WO1993007261A1 - Novel cholesterol oxidase - Google Patents

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WO1993007261A1
WO1993007261A1 PCT/JP1991/001375 JP9101375W WO9307261A1 WO 1993007261 A1 WO1993007261 A1 WO 1993007261A1 JP 9101375 W JP9101375 W JP 9101375W WO 9307261 A1 WO9307261 A1 WO 9307261A1
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cholesterol
dna
cholesterol oxidase
oxidase
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PCT/JP1991/001375
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French (fr)
Inventor
Kinya Fujishiro
Takayuki Uwajima
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol

Definitions

  • the present invention relates to a novel cholesterol oxidase (hereinafter referred to as cholesterol oxidase ⁇ ) having a peptide sequence represented by Sequence No. 1 and having the following physicochemical properties) to ⁇ : And c regarding its manufacturing method
  • Cholesterol oxidase is oxidized by using cholesterol (5-cholesten-3-; 9-ol) as a substrate, and 4-cholesten-3-one is oxidized.
  • Cholesterol is a member of the genus Schizophyllum, Streptoverterisum, Brevibacterium and Streptomyces. It is known that it is produced by microorganisms belonging to it, and fermentative production on an industrial scale has already been performed using these microorganisms. Cholesterol ⁇ oxidase, which has been conventionally used for the determination of cholesterol in blood, has low substrate affinity and analyzes samples containing low concentrations of cholesterol. It has been pointed out that there is a problem in the quantitativeness of the reaction when measuring after diluting the sample. In addition, optimal action P
  • the H region is relatively narrow, when the reaction PH is set to the acidic side to avoid the influence of other components in the sample, for example, pyrirubin, it is said that there is a problem of reduced reactivity. . Furthermore, the cholesterol and oxidase production of microorganisms known as cholesterol osidase production bacteria is extremely low, and contaminant proteins are removed during the purification stage. Therefore, a multi-stage purification operation is required.
  • the present inventors have developed cholesterol osidase, which has a high affinity for cholesterol as a substrate and has a property of efficiently acting even in an acidic region, at low cost industrially and with high purity.
  • Various studies were made on the manufacturing method. As a result, strains belonging to the genus Brevibacterium show a higher cholesterol oxidase activity than that of the known cholesterol, which has a different substrate affinity, action pH range, and isoelectric point from the known cholesterol oxidase.
  • cholesteric ⁇ -phosphoridase having a peptide sequence represented by Sequence Listing No. 1 and having the following physicochemical properties and a method for producing the same. it can.
  • the optimum pH is 5.0 to 7.5, and 50 ⁇ : stable under heating conditions for 60 minutes within the range of 5.3 ⁇ 7.5.
  • Cholesterol oxidase is a strain of Brevibacterium sterolicum ATCC 21387, which is conventionally known as a cholesterol oxidase-producing bacterium. 0) A newly isolated enzyme, cholesterol oxidase derived from the conventional ATCC21387 strain (hereinafter referred to as cholesterol oxidase I) is as follows. It is a novel enzyme with different properties.
  • Cholesterol oxidase has a pH of 4.7, whereas cholesterol oxidase I has a pH of 8.9.
  • Table 1 shows the substrate specificity of cholesterol oxidase I and ⁇ . Show.
  • Cholesterol oxidase 11 has a pH of 5.0 to 7.5, whereas cholesterol oxidase I has a pH of 6.0 to 5.5.
  • the production of cholesterol oxidase can be carried out by culturing a microorganism capable of producing cholesterol oxidase.
  • Cholesterol's oxidase is a novel enzyme derived from Brevibacterium sterolium, but its expression of activity is very small. It is difficult to separate and purify from a culture solution obtained by cultivating a Cam species normally. Therefore, a gene encoding cholesterol oxidase n was isolated from the chromosomal DNA of Brevibacterium 'sterolium sp., And the gene was isolated using an appropriate host vector system. By amplifying this, a cholesteric ⁇ -yl'oxidase ⁇ producing bacterium can be obtained.
  • the shotgun-cloning of the cholesterol oxidase gene from strains belonging to the genus Brevibacterium can be performed by direct search using Escherichia coli as a host and using the activity expression as an index.
  • direct activity expression as an index for example, a method of using the cells of the transformant directly as an enzyme source, lysing with lysozyme or the like, and measuring the enzyme activity using the obtained cell contents, Alternatively, it can be performed by mixing cholesterol ⁇ -les in the medium, and observing the clear halo monoformation associated with cholesterol oxidation caused by enzymatic activity that leaks out of the cells in a minute amount.
  • the chromosome D ⁇ containing the cholesterol oxidase ⁇ gene from a strain belonging to the genus Brevibacterium can be isolated according to a conventional method, for example, by using the manual for molecular biology (RF Schleif This can be performed by the method described in PC Jenshink, translated by Masaya Kawakami and Tatsumi Yamazaki, published by Kodansha Scientific, 1983.
  • chromosome A obtained above is integrated into vector DNA to prepare a recombinant DXA.
  • the integration of chromosome A is carried out according to a conventional method.
  • chromosome D ⁇ 'A and vector DNA are cleaved with an appropriate restriction enzyme to prepare a chromosome DNA fragment and a vector DNA fragment.
  • an appropriate restriction enzyme to prepare a chromosome DNA fragment and a vector DNA fragment.
  • the vector-DNA used here any plasmid capable of hosting Escherichia coli can be used, and pC13 and pPR ⁇ K-C are particularly preferable.
  • the restriction enzyme include, for example, BamHI and Sau3AI.
  • the DMA fragment obtained by the limited digestion can be ligated to the vector-DXA fragment cut with BamHI.
  • DA As the ligase, T4 DNA ligase derived from Escherichia coli infected with T4 phage is suitably used.
  • the recombinant DNA obtained by the above method can be used in a conventional manner, for example, as described in Molecular Cloning (T. Maniatis, EF Fritsch, J. Sambrook, Call The method can be introduced into Escherichia coli by the method described in Dospring Herba Publishing Company, 1982.
  • a method for selecting a strain having a recombinant DNA can be carried out as follows. That is, the strain was cultured in an LB solid medium containing 0.1% cholesterol and 0.1% triton X—100, 0.0025% ampicillin, and the resulting colony was cultured.
  • plasmid pnH10 examples include Escherichih-coli ⁇ H10.
  • FERBP-2850 Research Institute of Microbial Industry and Technology of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as Escherichia coli II-10
  • Cholesterol osidase I [produced as described above] was produced by culturing in a nutrient medium to produce a significant amount of cholesterol oxidase in the cultured cells and culture supernatant. Accumulate zero.
  • any of a synthetic medium and a natural medium having a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance and the like can be used.
  • the carbon source various carbohydrates such as lactic acid, glycerol, molasses and the like are used, and the amount of use is preferably about 5 to 70 g / 1.
  • the nitrogen source include ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium carbonate, and ammonium acetate.
  • nitrogen-containing organic substances such as peptone, yeast extract, corn 'steep' liquor, casein hydrolyzate, meat kiss, and the like are used, and the use amount thereof is preferably about 5 to 201.
  • the inorganic substance for example, sodium chloride, dihydrogen phosphate phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, magnesium chloride, etc. are used.
  • the dose is preferably about 0.05 to 5 g Z1.
  • the cultivation is performed under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and stirring culture.
  • the culture temperature is preferably 30 to 37 t, and the culture period is usually about 16 to 40 hours.
  • cholesterol oxidase II thus obtained will be described in detail below (note that cholesterol oxidase II was the purified preparation obtained in Example 2).
  • Cholesterol oxidase is allowed to act on cholesterol in the presence of oxygen, and then peroxidase, phenol and 4 mino-anti-minobilin are added to the enzyme system to cause a reaction with the quinolinimine dye. Is generated.
  • Cholesterol oxidase is allowed to act on cholesterol in the presence of oxygen, and the amount of oxygen consumed is measured with a Peelburg manometer.
  • V is the ideal gas consumption in standard mode (unit "1")
  • P is the atmospheric pressure at measurement (unit mmHg)
  • Pw is the water vapor pressure at the reaction temperature at measurement ( unit mmHg)
  • T is the reaction temperature (unit K ° at the time of measurement)
  • the moving amount of the AV g is Manome over data one-pack (unit 1)
  • K is the container constant (unit m 2) (also 1 under standard conditions
  • the cholestere of 1.5 mo 1 e was obtained from the c measurement result equivalent to 0.044 46 uniole.When the cholesterol • oxidase ⁇ reacted with 1,4,3 m 0 It was confirmed that 1 e of oxygen was consumed.
  • the product in this reaction mixture was identified as 4—cholestene 13 _ on by thin layer chromatography (hereinafter abbreviated as TLC) as shown below.
  • the plate is irradiated with ultraviolet light (wavelength: 254 nm), and the fluorescence is observed.
  • the plate is subjected to a linmolybdic acid reaction, and the Rf value of the reaction product matches that of the sample. It was confirmed. Table 3 shows the results. Table 3 Identification of reaction products by TLC
  • Linmolybdic acid reagent Organic compounds containing carbon react with this reagent to give black spots.
  • Table 3 the Rf values of the product and the 4-cholesten-3-on sample were completely identical, confirming the identity of the two. That is, it was confirmed that the product obtained by reacting cholesteryl ⁇ -yl oxidase ⁇ ⁇ with cholesteryl in the presence of oxygen was 4-cholesten-3-on: (2) Based on the amount of hydrogen peroxide generated, the amount of oxygen consumed, and the result of identification of the reaction product determined by the methods described in (a), (mouth), and (c) above, To specifically oxidize cholesterol, to generate hydrogen peroxide, and to oxidize cholesterol to produce 4-cholesten-3-one. It was confirmed to have resterol oxidase activity.
  • the optimal pH range of action is in the range of pH 5.0 to 7.5. Measure each pH
  • the activity was determined by measuring the activity after reaction at 37: 5 for 5 minutes in (acid buffer, Tris-HCl buffer, sodium acetate buffer). At this time, cholesterol oxidase I was similarly measured.
  • Fig. 1 shows the results. As shown in FIG. 1, the optimal pH range of cholesterol oxidase I and cholesterol oxidase I is clearly different.
  • the stable PH range is pH 5.3 to pH5.
  • the measurement was performed at 50 for 60 minutes, and the remaining activity was measured after treatment with each PH (phosphate buffer, Tris-HCl buffer, sodium acetate buffer). The results are shown in FIG. ⁇ .
  • the amount of enzyme that catalyzes the reaction to decompose cholesterol in 1 minute at 37 with oxygen in the presence of oxygen is defined as 1 unit.
  • the enzyme is allowed to act on cholesterol with shaking, and 4-hydroxyaminopyridine and phenol are allowed to act on the resulting hydrogen peroxide in the presence of peroxidase.
  • Leading to quinonymine dyes The absorption of the visible portion of the quinonimine dye thus produced is measured, and the amount of hydrogen peroxide generated is determined to determine the enzyme titer.
  • the lower specific activity was expressed as activity per mg protein (umt / mg).
  • the amount of enzyme protein is measured by the absorbance at 280 ⁇ ⁇ (when the absorbance is 1, lmg Zml).
  • Enzyme activity is measured by reacting hydrogen peroxide generated by the enzyme with 4-aminoantipyrine and phenol in the presence of peroxidase, and quantifying the resulting quinonimine dye. Do.
  • the reaction formula is represented by the following formulas (1) and (2).
  • Cholesterol roll '1 unit of oxidase is 3? "Collect in one minute with C It is the amount of enzyme that degrades sterol by l ⁇ tm o 1 e.
  • the extinction coefficient of quinonimine of ImM is reported to be 5.33 [Klini-Kiryu Chemistry, Vol. 20, p. 470 (1974)]. From the above, the titer (A) per 1 m 1 of the enzyme solution to be determined is determined by defining the 0D 500 ntn of 3 m 1 of the reaction solution obtained by the above operation according to a) below and using b).
  • Reagent blank is a solution obtained by removing the enzyme solution from the reaction solution.
  • Fig. 3 shows the results of examining the optimum temperature at pH 6.6 and a reaction time of 3 minutes.
  • the optimum temperature was around 50 T :.
  • Cholesterol oxidase ⁇ is inactivated at ⁇ ⁇ 8.5 and above.
  • the residual activity was measured by heating for 60 minutes at ⁇ ⁇ 7.0 in 0.05 5 phosphate buffer, and the residual activity was measured. Approximately 10% is deactivated at t, and approximately 83% is deactivated at 60.
  • the Michaelis constant (Km value) of cholesterol oxidase ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ for the substrate cholesterol was 3.0 X 10 — 5 M.
  • the K m value of cholesterol oxidase I was measured to be 1.1 X 1 (] — 3 M.
  • the results of measuring the reaction kinetics of both enzymes at various cholesterol concentrations Is shown in Fig. 5.
  • the K m value of cholesterol oxidase was about 1/100. Therefore, cholesterol oxidase ⁇ against cholesterol The affinity was extremely high and proved to be more suitable for cholesterol quantification. Furthermore, as shown in FIG.
  • the cholesterol saturation curve of cholesterol oxidase II is a so-called Michaelis-Menten type, and the apparent cholesterol oxidase I shows. It does not show the above cholesterol activation phenomenon. This indicates that cholesterol oxidase has a better reactivity than cholesterol oxidase I in the determination of serum cholesterol at low concentrations. I have.
  • the sample of cholesterol oxidase can be further separated and purified into two subunits using reversed-phase high-performance liquid chromatography.
  • Each digest is digested with a protease, for example, triscine, and the digest is fractionated using high-performance liquid chromatography to obtain a digested fragment of proteinase.
  • the amino acid sequence of each digested fragment can be analyzed by a conventional method using an amino acid sequencer.
  • the nucleotide sequence can be analyzed by Sanger's method using Sequence Ver. 2.0 [F. Sanger: Science, 120, 1205 (1981) :.
  • FIG. 1 shows the relative activities of cholesterol oxidase I and ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ at each pH after treatment with 3 to 13 for 5 minutes.
  • G indicates the activity of cholesterol oxidase
  • 10 indicates the activity of cholesterol 'oxidase I.
  • FIG. 2 shows the results of the analysis of choleste D—le oxosidase ⁇ obtained in Example 2. Shows PH stability.
  • FIG. 3 shows the optimum temperature of cholesterol osidase obtained in Example 2.
  • FIG. 4 shows the thermostability of cholesterol oxidase obtained in Example 2.
  • ⁇ indicates thermal stability at 50 and violence indicates thermal stability at 60.
  • FIG. 5 shows the substrate saturation curves of cholesterol oxidase I and ⁇ ⁇ ⁇ by purified cholesterol.
  • ⁇ shows the results for cholesterol oxidase ⁇
  • ⁇ shows the results for cholesterol ⁇ oxidase I.
  • FIG. 6 shows a restriction map of the recombinant plasmid ⁇ ⁇ ⁇ 10.
  • FIG. 7 shows the elution pattern in ion-exchange chromatography of cholesterol monosodium by DEAE-cellulofine.
  • ⁇ indicates the protein concentration of the eluate (OD 28 Onm, mg / m 1)
  • ⁇ indicates the enzyme activity (U / m 1) of the eluate.
  • Figure 8 shows the elution pattern in the gel filtration of Collector sterol Owishidaze ⁇ by scan Parosu p re p 1 2 HR 1 6 /5 0.
  • ⁇ indicates the protein concentration (OD 28 O nm, mg / l) of the eluate
  • the letter indicates the enzyme activity (UZml) of the eluate.
  • Brevibacterium stellolicum ATCC 213887 strain was transferred to LB medium [Bactotripton 10 g / 1, No, Quartz Extract Extract (above, 8 g Z1, NaC 15 g / 1 (pH 7.2) ⁇
  • the cells obtained by shaking culture in 3 Oml at 3 for 3 days are subjected to Hitachi's cooling centrifuge. (RPR 2 0 — 2 D —data) using 4 at 1 0, 0 0 0 r P m,.
  • Centrifugation was performed at 26,000 rpm for 16 hours using a Hitachi ultracentrifuge (SRP 28 n-meter). After centrifugation, fractionation was performed, and a part of each fraction was subjected to a galose gel electrophoresis according to the method described in Molecular Cloning to measure the size of the DNA fragment. Furthermore, only the fractions containing the 0 NA fragment of 3 to 61) were collected and subjected to ethanol precipitation, followed by ligation buffer [Tris-HCl buffer (P P? .6) 6] 6 mM, 5 mM MgCl 2, 5 mM DTT, 1 ATP inM) to obtain a chromosomal DNA solution containing about 5 xg of DNA fragment.
  • ligation buffer Tris-HCl buffer (P P? .6) 6] 6 mM, 5 mM MgCl 2, 5 mM DTT, 1 ATP inM
  • chromosome D partially degraded by S au 3 AI NA solution 3 2 ⁇ 1 and pPROK-C solution 51 decomposed with BamHI were mixed and made up to a total volume of 751 with ligation buffer, and then ⁇ 4D ⁇ ⁇ ligase (Takara Shuzo) 2 The unit was added and the ligation reaction was performed at 16: for 16 hours to obtain a recombinant DNA hybrid.
  • Escherichia coli was transformed using the recombinant DNA mixture obtained in 2) above.
  • the method for preparing a DNA-sensitive bacterium used for the transformation was according to the method of Hanahan et al. Described in Journal of Molecular Biology, Vol. 166, p. After culturing E. coli MM294 strain in LB medium overnight, 0.2 ml of the obtained culture solution is added to 2 O ml of SOB medium cttotripton 20 g / 1, ritois made DOO extract preparative la click DOO 0.05 gi ⁇ top di fucosyltransferase Co.), 1 0 mM N a C 2. 5 m KC 1, 1 0 mM M g C 1 2.
  • a recombinant DNA containing the cholesterol oxidase ⁇ gene was obtained according to the following method. Select colonies that form a clear mouth around the LB solid medium grown above and inoculate the colonies into microtiter plates to determine the presence or absence of cholesterol oxidase activity. Tested. The transformed hay was inoculated into an LB medium containing 0.05% ampicillin, and cultured overnight at 30: c. After suspending the cells in 10 ml of 0.05 MU phosphate buffer (pH 7.0), the cells were disrupted by an ultrasonic disrupter (Cell Dislabter Model 200, manufactured by Branson).
  • pnH10 is Brevibacterium sterolicum ATCC2138? Differs from the known cholesterol oscidase I produced by It was confirmed by the following method that it was a recombinant plasmid containing a gene encoding a so-enzyme. That is to say, nH according to the method described in Molecular Cloning (T. Maniatis, E. F. Flitch, J. Sambrook, Cold Spring Harbor Publishing Company, 1982).
  • the filter prepared as described above was used to prepare a partial sequence of the amino acid of cholesterol oxidase I produced by Brevibacterium 'sterolium ATC C21387 strain.
  • No.1 the sixth base is either T or C, the ninth base is either ⁇ or C
  • the base of the 12th subject is any of A, G, and T
  • the 15th base is any of the A and G, and they are combined to form a mixture of 24 types of synthetic D ⁇ .
  • the probe N 0.2 represented by the sequence No.
  • Escherichia coli Escherichia coli (Escherichia coli) nH10 strain (FERMBP—2850) in an LB medium containing a seed medium containing 0.005% of ampicillin (sterilized) Before PH 7.2) 3 ml was inoculated and cultured with shaking at 3 3t for 18 hours. 3 ml of this seed culture was added to five 2-liter triangular flasks (with baffles) each containing 500 ml of the same medium as the above seed medium. The cells were cultured with shaking for hours. After the culture, the culture was centrifuged with a cooling centrifuge at 10, GOOx g for 2 Q minutes to obtain about 18.6 g (wet cell weight) of the cells.
  • phosphate buffer 1 0.01 phosphate buffer (PH 7.0, hereinafter abbreviated as buffer 1) was added and suspended, and then the ultrasonic cell disrupter (Celdisra) was added.
  • the obtained active fraction was concentrated by adding ammonium sulfate until its saturation reached 60%, and the resulting precipitate was dissolved in a buffer. Furthermore, the solution was concentrated by ultrafiltration to about 2 ml. This was superseded with Superose prep 12 which had been equilibrated with 0.05 M phosphate buffer (pH 7.0) plus 0.3 M NaCl.
  • HR 16/50 (Pharmacia 'Fine' Chemical Co.) passed through a column (1.3 x 50 cm) and passed through an 880 PU pump (Japan) Spectroscopy) and eluted at a flow rate of 3 Qml Zhr.
  • the native sample obtained as described above was subjected to polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the method is described by Davis et al. (BJ Davis et al., Anals' Ob 'New York' Academia 'Ob' Science, Vol. 121.
  • the concentration of cholesterol in the sample may be low due to a high dilution operation or the like, or may be affected by interfering substances such as bilirubin. If the measurement pH must be lowered to around 6 to avoid cholesterol oxidase, a more sensitive and quantitative cholesterol can be used instead of the known cholesterol oxidase. ⁇ Oxidase can be provided industrially at low cost. [Sequence list]
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Brevibacterium. Recomm (Bre v i bact e r i um st er o 1 1 cum)
  • V ⁇ -im usy ⁇ 19 usy ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ 13 ⁇ 4 ⁇ ⁇ IV naq nig ⁇ ngq 2Z V39 3VX DDV DVV 399 DVV 391] ⁇ 3 3iD 93D DDV 3 ⁇ BV9 D3V DID D13
  • Sequence type nucleic acid
  • Oxidase I A synthetic nucleic acid probe that responds to the central part of the polypeptide chain encoded by the structural gene.

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Description

明 細 書
新規コ レステ ロ ール · ォキ シダーゼ
技 術 分 野
本発明は、 配列蕃号 1 で表わされるペプチ ド配列を有し、 かつ下記 の理化学的性質 )〜 ωを有する新規コ レステロール · ォキシダ一ゼ (以下、 コ レステロ ール ' ォヰシダーゼ πと称す。 ） およびその製造 法に関する c
背 景 技 術
コ レステ ロ ール ' ォキ シダーゼは、 コ レステロ ール （ 5-cholesten- 3- ;9 -ol)を基質と して、 酸化反応によ り 4 ーコ レステ ン一 3 —オ ン
(4-cholesten -3- one) と過酸化水素を生ずる反応を触媒する酵素で あり、 臨床検査薬と して、 血中コ レステ ロ ールの定量などに用いられ な
コ レステ ロ ール ' ォキ シダ一ゼは、 シゾフ ィ ラ ム属、 ス ト レブ ト べ ルテ ィ シ リ ゥ ム属、 ブレ ビバク テ リ ゥ 厶属およびス ト レブ ト マイ セ ス 属などに属する微生物によって生産されることが知られており、 既に これらの微生物を用いて、 工業的規模での発酵生産が行われている。 従来、 血中コ レステ Π —ルの定量などに用いられているコ レ ス亍 Π ール ♦ ォキシダーゼは、 基質親和性が低く 、 含有するコ レステ ロ ール の濃度が低い試料の分析や、 試料を希釈した後に測定を行う場合の反 応の定量性に問題点があることが指摘されている。 また、 作用至適 P
H域が比較的狭いので、 試料中の他の成分、 例えばピ リ ルビンなどの 影響を回避するために反応 P Hを酸性側に設定したとき、 反応性の低 下の問題があるとされている。 さ らに、 上記のコ レス テ ロ ール · ォヰ シダーゼ生産菌と して知られる微生物のコ レステロー ル . ォキシダー ゼ生産量はきわめて低く、 また精製の段階において、 夾雑タ ンパク質 を除去するために、 多段階にわたる精製操作が必要である。
そ二で、 高い基質親和性と広い作用至適 P Hを有するコ レステロ一 ル . ォキシダーゼ、 および夾雑タ ンパク質などの併産が少なく 、 コ レ ステ D —ル . ォヰシダ一ゼ生産量が高い微生物の開発が望まれている; 発 明 の 開 示
本発明者は、 基質であるコ レステロールに対する親和性が髙く、 酸 性域においても効率よく作用する性質をもったコ レステロ ール ' ォヰ シダーゼを、 工業的に安価に、 しかも髙純度に製造する方法について 種々検討した。 その結果、 ブレビバクテ リ ウム属に属する菌株より、 既知のコ レステ n —ル * ォヰシダ一ゼとは異なる基質親和性、 作用 p H 域および等電点を有する、 コ レステロ ール ' ォキシダ一ゼのィ ソ酵素 の産生に関与する遺伝情報を担う D N Aを単離し、 このコ レステロ一 ル · ォキシダーゼ遺伝子を含む D N A断片を組み込んだ組換え体 D X Aをエツ シヱ リ ヒ ア属菌種に導入することによって得られた微生物を 用いることにより、 高い基質親和性と広い作用至適 P Hを有するコ レ ステロール . ォキシダ一ゼ Πを収率よく製造できることを見出し、 本 発明を完成した c
本発明によれば、 配列審号 1 で表わされるぺフチ ド配列を有し、 か つ下記の理化学的性質を有するコ レステ α —ル ' ォヰシダ一ゼ Πおよ びその製造法を提供することができる。
( a ) 作用 ：
酸素の存在下コ レステロールを酸化し、 過酸化水素と 4 ーコ レステ ンー 3—ォンを生成する反応を触媒する。
( ) 等電点 ： p H 4. ？
( c ) 基質特異性 ：
コ レステロ ール、 一シ ト ステロ 一リレ、 スチグマステロ ール、 ブレ グネノ ロ ン、 デヒ ドロ イ ソ アン ドロ ステロ ン、 エス ト ラジオールに作 用し、 ビタ ミ ン D 3 、 コ ール酸、 アン ド π ステロ ン、 コ レステロ ール リ ノ レー ト、 ラ ノ ステロールは基質としない。 ( d ) 至適 p Hおよび安定 p H範囲 ：
至適 P Hは 5. 0〜7. 5であり、 5 0 ΐ：、 6 0分間の加熱条件下では Ρ Η 5. 3〜7. 5の範囲内で安定である。
( e ) 作用適温 ： 5 0 t:付近に至適作用温度を有する。
( f ) p Hおよび温度による失活の条件 ：
5 0 t、 1 時間の加熱条件下では、 p H 1 0. 0以上または p H 4. 0 以下で失活する。 また、 P H 7. 0、 6 (1 で、 1時間の熱処理.で約 8 3 %失活する。
( g ) 阻害および安定化 ：
p 一ク ロ ロマ—キュ リ ベンゼンスルホネー ト、 硝酸銀、 0 ーヒ ドロ キシキノ リ ンにより阻害を受ける。 また、 牛血清アルブ ミ ンを共存さ せることにより、 耐熱性および保存安定性が向上する。
( h ) コ レステ D —ルに対する ミ ハエ リ ス定数（km値） ： 3. (] x 10— 5 -M . ( i ) 分子量 ： 約 4 3, Q 0 0 (ゲル濾過法）
約 6 0. 0 Q 0 (電気泳動法）
6 6. 5 8 6 ( D A配列）
以下に、 本発明を詳細に説明する。
コ レステロ ール ' ォキ シダーゼ Π は、 従来コ レステロール ' ォキシ ダーゼ生産菌と して知られているブレビバクテ リ ゥム · ステロ リ カム A T C C 2 1 3 8 7株 （特公昭 4 8 — 1 1 9 0 ) より新たに分離され た酵素であり、 従来の AT CC2138 7 株由来のコ レステロール · ォヰ シダ ーゼ （以下コ レステロ ール ' ォキシダ一ゼ I と称す） とは、 以下のよ うな点で性質の異なる新規酵素である。
( 1 ) 等電点 ：
コ レステロール · ォキシダ一ゼ Πが p H 4. 7 であるのに対し、 コ レ ステロール ' ォキシダーゼ I は p H 8. 9 である。
( 2 ) 基質特異性 ：
コ レステロール ' ォキシダ一ゼ I および Πの基質特異性を第 1表に 示す。
Figure imgf000006_0001
( 3 ) 作用至適 p H ：
コ レステ ロ ール . ォキシダーゼ 1 1が p H 5. 0〜 7. 5 であるのに対し コ レステロール · ォキシダ一ゼ I は p H 6. 0〜了. 5 である。
( ) コ レステ Ώ—ルに対する ミ ハエ リ ス定数 （km値） ：
コ レステロ ール ' ォキシダ一ゼ 1 1が 3. 0 X 10— 5M であるのに対し、 コ レステロール · ォキシダーゼ I は 1. 1 X 1 0— 3Mである。
( 5 ) 阻害剤の影響 ：
阻害剤 （ 1 m l) を添加したときのコ レステ ロ ール ' ォキシダ一ゼ I および Uの酵素活性を、 阻害剤無添加時の酵素活性を 1 0 0 とし、 第 2表に示す c
Figure imgf000007_0001
( 6 ) 分子量 ：
東洋曹達社製 T S K G 3 0 0 0 S W塔を用いて分析したと ころ、 その溶出パタ ーンから 3, 000 と推定される。 また S D S — P A G E を用いて分析したと ころ、 その移動度から 6 0， 0 0 0 と推定される。 D X A配列から計算された分子量は 66, 586である。 これに対し、 コ レ ステ π—ル . ォキ シダ一ゼ I の場合は、 フ ア ルマ シア社製セフ アデッ クスゲルろ過担体を用いた分析により 33, 000、 S D S — P A G Eを用 いた分析により 5 5, 0 0 0 と推定されている。
コ レステ ロ ール · ォキ シダーゼ Πの生産は、 コ レステ ロ ール · ォキ シダーゼ Π生産能を有する微生物を培養することにより行う ことがで きる。
コ レステ ロ ール ' ォヰ シダ一ゼ Πは、 ブレビバク テ リ ゥ ム · ステ ロ リ カ ム由来の新規酵素であるが、 その活性発現量はごく 微量であり、 ブレビバクテ リ ウ厶 · ステロ リ カ ム菌種を通常培養して得られる培養 液からは、 分離精製が因難である。 従って、 ブレビバタテ リ ゥム ' ス テロ リ カ厶菌種の染色体 D N Aより コ レステ ロ ール · ォキシダーゼ n をコー ドする遺伝子を単離し、 適当な宿主 · ベク タ ー系を用いて該遺 伝子を増幅することにより、 コ レステ π—ル ' ォキシダーゼ Π生産菌 を得ることができる。
^下に、 コ レステ ロ ール ' ォキシダーゼ Π生産菌の造成について說 明する。
ブレビバクテ リ ゥ厶属に属する菌株からのコ レステロール · ォキシ ダーゼ Π遺伝子のシ ョ ッ トガン · クロ一ニングは、 大腸菌を宿主とし て直接活性発現を指標とした検索により行うことができる。 直接活性 発現を指標とした検索については例えば、 形質転換体の菌体を直接酵 素源として用いるか、 リ ゾチームなどで溶菌し、 得られた細胞内容物 を用いて酵素活性を測定する方法や、 培地中にコ レス-テ α—ルを混合 しておき、 菌体外に微量漏出する酵素活性によるコ レステロールの酸 化にともなう清澄なハロ一形成を観察することによって行うことがで きる。
ブレビバク テ リ ゥ ム属に属する菌株からのコ レステロ ール · ォキ シ ダーゼ Π遺伝子を含む染色体 D Ν Αの単雜は常法に従って、 例えば、 分子生物学実験マニュ アル （R. F. シュ ラ イ フ、 P. C. ゥェ ンシ ンク著、 川上正也、 山崎達美訳、 講談社サイ ェ ンティ フ イ ク、 1 9 8 3年発行） に記載された方法によって行う ことができる。
ついで、 上記で得られた染色体 Aをべクタ一 DN Aに組み込ん で、 組換え体 D X Aを調製する。 染色体 Aの組み込みは、 常法に 従って、 例えば染色体 D λ' Aおよびべクタ一DN Aを適当な制限酵素 で切断して染色体 DN A断片およびべクター DN A断片を調製した後、 両者の混合物を D N Aリガーゼで処理することによつて行うことがで きる。 こ こで用いられるベクタ一 D N Aとしては、 大腸菌を宿主とす る二とが可能なプラス ミ ドであればすべて可能であり、 とりわけ pじ C 13や p P R〇 K一 Cなどが好適に用いられる。 また、 制限酵素と し て：ま、 例えば、 B a mH I、 S a u 3 A Iなどが挙げられる。 S a u 3 A Iの切断部位は、 B a mH Iでの切断部位と同じ構造の突出末端 を生じるため、 組換えのためのライゲーシヨ ンが可能であり、 染色体 0>： を3 & 11 3 1で限定分解して得られる DMA断片を、 B a m H Iで切断したベクタ一 D X A断片と連結することができる。 D A リ ガーゼと しては、 T 4 フ ァ ージ感染大腸菌由来の T 4 D N A リ ガ一 ゼが好適に用いられる。
ついで、 上記方法で得られた組換え体 D N Aは、 常法に従って、 例 えば、 モレキュ ラー · ク ロ 一ニング （T . マニアチス、 E . F . フ リ ツチ、 J . サムブルッ ク著、 コ ール ドスプリ ングハーバ一出版社、 1 9 8 2年） に記載の方法によって大腸菌に導入することができる。 組 換え体 D N A (すなわちコ レステロ ール · ォキシダーゼ Π遺伝子を含 む D N A断片を組み込んだベク タ ー D N A ) を保有する菌株の選択方 法は、 次のよう に して行う ことができる。 すなわち、 菌株を 0. 1 %コ レステロール、 0. 1 % ト リ ト ン X — 1 0 0 、 0. 0 0 2 5 %アン ピシ リ ンを含む L B固体培地で培養し、 生じたコ ロニーのう ちコ ロニー周辺 に清澄なハロ ーを形成しているものを選択する。 ついで、 それらのコ ロニーをマイ ク ロタ イ タ ープレー 卜 に植菌し、 コ レステロ ールォキ シ ダ―ゼ活性の有無を検定する。 このよう に して得られる組換え体ブラ ス ミ ドの一例が、 p n H 1 0 である。 得られたプラス ミ ド p n H 1 0 を保有する微生物と して、 エ ツ シ ェ リ ヒ了 · コ リ π H 1 0 が挙げられ る。 該菌株は、 平成 2年 4 月 5 日付で、 工業技術院微生物工業技術研 究所にエ ツ シヱ リ ヒア · コ リ II Η 1 0 ( F E R B P - 2 8 5 0 ) と して、 ブダぺス ト条約に基づいて寄託されている。
上記のよ うに して得られたコ レステロール · ォヰシダーゼ I [生産菌 は、 栄養培地で培養することによ り、 培養菌体および培養上清中に著 量のコ レステロ ール · ォキ シダ一ゼ Πを蓄積する。
コ レステ π —ル · ォキシダーゼ Π生産菌の培養に用いられる培地と して；ま、 炭素源、 窒素源、 無機物などを舍有する合成培地または天然 培地のいずれも使用できる。 炭素源と しては、 例えば乳酸、 グリ セ σ —ル、 糖蜜など種々の炭水化物が用いられ、 その使用量は 5 〜 7 0 g / 1 程度が好ま しい。 また、 窒素源と しては、 例えば硫酸アンモニゥ ム、 リ ン酸アンモニゥ厶、 炭酸アンモニゥム、 酢酸アンモニゥ厶、 あ . るいはペプト ン、 酵母エキス、 コーン ' スティ ープ ' リ カー、 カゼィ ン加水分解物、 肉ヱキスなどの窒素含有有機物などが用いられ、 その 使用量は、 5〜 2 0 1程度が好ましい。 さ らに、 無機物と しては、 例えば、 塩化ナ ト リ ウム、 リ ン酸第一水素力 リ ゥム、 リ ン酸第二力 リ ゥム、 硫酸マグネシウム、 塩化マグネシウムなどが用いられ、 その使 用量は 0. 0 5〜 5 g Z 1程度が好ましい。 培養は、 振盪培養または通 気攪拌培養などの好気的条件下に行われる。 培養温度は 3 0〜 3 7 t が好適であり、 培養期間は通常 16〜40時間程度である。
培養を終了した培養液から、 コ レステロール ' ォキシダーゼ Πを採 取するには、 上記培養液から遠心分離などの方法で菌体を集め、 得ら れた菌体を超音波処理、 ガラスビーズを用いる磨砕処理、 フレンチプ レス処理などによって破砕し、 酵素を抽出する。 抽出液は、 これを硫 安塩析法、 ィォン交換樹脂を用いるクロマ トグラフィ ー、 ゲル濾過法、 ヒ ドロキシァパタイ ト吸着樹脂を用いるク ロマ トグラフィ ーなどの常 法により処理して、 精製コ レステロール ' ォキシダーゼ Πを得ること ができる。 菌体外に蓄積する酵素については、 菌体破砕の操作を省略 する以ク ま上記と同様に行い、 コ レステ ロ ール ' ォキシダ一ゼ Dを取 得できる。
このようにして得られたコ レステロール · ォキシダーゼ Πの理化学 的性質について、 以下に詳述する （なおコ レステロール · ォキシダー ゼ Πは、 実施例 2で得られた精製標品を用いた） 。
I . 作用
酸素の存在下コ レステロールを酸化して、 過酸化水素と 4 ーコ レス テン一 3 —オンを生成する反応を触媒する。
(ィ） 過酸化氷素の生成の確認
酸素の存在下コ レステロールにコ レステロール · ォキシダーゼ Πを 作用させ、 ついで該酵素系にパーォキシダーゼ、 フヱノ ール、 4 一了 ミノアンチビリ ンを加えて反応させると、 反応系にキノ ンィ ミ ン色素 が生成する。
反応組成
1.0 ml 3m コ レステ ロ ール、 1.0%ト リ ト ン ) (-100水溶液
0.3 ml 50m¾lコ一ル酸ナ ト リ ゥ ム水溶液
0.3 ml 0.5M Na- リ ン酸緩衝液（PH 6.0)
0.5 ml 42mM フ ュ ノ ール水溶液
0.5 ml 2.4mM 4-ァ ミ ノ ア ンチ ピ リ ン水溶液
0.2 ml 2mg/mlパーォキ シダーゼ （東洋紡社製、 比活性 115単位/ mg 蛋白）
0.2 ml コ レステロール · ォキ シダ一ゼ Π水溶液 （0.5 単位） 反応組成に示した各試薬を混ぜ、 3 7 tで攪拌下、 発生する過酸化 水素量を生成したヰノ ンィ ミ ン系色素の比色定量によって求めた。 即 ち、 上記の系において生成した過酸化水素を、 ク リ ニ力ルケ ミ ス ト リ —第 2 0巻、 4 7 0頁 （ 1 9 7 4年） に記載の方法で定量した結果、 0. 1 ΰ u rn 0 】 eのコ レステ ロ ールから◦. 1 9 〃m o 1 eの過酸化水 素の生成が確認された。
酸素消費の確認
酸素の存在下、 コ レ ステ ロ ールにコ レステ ロ ール · ォキ シダーゼ Π を作用させ、 消費される酸素の量をヮールブルグ検圧計によつて測定 ) 十
反応組成
1.0 ml 3mM コ レステ ロ ール、 1.5%ト リ ト ン X— 1 0 0水溶液
0.3 ml 50mMコ ―ル酸ナ ト リ ゥ ム水溶液
0.3 ml 0.5M a-K リ ン酸緩衝液（PH 6.0)
0.5 ml 42mMフ ヱ ノ ール水溶液
0.5 m 1 2.4m M 4-ァ ミ ノ ア ンチ ピ リ ン水溶液
0.2 ml 2 mg/tnl パーォキ シダーゼ （東洋紡社製、 比活性 115 単位
/mg蛋白） 0.2 ml コ レステロ ール ♦ ォキシダーゼ Π水溶液 （0.5 単位） 反応組成に示した各試薬を混ぜ、 3 7 tで攪拌下、 酸素吸収により 生ずる反応容器内外の気体の圧力差を、 一端を容器に連結し他端を外 気と連結した円筒中のマノ メ一ター液の異動によって解消させ、 その 際のマノメ一ター液の移動量を測定した。 該マノメ ータ一液の移動量 は次式 （ゥ 厶ブレイ ト ' ブリ ス ' スタウフ ァ ー著 ： マノ メ ト リ ッ ク · アン ド ' ビォケミカル · テクニッ クス、 第 5版、 第 5章） によって、 標準状態の理想気体の消費量に換算される。
2 7 3 ( P— P w) X Δ V g
V =
7 6 0 K X T 二こで、 Vは標準犹態における理想気体の消費量 （単位 " 1 ) 、 P は測定時の大気圧 （単位 mmHg) 、 P wは測定時の反応温度における水 蒸気圧 （単位 mmHg) 、 Tは測定時の反応温度 （単位 K° ) 、 A V gは マノメ ータ一液の移動量 （単位 1)、 Kは容器定数 （単位 m2) である ( また標準状態において 1 1 の気体は 0. 0 4 4 6 unioleに相当する c 測定結果より、 1. 5 m o 1 eのコ レステ。一ルと コ レステロ ール • ォキシダーゼ Πを反応させると、 1. 4 3 m 0 1 eの酸素が消費さ れることが確認された。
(ハ） 4 —コ レステ ン一 3 —オ ンの生成の確認
酸素の存在下、 コ レステ 1 ルにコ レステロ ール · ォキ シダーゼ Π を作用させ、 反応生成物を 4 ーコ レステ ン一 3 —ォ ンと同定した。
同定の手順
1 ) 反応液
6.0 ml 50mMコ レステロ ール、 エタ ノ ール溶液
5.0 ml 50mMコ ール酸ナ ト リ ウ ム水溶液
1.5 ml ト リ ト ン X— 1 0 0
5.0 ml 0.5 \'a- リ ン酸緩衝液（pH 7.5) 1 3. Om l コ レステロール ' ォキシダ一ゼ Π水溶液 （19単位）
19. 5m l 水
2 ) 反応操作
上記反応液を 3 7 でで振盪下に反応させ、 3 0分後、 3時間後、 16 時間後に 5 0 ずつ試料採取を行い、 5 0 のへキサンと混合した後, 上清を 取り、 3 ) の同定操作を行った。
3 ) 同定
この反応液中の生成物は以下に示す薄層ク ロマ トグラフィ ー （以下 T L Cと略す） の結果、 4 —コ レステン一 3 _オ ンであると同定した： 使用した薄層プレー トはシ リ カゲル · G _ 6 0 F— 2 5 4 (商品名、 Eメ ルク社製） で、 展開溶剤は溶剤系 〔へキサン ： 酢酸ェチル = 3 ： 2 (容量比） 〕 である。 展開後、 プレー トを紫外線 （波長 2 5 4 nm ) 照射下、 蛍光発色を観測した後、 リ ンモ リ ブデン酸反応を行って、 反 応生成物の R f 値が標品のそれらと一致することを確認した。 結 果を第 3表に示す。 第 3表 T L Cによる反応生成物の同定
Figure imgf000013_0001
注） リ ンモ リ ブデン酸試薬 ： 炭素を含む有機化合物は、 本試薬と反応して黒色のスポ ッ トを与える。 第 3表に示したように、 生成物と 4 ーコ レステン一 3 —オ ン標品の R f 値が完全に一致することから両者の同一性が確認された。 即ち酸素の存 在下、 コ レステ 一ルにコ レステ π—ル · ォキシダーゼ Πを作用させて 得られる生成物が、 4 —コ レステ ン一 3 —オ ンであることが確認された: (二） 上記の （ィ） 、 （口） 、 （ハ） に記載された方法によって求め られた過酸化水素生成量、 酸素の消費量、 反応生成物の同定結果により 下式に従って、 本酵素がコ レステロ ールを特異的に酸化すること、 過酸 化水素を発生させること、 コ レステロ ールを酸化して 4 —コ レステ ン一 3—ォンを生成すること、 即ち、 本酵素がコ レステロールォキシダ一ゼ 活性を持つことが確認された。
+ H202
Figure imgf000014_0001
Π . 至適 p Hおよび安定 p H範囲
作用至適 p H域は、 p H 5. 0 〜 7. 5の範囲にある。 測定は、 各 p H
( ン酸緩衝液、 ト リス塩酸緩衝液、 酢酸ナ ト リ ゥム緩衝液） におい て、 3 7 :で 5分間反応後の活性を測定することにより行った。 この とき、 コ レステロ ール · ォキシダーゼ I についても同様に測定を行つ た。 結果を第 1図に示す。 第 1図に示したように、 コ レステロ ール ' ォキシダーゼ Πとコ レステロール · ォキシダーゼ I の作用至適 p H域 は、 明らかに異なる。
安定 P H範囲は p H 5. 3〜了. 5である。 測定は、 5 0 でで、 6 0分 間、 各 P H (リ ン酸緩衝液、 ト リス塩酸緩衝液、 酢酸ナ ト リ ゥム緩衝 液） で処理後、 残存活性を測定した。 結果を第 2図に示す。 Π. 力価の測定法
酸素の存在下、 3 7 でで 1分間にコ レステ ロ ールを l m o 1 e分 解する反応を触媒する酵素量を 1単位 （ュニッ ト、 unit) とする。 力 価の測定は、 コ レステ ールに酵素を振盪しながら作用させ、 生成す る過酸化水素に、 パーォキシダーゼの存在下、 4 —ァ ミ ノ アンチピリ ンと フ ヱ ノ ールを作用させ、 キノ ンィ ミ ン色素に導く 。 この生成した キノ ンィ ミ ン色素の可視部の吸収を測定して、 発生した過酸化水素量 を求めることによって酵素の力価を測定する。 なお、 下比活性は蛋 白ノ mgあたりの活性 （umt/mg ) で表示した。 また、 酵素蛋白量は 2 8 0 τι τηの吸光度 （吸光度 1 のとき、 l m g Zm l ) によって測定し ィ） 原理
酵素活性の測定は、 酵素によって発生する過酸化水素を、 パーォキ シダーゼの存在下に、 4 —ァ ミ ノ アンチピリ ンとフヱノ ールを反応さ せ、 生成したキノ ンィ ミ ン色素を定量することによって行う。 反応式 は次式 （ 1 ) 、 （ 2 ) で示される。
Figure imgf000015_0001
バーオキシダ一ゼ
2H202 +
Figure imgf000016_0001
4·ァミノアンチビリン
Figure imgf000016_0002
(口） 操作
細型試験管に 3 mMコ レステロ一ル溶液 （ 5 O mMのコ レステロ一 ルのエタ ノ 一ル溶液 6 m 1を、 9 4 m I の 1. 0 5 % ト リ ト ン X— 100 溶液中に攪拌しながら加え、 湯煎中で 1 0分間加熱した後、 水中で冷 却し、 蒸留水を用いて 1 0 0 m 1 とし、 1. 0 % ト リ ト ン X— 1 0 0溶 液とする。 調製後 30分以内に使用する） 1. Q m I 、 5 0 mM 胆汁酸 ナ ト リ ウ厶溶液 0. 3 m l 、 0. 5 Mリ ン酸カ リ ウム一ナ ト リ ウム緩衝液
( p H 6. 6 ) 0. 3 m l、 4 2 mMフ ヱ ノ ール 0. 5 m l 、 2. 4 mM 4 — ァミ ノ アンチピ リ ン 0. 5 m 1 、 1 1 5単位 Zm 1 西洋ヮサビ由来パー ォキシダーゼ 0. 2 m 1 を入れ、 混合する。 ついでこれを 3 7 tで 3分 P 保温した後、 酵素溶液 0. 2 m 1 を添加する。 振盪しながら 3 7 でで 5分間ないし 1 0分閜反応を行った後、 5 0 0 n mの吸光度 （J¾下 0D 500nm) を測定した。
(ハ） 力価の計算法
コ レス干ロール ' ォキシダーゼの 1単位は、 3 ？ "Cで 1分間にコ レ ステロールを l ^tm o 1 e分解する酵素量である。 一方、 I mMのキ ノ ンィ ミ ンの吸光係数は 5. 3 3 と報告されている 〔ク リニ力ルケ ミ ス ト リ ー， 第 2 0巻， 4 7 0頁 （ 1 9 7 4 ) 〕 から、 求める酵素溶液 1 m 1 あたりの力価 （ A) は、 前記操作で求められた反応液 3 m 1 の 0D 500ntn を下記 a)によって規定し、 b)を用いて算出する。
a ) Γ (酵素 · 基質を共に含む反応液の 0D500nni)より （基質を除いた 反応液の OD500nm)を差し引いたもの〕 から 〔 （試薬ブラ ンク の 0D500 nm) より （試薬ブラ ンク から基質を除いた溶液の OD500nm)〕 を差し引 いたものを ΔΕと規定する。
b ) ΔΕ ÷ 5.33 ÷時間（min) x 3 x希釈率 = A酵素溶液の力価 （単 位/ ml)
注 1 ： 試薬ブラ ンク とは反応液中から酵素溶液を除いた溶液をいう。
IV. 作用適温の範囲
P H 6. 6、 反応時間 3分間における至適温度を検討した結果を第 3 図に示す。 至適温度は 5 0 T:付近に存在した。
V. ρ Ηおよび温度による失活について
コ レステロール ' ォキシダーゼ Πは、 ρ Η 8. 5以上で失活する。 ま た、 0. 0 5 Μ リ ン酸緩衝液中、 ρ Η 7. 0で 6 0分間加熱処理して、 残 存活性を測定したところ、 第 4図に結果を示したように、 5 0 tで約 1 0 %、 6 0 で約 8 3 %失活する。
VI. 基質親和性
コ レステロール · ォキシダーゼ Πの基質コ レステロールに対する ミ ハエ リ ス定数 （K m値） は 3. 0 X 1 0 — 5Mであった。 一方、 コ レス テロール . ォキシダーゼ I の K m値は実測の結果、 1. 1 X 1 (] — 3Mで あった。 両酵素の種々のコ レス テ ロ ール濃度における反応速度を計測 した結果を、 第 5図に示す。 コ レステ n—ル ' ォキシダーゼ I に对し、 コ レステ ϋール · ォキシダーゼ Πの K m値は、 約百分の 1 であった。 従って、 コ レステロール · ォキシダーゼ Π コ レステロールに対する 親和性は極めて高く 、 コ レステロ一ルの定量により適していることが 判明した。 さらに、 第 5図に示したように、 コ レステロ ール · ォキシ ダーゼ Πの示すコ レステロール飽和曲線は、 いわゆる ミハエ リ ス · メ ンテン型であり、 コ レステロ ール ' ォキシダ一ゼ I の示す見かけ上の コ レステロ ールによる活性化現象を示さない。 このことは、 コ レステ π—ル ' ォキシダーゼ Πが低濃度域での血清コ レステロ一ルの定量に おいて、 コ レステロ ール · ォキシダーゼ I に優る良好な反応性を有す ることを示している。
なお、 ミハエ リ ス定数の求め方は、 H . ラ イ ンウ ィ ーバーら、 ジャ ーナル ォブ アメ リ カ ン ケ ミ カ ル ソサイ エテ ィ 一、 第 5 6巻、 6 5 8頁 （ 1 9 3 4 ) の記載に従った。
. コ レステロ ール . ォキシダーゼ IIのァ ミ ノ酸配列および塩基配列 の決定
コ レステ n—ル · ォキシダ一ゼ Πの標品はさ らに、 逆層高速液体ク 口マ トグラフィ 一を用いて、 2つのサブユニッ トに分離、 精製するこ とができる。 各サブュニッ トをプロテアーゼ、 例えば、 ト リブシンに より消化し、 消化物を高速液体ク口マ トグラ フィ ーを用いて分画する ことによって、 プロテ了ーゼ消化断片が得られる。 各消化断片のア ミ ノ酸配列は、 アミ ノ酸シーケ ンサーを用いる通常の手法によって分析 できる。
塩基配列はシ一ケナ一ゼ Ver 2. 0を用いるサンガーの方法によって 分析できる 〔F.サンガー著 ： サイ エ ンス、 ϋ， 1205 ( 198 1) ： 。
図面の簡単な説明
第 1図は、 コ レステロ ール ' ォキシダーゼ Iおよび Πの、 3 ? 13で 5分間処理した後の各 P Hにおける相対活性を示す。 図中、 Gはコ レ ステ□ール . ォキ シダーゼ Π、 ⑩はコ レステロ ール ' ォキ シダーゼ I の活性を示す。
第 2図は、 実施例 2 で得られたコ レステ D —ル · ォキ シダーゼ π の P H安定性を示す。
第 3図は、 実施例 2で得られたコ レステロール · ォヰシダーゼ Πの 至適温度を示す。
第 4図は、 実施例 2で得られたコ レステロ ール · ォキシダーゼ Πの 熱安定性を示す。 図中、 〇は 5 0 でにおける、 暴は 6 0 における熱 安定性を示す。
第 5図は、 コ レステ ロ ール ' ォキシダ一ゼ I および Πの、 精製標品 のコ レステロールによる基質飽和曲線を示す。
図中、 Αはコ レステ ロ ール ' ォキシダーゼ Π、 Βはコ レステ ロ ール ♦ ォキシダーゼ I についての結果を示す。
第 6図は、 組換え体プラス ミ ド ρ η Η 1 0 の制限酵素地図を示す。 第 7図は、 D E A E —セルロ フ アイ ンによるコ レステロ一ゾレ ' ォヰ シダ一ゼ Πのイ オ ン交換ク ロマ トグラフィ 一における溶出パター ンを 示す。 図中、 〇は溶出液の蛋白濃度 （O D 2 8 O n m、 m g /m 1 ) を、 ·は溶出液の酵素活性 （U /m 1 ) を示す。
第 8図はス ーパーロース p r e p 1 2 H R 1 6 / 5 0 によるコ レ ステロール · ォヰシダーゼ Πのゲルろ過における溶出パター ンを示す。 図中、 〇は溶出液の蛋白濃度 （ O D 2 8 O n m、 m g / l ) を、 書 は溶出液の酵素活性 （UZm l ) を示す。
発明を実施するための最良の形態
実施例 1. コ レステロール · ォキシダーゼ Π遺伝子のク ローニング 1 ) コ レステ D —ル · ォキシダーゼ Π遺伝子を含む染色体 D N Aの調 製
ブレビバクテ リ ウ厶 · ステロ リ カ厶 A T C C 2 1 3 8 7株を L B 培地 〔バク ト ト リ プ ト ン 1 0 g / 1 、 ノ、'ク トイ ース ト エキス ト ラ ク ト (以上、 ディ フコ社製） 8 g Z 1、 N a C 1 5 g / 1 ( p H 7. 2 ) ■ 3 O m l 中、 3 で 3 日間振盪培養して得られた菌体を、 日立製冷 却遠心機 （R P R 2 0 — 2 D —タ一） を用いて 4 でで 1 0, 0 0 0 rPm 、. 1 0分間遠心して集菌し、 1 0, 3 %ショ糖溶液で洗浄後再び遠心して 菌体を集め、 カ レン ト · ト ピッ クス ' イ ン ' マイ クロノ、'ィ ォロ ジー ' アン ド · ィ 厶ノ ロジー 第 9 6巻 （ 1 9 8 2 ) に記載されている方法 で全染色体 DN Aを抽出し、 約 1 m gの染色体 D N Aを得た。
2 ) 染色体 D NA断片のベクター D N Aへの導入
上記 1 ) で得られた全染色体 D N A 7 2 X gをとり、 M緩衝液 〔 ト リス一塩酸緩衝液 （ p H7. 5 ) 1 0 mM、 M g C l 2 1 0 mM、 N a C I 5 O mM、 D T T (ジチオス レィ ト ール） l mM〕 1, 0 0 0 nil に溶解して、 制限ェ ン ドヌク レアーゼ S a u 3 A I (宝酒造社製） 3.6 単位を添加し、 3 7 tで 3 0分間限定分解を行った。 ついで、 これを モレキュラー ' クロ一二ングに記載されている方法に従って、 1 0〜 4 0 %ショ糖密度勾配遠心法により分画を行った。 遠心は、 日立製超 遠心機 （ S R P 2 8 n—ター） を用い、 で 26, 0 0 0 r p m、 1 6時間行った。 遠心後、 分画を行い、 各分画の一部をモレキュ ラ ー . クロ一二ングに記載されている方法に従って了ガロースゲル電気泳 動を行い、 D N A断片の大きさを測定した。 さらに、 3〜 6 1)の0 N A断片を含む分画のみを集めてエタノ ール沈澱を行った後、 ライゲ ーシ ョ ン緩衝液 〔 ト リス一塩酸緩衝液 （ P Η?. 6 ) 6 6 mM、 M g C l 2 5 mM、 D T T 5 mM、 A T P 1 inM) 6 0 1 に溶解して 約 5 x gの D N A断片を含む染色体 D N A溶液を得た。 また、 ベクタ 一として使用する P P R〇K— C (クローンテック社製） 1 0 i gを、 M緩衝液 3 0 0 i 1 に溶解して、 制限ェン ドヌ タ レ了ーゼ B a mH I (宝酒造社製） 4 0単位を添加し、 3 7 tで 3時間反応を行って完全 分解した後、 1 Mト リ ス一塩酸緩衝液 （ p H8. 6 ) 2 0 1 と仔牛小 腸由来アル力 リ性ホス フ ァ ターゼ 4単位を添加し、 3 7 tで 1 時間反 応を行い、 脱リ ン酸化を行った。 さらに 6 5 t:で 1 0分間加熱して酵 素を失活させ、 エタノ ール沈澱を行った後、 8 0 1 のライゲーシ ョ ン緩衝液に溶解した。 ついで、 S a u 3 A Iで部分分解した染色体 D N A溶液 3 2 β 1 と B a mH I で分解した p P R O K— C溶液 5 1 を混合し、 ライゲーシヨ ン緩衝液で全量 7 5 1 にした後、 Τ 4 D Ν Α リガーゼ （宝酒造社製） 2単位を添加し、 1 6 :で 1 6時間、 連結 反応を行い、 組換え体 D N A混成物を得た。
3 ) 大腸菌の形質転換
上記 2 ) で得られた組換え体 D N A混成物を用いて、 大腸菌を形質 転換した。 形質転換に用いる D N A感受性菌の調製法は、 ジャ ーナル • ォブ . モレキュ ラー · バイ オロジー 第 1 6 6巻 5 7 7頁に記載 されているハナハンらの方法に準じた。 大腸菌 MM 2 9 4株を、 L B 培地で一晩培養後、 得られた培養液 0. 2 m l を 2 O m l の S O B培地 ク ト ト リ プ ト ン 2 0 g / 1 , り ト イ 一ス ト エキス ト ラ ク ト 0.05 g i^上ディ フコ社製） 、 1 0 mM N a C 2. 5 m K C 1、 1 0 mM M g C 1 2 . 1 0 m M M g S〇 4 ( P H7. 0 ) 〕 に植菌 し、 3時間培養後、 フ ァ ルコ ン 2 0 7 0試験管に移し、 氷中に 1 5分 間おき、 4 :で遠心し菌体を集めた。 7 m 1 の T F B [ 1 0 m M グ M E S緩衝液 （ p H 6. 2 0 ) 、 1 0 0 mM R b C 1、 5 m n C 1 2 . 1 0 m C a C 1 2、 3 m M へキサ ミ ン コ バル ト ク 口 ライ ド〕 に懸濁し、 氷中で 1 5分間静置した。 菌体を遠心分 離によって集め、 1. 6 m 1 の T F Βに再び懸濁した。 得られた懸濁液 に 5 6 u 1 のジメチルスルホキシ ドを加え、 氷中で 5分間緩やかに攪 拌した後、 5 6 1 の 9—メ ルカプトエタノ ールを加え、 氷中で 1 0 分間緩やかに攪拌した。 5 6 i 1 のジメ チルスルホキシ ドを加え、 氷 中で 5分間緩やかに攪拌して得られた菌体を、 D N A感受性菌と して 形質転換に使用した。 得られた D N A感受性菌液 2 1 0 】 をフ ア ル コ ン 2 0 5 9試験管に入れ、 2 ) で作製した組換え体 D N A混成物 1 0 M 1 を加え、 緩やかに攪拌した後、 氷中で 3 0分間静置した。 4 2 の恒温槽中で 9 0秒間加熱し、 氷中に移して 2分間保った。 これに 8 0 G ; 】 の S O C培地 （ S O B培地に 2 O mMグルコースを加えた もの） を加え、 37tで 1時間振盪培養した。 得られた培養液を、 0. 1 %コ レステロ ール、 0. 1 %ト リ ト ン X— 1 0 0、 0.0025%ァン ピシ リ ンを舍む L B固体培地に接種し、 37 :で一晩培養し、 生育してきたコ ロニーを形質転換株として取得した。
4 ) コ レステロール · ォキ シダーゼ E遺伝子を含む組換え体 D N Aを 保有する形質転換株の選択
上記 3 ) で得られた形質転換株よりコ レステロ ールォキシダーゼ Π 遺伝子を含む組換え体 DN Aを、 以下の方法に従って取得した。 上記 L B固体培地上に生育した周辺に清澄なハ口一を形成しているコロニ 一を選択し、 それらのコ ロニーをマイ クロタイ タープレー トに植菌し、 コ レステロールォキシダ一ゼ活性の有無を検定した。 活性を検出した. 形質転換秣は、 0. 0 0 5 %のアンピシ リ ンを舍む L B培地に植菌し、 3 0 :で一晩培養した c 培養終了後集菌し、 得られた菌体を、 1 0 m 1の 0.05M Uン酸緩衝液 （p H7. 0 ) に懸濁後、 超音波破砕機 （セル ディスラブタ一モデル 2 0 0、 ブラ ンソン社製） により菌体を破砕し (出力 4 0 %、 1 0分間） 、 遠心後得られた上清について前記の方法 でコ レステ π—ル · ォキシダ一ゼ活性を測定した。 このようにして高 いコ レステロ ール ♦ ォキシダ一ゼ活性を有する形質転換株ェッ シヱ リ ヒ 了 · コ リ II H 1 0株を得た。 形質転換株 n H 1 0より保有する組換 え体プラス ミ ド DN Aを回収し、 p n H I Oを得た。 p n H l Oの構 造を、 H i n d m, F s t l , S a i l , X o I , K p n I , A p a I , B amH I , M 1 u I T E c o R I , S m a I , S e a lで切 断して、 ァガロースゲル電気泳動法にて確認した結果、 ベクターであ る p P ROK— Cに、 揮入遺伝子である約 3. 0 k bの D N A断片が組 み込まれた構造を有していた （第 6図参照） 。
5 ) クローン化したコ レステ D —ル . ォキシダーゼ遺伝子の解析
p n H 1 0が、 ブレビバクテ リ ウム · ステロ リ カム A T C C 2 1 3 8 ？の生産する既知のコ レステロール · ォヰシダーゼ I とは異なるィ ソ酵素をコー ドする遺伝子を含む組換え体プラス ミ ドであることは、 ^下の方法により確認した。 すなわち、 モレキュラー · クローニング (T. マニアチス、 E. F . フ リ ッ チ、 J. サムブルッ ク著、 コール ドスプリ ングハーバー出版社、 1 9 8 2年） に記されている方法に従 つて、 n H l 0株より組換え体プラス ミ ド Ρ ΊΊ Η Ι 0を調製し、 ァガ πースゲル電気泳動後、 ρ η Η 1 0を含むゲルを 1. 5 M N a C 1お よび 0. 5 M N a 0 Hを含む溶液に室温で 3 0分間漬け、 2本鎖 DN Aを変性させた。 さ らに、 ナイ ロ ンフ ィ ルタ ー上に密着させ、 フ ィ ル ターの下面より 1. 5 M N a C lぉょび0. 2 5 M N a OHを含む溶 液を浸透させ、 変性後の DN Aをフィ ルター上に転写後固定した。 二 のようにして調製したフ ィ ルタ ーを、 ブレビバクテ リ ウム ' ステロ リ カ厶 ATC C 2 1 3 8 7株の産生するコ レステ ロ ール · ォキシダ一ゼ Iのア ミ ノ酸の部分配列から推定される D N A塩基配列の合成一本鎖 DNA、 すなわち、 配列蕃号 2で表わされるプローブ No.1 ( 6番目の 塩基は T， Cのいずれか、 9番目の塩基は Τ, Cのいずれか、 1 2審 目の塩基は A , G， Tのいずれか、 1 5番目の塩基は A， Gのいずれ かであり、 組み合わせて 2 4通りの合成 D Ν Αの混合物となる。 ） ま たは、 配列蕃号 3で表わされるプ n—ブ N 0. 2 ( 3蕃目の塩基は A， Gのいずれか、 9蕃目の塩基は A, Gのいずれか、 1 2番目の塩基は C, Tのいずれか、 1 5番目の塩基は T, A, Gのいずれかであり、 組み合わせて 2 4通りの合成 DN Aの混合物となる。 ） を r一 32 P— A T Pで標識して得られた D N Aプローブを含むハイ ブリ ダィゼー シ ヨ ンバッ フ ァ ー （ N a C 1 53. 0 g / コ ハク酸ナ ト リ ウ ム 26. 5 g / 1 0 m M E DTA、 5倍濃度デンハー ト溶液、 0. 5 % S D S、 0. 1 m g Zm 1熱変性牛胸腺 D N A、 p H7. O ) と 4 5 "tで 1 6時間反応させた後、 プローブを含む溶液を捨て、 3倍濃度の S S C中で 6 5 t:で十分洗浄した。 フ ィ ルターと X線撮影用フ ィ ルムを密 着させ、 一 Ί 0 tにおいて 1昼夜感光させ、 いわゆるオー ト ラジオグ ラ フィ 一法によって p n H l 0 との反応性を検討した。 プ 一ブ No.
1 はコ レステロ ール ' ォキシダ一ゼ Iの中央部分のポ リぺプチド鎖の アミ ノ酸部分配列に、 プローブ No. 2は C末端部分のア ミ ノ酸配列に 対応する。 オー ト ラジオグラフィ 一の解析の結果、 P n H 1 0 はプロ ーブ No. 1、 No.2 と全く反応しなかった。 この結果より、 プラス ミ ド p II H 1 0 に含まれるコ レステロ ール ' ォキシダーゼ II遺伝子は、 既 知のコ レステロール ' ォキシダーゼ Iをコ一 ドする遺伝子とは異なる ことが明らかになった。
実施例 2.
エ ツ シヱ リ ヒ ア ' コ リ （Escherichia col i) n H 1 0株 （ F E R M B P — 2 8 5 0 ) を L B培地に了ン ピシ リ ン 0. 0 0 5 %を含有する 種培地 （殺菌前 P H 7. 2 ) 3 m l に植菌し、 3 ϋ tで 1 8時間振盪培 養した。 この種培養液 3 m 1 を、 上記種培地と同じ培地を各々 5 0 0 m 1仕込んだ 2 リ ッ トル三角フ ラスコ （バッ フル付き） 5本にそれ ぞれ加え、 3 0 :で 1 6時間振盪培養した。 培養後、 培養液を冷却遠 心機にて 10, GOOx gで 2 Q分間遠心し、 約 1 8. 6 g (湿菌体重量） の 菌体を得た。 得られた湿菌体に 1 8 6 m 1 の 0.01 リ ン酸緩衝液 （PH 7. 0、 以下バッファ一と略称する） を加えて懸濁した後、 超音波菌体 破砕機 （セルディ ス ラ ブタ ーモデル 2 0 0 、 ブラ ンソ ン社製） により 3 0分間超音波破砕した （出力 75%、 パルス保持時間 70%、 フ ラ ッ ト チップ装着） 。 破砕した後、 冷却遠心機にて 2 0， 0 0 0 X gで 15分間 遠心分錐し、 上清液を無細胞抽出液として得た。 得られた無細胞抽出 液 1 9 4 m 1 に 6 0 %飽和になるまで固形硫酸アンモニゥムを加え、 1 N a O H溶液で PH 7 に保ちながら、 緩やかに攪拌し、 硫酸アン モニゥムが完全に溶解してから、 さらに 3 0分間攪拌した。 その後、 冷却遠心機にて 2 0， 0 0 0 X gで 1 5分間遠心し、 上清を得た。 得ら れた上清はセロ フ ァ ンチュ ーブを透折膜として、 1 リ ッ ト ルのバッ フ ァ一に封し 1 2時間透析し、 その後バッ フ ァ一を交換して、 さらに 12 時間透析を行い脱塩した。 透析後の粗酵素液 9 5 m I を、 予めバッ フ ァーで平衡化しておいた D E A E—セル口 フ ァ イ ン （生化学工業社 製） のカ ラ ム （07. 5 x 1 5 c m)に通塔した。 流速 d S O m l Z h r でバッ フ ァ ー 3 リ ッ ト ルにて洗浄し、 未吸着の蛋白を洗い出した。 次 に、 N a C 1 濃度を 0から 0. 5 Mまで直線的に濃度勾配溶出し、 酵素 を溶出した。 溶出画分のうち、 比活性が 1 0単位 Zm g以上の画分を 集めた。 溶出パターンを第 7図に示した。
得られた活性画分を硫酸ア ンモニゥムを 6 0 %飽和になるまで添加 して濃縮し、 生成した沈澱をバッ ファ—にて溶解後、 前記と同様に透 析を行って脱塩した。 さ らに、 限外ろ過により濃縮し約 2 m 1 と した。 これを、 予め 0. 0 5 M リ ン酸緩衝液 （ p H7. 0 ) に 0. 3 Mの N a C 1 を加えたもので平衡化しておいたスー パ ーロース （ S u p e r o s e ) p r e p 1 2 H R 1 6 / 5 0 (フ ア ルマ シア ' フ ァ イ ン ' ケ ミ カ ル 社製） カ ラ ム ( 1. 3 X 5 0 c m) に通塔し、 8 8 0 P Uポ ンプ （日 本分光） に接続し、 3 Q m l Z h rの流速で溶出を行った。 溶出画分 のうち比活性 1 5単位 Zm g以上の画分を集めて、 1 リ ッ ト ルのバッ フ ァーに対し透析した。 溶出パター ンを第 8図に示した。 得られた活 性画分を、 予めバッ フ ァーで平衡化しておいたヒ ド πキシ了パタイ ト (生化学工業社製） のカ ラ ム ( 3. 2 X 4. 0 c m) に通塔し、 流速 1 0 0 m 1 / h rでバ 'ッ ファ一で洗浄したところ、 活性はすべて洗液 中に回収されていた。 洗液を限外ろ過により濃縮後、 本酵素の精製標 品と した。 以上の精製過程を第 4表にまとめた。 ステップ 全活性 全蛋白 比活性 収 量
(U) (nig; (ll/rag) (50
無 細 胞 抽 出 液 1462 6940 0.21 100 硫安分画（0~60%) - 2368 5990 0.40 162
DBAB—セルロフ 7イ 844 57 14.8 57.7 スーパー ϋース prepl2 740 39 19.1 51.0 t Fnキシァパタ イ 卜 404 20 20.4 J 28.0
さらに、 精製酵素標品の純度を検定するために、 上記のようにして 得られた未変性状態のサンプルを、 ポ リ アク リ ルァ ミ ドゲル電気泳動 にかけた。 方法は、 デービスらの方法 〔B. J . デ一ビスら、 アナル ス ' ォブ ' ニューヨーク ' ァカデミ ィ ' ォブ ' サイ エ ンス、 第 121巻.
404頁 （1964) ： に従った。 その結果本標品は均一であることがわか つ / ：
産業上の利用可能性
本発明によれば、 血清コ レステロ ールを測定するにあたり、 高度の 希釈操作などの原因により試料中のコ レステ π—ル濃度が低濃度であ つたり、 ビ リ ルビンなどの妨害物質による影響を回避するため、 測定 p Hを 6前後に下げて測定しなければならないような場合に、 既知の コ レステロール · ォキシダ一ゼに代わり、 より高感度で定量性の髙ぃ 新規なコ レステロ ール · ォキ シダーゼを、 工業的に安価に提供するこ とができる。 【配列表】
配列番号 ： 1
配列の長さ ： 1 8 4 5
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トポ□ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： Ge nom i c DNA
起源 ：
生物名 ： ブレビバク テ リ ゥ 厶 ステ 。 リ カ ム ( Br e v i bact e r i um s t er o 1 1 cum )
株名 ： A T C C 2 1 3 8 7
配列：
ATG ACG CTC AAC GAC GAG CAG TTA CGG CTG TCC CGG CGA GGA TTC CTC 48 Met Thr Leu Asn Asp Gl u Gi n Leu Arg Leu Ser Arg Arg Gly Phe し eu
1 5 10 15
ACC GCG GGC GCT GCG GGC GCC GGC GTG CTG GCA GCC GGC GCA CTC GGC 96 Thr Ala Gly Ala Al a Gly Ala Gly Val し eu Ala Ala Gly Ala し eu Gly
20 25 30
GGC TGG ACC CCG GCC TTC GCC GTC CCT GCC GGT TCC GCC GGC TCC CTC 144 Gly Trp Thr Pro Ala Phe Ala Val Pro Ala Gly Ser Ala Gly Ser Leu
35 40 45
GGA TCG CTC GGA TCG ACC GGG CCG GTC GCG CCG CTT CCG ACG CCG CCG 192 Gly Ser Leu Gly Ser Thr Gly Pro Val Ala Pro し eu Pro Thr Pro Pro
50 55 60
AAC TTC CCG AAC GAC ATC GCG CTG TTC CAG CAG GCG TAC CAG AAC TGG 240 Asn Phe Pro Asn Asp l ie Ala Leu Phe Gi n Gin Ala Tyr Gin Asn Trp
65 70 75 80 TCC AAG GAG ATC ATG CTG GAC GCC ACT TGG GTC TGC TCG CCC AAG ACG 288 Ser Lys Glu He Met Leu Asp Ala Thr Trp Val Cys Ser Pro Lys Thr
85 90 95
CCG CAG GAT GTC GTT CGC CTT GCC AAC TGG GCG CAC GAG CAC GAC TAC 336 Pro Gin Asp Val Val Arg Leu Ala Asn Trp Ala His Glu His Asp Tyr
100 105 110
AAG ATC CGC CCG CGC GGC GCG ATG CAC GGC TGG ACC CCG CTC ACC GTG 384 Lys l ie Arg Pro Arg Gly Ala Met His Gly Trp Thr Pro Leu Thr Val
115 120 125
GAG AAG GGG GCC AAC GTC GAG AAG GTG ATC CTC GCC GAC ACG ATG ACG 432 Glu Lys Gly Ala Asn V l Glu Lys Val l ie Leu Ala Asp Thr Met Thr
130 135 140
CAT CTG AAC GGC ATC ACG GTG AAC ACG GGC GGC CCC GTG GCT ACC GTC 480 His Leu Asn Gly l ie Thr Val Asn Thr Gly Gly Pro Val Ala Thr Val
145 150 155 160
ACG GCC GGT GCC GGC GCC AGC ATC GAG GCG ATC GTC ACC GAA CTG CAG 528 Thr Ala Gly Ala Gly Ala Ser l ie Glu Ala l i e Val Thr Glu Leu Gin
165 170 175
AAG CAC GAC CTC GGC TGG GCC AAC CTG CCC GCT CCG GGT GTG CTG TCG 576 Lys His Asp Leu Gly Trp Ala Asn Leu Pro Ala Pro Gly Val Leu Ser
180 185 190
ATC GGT GGC GCC CTT GCG GTC AAC GCG CAC GGT GCG GCG CTG CCG GCC 624 l ie Gly Gly Ala Leu Ala Val Asn Ala His Gly Ala Ala Leu Pro Ala
19a 200 205
GTC GGC CAG ACC ACG CTG CCC GGT CAC ACC TAC GGT TCG CTG AGC AAC 672 Val Gly Gin Thr Thr Leu Pro Gly His Thr Tyr Gly Ser Leu Ser Asn
210 215 220 S98 09E 958 dsv S 3 Lid l usv oJd λΐ9 i3S Ι¾Λ nig 2JV ¾IV "ID o-id ^Οΐΐ 3VD GD 3Π 3XV 3VX DVV DVi 333 339 DDI DID 9V9 IDD D39 9V3 DDD
OSE s^e ο^ε
sAq it9 Ι¾Λ na jas ig ¾tv ias '《13 ng J9S 13 lΊs^ nig usy 9S0I 133 DVV 399 3X9 212 DDI 333 939 931399 3X3 3DV V39 319 9V9 DVV
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ュ 9S J9S dsy 0Jd sCq jqx OJJ Ι^Λ 丄 丄 〖^ s OJJ
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008 562 062
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m naq ngq OJJ 丄 d\\ 3jy OJ^ dsy usy SJV "19 丄 nig naq 9A 3DV 3XD 9X3 VDD 33V DXV DD3 133 XVD DVV 393 9V3 DVl 93V DV9 DID
0^2 5S2 ^ZZ
V 丄 -im usy ^19 usy Ι¾Λ 1¾Λ ^IV naq nig ιιι ngq 2Z V39 3VX DDV DVV 399 DVV 391 ]丄 3 3iD 93D DDV 3丄コ BV9 D3V DID D13
LZ
SL£lQ/l6dC/lDd l9 0/£6OAi AAC CTG CCG GAG CCC ATC ACC GAC ATG ATC GGC GCC ATC AAC GCC GGA 1152 Asn Leu Pro Glu Pro l ie Thr Asp Met He Gly Ala He Asn Ala Gly
370 375 380
AAC CCC GGA ATC GCA CCG CTG TTC GGC CCG GCG ATG TAC GAG ATC ACC 1200 Asn Pro Gly lie Ala Pro Leu Phe Gly Pro Ala Met Tyr Glu l ie Thr
385 390 395 400
AAG CTC GGG CT GCC GCG ACG AAT GCC AAC GAC ATC TGG GGC TGG TCG 1248 Lys Leu Gly Leu Ala Ala Thr Asn Ala Asn Asp l ie Trp Gly Trp Ser
405 410 415
AAG GAC GTC CAG TTC TAC ATC AAG GCC ACG ACG TTG CGA CTC ACC GAG 1296 Lys Asp Val Gin Phe Tyr He Lys Ala Thr Thr Leu Arg Leu Thr Glu
420 425 430
GGC GGC GGC GCC GTC GTC ACG AGC CGC GCC AAC ATC GCG ACC GTG ATC 1344 Gly Gly Gly Ala Val Val Thr Ser Arg Ala Asn lie Ala Thr Val l ie
435 440 445
AAC GAC TTC ACC GAG TGG TTC CAC GAG CGC ATC GAG TTC TAC CGC GCG 1392 Asn Asp Phe Thr Glu Trp Phe His Glu Arg l ie Glu Phe Tyr Arg Ala
450 455 460
AAG GGC GAG TTC CCG CTC AAC GGT CCG GTC GAG ATC CGC TGC TGC GGG 1440 Lys Gly Glu Phe Pro Leu Asn Gly Pro Val Glu l ie Arg Cys Cys Gly
465 470 475 480
CTC GAT CAG GCA GCC GAC GTC AAG GTG CCG TCG GTG GGC CCG CCG ACC 1488 Leu Asp Gin Ala Ala Asp Val Lys Val Pro Ser Val Gly Pro Pro Thr
485 490 495
ATC TCG GCG ACC CGT CCG CGT CCG GAT CAT CCG GAC TGG GAC GTC GCG 1536 l ie Ser Ala Thr Arg Pro Arg Pro Asp His Pro Asp Trp Asp Val Ala
500 505 510 ATC TGG CTG AAC GTT CTC GGT GTT CCG GGC ACC CCC GGC ATG TTC GAG 1584 l ie Trp Leu Asn Val Leu Gly Val Pro Gly Thr Pro Gly Met Phe Glu
515 520 525
TTC TAC CGC GAG ATG GAG CAG TGG ATG CGG AGC CAC TAC AAC AAC GAC 1632 Phe Tyr Arg Glu Met Gl u Gin Trp Met Arg Ser His Tyr Asn Asn Asp
530 535 540
GAC GCC ACC TTC CGG CCC GAG TGG TCG AAG GGG TGG GCG TTC GGT CCC 1680 Asp Ala Thr Phe Arg Pro Glu Trp Ser し ys Gly Trp Ala Phe Gly Pro
545 550 555 560
GAC CCG TAC ACC GAC AAC GAC ATC GTC ACG AAC AAG ATG CGC GCC ACC 1728 Asp Pro Tyr Thr Asp Asn Asp He Val Thr Asn し ys Met Arg Ala Thr
565 570 575
TAC ATC GAA GGT GTC CCG ACG ACC GAG AAC TGG GAC ACC GCG CGC GCT 1776 Tyr l ie Gl u Gly I'al Pro Thr Thr Glu Asn Trp Asp Thr Ala Arg Ala
580 585 590
CGG TAC CAA CCA GGA TTC GAC CGG CAT CGC GTG TTC ACC AAC GGA TTC 1824 Arg Tyr Gi n Pro Gly Phe Asp Arg His Arg Val Phe Thr Asn Gly Phe
595 600 605
ATG GAC AAG CTG CTT CCG TAG 1842 Met As し ys Leu Leu Pro
610
配列審号 ： 2
配列の長さ ： 1 Ί
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
ト ポロ ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 他の核酸 合成 D N A
ハイ ポセテ ィ カ ル配列 ： Y E S 了ンチセ ンス ： YE S
配列の特徵
他の情報 ： 従来型コ レステロール ォキシダーゼ （コ レステロール
♦ ォキシダーゼ I ) 構造遺伝子にコ ' ドされたポ リぺプチ ド鎖の中央 部分に射応した合成核酸プ σ—ブ
配列
TCRTCDATYT GYTCCAT 17
配列蕃号 ： 3
配列の長さ ： 1 7
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロ ジー ： 直鎖状
配列の種類 ：他の核酸 合成 DN A
ハイ ポセティ カル配列 YE S
アンチセ ンス ： YE S
配列の特徴
他の情報 ： 従来型コ レステ π—ル ォキシダ一ゼ （コ レステロール • ォヰシダーゼ I ) 構造遺伝子にコ ドされたポ リベプチ ド鎖 C末端 部分に対応した合成核酸プ D—ブ
配列
ATDATYTTRT CCATRTT 17

Claims

特 許 請 求 の 範 囲
(1) 配列蕃号 1 で表わされるペプチ ド配列を有し、 下記の理化学的性 質を有する新規コ レステロール · ォキシダ一ゼ。
( a ) 作用
酸素の存在下コ レステ口ールを酸化し、 過酸化水素と 4 ーコ レステ ンー 3 —オ ンを生成する反応を触媒する。
( ) 等電点 ： p H 4. 7
( c ) 基質特異性 ：
コ レステ ロ ール、 ]9 — シ ト ステ ロ ール、 スチグマステ ロ ール、 プレ グネ ノ ロ ン、 デヒ ド ロ イ ソ ア ン ド ロ ステ ロ ン、 エス ト ラ ジオ ールに作 用し、 ビタ ミ ン D 3 、 コ ール酸、 ア ン ドロ ステロ ン、 コ レステ ロ ール リ ノ レー ト、 ラノ ステ π —ルは基質と しない。
( d ) 至適 p Hおよび安定 p H範囲 ：
至適 p Hは 5. 0〜7. 5であり、 5 0 t、 6 0分間の加熱条件下では、 P H 5. 3〜了. 5の範囲内で安定である。
( e ) 作用適温 ： · 5 ϋ で付近に至適作用温度を有する。
( f ) p Hおよび温度などによる失活の条件 ：
5 0 °C、 1 時間の加熱条件下では、 p H 1 0. 0以上または p H 4. 0 以下で失活する。 また、 P H 7. 0、 6 0 ：、 1時間の熱処理で約 8 3 % 失活する。
( g ) 阻害および安定化 ：
p 一ク ロ ロマ—キユ リ ベンゼンスルホネー ト、 硝酸銀、 0 — ヒ ド ロ キシキノ リ ンにより阻害を受ける。 また、 牛血清アルブ ミ ンを共存さ せることによ り、 耐熱性および保存安定性が向上する。
( h ) コ レステロ一ルに対する ミ ハエ リス定数（km値） ： 3. 0 X 10— 5 M ( i ) 分子量 ： 約 4 3， 0 0 0 (ゲル濾過法）
約 6 G, G 0 0 (電気泳動法）
6 6, 5 8 6 ( D N A配列）
(2) 該コ レステロ ール ' ォキシダ一ゼが、 ブレビバタテ リ ゥ厶 ' ステ 口 リ力ム由来である請求項 1記載のコ レステロ ール ' ォキシダーゼ。
(3) エツ シヱ リ ヒ ア属に属し、 配列審号 1で表わされる D N A配列で 特定される D N Aおよび該 D N Aにハイブリダィズしかつコ レステロ ール . ォキシダーゼをコ一ドする D N Aから選ばれる D N Aを組み込 んだ組換え体 D Aを保有する微生物を培地に培養し、 培養物中にコ レステロール · ォキシダ一ゼを生成蓄積させ、 該培養物から該コ レス テロール . ォキシダーゼを採取することを特徵とする新規コ レステロ ール . ォキ シダーゼの製造法。
(4) 該配列蕃号 1で表わされる D N A配列で特定される D N Aが、 ブ レビバクテ リ ウム ♦ ステロ リ カム由来である請求項 3記載の製造法。
(5) エ ツ シ ェ リ ヒ了属に属し、 配列蕃号 1 で表わされる D X A配列で 特定される D >： Aおよび該 D N Aにハイ ブリダィズしかつコ レステロ —ル . ォキ シダーゼをコードする D X Aから選ばれる D X Aを組み込 んだ組換え体 D X Aを保有する微生物。
(6) 該微生物が、 エ ッ シェ リ ヒ ァ ' コ リ n H 1 0 ( F E R M B P— 2 8 5 0 ) である請求項 5記載の微生物。
ω 配列蕃号 1で表わされる D N Α配列で特定される D X Aおよび該 D >： Aにハイ ブリ ダイ ズしかつコ レステロール · ォキシダーゼをコー ドする D X Aから選ばれる D N Aをベクター D N Aに組み込んだ組換 え体 A。
(8) 該組換え体 D -\' Aが、 エ ツ シヱ リ ヒ ア · コ リ n H 1 0 ( F E R M B P - 2 8 5 0 ) が保有するプラス ミ ド P n H 1 0である請求項 7 記載の組換え体 D X A c
(9) 配列蕃号 1 で表わされる D X A配列で特定され、 かつコ レステロ ール · ォキシダーゼをコー ドする D N A。
αο) 該 D Ν Αがブレビパク テ リ ゥ ム ' ステ 口 リ カ 厶由来である請求項 9記載の遺伝子。
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