液やトリス−塩酸緩衝液などの溶液に分散し、リゾチーム処理、超音波処理、フレンチプレス処理、ダイノミル処理などの菌体破砕手段を適宜選択組み合わせて、粗製のヘキソキナーゼ含有液を得る。
【００４０】
粗製のヘキソキナーゼ含有液から公知の蛋白質や酵素などの単離、精製手段を用いて精製ヘキソキナーゼを得る。例えば、粗製のヘキソキナーゼ含有液にアセトン、メタノール、エタノールなどの有機溶媒による分別沈殿法、硫酸アンモニウム、食塩などによる塩析法などを適用してヘキソキナーゼを沈殿させ、回収する。さらに、この沈殿物を必要に応じて透析、等電点沈殿を行った後、電気泳動法などで単一の帯を示すまで、イオン交換体、ゲルろ過剤、吸着体などを用いるカラムクロマトグラフィーなどにより精製する。また、これらの方法を適当に組み合わせることによりヘキソキナーゼの精製度が上がる場合は適宜組み合わせて行うことができる。
【００４１】
これらの方法によって得られる酵素は安定化剤として、各種の塩類、糖類、タンパク質、脂質、海面活性化剤などを加え、あるいは加えることなく、限外ろ過濃縮、凍結乾燥などの方法により、液状または固形のヘキソキナーゼを得ることができ、また、適宜凍結乾燥を行ってもよく、この場合安定化剤としてサッカロース、マンニトール、食塩、アルブミンなどを０．５〜１０％程度添加してもよい。
【００４２】
つぎに本発明で得られるヘキソキナーゼの理化学的性質および酵素活性測定法を述べる。
ヘキソキナーゼの酵素活性測定法
測定試薬
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）
２０ｍＭ グルコース
４ｍＭ ＡＴＰ
１０ｍＭ ＭｇＣｌ2
１ｍＭ ＮＡＤＰ
５Ｕ／ｍｌ グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）（東洋紡社製）
【００４３】
測定試薬１ｍｌを光路長１ｃｍのセルに入れ３７℃で５分間予備加温した後、０．０２ｍｌの酵素液添加後０．５分後の波長３４０ｎｍにおける吸光度（Ａａ）と酵素液添加後１．５分後の吸光度（Ａｂ）を測定する。この吸光度（Ａａ）と（Ａｂ）の吸光度差（Ａｂ−Ａａ）より酵素活性を求める。なお、吸光度（Ａｂ）が０．２以上になる時は酵素液を５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で希釈して測定するものとする。酵素活性１単位は３７℃で１分間に１μモルの還元型ＮＡＤＰを生成させる酵素量とし、計算式は下記の通りである。
酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝（Ａｂ−Ａａ）×８．１×酵素の希釈倍率
【００４４】
理化学的性質
（１）酵素作用
基質としてグルコースを用いたときの酵素作用を以下に示す。
【００４５】
【化４】
（２）Ｋｍ値
本発明のヘキソキナーゼ（以下、本発明ヘキソキナーゼもしくは本発明ＨＫともいう）、酵母由来ヘキソキナーゼ（オリエンタル酵母社製、以下、酵母由来ＨＫともいう）、バチルス・ステアロサーモフィルス由来グルコキナーゼ（ユニチカ社製、以下、バチルス由来ＧＫともいう）、サーモトーガ・ネアポリタナ ＤＳＭ４３５９［サーモトーガ・ネアポリタナ（ＤＳＭ４３５９）菌株由来ＨＫともいう］およびエアロパイラム・ペルニクス ＪＣＭ９８２０［エアロパイラム・ペルニクス（ＪＣＭ９８２０）菌株由来ＨＫともいう］のグルコースおよびＡＴＰに対するＫｍ値は表１の通りである。
【００４６】
【表１】
【００４７】
（３）基質特異性
本発明ヘキソキナーゼ、酵母由来ＨＫおよびバチルス由来ＧＫの各種糖類に対する特異性は表２の通りである。本酵素はグルコースに対して最も高い反応性を示し、フルクトースには全く作用しない点で酵母由来の酵素とは異なり、また、１，５−アンヒドログルシトールに対する反応性がバチルス由来の酵素の７．５倍であることからバチルス由来酵素とも異なっていた。
【００４８】
【表２】
【００４９】
（４）リン酸基供与体
本発明ヘキソキナーゼの各種リン酸基供与体に対する特異性は表３の通りである。
【００５０】
【表３】
【００５１】
（５）等電点
５．０±０．２（キャリアーアンフォライを用いた電気泳動法にて）
【００５２】
（６）分子量
１１５，０００±５，０００（ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷＸＬを用いたゲルろ過法にて）
（７）至適ｐＨ
前記酵素活性測定法にしたがって至適ｐＨを求めたもので、その結果を図１に示した。ｐＨ４．５〜５．５の範囲は１００ｍＭの酢酸緩衝液（図中、○）、ｐＨ５〜６の範囲は１００ｍＭのクエン酸緩衝液（図中、□）、ｐＨ６〜７．５の範囲は１００ｍＭのリン酸緩衝液（図中、△）、ｐＨ７．５〜９の範囲は１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（図中、●）、ｐＨ９．５〜１０の範囲は１００ｍＭのグリシン緩衝液（図中、■）を使用した場合の活性値を示すもので、至適ｐＨは７．５〜９にあった。
【００５３】
（８）ｐＨ安定性
１Ｕ／ｍｌの本発明ヘキソキナーゼを１００ｍＭの各種緩衝液中で３７℃、１時間処理し、その残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。その結果を図２に示した。ｐＨ４．５〜５．５の範囲は１００ｍＭの酢酸緩衝液（図中、○）、ｐＨ５〜６の範囲は１００ｍＭのクエン酸緩衝液（図中、□）、ｐＨ６〜７．５の範囲は１００ｍＭのリン酸緩衝液（図中、△）、ｐＨ７．５〜９の範囲は１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（図中、●）、ｐＨ９．５〜１０の範囲は１００ｍＭのグリシン緩衝液（図中、■）を使用した。ｐＨ４．５〜１０の範囲で良好な安定性を示した。
【００５４】
（９）至適温度
前記酵素活性測定法に従って、温度３７〜９５℃の範囲で変化させて至適温度をもとめた結果は図３に示す通りであり、本酵素の至適温度は測定の範囲内においては９５℃であった。
（１０）熱安定性
０．５Ｕ／ｍｌの本発明ヘキソキナーゼを１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）中で各温度で１０分間加熱処理した後の残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。その結果、図４に示す通り、少なくとも８０℃、１０分間処理における残存活性が少なくとも８０％以上を示す安定なものであった。
【００５５】
（１１）各種２価の金属イオンの活性におよぼす影響
前記酵素活性測定法においてマグネシウムイオンの代わりに各種２価の金属イオンを添加して活性測定を行った結果を表４に示した。
【００５６】
【表４】
その結果、本発明ヘキソキナーゼはマグネシウムイオンによって最も強く活性化され、コバルトイオン、マンガンイオンによって少し活性化され、ニッケルイオンによってわずかに活性化を受けた。
（１２）各種金属イオンおよび阻害剤の影響
各種１価の金属イオンおよび阻害剤の影響を表５に示した。
【００５７】
【表５】
その結果、検討を行った金属イオンおよび阻害剤で影響を受けるものは無かった。尚、表中ＡＰ5 ＡはＰ1 ，Ｐ5 −ジ（アデノシン−５’）ペンタリン酸（シグマ社製）、ＮＡＣはＮ−アセチル−Ｌ−システイン（シグマ社製）を示す。
また以上の結果から、、クルベルマイセス属由来のヘキソキナーゼは、分子量が６０，０００で、グルコースに対する活性を１００とした時のフルクトースに対する相対活性が１８９．４％であり、明らかに本発明ヘキソキナーゼとは異なる性質のものである。
【００５８】
【発明実施の形態】
以下、本発明の実施例を詳しく述べるが、本発明は何らこれらにより限定されるものではない。なお、実施例中、常法に従い、と記述した遺伝子操作技術は、例えば前出のマニアティスらの方法や、市販の各種酵素、キット類に添付された手順に従えば実施できるものである。また、実験に使用した組み換えＤＮＡ実験酵素試薬（制限酵素など）、ベクターＤＮＡ、キット類は特に指摘しない限り宝酒造株式会社より購入したものである。
【００５９】
【実施例１】
＜ロドサーマスの培養＞
ロドサーマス・オバメンシス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ） ＪＣＭ９７８５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３８４）菌株をトリプティカーゼペプトン（ＢＢＬ社製）を０．４％、酵母エキス（ディフコ社製）を０．４％、ジャマリンＳ（ジャマリン ラボラトリー社製）１００ｍｌ、ニトリロトリ酢酸を０．１５％、ＭｎＳＯ4 ・Ｈ2 Ｏを０．０５％、ＦｅＳＯ4 を０．１４％、ＮｉＣl 2 を０．０２％、ＣｏＳＯ4 を０．０１％、ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏを０．０１％、ＣｕＳＯ4 を０．００１％、Ｎａ2 ＷＯ4 ・２Ｈ2 Ｏを０．０００３％、Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏを０．００１％からなる培地（ｐＨ７．０）を５００ｍｌの三角フラスコ２本に分注したものに接種し、７５℃、１５時間培養し、得られた種培養液を上記と同一組成培地に消泡剤を加えた培地２０Ｌに添加し、７５℃で１５時間培養した。培養終了後、培養物を４，５００ｒｐｍで３０分間、遠心し、菌体０．４３ｋｇを回収した。
【００６０】
【実施例２】
＜ヘキソキナーゼの精製法＞
この菌体を５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、全量を２，０００ｍｌとした後、超音波破砕装置を用いて、氷中で３０分間超音波処理を行った。その後、７，５００ｒｐｍで２０分間、遠心分離して不溶物を除去して、その上清１，８００ｍｌ（７５０Ｕ）を得た。
ついでこの上清を１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）にて、１５時間透析し、ＤＥＡＥ−セファロース・ファーストフロー（２．７×３０ｃｍ）（ファルマシア社製）イオン交換クロマトグラフィを行った。溶出はＮａＣｌの０〜１Ｍのリニアグラジエントにより行い、０．２Ｍ〜０．３ＭのＮａＣｌの溶出画分（６００Ｕ）を回収した。この酵素液に１５％（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 の濃度となるように（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 を溶解し、フェニルセファロース・ファーストフロー（２．７×１９．５ｃｍ）（ファルマシア社製）の疎水クロマトグラフィーを行った。溶出は１５％〜０％の（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 のリニアグラジエントにより行い、５〜２％の（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 の溶出画分（４５０Ｕ）を回収した。
【００６１】
ついで、この酵素液を１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）にて１５時間透析し、Ｑ−セファロース・ファーストフロー（２．７×１９．５ｃｍ）（ファルマシア社製）のイオン交換クロマトグラフィを行った。溶出は０〜０．５ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントにより行い、０．２〜０．３ＭのＮａＣｌの溶出画分（３２０Ｕ）を回収した。さらに、この酵素液を１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて１５時間透析し、ハイドロキシアパタイト（ペンタックス社製）（１．６×２６．５ｃｍ）クロマトグラフィーを行った。溶出は０〜０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）によるリニアグラジエントにより行い、０．０３〜０．０４Ｍのリン酸緩衝液の溶出画分（２４０Ｕ）を回収し、精製ヘキソキナーゼを得た。
【００６２】
【実施例３】
＜本発明ヘキソキナーゼの保存安定性＞
本発明ヘキソキナーゼ、酵母由来ヘキソキナーゼおよびバチルス・ステアロサーモフィルス由来グルコキナーゼを各０．５Ｕ／ｍｌ濃度で５０ｍＭのイミダゾール緩衝液（ｐＨ６．７）中で４℃および２５℃、８週間保存し、残存活性を前記活性測定法により測定した。その結果を図５（４℃における保存安定性）および図６（２５℃における保存安定性）に示した。（図中、○は本発明ヘキソキナーゼ、□は酵母由来ヘキソキナーゼ、△はバチルス・ステアロサーモフィルス由来グルコキナーゼを示す）。４℃の保存では酵母由来ヘキソキナーゼおよびバチルス・ステアロサーモフィルス由来グルコキナーゼは８週間の保存で残存活性が約４０％まで低下したが、本発明ヘキソキナーゼは９５％以上の残存活性を示した。また２５℃の保存ではバチルス・ステアロサーモフィルス由来グルコキナーゼは４週間で、酵母由来のヘキソキナーゼは６週間で残存活性が０％になったが、本発明ヘキソキナーゼは６週間後でも８０％以上の残存活性を示した。
【００６３】
【実施例４】
＜ヘキソキナーゼのＮ末端アミノ酸配列の解析＞
実施例２により得られた精製ヘキソキナーゼのＮ末端アミノ酸配列を、エドマン分解法により決定した。決定されたＮ末端アミノ酸配列は、配列表の配列番号１のアミノ酸配列の１から４０で表される。
【００６４】
【実施例５】
＜放射性ＤＮＡプローブの作製＞
判明した部分アミノ酸配列をコードするヘキソキナーゼ遺伝子の塩基配列を予想した。この配列を基に設計されるオリゴヌクレオチドプローブには無数の形状があるが、本発明ではそのうち、配列表の配列番号２で表される塩基配列を有するＨＫ３と命名したオリゴヌクレオチドを使用した。
【００６５】
このオリゴヌクレオチドを外部機関（ベックス社）に合成依託して作成し、完成したオリゴヌクレオチド２００ｎｇをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼバッファー（５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭの２−メルカプトエタノール）、及び７４０ｋＢｑ（キロベクレル）の［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（第一化学薬品社販売）存在下、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ ８．５ｕで３７℃、３０分間反応せしめ、ラジオアイソトープ３２Ｐを取り込ませ放射性オリゴヌクレオチドプローブとした。
【００６６】
【実施例６】
＜ロドサーマス・オバメンシスからのＤＮＡの抽出＞
実施例１で培養したロドサーマス・オバメンシス ＪＣＭ９７８５株の菌体を５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＥＤＴＡ、１５％シュークロースを含む１ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液で３７℃、１０分処理した後、ＳＤＳを最終濃度０．２５％になるよう添加して菌体を溶解した。さらに等量のフェノール／クロロホルム＝１：１混合液を加え、３０分攪拌した後、１２，０００ｒｐｍで１５分遠心分離処理をして水層を回収した。
【００６７】
回収した水層に１０分の１量の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を混合後、２倍量のエタノールを静かに重層し、ゲノムＤＮＡをガラス棒に巻き付かせて分離した。分離したゲノムＤＮＡを、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ水溶液（ＴＥバッファー）２０ｍｌに溶解し、２０ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを２００μｌ加え、３７℃で１時間保温し、混在しているＲＮＡを分解した。次いで、等量のフェノール／クロロホルム混合液を加え、前記と同様に処理して、水層を分取した。分取した水層に１０分の１量の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）と２倍量のエタノールを加えて前記の方法でもう一度ゲノムＤＮＡを分離した。
【００６８】
この染色体を５０ｍｌのＴＥ（１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））に溶解し、ＴＥ飽和のフェノールとクロロホルムの１対１混和液２０ｍｌを加え、全体を懸濁した後、同様の遠心分離を繰り返し、上層を再び別の容器に移した。この分離した上層２０ｍｌに３Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）２ｍｌとエタノール５０ｍｌを加え、撹拌後−７０℃で５分間冷却した後、遠心分離（２，０００Ｇ、４℃、１５分）し、沈澱した染色体を７５％ エタノールで洗い、減圧乾燥した。
以上の操作によりロドサーマス・オバメンシス ＪＣＭ９７８５株の染色体標品１ｍｇを得た。
【００６９】
【実施例７】
＜ヘキソキナーゼ遺伝子含有ＤＮＡフラグメントの検定＞
実施例６の操作で得られたロドサーマス・オバメンシス ＪＣＭ９７８５株の染色体ＤＮＡから遺伝子ライブラリーを作成するため、本染色体を各種制限酵素で切断し、目的遺伝子が含有されるＤＮＡフラグメントの鎖長を検定する操作を行った。即ち、ロドサーマス・オバメンシス ＪＣＭ９７８５株の染色体ＤＮＡ（１０μｇ）を各種制限酵素で切断し、１．５％アガロースゲル（宝酒造社製Ｈ１４、４０ｍＭのトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７．４）、２ｍＭのＥＤＴＡ）で１５０Ｖ、１．５時間電気泳動し、常法に従ってサザンブロッティングを行い、アガロースゲルからナイロンメンブレン（ＰＡＬＬ社製：バイオダインＡ）にＤＮＡを移行させた。
【００７０】
このメンブレンを風乾後、ナイロンメンブレン添付のマニュアルに従ってプレハイブリダイゼーションを行い、さらに実施例５で作成したＨＫ３放射性プローブを使用したハイブリダイゼーションを４５℃で１晩行った。ハイブリダイゼーション後、メンブレンを５５℃の洗浄液（６×ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム〔１×ＳＳＣ：０．１５Ｍの塩化ナトリウム，１５ｍＭのクエン酸ナトリウム〕：メンブレン１００平方ｃｍ当り約５０ｍｌ）で１０分洗った後、メンブレンを自然乾燥した。この乾燥したメンブレンをＸ線フィルム（富士写真フィルム社製 Ｎｅｗ ＲＸＯ−Ｈ）に重ね、遮光下、−７０℃で２４時間オートラジオグラフィーを行った。
【００７１】
オートラジオグラフィー終了後、フィルムを現像し、各制限酵素による切断染色体が示すポジティブバンドのサイズを観察した。
その結果、ＥｃｏＲＩ切断により約４ｋｂ（キロベース：ＤＮＡ鎖長の単位、１，０００塩基対）のＤＮＡフラグメント上にヘキソキナーゼ遺伝子が含有されることが明らかとなり、ＥｃｏＲＩで切断した染色体ＤＮＡの４ｋｂフラグメントから遺伝子ライブラリーを作成することとした。
【００７２】
【実施例８】
＜遺伝子ライブラリーの作成＞
実施例６の操作で得られたロドサーマス・オバメンシス ＪＣＭ９７８５株の染色体ＤＮＡ１０μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、常法に従い約４ｋｂのＤＮＡフラグメントを分離した。このＤＮＡフラグメントを、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断しアルカリフォスファターゼ（以下ＢＡＰと略称）１ｕで切断末端を脱リン酸化したｐＵＣ１１９ １μｇと、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）で連結させた。これを用いて、常法に従ってコンピテント細胞としたエシェリヒア・コリ ＪＭ１０９（東洋紡績社製）（ｒｅｃＡ１，△（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ），ｅｎｄＡ１，ｇｙｒＡ９６，ｔｈｉ−１，ｈｓｄＲ１７，ｒｅｌＡ１，ｓｕｐＥ４４，〔Ｆ’ｔｒａＤ３６，ｐｒｏＡＢ，ｌａｃｌｑＺ△Ｍ１５〕）をトランスフォーメーションし、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ（バクトトリプトン（ＤＩＦＣＯ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製）５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／ｌ）１．５％寒天平板培地にて一夜培養し、約２，６００個のアンピシリン耐性コロニーを得、遺伝子ライブラリーとした。
【００７３】
【実施例９】
＜ヘキソキナーゼ遺伝子含有クローンのスクリーニング＞
実施例８により得た遺伝子ライブラリーを、ナイロンメンブレン（ＰＡＬＬ社製：バイオダインＡ）にレプリカし、このフィルターに添付のマニュアルに従って菌体のＤＮＡを固定した。
このフィルターを添付のマニュアルに従ってプレハイブリダイゼーションおよび、実施例５で調製したＨＫ３プローブを使用したハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション後、メンブレンを実施例７に示した５５℃の洗浄液で１０分洗った後メンブレンを自然乾燥した。この乾燥メンブレンをＸ線フィルムに重ね、遮光下、−７０℃で２４時間オートラジオグラフィーを行った。
オートラジオグラフィー終了後、フィルムを現像し、ポジティブシグナルをしめすコロニーを４個確認した。
【００７４】
【実施例１０】
＜組み換えプラスミドの抽出＞
実施例９で選ばれたポジティブシグナルを示すコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ液体培地１．５ｍｌに植菌し３７℃で１６時間振盪培養した後、常法に従ってプラスミドを抽出した。その結果、４つのコロニーより抽出されたプラスミドは同じ染色体ＤＮＡ断片を含むものであり、このプラスミドのうちの１つをｐｃＨＫＲ１と命名した。
【００７５】
【実施例１１】
＜ヘキソキナーゼ遺伝子塩基配列の決定＞
実施例１０で得られたプラスミドｐｃＨＫＲ１より、ヘキソキナーゼ構造遺伝子部分についてジデオキシ法により塩基配列を決定した。
【００７６】
【実施例１２】
＜ヘキソキナーゼ発現プラスミドの構築＞
ｐｃＨＫＲ１にゾラーらの部位特異的変異法により変異を行い、ヘキソキナーゼ構造遺伝子上流に制限酵素ＸｂａＩ認識部位とリボソーム結合部位を、下流部に制限酵素ＳａｃＩ認識部位を作製した。ヘキソキナーゼの構造遺伝子とその変異した上流と下流域の塩基配列、およびヘキソキナーゼ構造遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示した。変異したｐｃＨＫＲ１をＸｂａＩとＳａｃＩで切断し、ヘキソキナーゼの構造遺伝子を含む約１ｋｂのＤＮＡ断片を分離した。これをｐＵＣ１１９のＸｂａＩとＳａｃＩの切断部位に挿入し、ｐＵＣ１１９のｌａｃプロモーター下流にＳＤ配列とヘキソキナーゼ遺伝子が連結されたプラスミドを構築し、本プラスミドをｐｃＨＫＲ２と命名した。プラスミドｐｃＨＫＲ２の構造を図９に示す。なお、図中の「ｈｋ」はヘキソキナーゼ構造遺伝子を、「ａｐ」はアンピシリン耐性構造遺伝子を、「ｏｒｉ」は大腸菌プラスミドの複製起点領域を、「ｌａｃ」はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子プロモーター領域をそれぞれ表す。このｐｃＨＫＲ２をエシェリヒア・コリ ＪＭ１０９株に導入した。
【００７７】
【実施例１３】
＜ｐｃＨＫＲ２保持大腸菌の培養とその細胞抽出液の調製＞
ｐｃＨＫＲ２を導入したエシェリヒア・コリ ＪＭ１０９株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンとｌａｃプロモーター誘導剤である１ｍＭのＩＰＴＧ（和光純薬社製）を含有した３．７％ＢＨＩ（ＤＩＦＣＯ社製）液体培地１．５ｍｌで３７℃、１６時間培養し、そのうち１ｍｌを遠心分離（１５，０００Ｇ、１分、４℃）により集菌し、２００μｌの１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、超音波破砕機を用いて菌体を破砕した後、遠心分離（１４，０００Ｇ、５分、４℃）し、上清を取得して細胞抽出液とした。同様に、ヘキソキナーゼ遺伝子を含まないクローニングベクターｐＵＣ１１９により形質転換されたエシェリヒア・コリ ＪＭ１０９の抽出液も調製した。
【００７８】
【実施例１４】
＜細胞抽出液中のヘキソキナーゼ酵素活性の確認＞
実施例１３で調製したエシェリヒア・コリ ＪＭ１０９・ｐｃＨＫＲ２、およびエシェリヒア・コリ ＪＭ１０９・ｐＵＣ１１９の細胞抽出液中のヘキソキナーゼ酵素活性を、参考例１の方法に従って測定した。その結果、エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９・ｐｃＨＫＲ２では、培養液１ｍｌあたり０．１ユニットの活性が検出され、ｐＵＣ１１９を導入したエシェリヒア・コリ ＪＭ１０９には活性は検出されなかった。これによりｐｃＨＫＲ２を導入したエシェリヒア・コリＪＭ１０９でのヘキソキナーゼの活性発現が確認された。以上の方法で作成した本発明組み換え体ヘキソキナーゼを実施例２の方法で精製し諸性質を測定したところ、天然物ヘキソキナーゼと同じ性質を有することが確認された。
【００７９】
【参考例１】
＜本発明ヘキソキナーゼを用いたグルコースの定量＞
測定試薬
５０ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
４ｍＭ ＡＴＰ
１０Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ ＮＡＤＰ
１０ｍＭ ＭｇＣｌ2
１０Ｕ／ｍｌ 本発明ヘキソキナーゼ
【００８０】
測定方法
グルコースを０．４ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭの水溶液に調整し、グルコースサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌにグルコースサンプル０．０５ｍｌ加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブランクを対照に測定した。図７に示すようにグルコースが定量的に測定できた。
【００８１】
【参考例２】
＜本発明ヘキソキナーゼを用いたマグネシウムの定量＞
測定試薬
５０ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
４ｍＭ ＡＴＰ
１０Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ ＮＡＤＰ
２０ｍＭ グルコース
１０Ｕ／ｍｌ 本発明ヘキソキナーゼ
【００８２】
測定方法
塩化マグネシウムを５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭの水溶液に調整し、塩化マグネシウムサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌに塩化マグネシウムサンプル０．０１ｍｌ加え、３７℃、２分間〜３分間後の３４０ｎｍの吸光度差を試薬ブランクを対照に測定した。図８に示すようにマグネシウムが定量的に測定できた。
【００８３】
【参考例３】
＜サーモトーガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ・ｎａｐｏｌｉｔａｎａ；ＤＳＭ４３５９）菌株由来ＨＫの取得方法＞
０．１％ 酵母エキス
０．５％ トリプトン
０．７２％ マルトース
２．３９％ ＮａＣｌ
０．４％ Ｎａ2 ＳＯ4
０．０７％ ＫＣｌ
０．０２％ ＮａＨＣＯ3
０．０１％ ＫＢｒ
０．０３％ Ｈ3 ＢＯ4
１．０８％ ＭｇＣｌ2
０．１５％ ＣａＣｌ2
０．００２５％ ＳｒＣｌ2
０．０２５％ ＮＨ4 Ｃｌ
０．０１４％ Ｋ2 ＨＰＯ4
０．１％ ＣＨ3 ＣＯＯＮａ
０．００１５％ Ｎ（ＣＯＯＨ）3
０．０００５％ ＭｎＳＯ4
０．００１４％ ＦｅＳＯ4
０．０００２％ ＮｉＣｌ2
０．０００１％ ＣｏＳＯ4
０．０００１％ ＺｎＳＯ4
０．００００１％ ＣｕＳＯ4
０．０００００１％ Ｎａ2 ＷＯ4
０．０００００１％ Ｎａ2 ＭｏＯ4
０．１％ システイン塩酸塩
【００８４】
上記培地成分を含む液体培地（ｐＨ７．５）５００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコ２本に分注し、１２０℃、２０分間、加熱滅菌した後、これにサーモトーガ・ネアポリタナ株の菌体懸濁液１０ｍｌを移植し、攪拌させながら、９５℃で２０時間培養を行った。得られた培養液を８，０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離を行い、５ｇの湿潤菌体を得た。この菌体を１０ｍｌの１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、超音波破砕により、菌体破砕を行った。得られた菌体破砕液を１５，０００ｒｐｍ、３０分間、遠心分離を行った後、１０Ｌの１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に２０時間透析し、粗酵素液とした（６．５Ｕ、１０ｍｌ）。
【００８５】
【参考例４】
＜エアロパイラム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ・ｐｅｒｎｉｘ；ＪＣＭ９８２０）菌株由来ＨＫの取得方法＞
培地組成
０．１％ バクトイストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）
０．１％ トリプチカーゼペプトン（ＢＢＬ社製）
０．１％ チオ硫酸ナトリウム
１Ｌ 人工海水（Ｊａｍａｒｉｎ Ｓ、ジャマリンラボラトリー社製）
【００８６】
上記培地成分を含む液体培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを５００ｍｌ容の坂口フラスコ２０本に分注し、１２０℃、２０分間、加熱滅菌した後、これにエアロパイラム・ペルニクス菌株を移植し、振盪させながら９０℃で２０時間培養を行った。得られた培養液を８，０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離を行い、４．２ｇの湿潤菌体を得た。この菌体を１０ｍｌの１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、超音波破砕により、菌体破砕を行った。得られた菌体破砕液を１５，０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離を行った後、１０Ｌの１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に２０時間透析し、粗酵素液を得た（４．５Ｕ、１０ｍｌ）。
【００８７】
【発明の効果】
本発明により、新規なヘキソキナーゼおよびロドサーマス属に属する微生物よるヘキソキナーゼの新規な製造法を提供できるものであり、本酵素を用いるグルコースまたはＣＰＫの測定用酵素をして提供できた。
【００８８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のヘキソキナーゼの至適ｐＨ曲線を示すものである。
【図２】本発明のヘキソキナーゼのｐＨ安定曲線を示すものである。
【図３】本発明のヘキソキナーゼの至適温度曲線を示すものである。
【図４】本発明のヘキソキナーゼの熱安定曲線を示すものである。
【図５】本発明ヘキソキナーゼおよび従来のヘキソキナーゼの４℃における保存安定曲線を示すものである。
【図６】本発明ヘキソキナーゼおよび従来のヘキソキナーゼの２５℃における保存安定曲線を示すものである。
【図７】本発明ヘキソキナーゼを用いたグルコースの定量曲線を示すものである。
【図８】本発明ヘキソキナーゼを用いたマグネシウムの定量曲線を示すものである。
【図９】本発明プラスミドヘキソキナーゼ遺伝子の発現プラスミドｐｃＨＫＲ２の制限酵素地図を示すものである。
Claims (6)
- ２５℃、６週間の５０ｍＭのイミダゾール緩衝液（ｐＨ６．５）中保存において、少なくとも８０％以上の残存活性を有し、かつ次の理化学的性質（１）〜（６）を有するヘキソキナーゼ
（１）作用
グルコースを基質として用いたときの反応式が下記の通りである。
ｐＨ７．５〜８．５（トリス−塩酸緩衝液）のｐＨ範囲に至適ｐＨを持つ。
（３）熱安定性
８０℃、１０分間の熱処理後の残存活性が少なくとも８０％以上である。
（４）基質特異性
フルクトースに対して実質的に作用しない。グルコース（２０ｍＭ）に対する反応性を１００としたときに、１,５−アンヒドログルシトール（２０ｍＭ）に対する反応性が１５である。
（５）至適温度
９５℃
（６）分子量
１１５，０００±５，０００（ゲルろ過法にて計測される分子量）。 - ヘキソキナーゼが配列表の配列番号１の１から３３２のアミノ酸配列を有するヘキソキナーゼである、請求項１に記載のヘキソキナーゼ。
- 請求項２に記載のヘキソキナーゼをコードするＤＮＡ。
- 請求項２に記載の外来性のヘキソキナーゼの生産能を有することを特徴とする実質的に純粋な遺伝子組み換え微生物。
- ロドサーマス属に属する請求項２に記載のヘキソキナーゼ生産菌、または請求項２に記載の外来性のヘキソキナーゼの生産能を有することを特徴とする実質的に純粋な遺伝子組み換え微生物を培地に培養し、その培養物から当該ヘキソキナーゼを採取することを特徴とする請求項２に記載のヘキソキナーゼの製造法。
- ロドサーマス属に属するヘキソキナーゼ生産菌が、ロドサーマス・オバメンシス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ） ＪＣＭ９７８５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３８４）菌株である請求項５に記載のヘキソキナーゼの製造法。
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