JP3117709B2

JP3117709B2 - 新規コレステロール・オキシダーゼ

Info

Publication number: JP3117709B2
Application number: JP03515990A
Authority: JP
Inventors: 欣也藤代; 孝之上島
Original assignee: 協和醗酵工業株式会社
Priority date: 1990-04-10
Filing date: 1991-10-09
Publication date: 2000-12-18
Anticipated expiration: 2015-12-18
Also published as: ES2093596T1; JPH04218367A; EP0560983B1; EP0730028A1; EP0452112A1; EP0560983A1; DE730028T1; WO1993007261A1; DE69130259D1; DE69130259T2; EP0560983A4; DK0560983T3; ES2093596T2; ATE171470T1; GR960300069T1

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明は、配列番号１で表わされるペプチド配列を有
し、かつ下記の理化学的性質（ａ）〜（ｉ）を有する新
規コレステロール・オキシダーゼ（以下、コレステロー
ル・オキシダーゼIIと称す。）およびその製造法に関す
る。

背景技術コレステロール・オキシダーゼは、コレステロール
（５−cholesten−３−β−ol）を基質として、酸化反
応により４−コレステン−３−オン（４−cholesten−
３−one）と過酸化水素を生ずる反応を触媒する酵素で
あり、臨床検査薬として、血中コレステロールの定量な
どに用いられる。

コレステロール・オキシダーゼは、シゾフィラム属、
ストレプトベルティシリウム属、ブレビバクテリウム属
およびストレプトマイセス属などに属する微生物によっ
て生産されることが知られており、既にこれらの微生物
を用いて、工業的規模での発酵生産が行われている。

従来、血中コレステロールの定量などに用いられてい
るコレステロール・オキシダーゼは、基質親和性が低
く、含有するコレステロールの濃度が低い試料の分析
や、試料を希釈した後に測定を行う場合の反応の定量性
に問題点があることが指摘されている。また、作用至適
pH域が比較的狭いので、試料中の他の成分、例えばビリ
ルビンなどの影響を回避するために反応pHを酸性側に設
定したとき、反応性の低下の問題があるとされている。
さらに、上記のコレステロール・オキシダーゼ生産菌と
して知られる微生物のコレステロール・オキシダーゼ生
産量はきわめて低く、また精製の段階において、夾雑タ
ンパク質を除去するために、多段階にわたる精製操作が
必要である。

そこで、高い基質親和性と広い作用至適pHを有するコ
レステロール・オキシダーゼ、および夾雑タンパク質な
どの併産が少なく、コレステロール・オキシダーゼ生産
量が高い微生物の開発が望まれている。

発明の開示本発明者は、基質であるコレステロールに対する親和
性が高く、酸性域においても効率よく作用する性質をも
ったコレステロール・オキシダーゼを、工業的に安価
に、しかも高純度に製造する方法について種々検討し
た。その結果、ブレビバクテリウム属に属する菌株よ
り、既知のコレステロール・オキシダーゼとは異なる基
質親和性、作用pH域および等電点を有する、コレステロ
ール・オキシダーゼのイソ酵素の産生に関与する遺伝情
報を担うDNAを単離し、このコレステロール・オキシダ
ーゼ遺伝子を含むDNA断片を組み込んだ組換え体DNAをエ
ッシェリヒア属菌種に導入することによって得られた微
生物を用いることにより、高い基質親和性と広い作用至
適pHを有するコレステロール・オキシダーゼIIを収率よ
く製造できることを見出し、本発明を完成した。

本発明によれば、配列番号４で表わされるペプチド配
列を有し、かつ下記の理化学的性質を有するコレステロ
ール・オキシダーゼIIおよびその製造法を提供すること
ができる。

（ａ）作用：酸素の存在下コレステロールを酸化し、過酸化水素と
４−コレステン−３−オンを生成する反応を触媒する。

（ｂ）等電点:pH4.7 （ｃ）基質特異性：コレステロール、β−シトステロール、スチグマステ
ロール、プレグネノロン、デヒドロイソアンドロステロ
ン、エストラジオールに作用し、ビタミンD₃、コール
酸、アンドロステロン、コレステロールリノレート、ラ
ノステロールは基質としない。

（ｄ）至適pHおよび安定pH範囲：至適pHは5.0〜7.5であり、50℃、60分間の加熱条件下
では、pH5.3〜7.5の範囲で安定である。

（ｅ）作用適温:50℃付近に至適作用温度を有する。

（ｆ）pHおよび温度による失活の条件： 50℃、１時間の加熱条件下では、pH10.0以上またはpH
4.0以下で失活する。また、pH7.0、60℃、１時間の熱処
理で約83％失活する。

（ｇ）阻害および安定化：ｐ−クロロマーキュリベンゼンスルホネート、硝酸
銀、ｏ−ヒドロキシキノリンにより阻害を受ける。ま
た、牛血清アルブミンを共存させることにより、耐熱性
および保存安定性が向上する。

（ｈ）コレステロールに対するミハエリス定数（km
値）:3.0×10^-5M （ｉ）分子量：約43,000（ゲル濾過法）約60,000（電気泳動法） 66,586（アミノ酸配列）。

以下に、本発明を詳細に説明する。

コレステロール・オキシダーゼIIは、従来コレステロ
ール・オキシダーゼ生産菌として知られているブレビバ
クテリウム・ステロリカムATCC21387株（特公昭48−119
0）より新たに分離された酵素であり、従来のATCC21387
株由来のコレステロール・オキシダーゼ（以下コレステ
ロール・オキシダーゼＩと称す）とは、以下のような点
で性質の異なる新規酵素である。

（１）等電点：コレステロール・オキシダーゼIIがpH4.7であるのに
対し、コレステロール・オキシダーゼＩはpH8.9であ
る。

（２）基質特異性：コレステロール・オキシダーゼＩおよびIIの基質特異
性を第１表に示す。

（３）作用至適pH: コレステロール・オキシダーゼIIがpH5.0〜7.5である
のに対し、コレステロール・オキシダーゼＩはpH6.0〜
7.5である。

（４）コレステロールに対するミハエリス定数（km
値）：コレステロール・オキシダーゼIIが3.0×10^-5Mである
のに対し、コレステロール・オキシダーゼＩは1.1×10
^-3Mである。

（５）阻害剤の影響：阻害剤（1mM）を添加したときのコレステロール・オ
キシダーゼＩおよびIIの酵素活性を、阻害剤無添加時の
酵素活性を100とし、第２表に示す。

（６）分子量：東洋曹達社製TSK G3000SW塔を用いて分析したとこ
ろ、その溶出パターンから、43,000と推定される。また
SDS−PAGEを用いて分析したところ、その移動度から60,
000と推定される。DNA配列から計算された分子量は66,5
86である。これに対し、コレステロール・オキシダーゼ
Ｉの場合は、ファルマシア社製セファデックスゲルろ過
担体を用いた分析により33,000、SDS−PAGEを用いた分
析により55,000と推定されている。

コレステロール・オキシダーゼIIの生産は、コレステ
ロール・オキシダーゼII生産能を有する微生物を培養す
ることにより行うことができる。

コレステロール・オキシダーゼIIは、ブレビバクテリ
ウム・ステロリカム由来の新規酵素であるが、その活性
発現量はごく微量であり、ブレビバクテリウム・ステロ
リカム菌種を通常培養して得られる培養液からは、分離
精製が困難である。従って、ブレビバクテリウム・ステ
ロリカム菌種の染色体DNAよりコレステロール・オキシ
ダーゼIIをコードする遺伝子を単離し、適当な宿主・ベ
クター系を用いて該遺伝子を増幅することにより、コレ
ステロール・オキシダーゼII生産菌を得ることができ
る。

以下に、コレステロール・オキシダーゼII生産菌の造
成について説明する。

ブレビバクテリウム属に属する菌株からのコレステロ
ール・オキシダーゼII遺伝子のショットガン・クローニ
ングは、大腸菌を宿主として直接活性発現を指標とした
検索により行うことができる。直接活性発現を指標とし
た検索については例えば、形質転換体の菌体を直接酵素
源として用いるか、リゾチームなどで溶菌し、得られた
細胞内容物を用いて酵素活性を測定する方法や、培地中
にコレステロールを混合しておき、菌体外に微量漏出す
る酵素活性によるコレステロールの酸化にともなう清澄
なハロー形成を観察することによって行うことができ
る。

ブレビバクテリウム属に属する菌株からのコレステロ
ール・オキシダーゼII遺伝子を含む染色体DNAの単離は
常法に従って、例えば、分子生物学実験マニュアル（R.
F.シュライフ、P.C.ウエンシンク著、川上正也、山崎達
美訳、講談社サイエンティフィク、1983年発行）に記載
された方法によって行うことができる。

ついで、上記で得られた染色体DNAをベクターDNAに組
み込んで、組換え体DNAを調製する。染色体DNAの組み込
みは、常法に従って、例えば染色体DNAおよびベクターD
NAを適当な制限酵素で切断して染色体DNA断片およびベ
クターDNA断片を調製した後、両者の混合物をDNAリガー
ゼで処理することによって行うことができる。ここで用
いられるベクターDNAとしては、大腸菌を宿主とするこ
とが可能なプラスミドであればすべて可能であり、とり
わけpUC13やpPROK−Ｃなどが好適に用いられる。また、
制限酵素としては、例えば、BamH I、Sau3A Iなどが挙
げられる。Sau3A Iの切断部位は、BamH Iでの切断部位
と同じ構造の突出末端を生じるため、組換えのためのラ
イゲーションが可能であり、染色体DNAをSau3A Iで限定
分解して得られるDNA断片を、BamH Iで切断したベクタ
ーDNA断片と連結することができる。DNAリガーゼとして
は、T4ファージ感染大腸菌由来のT4DNAリガーゼが好適
に用いられる。

ついで、上記方法で得られた組換え体DNAは、常法に
従って、例えば、モレキュラー・クローニング（T.マニ
アチス、E.F.フリッチ、J.サムブルック著、コールドス
プリングハーバー出版社、1982年）に記載の方法によっ
て大腸菌に導入することができる。組換え体DNA（すな
わちコレステロール・オキシダーゼII遺伝子を含むDNA
断片を組み込んだベクターDNA）を保有する菌株の選択
方法は、次のようにして行うことができる。すなわち、
菌株を0.1％コレステロール、0.1％トリトンＸ−100、
0.0025％アンピシリンを含むLB固体培地で培養し、生じ
たコロニーのうちコロニー周辺に清澄なハローを形成し
ているものを選択する。ついで、それらのコロニーをマ
イクロタイタープレートに植菌し、コレステロールオキ
シダーゼ活性の有無を検定する。このようにして得られ
る組換え体プラスミドの一例が、pnH10である。得られ
たプラスミドpnH10を保有する微生物として、エッシェ
リヒア・コリnH10が挙げられる。該菌株は、平成２年４
月５日付で、工業技術院微生物工業技術研究所にエッシ
ェリヒア・コリnH10（FERM BP−2850）として、ブダペ
スト条約に基づいて寄託されている。

上記のようにして得られたコレステロール・オキシダ
ーゼII生産菌は、栄養培地で培養することにより、培養
菌体および培養上清中に著量のコレステロール・オキシ
ダーゼIIを蓄積する。

コレステロール・オキシダーゼII生産菌の培養に用い
られる培地としては、炭素源、窒素源、無機物などを含
有する合成培地または天然培地のいずれも使用できる。
炭素源としては、例えば乳酸、グリセロール、糖蜜など
種々の炭水化物が用いられ、その使用量は５〜70g/程
度が好ましい。また、窒素源としては、例えば硫酸アン
モニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢
酸アンモニウム、あるいはペプトン、酵母エキス、コー
ン・スティープ・リカー、カゼイン加水分解物、肉エキ
スなどの窒素含有有機物などが用いられ、その使用量
は、５〜20g/程度が好ましい。さらに、無機物として
は、例えば、塩化ナトリウム、リン酸第一水素カリウ
ム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグ
ネシウムなどが用いられ、その使用量は0.05〜5g/程
度が好ましい。培養は、振盪培養または通気攪拌培養な
どの好気的条件下に行われる。培養温度は30〜37℃が好
適であり、培養期間は通常16〜40時間程度である。

培養を終了した培養液から、コレステロール・オキシ
ダーゼIIを採取するには、上記培養液から遠心分離など
の方法で菌体を集め、得られた菌体を超音波処理、ガラ
スビーズを用いる磨砕処理、フレンチプレス処理などに
よって破砕し、酵素を抽出する。抽出液は、これを硫安
塩析法、イオン交換樹脂を用いるクロマトグラフィー、
ゲル濾過法、ヒドロキシアパタイト吸着樹脂を用いるク
ロマトグラフィーなどの常法により処理して、精製コレ
ステロール・オキシダーゼIIを得ることができる。菌体
外に蓄積する酵素については、菌体破砕の操作を省略す
る以外は上記と同様に行い、コレステロール・オキシダ
ーゼIIを取得できる。

このようにして得られたコレステロール・オキシダー
ゼIIの理化学的性質について、以下に詳述する（なおコ
レステロール・オキシダーゼIIは、実施例２で得られた
精製標品を用いた）。

I.作用酸素の存在下コレステロールを酸化して、過酸化水素
と４−コレステン−３−オンを生成する反応を触媒す
る。

（イ）過酸化水素の生成の確認酸素の存在下コレステロールにコレステロール・オキ
シダーゼIIを作用させ、ついで該酵素系にパーオキシダ
ーゼ、フェノール、４−アミノアンチピリンを加えて反
応させると、反応系にキノンイミン色素が生成する。

反応組成に示した各試薬を混ぜ、37℃で攪拌下、発生
する過酸化水素量を生成したキノンイミン系色素の比色
定量によって求めた。即ち、上記の系において生成した
過酸化水素を、クリニカルケミストリー第20巻、470頁
（1974年）に記載の方法で定量した結果、0.15μmoleの
コレステロールから0.19μmoleの過酸化水素の生成が確
認された。

（ロ）酸素消費の確認酸素の存在下、コレステロールにコレステロール・オ
キシダーゼIIを作用させ、消費される酸素の量をワール
ブルグ検圧計によって測定した。

反応組成に示した各試薬を混ぜ、37℃で攪拌下、酸素
吸収により生ずる反応容器内外の気体の圧力差を、一端
を容器に連結し他端を外気と連結した円筒中のマノメー
ター液の異動によって解消させ、その際のマノメーター
液の移動量を測定した。該マノメーター液の移動量は次
式（ウムブレイト・ブリス・スタウファー著：マノメト
リック・アンド・ビオケミカル・テクニックス、第５
版、第５章）によって、標準状態の理想気体の消費量に
換算される。

ここで、Ｖは標準状態における理想気体の消費量（単
位μｌ）、Ｐは測定時の大気圧（単位mmHg）、Pwは測定
時の反応温度における水蒸気圧（単位mmHg）、Ｔは測定
時の反応温度（単位K゜）、ΔVgはマノメーター液の移
動量（単位μｌ）、Ｋは容器定数（単位m²）である。ま
た標準状態において１μｌの気体は0.0446μmoleに相当
する。

測定結果より、1.5μmoleのコレステロールとコレス
テロール・オキシダーゼIIを反応させると、1.43μmole
の酸素が消費されることが確認された。

（ハ）４−コレステン−３−オンの生成の確認酸素の存在下、コレステロールにコレステロール・オ
キシダーゼIIを作用させ、反応生成物を４−コレステン
−３−オンと同定した。

同定の手順２）反応操作上記反応液を37℃で振盪下に反応させ、30分後、３時
間後、16時間後に50μずつ試料採取を行い、50μの
ヘキサンと混合した後、上清を５μ取り、３）の同定
操作を行った。

３）同定この反応液中の生成物は以下に示す薄層クロマトグラ
フィー（以下TCLと略す）の結果、４−コレステン−３
−オンであると同定した。

使用した薄層プレートはシリカゲル・Ｇ−60F−254
（商品名、Ｅメルク社製）で、展開溶剤は溶剤系〔ヘキ
サン：酢酸エチル＝3:2（容量比）〕である。展開後、
プレートを紫外線（波長254nm）照射下、蛍光発色を観
測した後、リンモリブデン酸反応を行って、反応生成物
のRf値が標品のそれらと一致することを確認した。結果
を第３表に示す。

第３表に示したように、生成物と４−コレステン−３
−オン標品のRf値が完全に一致することから両者の同一
性が確認された。即ち酸素の存在下、コレステロールに
コレステロール・オキシダーゼIIを作用させて得られる
生成物が、４−コレステン−３−オンであることが確認
された。

（ニ）上記の（イ）、（ロ）、（ハ）に記載された方法
によって求められた過酸化水素生成量、酸素の消費量、
反応生成物の同定結果により、下式に従って、本酵素が
コレステロールを特異的に酸化すること、過酸化水素を
発生させること、コレステロールを酸化して４−コレス
テン−３−オンを生成すること、即ち、本酵素がコレス
テロールオキシダーゼ活性を持つことが確認された。

II.至適pHおよび安定pH範囲作用至適pH域は、pH5.0〜7.5の範囲にある。測定は、
各pH（リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、酢酸ナトリウ
ム緩衝液）において、37℃で５分間反応後の活性を測定
することにより行った。このとき、コレステロール・オ
キシダーゼＩについても同様に測定を行った。結果を第
１図に示す。第１図に示したように、コレステロール・
オキシダーゼIIとコレステロール・オキシダーゼＩの作
用至適pH域は、明らかに異なる。

安定pH範囲はpH5.3〜7.5である。測定は、50℃で、60
分間、各pH（リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、酢酸ナ
トリウム緩衝液）で処理後、残存活性を測定した。結果
を第２図に示す。

III.力価の測定法酸素の存在下、37℃で１分間にコレステロールを１μ
mole分解する反応を触媒する酵素量を１単位（ユニッ
ト、unit）とする。力価の測定は、コレステロールに酵
素を振盪しながら作用させ、生成する過酸化水素に、パ
ーオキシダーゼの存在下、４−アミノアンチピリンとフ
ェノールを作用させ、キノンイミン色素に導く。この生
成したキノンイミン色素の可視部の吸収を測定して、発
生した過酸化水素量を求めることによって酵素の力価を
測定する。なお、以下比活性は蛋白/mgあたりの活性（u
nit/mg）で表示した。また、酵素蛋白量は280nmの吸光
度（吸光度１のとき、1mg/ml）によって測定した。

イ）原理酵素活性の測定は、酵素によって発生する過酸化水素
を、パーオキシダーゼの存在下、４−アミノアンチピリ
ンとフェノールを反応させ、生成したキノンイミン色素
を定量することによって行う。反応式は次式（１）、
（２）で示される。

（ロ）操作細型試験管に3mMコレステロール溶液（50mMのコレス
テロールのエタノール溶液6mlを、94mlの1.05％トリト
ンＸ−100溶液中に攪拌しながら加え、湯煎中で10分間
加熱した後、水中で冷却し、蒸留水を用いて100mlと
し、1.0％トリトンＸ−100溶液とする。調製後30分以内
に使用する）1.0ml、50mM、胆汁酸ナトリウム溶液0.3m
l、0.5Mリン酸カリウム−ナトリウム緩衝液（pH6.6）0.
3ml、42mMフェノール0.5ml、2.4mM4−アミノアンチピリ
ン0.5ml、115単位/ml西洋ワサビ由来パーオキシダーゼ
0.2mlを入れ、混合する。ついでこれを37℃で３分間保
温した後、酵素溶液0.2mlを添加する。振盪しながら37
℃で５分間ないし10分間反応を行った後、500nmの吸光
度（以下OD500nm）を測定した。

（ハ）力価の計算法コレステロール・オキシダーゼの１単位は、37℃で１
分間にコレステロールを１μmole分解する酵素量であ
る。一方、1mMのキノンイミンの吸光係数は5.33と報告
されている〔クリニカルケミストリー，第20巻,470頁
（1974）〕から、求める酵素溶液1mlあたりの力価
（Ａ）は、前記操作で求められた反応液3mlのOD500nmを
下記ａ）によって規定し、ｂ）を用いて算出する。

ａ）〔（酵素・基質を共に含む反応液のOD500nm）より
（基質を除いた反応液のOD500nm）を差し引いたもの〕
から〔（試薬ブランクのOD500nm）より（試薬ブランク
から基質を除いた溶液のOD500nm）〕を差し引いたもの
を△Ｅと規定する。

ｂ）△Ｅ÷5.33÷時間（min）×３×希釈率＝Ａ酵素溶
液の力価（単位/ml）注1:試薬ブランクとは反応液中から酵素溶液を除いた溶
液をいう。

IV.作用適温の範囲 pH6.6、反応時間３分間における至適温度を検討した
結果を第３図に示す。至適温度は50℃付近に存在した。

V.pHおよび温度による失活についてコレステロール・オキシダーゼIIは、pH8.5以上で失
活する。また、0.05Mリン酸緩衝液中、pH7.0で60分間加
熱処理して、残存活性を測定したところ、第４図に結果
を示したように、50℃で約10％、60℃で約83％失活す
る。

VI.基質親和性コレステロール・オキシダーゼIIの基質コレステロー
ルに対するミハエリス定数（Km値）は3.0×10^-5Mであっ
た。一方、コレステロール・オキシダーゼＩのKm値は実
測の結果、1.1×10^-3Mであった。両酵素の種々のコレス
テロール濃度における反応速度を計測した結果を、第５
図に示す。コレステロール・オキシダーゼＩに対し、コ
レステロール・オキシダーゼIIのKm値は、約百分の１で
あった。従って、コレステロール・オキシダーゼIIのコ
レステロールに対する親和性は極めて高く、コレステロ
ールの定量により適していることが判明した。さらに、
第５図に示したように、コレステロール・オキシダーゼ
IIの示すコレステロール飽和曲線は、いわゆるミハエリ
ス・メンテン型であり、コレステロール・オキシダーゼ
Ｉの示す見かけ上のコレステロールによる活性化現象を
示さない。このことは、コレステロール・オキシダーゼ
IIが低濃度域での血清コレステロールの定量において、
コレステロール・オキシダーゼＩに優る良好な反応性を
有することを示している。

なお、ミハエリス定数の求め方は、H.ラインウィーバ
ーら、ジャーナルオブアメリカンケミカルソサ
イエティー、第56巻、658頁（1934）の記載に従った。

VII.コレステロール・オキシダーゼIIのアミノ酸配列お
よび塩基配列の決定コレステロール・オキシダーゼIIの標品はさらに、逆
層高速液体クロマトグラフィーを用いて、２つのサブユ
ニットに分離、精製することができる。各サブユニット
をプロテアーゼ、例えば、トリプシンにより消化し、消
化物を高速液体クロマトグラフィーを用いて分画するこ
とによって、プロテアーゼ消化断片が得られる。各消化
断片のアミノ酸配列は、アミノ酸シーケンサーを用いる
通常の手法によって分析できる。

塩基配列はシーケナーゼVer2.0を用いるサンガーの方
法によって分析できる〔F.サンガー著：サイエンス、21
4,1205（1981）〕。

図面の簡単な説明第１図は、コレステロール・オキシダーゼＩおよびII
の、37℃で５分間処理した後の各pHにおける相対活性を
示す。図中、○はコレステロール・オキシダーゼII、●
はコレステロール・オキシダーゼＩの活性を示す。

第２図は、実施例２で得られたコレステロール・オキ
シダーゼIIのpH安定性を示す。

第３図は、実施例２で得られたコレステロール・オキ
シダーゼIIの至適温度を示す。

第４図は、実施例２で得られたコレステロール・オキ
シダーゼIIの熱安定性を示す。図中、○は50℃におけ
る、●は60℃における熱安定性を示す。

第５図は、コレステロール・オキシダーゼＩおよびII
の、精製標品のコレステロールによる基質飽和曲線を示
す。

図中、Ａはコレステロール・オキシダーゼII、Ｂはコ
レステロール・オキシダーゼＩについての結果を示す。

第６図は、組換え体プラスミドpnH10の制限酵素地図
を示す。

第７図は、DEAE−セルロファインによるコレステロー
ル・オキシダーゼIIのイオン交換クロマトグラフィーに
おける溶出パターンを示す。図中、○は溶出液の蛋白濃
度（OD280nm、mg/ml）を、●は溶出液の酵素活性（U/m
l）を示す。

第８図はスーパーロースprep12 HR16/50によるコレ
ステロール・オキシダーゼIIのゲルろ過における溶出パ
ターンを示す。図中、○は溶出液の蛋白濃度（OD280n
m、mg/ml）を、●は溶出液の酵素活性（U/ml）を示す。

発明を実施するための最良の形態実施例1. コレステロール・オキシダーゼII遺伝子のク
ローニング１）コレステロール・オキシダーゼII遺伝子を含む染色
体DNAの調製ブレビバクテリウム・ステロリカムATCC 21387株をL
B培地〔バクトトリプトン10g/、バクトイーストエキ
ストラクト（以上、ディフコ社製）8g/、NaCl 5g/
（pH7.2）〕30ml中、30℃で３日間振盪培養して得られ
た菌体を、日立製冷却遠心機（RPR20−２ローター）を
用いて４℃で10,000rpm、10分間遠心して集菌し、10.3
％ショ糖溶液で洗浄後再び遠心して菌体を集め、カレン
ト・トピックス・イン・マイクロバイオロジー・アンド
・イムノロジー第96巻（1982）に記載されている方法
で全染色体DNAを抽出し、約1mgの染色体DNAを得た。

２）染色体DNA断片のベクターDNAへの導入上記１）で得られた全染色体DNA72μｇをとり、Ｍ緩
衝液〔トリス−塩酸緩衝液（pH7.5）10mM、MgCl₂10mM、
NaCl 50mM、DTT（ジチオスレイトール）1mM〕1,000μ
に溶解して、制限エンドヌクレアーゼSau3A I（宝酒
造社製）3.6単位を添加し、37℃で30分間限定分解を行
った。ついで、これをモレキュラー・クローニングに記
載されている方法に従って、10〜40％ショ糖度勾配遠心
法により分画を行った。遠心は、日立製超遠心機（SRP2
8ローター）を用い、20℃で26,000rpm、16時間行った。
遠心後、分画を行い、各分画の一部をモレキュラー・ク
ローニングに記載されている方法に従ってアガロースゲ
ル電気泳動を行い、DNA断片の大きさを測定した。さら
に、３〜6kbのDNA断片を含む分画のみを集めてエタノー
ル沈澱を行った後、ライゲーション緩衝液〔トリス−塩
酸緩衝液（pH7.6）66mM、MgCl₂mM、DTT 5mM、ATP 1m
M）60μｌに溶解して約５μｇのDNA断片を含む染色体DN
A溶液を得た。また、ベクターとして使用するpPROK−Ｃ
（クローンテック社製）10μｇを、Ｍ緩衝液300μｌに
溶解して、制限エンドヌクレアーゼBamH I（宝酒造社
製）40単位を添加し、37℃で３時間反応を行って完全分
解した後、1Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.6）20μｌと仔
牛小腸由来アルカリ性ホスファターゼ４単位を添加し、
37℃で１時間反応を行い、脱リン酸化を行った。さらに
65℃で10分間加熱して酵素を失活させ、エタノール沈澱
を行った後、80μｌのライゲーション緩衝液に溶解し
た。ついで、Sau3A Iで部分分解した染色体DNA溶液32μ
ｌとBamH Iで分解したpPROK−Ｃ溶液５μｌを混合し、
ライゲーション緩衝液で全量75μｌにした後、T4DNAリ
ガーゼ（宝酒造社製）２単位を添加し、16℃で16時間、
連結反応を行い、組換え体DNA混成物を得た。

３）大腸菌の形質転換上記２）で得られた組換え体DNA混成物を用いて、大
腸菌を形質転換した。形質転換に用いるDNA感受性菌の
調製法は、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー第166巻 577頁に記載されているハナハンらの方
法に準じた。大腸菌MM294株を、LB培地で一晩培養後、
得られた培養液0.2mlを20mlのSOB培地〔バクトトリプト
ン20g/，バクトイーストエキストラクト0.05g/（以
上ディフコ社製）、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM Mg
Cl₂、10mM MgSO₄（pH7.0）〕に植菌し、３時間培養
後、ファルコン2070試験管に移し、氷中に15分間おき、
４℃で遠心し菌体を集めた。7mlのTFB〔10mM グッドME
S緩衝液（pH6.20）、100mM RbCl、45mM MnCl₂、10mM
CaCl₂、3mM ヘキサミンコバルトクロライド〕に
懸濁し、氷中で15分間静置した。菌体を遠心分離によっ
て集め、1.6mlのTFBに再び懸濁した。得られた懸濁液に
56μｌのジメチルスルホキシドを加え、氷中で５分間緩
やかに攪拌した後、56μｌのβ−メルカプトエタノール
を加え、氷中で10分間緩やかに攪拌した。56μｌのジメ
チルスルホキシドを加え、氷中で５分間緩やかに攪拌し
て得られた菌体を、DNA感受性菌として形質転換に使用
した。得られたDNA感受性菌液210μｌをファルコン2059
試験管に入れ、２）で作製した組換え体DNA混成物10μ
ｌを加え、緩やかに攪拌した後、氷中で30分間静置し
た。42℃の恒温槽中で90秒間加熱し、氷中に移して２分
間保った。これに800μｌのSOC培地（SOB培地に20mMグ
ルコースを加えたもの）を加え、37℃で１時間振盪培養
した。得られた培養液を、0.1％コレステロール、0.1％
トリトンＸ−100、0.0025％アンピシリンを含むLB固体
培地に接種し、37℃で一晩培養し、生育してきたコロニ
ーを形質転換株として取得した。

４）コレステロール・オキシダーゼII遺伝子を含む組換
え体DNAを保有する形質転換株の選択上記３）で得られた形質転換株よりコレステロールオ
キシダーゼII遺伝子を含む組換え体DNAを、以下の方法
に従って取得した。上記LB固体培地上に生育した周辺に
清澄なハローを形成しているコロニーを選択し、それら
のコロニーをマイクロタイタープレートに植菌し、コレ
ステロールオキシダーゼ活性の有無を検定した。活性を
検出した形質転換株は、0.005％のアンピシリンを含むL
B培地に植菌し、30℃で一晩培養した。培養終了後集菌
し、得られた菌体を、10mlの0.05Mリン酸緩衝液（pH7.
0）に懸濁後、超音波破砕機（セルディスラプターモデ
ル200、ブランソン社製）により菌体を破砕し（出力40
％、10分間）、遠心後得られた上清について前記の方法
でコレステロール・オキシダーゼ活性を測定した。この
ようにして高いコレステロール・オキシダーゼ活性を有
する形質転換株エッシェリヒア・コリnH10株を得た。形
質転換株nH10より保有する組換え体プラスミドDNAを回
収し、pnH10を得た。pnH10の構造を、Hind III,Pst I,S
al I,Xho I,Kpn I,Apa I,BamH I,Mlu I,EcoR I,Sma I,S
ca Iで切断して、アガロースゲル電気泳動法にて確認し
た結果、ベクターであるpPROK−Ｃに、挿入遺伝子であ
る約3.0kbのDNA断片が組み込まれた構造を有していた
（第６図参照）。

５）クローン化したコレステロール・オキシダーゼ遺伝
子の解析 pnH10が、ブレビバクテリウム・ステロリカムATCC213
87の生産する既知のコレステロール・オキシダーゼＩと
は異なるイソ酵素をコードする遺伝子を含む組換え体プ
ラスミドであることは、以下の方法により確認した。す
なわち、モレキュラー・クローニング（T.マニアチス、
E.F.フリッチ、J.サムブルック著、コールドスプリング
ハーバー出版社、1982年）に記されている方法に従っ
て、nH10株より組換え体プラスミドpnH10を調製し、ア
ガロースゲル電気泳動後、pnH10を含むゲルを1.5M NaC
lおよび0.5M NaOHを含む溶液に室温で30分間漬け、２
本鎖DNAを変性させた。さらに、ナイロンフィルター上
に密着させ、フィルターの下面より1.5M NaClおよび0.
25M NaOHを含む溶液を浸透させ、変性後のDNAをフィル
ター上に転写後固定した。このようにして調製したフィ
ルターを、ブレビバクテリウム・ステロリカムATCC2138
7株の産生するコレステロール・オキシダーゼＩのアミ
ノ酸の部分配列から推定されるDNA塩基配列の合成一本
鎖DNA、すなわち、配列番号２で表わされるプローブNo.
1（６番目の塩基はT,Cのいずれか、９番目の塩基はT,C
のいずれか、12番目の塩基はA,G,Tのいずれか、15番目
の塩基はA,Gのいずれかであり、組み合わせて24通りの
合成DNAの混合物となる。）または、配列番号３で表わ
されるプローブNo.2（３番目の塩基はA,Gのいずれか、
９番目の塩基はA,Gのいずれか、12番目の塩基はC,Tのい
ずれか、15番目の塩基はT,A,Gのいずれかであり、組み
合わせて24通りの合成DNAの混合物となる。）をγ−³²P
−ATPで標識して得られたDNAプローブを含むハイブリダ
イゼーションバッファー（NaCl 53.0g/、コハク酸ナ
トリウム26.5g/、10mM EDTA、５倍濃度デンハート溶
液、0.5％ SDS、0.1mg/ml熱変性牛胸腺DNA、pH7.0）と
45℃で16時間反応させた後、プローブを含む溶液を捨
て、３倍濃度のSSC中で65℃で十分洗浄した。フィルタ
ーとＸ線撮影用フィルムを密着させ、−70℃において１
昼夜感光させ、いわゆるオートラジオグラフィー法によ
ってpnH10との反応性を検討した。プローブNo.1はコレ
ステロール・オキシダーゼＩの中央部分のポリペプチド
鎖のアミノ酸部分配列に、プローブNo.2はＣ末端部分の
アミノ酸配列に対応する。オートラジオグラフィーの解
析の結果、pnH10はプローブNo.1、No.2と全く反応しな
かった。この結果より、プラスミドpnH10に含まれるコ
レステロール・オキシダーゼII遺伝子は、既知のコレス
テロール・オキシダーゼＩをコードする遺伝子とは異な
ることが明らかになった。

実施例2. エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）nH10株
（FERM BP−2850）をLB培地にアンピシリン0.005％を
含有する種培地（殺菌前pH7.2）3mlに植菌し、30℃で18
時間振盪培養した。この種培養液3mlを、上記種培地と
同じ培地を各々500ml仕込んだ２リットル三角フラスコ
（バッフル付き）５本にそれぞれ加え、30℃で16時間振
盪培養した。培養後、培養液を冷却遠心機にて10,000×
ｇで20分間遠心し、約18.6g（湿菌体重量）の菌体を得
た。得られた湿菌体に186mlの0.01Mリン酸緩衝液（pH7.
0、以下バッファーと略称する）を加えて懸濁した後、
超音波菌体破砕機（セルディスラプターモデル200、ブ
ランソン社製）により30分間超音波破砕した（出力75
％、パルス保持時間70％、フラットチップ装着）。破砕
した後、冷却遠心機にて20,000×ｇで15分間遠心分離
し、上清液を無細胞抽出液として得た。得られた無細胞
抽出液194mlに60％飽和になるまで固形硫酸アンモニウ
ムを加え、1N NaOH溶液でpH7に保ちながら、緩やかに
攪拌し、硫酸アンモニウムが完全に溶解してから、さら
に30分間攪拌した。その後、冷却遠心機にて20,000×ｇ
で15分間遠心し、上清を得た。得られた上清はセロファ
ンチューブを透析膜として、１リットルのバッファーに
対し12時間透析し、その後バッファーを交換して、さら
に12時間透析を行い脱塩した。透析後の粗酵素液98.5ml
を、予めバッファーで平衡化しておいたDEAE−セルロフ
ァイン（生化学工業社製）のカラム（φ7.5×15cm）に
通塔した。流速480ml/hrでバッファー３リットルにて洗
浄し、未吸着の蛋白を洗い出した。次に、NaCl濃度を０
から0.5Mまで直線的に濃度勾配溶出し、酵素を溶出し
た。溶出画分のうち、比活性が10単位/mg以上の画分を
集めた。溶出パターンを第７図に示した。

得られた活性画分を硫酸アンモニウムを60％飽和にな
るまで添加して濃縮し、生成した沈澱をバッファーにて
溶解後、前記と同様に透析を行って脱塩した。さらに、
限外ろ過により濃縮し約2mlとした。これを、予め0.05M
リン酸緩衝液（pH7.0）に0.3MのNaClを加えたもので平
衡化しておいたスーパーロース（Superose）prep12 HR
16/50（ファルマシア・ファイン・ケミカル社製）カラ
ム（φ1.3×50cm）に通塔し、880PUポンプ（日本分光）
に接続し、30ml/hrの流速で溶出を行った。溶出画分の
うち比活性15単位/mg以上の画分を集めて、１リットル
のバッファーに対し透析した。溶出パターンを第８図に
示した。得られた活性画分を、予めバッファーで平衡化
しておいたヒドロキシアパタイト（生化学工業社製）の
カラム（φ3.2×4.0cm）に通塔し、流速100ml/hrでバッ
ファーで洗浄したところ、活性はすべて洗液中に回収さ
れていた。洗液を限外ろ過により濃縮後、本酵素の精製
標品とした。以上の精製過程を第４表にまとめた。

さらに、精製酵素標品の純度を検定するために、上記
のようにして得られた未変性状態のサンプルを、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動にかけた。方法は、デービス
らの方法〔B.J.デービスら、アナルス・オブ・ニューヨ
ーク・アカデミイ・オブ・サイエンス、第121巻、404頁
（1964）〕に従った。その結果本標品は均一であること
がわかった。

産業上の利用可能性本発明によれば、血清コレステロールを測定するにあ
たり、高度の希釈操作などの原因により試料中のコレス
テロール濃度が低濃度であったり、ビリルビンなどの妨
害物質による影響を回避するため、測定pHを６前後に下
げて測定しなければならないような場合に、既知のコレ
ステロール・オキシダーゼに代わり、より高感度で定量
性の高い新規なコレステロール・オキシダーゼを、工業
的に安価に提供することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:13） (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/02 - 9/08 C12N 1/10 - 1/21 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ／Ｌ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳｅｑＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号４で表されるアミノ酸配列を有
し、かつ下記の理化学的性質を有する新規コレステロー
ル・オキシダーゼ；（ａ）作用酸素の存在下コレステロールを酸化し、過酸化水素と４
−コレステン−３−オンを生成する反応を触媒する、（ｂ）等電点:pH4.7、（ｃ）基質特異性：コレステロール、β−シトステロール、スチグマステロ
ール、プレグネノロン、デヒドロイソアンドロステロ
ン、エストラジオールに作用し、ビタミンD3、コール
酸、アンドロステロン、コレステロールリノレート、ラ
ノステロールは基質としない、（ｄ）至適pHおよび安定pH範囲：至適pHは5.0〜7.5であり、50℃、60分間の加熱条件下で
は、pH5.3〜7.5の範囲で安定である、（ｅ）作用温度:50℃付近に至適作用温度を有する、（ｆ）pHおよび温度などによる失活の条件： 50℃、１時間の加熱条件下では、pH10.0以上またはpH4.
0以下で失活する。また、pH7.0、60℃、１時間の熱処理
で約83％失活する、（ｇ）阻害および安定化：ｐ−クロロマーキュリベンゼンスルホネート、硝酸銀、
ｏ−ヒドロキシキノリンにより阻害を受ける。また、牛
血清アルブミンを共存させることにより、耐熱性および
保存安定性が向上する、（ｈ）コレステロールに対するミハエリス定数（Km
値）:3.0×10^-5mol/L、および（ｉ）分子量：約43,000（ゲル濾過法）約60,000（電気泳動法） 66,586（アミノ酸配列）。
【請求項２】該コレステロール・オキシダーゼが、ブレ
ビバクテリウム・ステロリカム由来である請求項１記載
のコレステロール・オキシダーゼ。
【請求項３】エッシェリヒア属に属し、配列番号１で表
されるDNA配列で特定されるDNAを組み込んだ組換え体DN
Aを保有する微生物を培地に培養し、培養物中にコレス
テロール・オキシダーゼを採取することを特徴とする新
規コレステロール・オキシダーゼの製造法。
【請求項４】該配列番号１で表されるDNA配列で特定さ
れるDNAが、ブレビバクテリウム・ステロリカム由来で
ある請求項３記載の製造法。
【請求項５】エッシェリヒア属に属し、配列番号１で表
されるDNA配列で特定されるDNAを組み込んだ組換え体DN
Aを保有する微生物。
【請求項６】該微生物が、エッシェリヒア・コリnH10
（FERM BP−2850）である請求項５記載の微生物。
【請求項７】配列番号１で表されるDNAで特定されるDNA
を組み込んだ組換え体DNA。
【請求項８】該組換え体DNAが、エッシェリヒア・コリn
H10（FERM BP−2850）が保有するプラスミドpnH10であ
る請求項７記載の組換え体DNA。
【請求項９】配列番号１で表されるDNAで特定されるDNA
で特定され、かつコレステロール・オキシダーゼをコー
ドするDNA。
【請求項１０】該DNAがブレビバクテリウム・ステロリ
カム由来である請求項９記載のDNA。
【請求項１１】エッシェリヒア・コリnH10（FERM BP−
2850）が保有するプラスミドpnH10中に存在するコレス
テロール・オキシダーゼをコードするDNAを組み込んだ
組換え体DNAを保有する微生物を培地に培養し、該培養
物から該コレステロール・オキシダーゼを生成蓄積さ
せ、該培養物から該コレステロール・オキシダーゼを採
取することを特徴とする新規コレステロール・オキシダ
ーゼの製造法。
【請求項１２】微生物がエッシェリヒア属に属する微生
物である、請求項11記載の製造法。
【請求項１３】微生物が、エッシェリヒア・コリnH10
（FERM BP−2850）である、請求項12記載の製造法。
【請求項１４】組換え体DNAが、プラスミドpnH10であ
る、請求項11、12または13記載の製造法。