JPH09168389A - アスコルビン酸オキシダーゼをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 アクレモニウム ｓｐ．ＨＩ−２５由来のア
スコルビン酸オキシダーゼの生産の高効率化。 【解決手段】 アスコルビン酸オキシダーゼポリペプチ
ドをコードするＤＮＡおよび該ＤＮＡを保有し、アスコ
ルビン酸オキシダーゼを生産するアクレモニウム・クリ
ソゲナム。 【効果】 アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＳＯＭ）遺
伝子の全ＤＮＡ配列を明確とした新規なＡＳＯＭ遺伝子
を分離でき、該ＡＳＯＭ遺伝子を真核微生物アクレモニ
ウム・クリソゲナムに導入して新規なアクレモニウム・
クリソゲナムを作成でき、また該アクレモニウム・クリ
ソゲナムを使用して高効率なＡＳＯＭの生産が可能であ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術】本発明は、アスコルビン酸オキシ
ダーゼポリペプチドをコードするＤＮＡ、アスコルビン
酸オキシダーゼを生産するアクレモニウム・クリソゲナ
ムおよび該ＤＮＡを保有するアクレモニウム・クリソゲ
ナムに関する。

【０００２】

【従来の技術】アスコルビン酸オキシダーゼ（Ａｓｃｏ
ｒｂａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ、以下ＡＯＸと略す）は
０．５ｍｏｌｅの分子状酸素存在下、１ｍｏｌｅのアス
コルビン酸を脱水素化し、１ｍｏｌｅのデヒドロアスコ
ルビン酸と１ｍｏｌｅの水分子を生ずる反応を触媒する
酵素である（Ｅ．Ｃ．１．１０．３．３）。

【０００３】ＡＯＸは還元作用を持つアスコルビン酸の
除去を行い、酵素反応系の精度を上昇させるのに利用さ
れる。従来、公知のＡＯＸとしては、キュウリ（Ｊ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．，６４，１８９−１９５、（１９６
８））、カボチャ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３
７，７１２−７１６、（１９６２））など植物により生
産されているものが知られている。

【０００４】また、アクレモニウム・クリソゲナムとは
種を異にする、糸状菌であるアクレモニウム ｓｐ．
（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ．）ＨＩ−２５株（ＦＥ
ＲＭＰ−１５３２８）がＡＯＸを生産していることが知
られている（特開平３−２３６７６６号公報；該ＡＯＸ
を以下ＡＳＯＭと表記する）。このＡＳＯＭは植物由来
のＡＯＸに比べ耐熱性が高い特徴を有する酵素である。

【０００５】

【発明が解決しようとする問題点】ＡＳＯＭの生産は上
記の糸状菌アクレモニウム ｓｐ．ＨＩ−２５の培養に
より行われるが、本方法における培養活性はたかだか１
０〜２０ｕ／ｍｌであり、１回の培養で得られる培養酵
素が少なく不経済であり、効率のよい高純度かつ高品質
ＡＳＯＭ生産法が望まれていた。

【０００６】

【問題点を解決するための手段】本発明者らは、上記問
題点に関し鋭意研究の結果、上記アクレモニウム ｓ
ｐ．ＨＩ−２５のＡＳＯＭを構成するポリペプチドの部
分一次構造の決定、および該酵素のアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡの塩基配列を決定した。この研究に際して
は、原因は不明であるが、ＡＳＯＭ蛋白のＮ末端部の一
次構造が解析できず、その決定には試行錯誤を要した。

【０００７】なお、決定されたＤＮＡ配列から推定され
たＡＳＯＭのアミノ酸配列は、公知であるキュウリ、カ
ボチャおよびタバコのＡＯＸをコードするＤＮＡ配列
（ＥＭＢＬ−ＧＤＢ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｊ０
４４９４，Ｘ５５７７９，Ｄ４３６２４）から推定され
るアミノ酸配列と相同性の数値は非常に低く（３０％以
下）、しかも一部領域に偏っており、またＤＮＡ配列に
は相同性は見いだせず、全く別の遺伝子である。

【０００８】また、該ＡＳＯＭ遺伝子をベクターに組み
込み、ＡＯＸの生産能を有していないアクレモニウム・
クリソゲナムに属する微生物に導入した結果、ＡＳＯＭ
遺伝子を保持し、ＡＳＯＭを産生する新規なアクレモニ
ウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ・ｃｈｒｙ
ｓｏｇｅｎｕｍ）を創製した。この創製に際しても、該
遺伝子を原核生物に導入しても活性酵素は生産されず、
試行錯誤の上ＡＳＯＭの生産能を有していないアクレモ
ニウム・クリソゲナムによるＡＳＯＭの生産に至ったも
のである。以上のようにして、発明者らは本発明を完成
するに至った。

【０００９】本発明は、上記の知見に基づいてなされた
もので、配列表配列番号１のアミノ酸配列の１から５５
１で表されるアミノ酸配列で構成されるＡＳＯＭポリペ
プチドをコードすることを特徴とするＤＮＡ、ＡＳＯＭ
を生産することを特徴とする新規なアクレモニウム・ク
リソゲナムおよびＡＳＯＭを生産するアクレモニウム・
クリソゲナムが配列表配列番号１のアミノ酸配列の１か
ら５５１で表されるアミノ酸配列で構成されるＡＳＯＭ
ポリペプチドをコードするＤＮＡを保有することを特徴
とする新規なアクレモニウム・クリソゲナムである。

【００１０】本発明の配列表配列番号１のアミノ酸配列
の１から５５１で表されるＡＳＯＭポリペプチドのアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡにおいて、その配列番号１
のアミノ酸配列にて表記されるアミノ酸配列のＮ末端側
およびＣ末端側はアミノ酸残基またはポリペプチド残基
を含む場合であってもよく、Ｎ末端側のＭｅｔの上流に
はさらに一個または複数のアミノ酸残基を有してもよ
く、またＣ末端側のＶａｌの下流には、さらに一個以上
のアミノ酸残基を有してもよい。

【００１１】さらに、本発明のＡＳＯＭを構成するアミ
ノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列の１から５５１
で表されるＡＳＯＭポリペプチドのアミノ酸配列からな
るポリペプチドによる酵素活性発現と同様の効果を発現
する配列番号１のアミノ酸配列の１から５５１で表され
るアミノ酸配列の一部であってもよい。本発明の配列番
号１のアミノ酸配列の１から５５１で表されるアミノ酸
配列をコードする新規なＤＮＡは、そのＮ末端側および
Ｃ末端側のアミノ酸残基またはポリペプチド残基を含め
たアミノ酸配列の各アミノ酸に対応する一連のコドンの
うちいずれか１個のコドンからなるＤＮＡであればよ
い。

【００１２】さらに、本発明のＡＳＯＭを構成するアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡは配列番号１のアミノ酸配
列の１から５５１で表されるアミノ酸配列からなるポリ
ペプチドによる酵素活性発現と同様の効果を発現する配
列番号１のアミノ酸配列の１から５５１で表されるアミ
ノ酸配列の一部分のアミノ酸配列をコードするＤＮＡで
あってもよい。

【００１３】上記ＤＮＡの代表例として、５’末端側よ
り配列番号１の塩基配列の１から１６５３までで表され
る塩基配列で表される塩基配列を有するＤＮＡを挙げる
ことができる。該ＤＮＡは、５’末端の上流側にアミノ
酸をコードするコドンを１個以上有したものでもよく、
ＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡ以外のコドンであればよ
い。３’末端たるＧＴＡの下流側には、アミノ酸をコー
ドするコドンを１個以上有するか、又は翻訳終止コドン
を有するかのいずれでもよい。

【００１４】さらに該ＤＮＡは、真核生物宿主で発現さ
せる場合には、コードするアミノ酸配列に影響を与えな
い、イントロンＤＮＡ配列を配列中に含んでもよい。イ
ントロンを含むＤＮＡは例えば配列表配列番号２にて示
され、そのイントロンの塩基配列は配列番号２の８０８
から８６４までで表される。配列番号１の１から５５１
までのアミノ酸配列で表されるアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡを取得するには、例えば、ＡＳＯＭを生産する
ＡＳＯＭ遺伝子の供与体である微生物より該微生物のＤ
ＮＡを分離精製した後、超音波、制限酵素などを用いて
切断した該ＤＮＡと切断してリニヤーにした発現ベクタ
ーとを両ＤＮＡの平滑または接着末端部においてＤＮＡ
リガーゼなどにより結合閉環させ、かくして得られた組
み換えＤＮＡベクターのマーカーを指標としてスクリー
ニングして取得した組み換えＤＮＡベクターを保持する
微生物を培養し、該培養菌体から該組み換えＤＮＡベク
ターを分離精製し、次いで該組み換えＤＮＡベクターか
らＡＳＯＭ遺伝子であるＤＮＡを取得すればよい。

【００１５】ＤＮＡの供与体である供与微生物として
は、アクレモニウム ｓｐ．ＨＩ−２５株を利用すると
よい。遺伝子の供与体である微生物に由来するＤＮＡを
採取するには以下の如く行うが、その操作法のうち常法
とされるものは、例えばティー・マニアティスらの方法
（Ｔ．ｍａｎｉａｔｉｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８２，１９８
９）や、市販の各種酵素、キット類に添付された手順に
従えば実施できるものである。

【００１６】例えば、上述の供与体である微生物を、液
体培地で約３日間通気撹拌培養し、得られる培養物を遠
心分離して集菌し、次いでこれを溶菌させることによっ
てＡＳＯＭ遺伝子を含有する溶菌物を調製する。溶菌方
法としては、例えばザイモリアーゼなどの細胞壁溶解酵
素による処理が施され、必要によりプロテアーゼなどの
他の酵素やドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤が
併用される。さらに細胞壁の物理的破壊法である凍結融
解（特開昭６３−１８５３７１号公報参照）やフレンチ
プレス処理を上述の溶菌法と組合せで行ってもよい。

【００１７】この様にして得られた溶菌物からＤＮＡを
分離精製するには、常法に従って、例えばフェノール抽
出による除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレア
ーゼ処理、アルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜
組み合わせることにより行うことができる。分離精製さ
れた微生物ＤＮＡを切断する方法は、常法に従って制限
酵素処理により行えばよく、特に得られるＤＮＡ断片と
ベクターとの結合を容易ならしめるため、とりわけ特定
ヌクレオチド配列に作用する、例えば、ＳａｌＩ、Ｂｇ
ｌＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＭｌｕＩなどのＩＩ形
制限酵素が適している。

【００１８】微生物ＤＮＡ断片を組み込むベクターとし
ては、宿主微生物体内で自律的に増殖しうるファージ又
はプラスミドから遺伝子組み換え用として構築されたも
のが適しており、ファージベクターとしては、例えば、
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）を宿主微生物とする場合にはλｇｔ・λＣ、λｇｔ
・λＢなどが使用できる。また、プラスミドベクターと
しては、例えば、エシェリヒア・コリを宿主微生物とす
る場合には、プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、
ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１
８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＩＮ Ｉなどが使用
できる。

【００１９】このようなベクターを、微生物ＤＮＡの切
断に使用した制限酵素で生成するＤＮＡ末端と、同じ末
端を生成する制限酵素で切断してベクター断片を作成
し、微生物ＤＮＡ断片とベクター断片とを、ＤＮＡリガ
ーゼ酵素により常法に従って結合させればよい。微生物
ＤＮＡの断片を結合したベクターを移入する宿主微生物
としては、組み換えＤＮＡが安定かつ自律的に増殖可能
であればよく、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に属する微生物
の場合、エシェリヒア・コリ ＤＨ１、エシェリヒア・
コリ ＨＢ１０１、エシェリヒア・コリ Ｗ３１１０、
エシェリヒア・コリ Ｃ６００等が利用できる。

【００２０】宿主微生物に組み換えＤＮＡを移入する方
法としては、例えば、宿主微生物がエシェリヒア属に属
する微生物の場合には、常法に従ってコンピテントセル
化した宿主菌株に組み換えＤＮＡの移入を行えばよい。
宿主微生物への目的組み換えＤＮＡ移入の有無について
の選択は配列表３に例示した予め合成したＡＳＯＭのＤ
ＮＡプローブを³²Ｐ等で放射能ラベルし、予め作製した
遺伝子ライブラリーとのコロニーハイブリダイゼーショ
ン法によりポジティブ株を目的の形質転換体とすればよ
い。

【００２１】かくして得られる形質転換体である微生物
からは、常法によりＡＳＯＭ遺伝子を含むＤＮＡ断片を
分離でき、これを他の宿主微生物に移入することも容易
に実施できる。上記の方法により分離されるＡＳＯＭ遺
伝子にイントロンが存在したり、また蛋白への糖鎖の付
加などの問題で、原核生物を宿主として本遺伝子を使用
するＡＳＯＭ生産が困難である場合、真核微生物を宿主
として、新たにベクターを使用してＡＳＯＭ遺伝子を導
入する必要がある。宿主としては遺伝子の供与微生物で
あるアクレモニウム ｓｐ．ＨＩ−２５と同属のアクレ
モニウム・クリソゲナムが優れており、本発明ではアク
レモニウム・クリソゲナムを宿主としてＡＳＯＭ遺伝子
を導入し、新規なアクレモニウム・クリソゲナムを作成
しているが、導入されるＡＳＯＭをコードするＤＮＡ
は、これによりなんら限定されるものではない。

【００２２】ベクターとしては、宿主で作用する薬剤耐
性または栄養要求性遺伝子マーカーを保有するベクター
であればよく、宿主真核微生物がアクレモニウム・クリ
ソゲナムの場合、プラスミドｐＰＧＫＭ５、ｐＡＣＴＨ
Ｙ８３、ｐＥＧＡＰ８３（特開平４−５８８９１号公
報）、コスミドｐＢＳＦＡＨＹ８３、ｐＢＳＦＰＫＭ５
（特開平４−１０４７９２号公報）等が使用できる。

【００２３】このようなベクターを、制限酵素で切断し
てベクター断片を作成し、微生物ＤＮＡ断片とＤＮＡリ
ガーゼ酵素により常法に従って結合させればよい。ま
た、１つのベクターに複数のＡＳＯＭ遺伝子を結合させ
ることも可能である。宿主アクレモニウム・クリソゲナ
ムとしては、例えば、アクレモニウム・クリソゲナム
ＡＴＣＣ１１５５０（ＡＴＣＣ１１５５０）が利用でき
る。

【００２４】宿主糸状菌に組み換えＤＮＡを移入する方
法としては、例えば、Ｑｕｅｅｎｅｒらの方法（Ｑｕｅ
ｅｎｅｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
１９８５．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（１９８５）４６８−４
７２）に準じて行えばよい。上記の遺伝子操作に一般的
に使用される量的関係は、供与微生物からのＤＮＡ及び
プラスミドまたはコスミドＤＮＡを０．１〜１０μｇに
対し、制限酵素を約１〜１０ｕ、リガーゼ約３００ｕ、
その他の酵素約１〜１０ｕ、程度が例示される。

【００２５】かくして得られた新規なアクレモニウム・
クリソゲナムに属する微生物は、栄養培地に培養される
ことにより、多量のＡＳＯＭを安定して産生し得る。ま
た必要なら、得られた組換え体プラスミドから、ＡＳＯ
Ｍ遺伝子を含むより限定的なＤＮＡ断片を、ゾラーの方
法による部位特異的変異法（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ａ
ｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３６７．（１９８３））によ
る制限酵素認識部位の作製や、制限酵素による切り出し
により分離し、新たにベクターに組み込んで作製したプ
ラスミドまたはコスミドにより、さらに効率のよい形質
転換体を作成し、より多量のＡＳＯＭを安定に産生させ
てもよい。

【００２６】また、同様に部位特異的変異法により該Ａ
ＳＯＭ遺伝子中のイントロンを除去し、制限酵素などに
より該遺伝子を含むＤＮＡをコードするＤＮＡを切り出
し、前記と同様な方法により切断して得られる他の開環
ベクター末端とを結合させて新規な特徴を有する組み換
えＤＮＡを作製して、他の宿主に移入してＡＳＯＭを産
生させることも容易に実施できる。

【００２７】また、本発明のＡＳＯＭは公知の遺伝子操
作手段によりペプチドの変異をなしてもよく、このよう
なムテインのＤＮＡは、本発明のＡＳＯＭ遺伝子から遺
伝子工学的手法により作製される人工変異遺伝子を意味
し、この人工変異遺伝子は部位特異的塩基変換法及び目
的遺伝子の特定ＤＮＡ断片を人工変異ＤＮＡで置換する
などの種々なる遺伝子工学的方法を使用して得られ、か
くして取得された人工変異遺伝子のうち特に優れた性質
を有するＡＳＯＭムテインＤＮＡについては最終的には
このムテインＤＮＡをベクターに挿入せしめて組み換え
ＤＮＡを作成し、これを宿主微生物に移入させることに
よって、ＡＳＯＭムテインの製造が可能である。

【００２８】形質転換体を具体的に例示すれば、配列番
号１又は配列番号２に示されたＤＮＡ配列を有するＤＮ
ＡをコスミドｐＢＳＦＡＨＹ８３に組み込み、宿主微生
物アクレモニウム・クリソゲナム ＡＴＣＣ１１５５０
に導入して染色体に挿入させ、ＡＳＯＭを生成する微生
物を選択して得た形質転換体アクレモニウム・クリソゲ
ナム ＡＴＣＣ１１５５０・ｐｃｓＭＡＯ１（ＦＥＲＭ
Ｐ−１５３２９）が挙げられる。

【００２９】上述の方法によって得られたＡＳＯＭを構
成するポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
の塩基配列は、ジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ，２１４，１２０５−１２１０（１９８
１））で解読し、またＡＳＯＭを構成するポリペプチド
の全アミノ酸配列は、塩基配列より予測決定した。ま
た、以下の方法により培養精製した該ＡＳＯＭであるポ
リペプチドを用いて、液相プロテインシーケンサー（ベ
ックマン社製：ＢＥＣＫＭＡＮ Ｓｙｓｔｅｍ ８９０
ＭＥ）によりその部分アミノ酸配列が、予測決定され
たアミノ酸配列の一部と一致することを確認した。

【００３０】形質転換体により該ＡＳＯＭを製造するに
当たっては、該形質転換体を栄養培地で培養し、菌体中
または培養液中に該ＡＳＯＭを産生せしめ、培養終了
後、もし生産物が菌体内にある場合には、得られた培養
物を濾過又は遠心分離などの手段により菌体を採集し、
次いでこの菌体を機械的方法又はリゾチームなどの酵素
的方法で破壊して菌体抽出液を得る。また生産物が菌体
外に放出される場合には遠心分離または濾過により培養
液中の菌体及び不溶成分を除去すればよい。また、必要
に応じてＥＤＴＡおよび／又は適当な界面活性剤などを
添加して該ＡＳＯＭの水溶液を濃縮するか、又は濃縮す
る事なく硫安分画、ゲル濾過、アフィニティークロマト
グラフィー等の吸着クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィーにより処理して、純度のよい該ＡＳＯ
Ｍを得ることができる。

【００３１】形質転換体である微生物の培養条件はその
栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すれば良く、
通常多くの場合は、液体培養で行うが、工業的には深部
通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源とし
ては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用さ
れうる。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であれ
ばよく、例えばグルコース、サッカロース、ラクトー
ス、マルトース、フラクトース、グリセロール、糖蜜な
どが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物
であれば良く、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、大豆タンパク、カゼイン加水分解物などが使用され
る。

【００３２】その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグ
ネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜
鉛、銅などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンな
どが必要に応じて使用される。培養温度は微生物が発育
し、ＡＳＯＭを生産する範囲で適宜変更し得るが、アク
レモニウム・クリソゲナムの場合、好ましくは２５〜２
８℃程度である。培養条件は、条件によって多少異なる
が、ＡＳＯＭが最高終了に達する時期を見計らって適当
な時期に培養を終了すればよく、アクレモニウム・クリ
ソゲナムの場合、通常は４〜７日間程度である。培地ｐ
Ｈは菌が発育し、ＡＳＯＭを生産する範囲で適宜変更し
得るが、アクレモニウム・クリソゲナムの場合、好まし
くはｐＨ６程度である。

【００３３】培養物中のＡＳＯＭは、菌体を含む培養液
そのままを採取し、利用することもできるが、一般には
常法に従って、ＡＳＯＭが培養液中に存在する場合に
は、濾過、遠心分離などによりＡＳＯＭ含有溶液と微生
物菌体とを分離した後に利用される。ＡＳＯＭが菌体内
に存在する場合には、得られた培養物を濾過又は遠心分
離などの手段により、菌体を採取し、次いでこの菌体を
機械的方法又はリゾチーム、ザイモリアーゼなどの酵素
的方法で破壊し、又、必要に応じてＥＤＴＡ等のキレー
ト剤及び／又は界面活性剤を添加してＡＳＯＭを可溶化
し水溶液として分離採取する。

【００３４】この様にして得られたＡＳＯＭ含有溶液
を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に、硫安、硫酸ナト
リウムなどの塩析処理などによる分別沈澱法により沈澱
せしめればよい。次いでこの沈澱物を、水に溶解し、半
透膜にて透析せしめて、より低分子量の不純物を除去す
ることができる。また、吸着剤あるいはゲル濾過剤など
によるゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等
の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィー等により精製し、これらの手段を用いて得られるＡ
ＳＯＭ含有溶液から、減圧濃縮凍結乾燥等の処理により
精製されたＡＳＯＭが得られる。

【００３５】以上の製造法により得られるＡＳＯＭとし
て、例えば下記の諸物性を有するＡＳＯＭが例示され
る。 （１）酵素作用 下記式に示したように、１ｍｏｌｅのアスコルビン酸お
よび０．５ｍｏｌｅの分子状酸素から１ｍｏｌｅのデヒ
ドロアスコルビン酸および１ｍｏｌｅの水分子を生成す
る反応を触媒する。

【００３６】

【化１】

【００３７】（２）分子量 単量体：６０，０００±５，０００（上記の新規なアク
レモニウム・クリソゲナムの生産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ電気泳動した結果による）。ただし生成するＡＳＯＭ
は二量体である。 （３）等電点 ｐＨ４．０±．２（等電点電気泳動用カラム（ＬＫＢ社
製）、キャリアーアンフォラインｐＨ３．５〜１０．０
（ＬＫＢ社製）を用い、７００Ｖ、４８時間通電した
後、カラム（２４×３０ｃｍ）から２ｍｌずつ分画し、
各々の画分のｐＨと活性を測定することによる。） （４）熱安定性 ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に本酵素を溶解
し、各温度で１０分間加熱処理した後、その残存活性を
後記の酵素活性測定法に従って測定した結果、本酵素は
少なくとも６０℃以下では安定であった。 （５）ｐＨ安定性 本酵素を５０ｍＭのジメチルグルタル酸−水酸化ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ５．０〜７．０）、トリス塩酸緩衝液
（ｐＨ６．５〜９．０）、グリシン−水酸化ナトリウム
緩衝液（ｐＨ８．５〜１０．０）に溶解し、３０℃で２
４時間処理した後、その残存活性を後記の酵素活性測定
法に従って測定した。その結果、本酵素はｐＨ６〜１０
の範囲で安定であった。 （６）至適ｐＨ 後記の酵素活性測定法の反応液中のリン酸緩衝剤を、次
の緩衝剤に変えて酵素活性を測定した。塩酸−グリシン
緩衝液（ｐＨ３．０〜４．０）、酢酸緩衝液（ｐＨ４．
０〜５．０）、ＭＥＳ緩衝液（同仁化学研究所製）（ｐ
Ｈ５．５）、リン酸緩衝液（ｐＨ６．０〜７．０）、ト
リス緩衝液（ｐＨ７．５〜８．０）。その結果、本酵素
はｐＨ４〜４．５付近に至適ｐＨを有した。 （７）ＡＳＯＭの酵素活性測定法 反応液組成 反応液：０．５ｍＭのアスコルビン酸、０．０５ｍＭの
塩酸、０．５ｍＭのエチレンジアミン４酢酸ナトリウ
ム、０．１Ｍのリン酸２水素カリウム、５ｍＭのリン酸
水素２ナトリウム（最終ｐＨ５．６） 酵素活性測定 酵素反応液１ｍｌを試験管に入れ、３０℃で５分間イン
キュベートした後に、適当に希釈した酵素液０．１ｍｌ
を添加して撹拌し、３０℃で反応を開始する。正確に５
分間反応の後、０．２Ｎの塩酸３ｍｌを添加して撹拌
し、反応を停止して、Ａ２４５ｎｍを測定して吸光度Ａ
ｓを求める。また、酵素反応液１ｍｌと０．２Ｎの塩酸
３ｍｌを試験管中で混合、撹拌し、３０℃で５分間イン
キュベートした後に、先述と同じ酵素液０．１ｍｌを加
え撹拌し、Ａ２４５ｎｍを測定してブランク吸光度Ａｂ
を求める。これにより得られたＡｓとＡｂから、以下の
式により酵素液の酵素活性値が導き出される。

【００３８】活性値（ｕ／ｍｌ）＝（Ａｓ−Ａｂ）×
０．８２×（希釈率）

【００３９】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施例を挙げて詳
細に説明するが、何等本発明はこれによって限定される
ものではない。なお、実施例中、常法に従い、と記述し
た操作は、例えばティー・マニアティスらの方法（Ｔ．
ｍａｎｉａｔｉｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８２，１９８９）や、
市販の各種酵素、キット類に添付された手順に従えば実
施できるものである。また、実験に使用した組換えＤＮ
Ａ酵素試薬（制限酵素等）は、特に指摘しない限りすべ
て宝酒造社製である。

【００４０】

【実施例１】 ＜アクレモニウム ｓｐ．からのＤＮＡの抽出＞ＣＭ培
地（ショ糖２０ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ
／ｌ、リン酸水素二カリウム０．５ｇ／ｌ、塩化カリウ
ム０．５ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．５ｇ／
ｌ、硫酸第１鉄・７水塩０．０１ｇ／ｌ、硝酸ナトリウ
ム３ｇ／ｌ、酵母エキス４ｇ／ｌ、ペプトン１０ｇ／
ｌ）に、ＡＳＯＭ生産菌であるアクレモニウム ｓｐ．
（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ．）ＨＩ−２５ 株（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１５３２８）を植菌し２８℃で３日間撹拌
培養し、培養液２０ｍｌを遠心分離（３，０００Ｇ、４
℃、１０分）し、集菌した菌体を２４ｍｌのＴＥＳ（５
０ｍＭトリス塩酸ｐＨ８．０、５０ｍＭエチレンジアミ
ン４酢酸ナトリウム（以下ＥＤＴＡと略す）ｐＨ８．
０、１５％ショ糖）に懸濁し、最終濃度が４μｇ／ｍｌ
になるようにザイモリアーゼ１００Ｔ（生化学工業社
製）と、同じく最終濃度０．４ｍｇのＲＮａｓｅＡ（Ｓ
ＩＧＭＡ社製）を加え、３７℃で１時間処理し、細胞壁
を破壊した。

【００４１】これに２０％ドデシル硫酸ナトリウム（以
下ＳＤＳと略す）１ｍｌを加え、３７℃に２時間置き菌
体を溶解した。これに２ｍｇ／ｍｌ濃度のプロテイナー
ゼＫ（ＳＩＧＭＡ社製）２ｍｌと１５ｍｌのクロロホル
ム・イソアミルアルコール２４対１混合液を加え、３７
℃で１０時間緩やかに振盪撹拌し蛋白を分解した。これ
を遠心分離（２５，０００Ｇ、１５分）し、分離した水
層を他の容器に移し、その上に２４ｍｌの−２０℃エタ
ノールを重層し、界面に析出してくる染色体をガラス棒
にからめて取得した。

【００４２】この染色体を２０ｍｌのＴＥ（１０ｍＭト
リス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．
０））に溶解し、常法に従ってフェノール・クロロホル
ム処理、エタノール沈澱及び乾燥操作を行った。以上の
操作によりアクレモニウム ｓｐ．ＨＩ−２５の染色体
標品２ｍｇを得た。

【００４３】

【実施例２】 ＜放射性ＤＮＡプローブの作製＞アクレモニウム ｓ
ｐ．ＨＩ−２５株により生産された酵素ＡＳＯＭを精製
し、その部分アミノ酸配列をエドマン分解法により決定
した。なお、当初Ｎ末端のアミノ酸配列を決定しようと
したが、全く解析データが得られず、決定を断念した。

【００４４】判明した部分アミノ酸配列を基に、その遺
伝子の部分塩基配列を予想した。この予想配列を基に設
計されるオリゴヌクレオチドプローブには無数の形状が
あり、そのうち６種類のプローブを作成したが、本発明
で有効であったのはＡＯ−１と命名したオリゴヌクレオ
チドのみであった。ＡＯ−１の塩基配列構造を配列番号
３に示した。

【００４５】このオリゴヌクレオチドは外部業者（株式
会社ＢＥＸ）により依託合成され、完成したオリゴヌク
レオチド２００ｎｇに、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ
により常法に従ってラジオアイソトープ³²Ｐを取り込ま
せ、放射性オリゴヌクレオチドプローブとした。

【００４６】

【実施例３】 ＜ＡＳＯＭ遺伝子含有ＤＮＡフラグメントの検定＞実施
例１の操作で得られたアクレモニウム ｓｐ．ＨＩ−２
５株の染色体ＤＮＡから遺伝子ライブラリーを作成する
ため、本染色体を各種制限酵素で切断し、目的遺伝子が
含有されるＤＮＡフラグメントの鎖長を検定する操作を
行った。即ち、アクレモニウム ｓｐ．ＨＩ−２５株の
染色体ＤＮＡ（５μｇ）を各種制限酵素で常法に従って
切断し、１．５％アガロースゲル（宝酒造社製Ｈ１４）
中で常法に従い電気泳動し、泳動後のアガロースゲルか
ら、常法に従ったサザンブロッティング法により、ナイ
ロンメンブレンフィルター（ＰＡＬＬ社製：バイオダイ
ンＡ）にＤＮＡを移行・固定させた。このフィルターに
対して、実施例２で調製した放射性ＤＮＡプローブＡＯ
−１を使用して、常法に従いサザンハイブリダイゼーシ
ョンを行い、各制限酵素による切断染色体が示すポジテ
ィブバンドのサイズを観察した。

【００４７】その結果、ＥｃｏＲＩ切断により約２．５
ｋｂ（キロベース：ＤＮＡ鎖長の単位、１，０００塩
基）、ＳａｃＩ切断により約３．８ｋｂのＤＮＡフラグ
メント上にＡＳＯＭ遺伝子が含有されることが明らかと
なり、ＥｃｏＲＩで切断した染色体ＤＮＡの２．５ｋｂ
フラグメント、ＳａｃＩで切断した染色体ＤＮＡの３．
８ｋｂフラグメントのそれぞれから遺伝子ライブラリー
を作成することとした。

【００４８】

【実施例４】 ＜遺伝子ライブラリーの作成＞実施例１の操作で得られ
たアクレモニウム ｓｐ．ＨＩ−２５株の染色体ＤＮＡ
１０μｇを常法に従い、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し約
２．５ｋｂ、ＳａｃＩで切断し約３．８ｋｂのＤＮＡフ
ラグメントを低融点アガロース電気泳動を使用してそれ
ぞれ分離した。

【００４９】このＤＮＡフラグメントを、それぞれ同じ
制限酵素で切断しアルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）
１ｕで切断末端を脱リン酸化したｐＵＣ１１８（宝酒造
社製）２μｇと、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ
（宝酒造社製）で連結させた。これを用いてＫ．Ｓｈｉ
ｇｅｓａｄａの方法（細胞工学２，６１６−６２６，
（１９８３））によってコンピテント細胞としたエシェ
リヒア・コリ ＪＭ１０９（宝酒造社製）（ｒｅｌＡ
１，ｓｕｐＥ４４，ｅｎｄＡ１，ｈｓｄＲ１７，ｇｙｒ
Ａ９６，ｒｅｃＡ１，ｔｈｉ，△（ｌａｃ−ｐｒｏＡ
Ｂ）／Ｆ’［ｔｒａＤ３６，ｐｒｏＡＢ＋，ｌａｃＩ
ｑ，ｌａｃＺ△Ｍ１５］，ｍｃｒＡ−，ｍｃｒＢ＋（Ｍ
ｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．（１９８５）Ｇｅｎｅ，３３，１１
９．））をトランスフォーメーションし、５０μｇ／ｍ
ｌアンピシリン含有Ｌ平板寒天培地（バクトトリプトン
（ＤＩＦＣＯ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ＤＩＦＣ
Ｏ社製）５ｇ／ｌ、１０ｇ／ｌの塩化ナトリウム、バク
トアガー（ＤＩＦＣＯ社製）１５ｇ／ｌ）にて一夜培養
し、ＥｃｏＲＩフラグメントからは約２５００個、Ｓａ
ｃＩフラグメントからは２８００個のアンピシリン耐性
コロニーを得、遺伝子ライブラリーとした。

【００５０】

【実施例５】 ＜ＡＳＯＭ遺伝子含有クローンのスクリーニング＞実施
例４により得た遺伝子ライブラリーを、ナイロンメンブ
レンフィルター（ＰＡＬＬ社製：バイオダインＡ）にレ
プリカし、このフィルターを別の５０μｇ／ｍｌアンピ
シリン含有Ｌ平板寒天培地上に、コロニー面が上になる
ように重ね、３７℃で１６時間培養した。培養後このフ
ィルターに対して、実施例２で調製された放射性ＤＮＡ
プローブＡＯ−１を使用して、常法に従いコロニーハイ
ブリダイゼーションを行った。その結果、ポジティブシ
グナルをしめすコロニーをＥｃｏＲＩライブラリーから
２個、ＳａｃＩライブラリーから１個確認した。

【００５１】

【実施例６】 ＜組み換えプラスミドの抽出＞実施例５で選ばれたポジ
ティブシグナルを示すコロニーを５０μｇ／ｍｌのアン
ピシリン含有ＬＢ液体培地（バクトトリプトン（ＤＩＦ
ＣＯ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製）
５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／ｌ）１．５ｍｌに植
菌し３７℃で１６時間振盪培養した後、常法に従いプラ
スミドを抽出した。その結果、ＥｃｏＲＩライブラリー
より分離した２つのコロニーより抽出したプラスミドは
同じものであり、これをｐｃＡＳＯＭ１と命名した。ま
たＳａｃＩライブラリーより分離したコロニーから抽出
したプラスミドをｐｃＡＳＯＭ２と命名した。なお、ｐ
ｃＡＳＯＭ１は約２．５ｋｂ、ｐｃＡＳＯＭ２は約３．
８ｋｂの染色体由来ＤＮＡを保有し、そのうち約１．５
ｋｂの領域は双方に共通に保有されていた。

【００５２】

【実施例７】 ＜ＡＳＯＭ遺伝子配列の決定＞実施例６で調製したプラ
スミドｐｃＡＳＯＭ１、ｐｃＡＳＯＭ２よりＡＳＯＭを
コードしていると推定される部分についてジデオキシ法
により塩基配列を決定した。その結果、ＡＳＯＭ遺伝子
の全ＤＮＡ配列が決定された。

【００５３】

【実施例８】 ＜ｃＤＮＡ由来ＡＳＯＭ遺伝子の分離と比較＞実施例７
で決定したＡＳＯＭの遺伝子配列と、実施例２のＡＳＯ
Ｍの部分アミノ酸配列を照合したところ、遺伝子中に真
核生物特有のイントロンが存在することが判明した。そ
こで遺伝子のエクソンとイントロンの領域を確定するた
め、ＡＳＯＭ遺伝子のｃＤＮＡを分離することにした。

【００５４】ＣＭ培地に、ＡＳＯＭ生産菌であるアクレ
モニウム ｓｐ．ＨＩ−２５株を植菌し２８℃で３日間
撹拌培養し、培養液２０ｍｌを遠心分離（３，０００
Ｇ、４℃、１０分）し、集菌した菌体を乳鉢に入れ、液
体窒素を注いで瞬間凍結させた。これを乳棒ですりつぶ
し、破砕した菌体０．５ｇを２０％グアニジン塩酸に懸
濁し、このサンプルより、ファルマシア社のｍＲＮＡ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットを使用して、添付のマ
ニュアルに従ってメッセンジャーＲＮＡ抽出を行った。
さらにこのメッセンジャーＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ
の合成を、ファルマシア社のｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｓキットを使用して、添付のマニュアルに従って行っ
た。以上の操作によりアクレモニウム ｓｐ．ＨＩ−２
５株のｃＤＮＡ約５０μｇが分離された。

【００５５】続いて、実施例７で明らかになったＡＳＯ
Ｍ遺伝子の５’末端の正鎖と、３’末端の相補鎖と同じ
塩基配列を有する２種の２０塩基のオリゴヌクレオチド
を、実施例２と同様に合成した。このオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとし、アクレモニウム ｓｐ．ＨＩ−２
５株のｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応操作（Ｓａｉｋ
ｉ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３
９，４８７−４９１（１９８８））を、ＤＮＡ Ｔｈｅ
ｒｍａｌ ＣｙｃｌｅｒとＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｒ
ｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ＡｍｐｌｉＴａｑ
ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ともにＰｅｒｋｉｎ−
Ｅｌｍｅｒ社製）を使用して、添付のマニュアルに従っ
て実施した。

【００５６】その結果約１．７ｋｂのＤＮＡフラグメン
トが合成され、このＤＮＡフラグメントの塩基配列を実
施例７と同様にして決定した。その結果、このＤＮＡフ
ラグメントがｃＤＮＡ由来のＡＳＯＭ遺伝子であること
が確認され、染色体ＤＮＡ由来のＡＳＯＭ遺伝子の塩基
配列との比較により、染色体ＤＮＡ由来のＡＳＯＭ遺伝
子中のイントロン領域が確定した。また染色体ＤＮＡ由
来のＡＳＯＭ遺伝子のエクソン領域の塩基配列は、ｃＤ
ＮＡ由来のＡＳＯＭ遺伝子の塩基配列と完全に一致する
ことが確認された。ｃＤＮＡ由来のＡＳＯＭ遺伝子の塩
基配列、すなわちＡＳＯＭ遺伝子のエクソン領域の塩基
配列と、そのコードするＡＳＯＭアミノ酸配列を配列番
号１に、染色体ＤＮＡ由来の、イントロン領域を含むＡ
ＳＯＭ遺伝子および周辺領域の塩基配列を配列番号２に
示した。

【００５７】

【実施例９】 ＜ＡＳＯＭ遺伝子の染色体組み込み用コスミドｐｃｓＭ
ＡＯ１の作製＞当初、実施例８で得たｃＤＮＡ由来のＡ
ＳＯ遺伝子を、大腸菌を始めとするバクテリアに導入し
ＡＳＯＭを生産させることを試みたが、活性を有する蛋
白は遂に得られなかった。そこで、新たに糸状菌を遺伝
子導入用宿主とすることにし、ＡＳＯＭ遺伝子を染色体
へ組み込むためのベクターの作成を行った。

【００５８】２μｇのｐｃＡＳＯＭ２をＮｓｐＶで切断
し、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造社製）
を使用して添付のマニュアルに従って切断末端を平滑化
した後さらにＳａｃＩで切断し、低融点アガロース電気
泳動を使用して１．９ｋｂのＤＮＡフラグメントを分離
した。このフラグメントをＳａｃＩとＳｍａＩで切断し
ＢＡＰ１ｕで切断末端を脱リン酸化した２μｇのｐｃＡ
ＳＯＭ１と、ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造
社製）で連結させた。

【００５９】これを用いてＫ．Ｓｈｉｇｅｓａｄａの方
法によってコンピテント細胞としたエシェリヒア・コリ
ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）（Ｆ−，ｒｅｃＡ１，
ｅｎｄＡ１，ｇｙｒＡ９６，ｔｈｉ−１，ｈｓｄＲ１７
（ｒｋ−，ｍｋ＋），ｓｕｐＥ４４，ｒｅｌＡ１，λ−
（Ｔ．ｍａｎｉａｔｉｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ（１９８２），５０４−５０６））をトラン
スフォーメーションし、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含
有Ｌ平板寒天培地（バクトトリプトン（ＤＩＦＣＯ社
製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製）５ｇ／
ｌ、１０ｇ／ｍｌの塩化ナトリウム、バクトアガー（Ｄ
ＩＦＣＯ社製）１５ｇ／ｌ）にて一夜培養し、形質転換
体を得た。この形質転換体より常法に従ってプラスミド
を抽出、精製し、このプラスミドをｐｃＡＳＯＭ３と命
名した。

【００６０】このｐｃＡＳＯＭ３（２μｇ）をＸｂａＩ
とＢａｍＨＩで切断し、約２．６ｋｂのＤＮＡフラグメ
ントを低融点アガロース電気泳動を使用して分離した。
また、プラスミドｐＵＣ１９のマルチクローニングサイ
トの両端に制限酵素ＳｆｉＩ認識部位を付加したプラス
ミドｐＳＦＩ−２（特開平４−１０４７９２号公報）を
制限酵素ＸｂａＩとＢａｍＨＩで切断し、このｐＳＦＩ
−２（１００ｎｇ）と先の２．６ｋｂのＤＮＡフラグメ
ント１００ｎｇを、ＤＮＡ ＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ
（宝酒造社製）で連結させた。これを用いてエシェリヒ
ア・コリ ＤＨ１のコンピテント細胞をトランスフォー
メーションし、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有Ｌ平板
寒天培地にて一夜培養し、形質転換体を得た。この形質
転換体より常法に従ってプラスミドを抽出、精製し、こ
のプラスミドをｐＳＦＡＯ１と命名した。

【００６１】次に、２μｇのプラスミドｐＳＦＡＯ１を
ＳｆｉＩ（東洋紡績社製）で切断し、ＡＳＯＭ遺伝子を
含む約２．２ｋｂのＤＮＡフラグメントを分離し、同じ
くＳｆｉＩで切断したコスミドｐＢＳＦＡＨＹ８３（特
開平４−１０４７９２号公報）とを、反応液中のモル濃
度比１５：１でＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用
いて複数連結し、λＤＮＡパッケージングキット（ファ
ルマシア社製）を用い添付のマニュアルに従って、新た
なコスミドＤＮＡをファージ粒子に封入し、これをエシ
ェリヒア・コリ ＤＨ１に感染させて形質転換体を作製
した。この形質転換体よりプラスミド抽出と同様にして
コスミドを抽出、精製し、このコスミドをｐｃｓＭＡＯ
１と命名した。

【００６２】

【実施例１０】 ＜コスミドｐｃｓＭＡＯ１のアクレモニウム株への導入
と形質転換＞ＣＭ寒天培地（ＣＭ培地＋１．５％寒天）
上で３０℃、５日間培養したアクレモニウム・クリソゲ
ナム ＡＴＣＣ１１５５０株の菌糸体をＣＭ培地５０ｍ
ｌに接種し、３０℃で３日間振盪培養した。この培養液
１ｍｌをＧＡ培地（４０ｇ／ｌグリセロール、４ｇ／ｌ
アスパラギン、０．１ｇ塩化カルシウム、０．１ｇ／ｌ
塩化ナトリウム、０．１ｇ／ｌ硫酸マグネシウム（７水
塩）、０．０１ｇ／ｌ硫酸第１鉄（７水塩）、４ｍｇ／
ｌ硫酸マンガン（４水塩）、０．０１ｇ／ｌ硫酸亜鉛
（７水塩）、１ｍｇ／ｌ無水硫酸銅、３ｍＭリン酸バッ
ファーｐＨ７．０）５０ｍｌに植菌し、さらに３０℃２
０時間培養した。

【００６３】培養後、菌体を３５００ｒｐｍで５分遠心
して集菌し、菌体を０．９％塩化ナトリウム溶液で洗浄
した後、１０ｍＭジチオスレイトール含有マクイルベイ
ン緩衝液（１２．９ｍＭのクエン酸、１８７ｍＭのリン
酸水素２ナトリウム）に懸濁して３０℃にゆっくり旋回
撹拌しながら１時間置いた。これを再び３０００ｒｐ
ｍ、５分遠心して集菌し、菌体を１０ｍｇ／ｍｌのノボ
ザイム（ノボ社製）を添加したプロトプラスト緩衝液
（０．６Ｍの塩化カリウム、１０ｍＭの塩化マグネシウ
ム、２５ｍＭの塩化カルシウム）に懸濁し３０℃にゆっ
くり旋回撹拌しながら３０分放置し菌体をプロトプラス
ト化した。反応終了後３０００ｒｐｍで１０分遠心して
集菌し、プロトプラスト緩衝液に菌体を懸濁し、再び遠
心集菌して菌体洗浄を行った。

【００６４】菌体は再びプロトプラスト緩衝液１０ｍｌ
に懸濁して１５ｍｌ滅菌試験管中に１０分静置して菌糸
塊を沈澱させ、懸濁液上部２／３程度を分取してプロト
プラスト懸濁液とした。この懸濁液を血球計算板上にの
せ、顕微鏡観察下プロトプラスト濃度を計算し、遠心集
菌と懸濁により１×１０の７乗ｃｅｌｌ／ｍｌにプロト
プラスト濃度を調整した。調整したプロトプラスト懸濁
液１００μｌに、実施例９で調製したコスミドｐｃｓＭ
ＡＯ１（３〜５μｇ）を５ｍｇ／ｍｌヘパリン溶液１０
μｌに溶解したものを添加し、さらに５０μｌのポリエ
チレングリコール溶液（１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液ｐ
Ｈ８．０、５０ｍＭの塩化カルシウム、２５％ポリエチ
レングリコール４０００（シグマ社製）、０．６Ｍの塩
化カリウム）を添加し、氷中に２５分放置した。

【００６５】これにさらに１ｍｌのポリエチレングリコ
ール溶液を添加し、室温下に３０分置き、コスミドを菌
体中に取り込ませた。この懸濁液をＢＲＭ寒天平板培地
（２７．５％シュークロース、０．２％硝酸ナトリウ
ム、０．１％リン酸２水素カリウム、１％ブレイン・ハ
ート・インフュージョン（ＤＩＦＣＯ社製）、２％グル
コース、２ｍＭの塩化マグネシウム、５ｍＭの塩化カル
シウム、０．７５％寒天：１枚当たり２５ｍｌ）上に２
００μｌを広げ、１５℃に１晩置き、菌体細胞壁の修復
を待った。

【００６６】その後、０．５ｍｇ／ｍｌハイグロマイシ
ンＢ（和光純薬社製）含有ＢＲＭ寒天培地を５ｍｌ重層
し、さらに３０℃で７〜１０日培養を行った。培養後寒
天培地上に生育してきたコロニーを、染色体中に先のｐ
ｃｓＭＡＯ１が組み込まれ、ハイグロマイシンＢ薬剤耐
性を獲得した形質転換体として取得し、これをアクレモ
ニウム・クリソゲナム ＡＴＣＣ１１５５０・ｐｃｓＭ
ＡＯ１（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕ
ｍ ＡＴＣＣ１１５５０・ｐｃｓＭＡＯ１）と命名し、
寄託した（ＦＥＲＭ Ｐ−１５３２９）。

【００６７】

【実施例１１】 ＜遺伝子組換えアクレモニウムの培養＞１００μｇ／ｍ
ｌ濃度のハイグロマイシンＢを添加したＣＭ培地５ｍｌ
にアクレモニウム・クリソゲナム ＡＴＣＣ１１５５０
・ｐｃｓＭＡＯ１の菌糸を１白金耳植菌し、２８℃で３
日間振盪培養した。この培養液を１２０００ｒｐｍで２
分遠心し、上清を分取した。また同時にアクレモニウム
・クリソゲナム ＡＴＣＣ１１５５０を、５ｍｌのハイ
グロマイシンＢ無添加のＣＭ培地で同様の条件の下培養
と上清の調製を行い、比較対照サンプルとした。

【００６８】

【実施例１２】 ＜培養上清中のＡＳＯＭ酵素活性の確認＞実施例１０で
調製したアクレモニウム・クリソゲナム ＡＴＣＣ１１
５５０・ｐｃｓＭＡＯ１とアクレモニウム・クリソゲナ
ム ＡＴＣＣ１１５５０の培養上清中のＡＳＯＭ酵素活
性を、前述したＡＳＯＭ酵素活性測定法によって測定し
た。

【００６９】その結果、表１に示す通り、アクレモニウ
ム・クリソゲナム ＡＴＣＣ１１５５０・ｐｃｓＭＡＯ
１の培養上清中にＡＳＯＭの活性を確認し、またアクレ
モニウム・クリソゲナム ＡＴＣＣ１１５５０培養上清
中にはＡＳＯＭ活性は検出されないことを確認した。

【００７０】

【表１】

【００７１】

【発明の効果】ＡＳＯＭのＮ末端アミノ酸配列に基づい
て合成したオリゴヌクレオチドを使用して、ＡＳＯＭ生
産菌株に由来する染色体ＤＮＡライブラリーからＡＳＯ
Ｍ遺伝子の全ＤＮＡ配列を明確とした新規なＡＳＯＭ遺
伝子を分離したもので、該ＡＳＯＭ遺伝子を利用して、
高効率なＡＳＯＭの生産が可能になった。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はプラスミドｐｃｓＭＡＯ１の作成フロー
図を示す。

【図２】図２はプラスミドｐｃｓＭＡＯ１の制限酵素地
図を示す。

【００７２】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１６５３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：アクレモニウム ｓｐ．（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕ
ｍ ｓｐ．） 株名：ＨＩ−２５ 配列の特徴 １−１６５３ Ｐ ＣＤＳ 配列 ATG CTT CTG GGC ACT CTC TTC ACG CTC TTG GCT CAA TGC CTT CTT ATT 48 Met Leu Leu Gly Thr Leu Phe Thr Leu Leu Ala Gln Cys Leu Leu Ile 1 5 10 15 GAG GCA ACT TCG TGT CTT GTG AAG CAT GAT GGT GGT TTC GTA CCT GAT 96 Glu Ala Thr Ser Cys Leu Val Lys His Asp Gly Gly Phe Val Pro Asp 20 25 30 CAT GTT CTC AGA GTG TCT AGT CGC AAT ATC AGC ATC GCT TGT ACG AGC 144 His Val Leu Arg Val Ser Ser Arg Asn Ile Ser Ile Ala Cys Thr Ser 35 40 45 CGA CAA TCA GCT GTG GTC AAT GGC ACA TCA CCT GGA CCA GAG CTC CGG 192 Arg Gln Ser Ala Val Val Asn Gly Thr Ser Pro Gly Pro Glu Leu Arg 50 55 60 GTC CCG GCC GGT CAG CGG ACC TGG ATC AGA GTT TAC AAT GAC TTG GAA 240 Val Pro Ala Gly Gln Arg Thr Trp Ile Arg Val Tyr Asn Asp Leu Glu 65 70 75 80 CAG GAG AAC TTG ACT ATG CAC TGG CAC GGC CTT GCC CAG CGC ATG GCA 288 Gln Glu Asn Leu Thr Met His Trp His Gly Leu Ala Gln Arg Met Ala 85 90 95 ATA TTT GCC GAT GGT AGC CCG CAA GGG TCT CAA TGG CCA ATT CCA CCC 336 Ile Phe Ala Asp Gly Ser Pro Gln Gly Ser Gln Trp Pro Ile Pro Pro 100 105 110 GGT CAC TTT TTC GAC TAC GAG CTT CAA ACG ACA GTT GAA GAT GCC GGC 384 Gly His Phe Phe Asp Tyr Glu Leu Gln Thr Thr Val Glu Asp Ala Gly 115 120 125 ACA TAT TTT TAC CAC TCT CAT GTC GGC ATG CAG GCC CTT ACA GCT TCA 432 Thr Tyr Phe Tyr His Ser His Val Gly Met Gln Ala Leu Thr Ala Ser 130 135 140 GGT GCC CTC ATC GTT GAA GGC TGC GAA CGC CCG CCG TAC CAA TAT GAT 480 Gly Ala Leu Ile Val Glu Gly Cys Glu Arg Pro Pro Tyr Gln Tyr Asp 145 150 155 160 GAC GAA CGC ACC CTG CAT TGG AGC GAC TTC TTC CCC CAA ACC GAT CAT 528 Asp Glu Arg Thr Leu His Trp Ser Asp Phe Phe Pro Gln Thr Asp His 165 170 175 GAG ATC GAA GTT GGC TTG CAA AGT GTA CCG CTC GTG TGG CCT GGC GAG 576 Glu Ile Glu Val Gly Leu Gln Ser Val Pro Leu Val Trp Pro Gly Glu 180 185 190 GTT CGC GCC GTC TTA CTC AAT GGG AAA GGC ATT GGC ATA GGT CAT GAG 624 Val Arg Ala Val Leu Leu Asn Gly Lys Gly Ile Gly Ile Gly His Glu 195 200 205 GCG GAC GTG AGT CCG TCT GGC GAC TGC TCC CTG CCC GTG ATT GAC GTT 672 Ala Asp Val Ser Pro Ser Gly Asp Cys Ser Leu Pro Val Ile Asp Val 210 215 220 GAT CCT GGC AAA ACA TAT CGG TTC AGA TTC ATC GGC GCA ACG GGC CTA 720 Asp Pro Gly Lys Thr Tyr Arg Phe Arg Phe Ile Gly Ala Thr Gly Leu 225 230 235 240 TCT CTT GTT AGC ATG GGC TTT GAG GGC CAT CAA AAT CTC ACC ATC ATT 768 Ser Leu Val Ser Met Gly Phe Glu Gly His Gln Asn Leu Thr Ile Ile 245 250 255 CAG GTT GAT GGT GGA GAA TGG ACA AAG CCA GCC TCA GTT GAC AGG ATA 816 Gln Val Asp Gly Gly Glu Trp Thr Lys Pro Ala Ser Val Asp Arg Ile 260 265 270 CAG CTG GCG TCT GGG CAG CGG TTT GAT GCA CTA TTC AAA GCA AAA ACA 864 Gln Leu Ala Ser Gly Gln Arg Phe Asp Ala Leu Phe Lys Ala Lys Thr 275 280 285 GAG GAG GAG CTT GCA TCA GAA GGC CGG CAA ACA TAT TTC ATT CAG TTT 912 Glu Glu Glu Leu Ala Ser Glu Gly Arg Gln Thr Tyr Phe Ile Gln Phe 290 295 300 GAG ACG CGC GAC CGG CCT GAG GTC TAT CGG GGC TAT GCA GTA ATT CGG 960 Glu Thr Arg Asp Arg Pro Glu Val Tyr Arg Gly Tyr Ala Val Ile Arg 305 310 315 320 TAC TCG AAG GCT AGC ACG ACG CCT CAT GTT CCA ACA ATA CCT CCG CTC 1008 Tyr Ser Lys Ala Ser Thr Thr Pro His Val Pro Thr Ile Pro Pro Leu 325 330 335 ACC CTT CCG AAC AAC ACA TAC GAC TGG CTC GAA TAC GAA CTT CGA CCC 1056 Thr Leu Pro Asn Asn Thr Tyr Asp Trp Leu Glu Tyr Glu Leu Arg Pro 340 345 350 CTC ATC GAA ACA GTG ACT CAG CCA ACT CTG GGC GAA GTC ACG CGT CGA 1104 Leu Ile Glu Thr Val Thr Gln Pro Thr Leu Gly Glu Val Thr Arg Arg 355 360 365 GTA ATA ATC AAT GCC TCT CAG TTG ACC GAT CCC CAA AAC CAA CAT GTC 1152 Val Ile Ile Asn Ala Ser Gln Leu Thr Asp Pro Gln Asn Gln His Val 370 375 380 GTT TGG CGG CTT GCG AAT CTT TCT TGG ACA GAA GCG GTG CGC CAG ACA 1200 Val Trp Arg Leu Ala Asn Leu Ser Trp Thr Glu Ala Val Arg Gln Thr 385 390 395 400 CCT CTG CTA GTT GAT ATA TAC AAA TTT GGC GAC CTC GCT ATC CCG AAC 1248 Pro Leu Leu Val Asp Ile Tyr Lys Phe Gly Asp Leu Ala Ile Pro Asn 405 410 415 TAC GAC GCT GCG CTG GCA AAT TAT GGC TGG GAC CCT GAG ACT CGG GCA 1296 Tyr Asp Ala Ala Leu Ala Asn Tyr Gly Trp Asp Pro Glu Thr Arg Ala 420 425 430 TTT CCT GCC AAG GTA GGA GAG GTG CTC GAG ATT GTC TTC CAG AAC ACG 1344 Phe Pro Ala Lys Val Gly Glu Val Leu Glu Ile Val Phe Gln Asn Thr 435 440 445 GGA TCT CTC GTG GGA AGT GAC GGT GCT GTA GAT ATA CAT CCT TTT CAT 1392 Gly Ser Leu Val Gly Ser Asp Gly Ala Val Asp Ile His Pro Phe His 450 455 460 GCT CAT GGC GAG CAC TTT TAT GAC ATC GGA AGC GGC GAC GGC GTT TAT 1440 Ala His Gly Glu His Phe Tyr Asp Ile Gly Ser Gly Asp Gly Val Tyr 465 470 475 480 GAT GCT GAG GCC AAT GAG GCA AAA CTC GTC GCC ATG AAC TAC ACA GCC 1488 Asp Ala Glu Ala Asn Glu Ala Lys Leu Val Ala Met Asn Tyr Thr Ala 485 490 495 GTG AAG AGG GAC ACG ACC ATG CTA TAT CAC TAC GCT GCC ACT ACA ACT 1536 Val Lys Arg Asp Thr Thr Met Leu Tyr His Tyr Ala Ala Thr Thr Thr 500 505 510 CCA GGG GCA CCC GCT GGC TGG CGA GCC TGG CGA CTC AGA GTG ACC CAA 1584 Pro Gly Ala Pro Ala Gly Trp Arg Ala Trp Arg Leu Arg Val Thr Gln 515 520 525 CCT GGA GTG TGG ATG ATT CAC TGC CAT ATT CTG CAG CAC ATG GTA ATG 1632 Pro Gly Val Trp Met Ile His Cys His Ile Leu Gln His Met Val Met 530 535 540 GGT AAG TCC GCA GAT GCT GTA 1653 Gly Lys Ser Ala Asp Ala Val 545 550

【００７３】

【配列表】

配列番号：２ 配列の長さ：２６４７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：アクレモニウム ｓｐ．（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕ
ｍ ｓｐ．） 株名：ＨＩ−２５ 配列の特徴 ５５０−２２５９ Ｐ ＣＤＳ ８０８−８６４ Ｅ ｉｎｔｒｏｎ 配列 TCTAGAAAGC GGAATAGGTA TACATGTCAT ATCGTCGATT TGGAGAATCG ACTGTAAGGT 60 TCTCCATGTG ACAAATTAAC GGCAATTCCG ATGTTCACGA TCCTTTTTTA TCTAGGACTA 120 GAGCTGCCCT GCTCGTACGA GCAAGGTTAT TGCCGCCTCA TCCCTGTCCC GACAGATAAA 180 AAAGATCCTC TACGGAGTAC TCGTACGAAT ACGATATGAA ACGCCGAACA AGAGTAGATT 240 GGACCCATTT TCCGCGACCC ATAGCGGCAG CACCCTTGTG CTTGTCCTGC AGAACACGAG 300 TCGTGTCAAT CTGCTTCGCG AAGAGGGCCT TAAAGGCACG CATGCACTTC GGTTGCATCG 360 AATGATATCT GATGCGAAAA ATTGCACGAC AATTGTCCAC TGGAATTTAA CAAGGCATGC 420 TCATTTCATA ACTGTTATGA TATCAACCCT TTAATTCATA TTGGACCCAT GCCCCATTGA 480 TCGTGTTGGC AGCGTGGCAG CGTGGCAGCG TGGCATACAT GCACACAGCC AAAACGGCTT 540 GTTACGACA ATG CTT CTG GGC ACT CTC TTC ACG CTC TTG GCT CAA TGC CTT 591 Met Leu Leu Gly Thr Leu Phe Thr Leu Leu Ala Gln Cys Leu 1 5 10 CTT ATT GAG GCA ACT TCG TGT CTT GTG AAG CAT GAT GGT GGT TTC GTA 639 Leu Ile Glu Ala Thr Ser Cys Leu Val Lys His Asp Gly Gly Phe Val 15 20 25 30 CCT GAT CAT GTT CTC AGA GTG TCT AGT CGC AAT ATC AGC ATC GCT TGT 687 Pro Asp His Val Leu Arg Val Ser Ser Arg Asn Ile Ser Ile Ala Cys 35 40 45 ACG AGC CGA CAA TCA GCT GTG GTC AAT GGC ACA TCA CCT GGA CCA GAG 735 Thr Ser Arg Gln Ser Ala Val Val Asn Gly Thr Ser Pro Gly Pro Glu 50 55 60 CTC CGG GTC CCG GCC GGT CAG CGG ACC TGG ATC AGA GTT TAC AAT GAC 783 Leu Arg Val Pro Ala Gly Gln Arg Thr Trp Ile Arg Val Tyr Asn Asp 65 70 75 TTG GAA CAG GAG AAC TTG ACT ATG GTATGTCATG ACAATAATGA AAACAGACTG 837 Leu Glu Gln Glu Asn Leu Thr Met 80 85 AAGTACCTGC TAATAGTGAG AGTGAAG CAC TGG CAC GGC CTT GCC CAG CGC ATG 891 His Trp His Gly Leu Ala Gln Arg Met 90 95 GCA ATA TTT GCC GAT GGT AGC CCG CAA GGG TCT CAA TGG CCA ATT CCA 939 Ala Ile Phe Ala Asp Gly Ser Pro Gln Gly Ser Gln Trp Pro Ile Pro 100 105 110 CCC GGT CAC TTT TTC GAC TAC GAG CTT CAA ACG ACA GTT GAA GAT GCC 987 Pro Gly His Phe Phe Asp Tyr Glu Leu Gln Thr Thr Val Glu Asp Ala 115 120 125 GGC ACA TAT TTT TAC CAC TCT CAT GTC GGC ATG CAG GCC CTT ACA GCT 1035 Gly Thr Tyr Phe Tyr His Ser His Val Gly Met Gln Ala Leu Thr Ala 130 135 140 TCA GGT GCC CTC ATC GTT GAA GGC TGC GAA CGC CCG CCG TAC CAA TAT 1083 Ser Gly Ala Leu Ile Val Glu Gly Cys Glu Arg Pro Pro Tyr Gln Tyr 145 150 155 GAT GAC GAA CGC ACC CTG CAT TGG AGC GAC TTC TTC CCC CAA ACC GAT 1131 Asp Asp Glu Arg Thr Leu His Trp Ser Asp Phe Phe Pro Gln Thr Asp 160 165 170 175 CAT GAG ATC GAA GTT GGC TTG CAA AGT GTA CCG CTC GTG TGG CCT GGC 1179 His Glu Ile Glu Val Gly Leu Gln Ser Val Pro Leu Val Trp Pro Gly 180 185 190 GAG GTT CGC GCC GTC TTA CTC AAT GGG AAA GGC ATT GGC ATA GGT CAT 1227 Glu Val Arg Ala Val Leu Leu Asn Gly Lys Gly Ile Gly Ile Gly His 195 200 205 GAG GCG GAC GTG AGT CCG TCT GGC GAC TGC TCC CTG CCC GTG ATT GAC 1275 Glu Ala Asp Val Ser Pro Ser Gly Asp Cys Ser Leu Pro Val Ile Asp 210 215 220 GTT GAT CCT GGC AAA ACA TAT CGG TTC AGA TTC ATC GGC GCA ACG GGC 1323 Val Asp Pro Gly Lys Thr Tyr Arg Phe Arg Phe Ile Gly Ala Thr Gly 225 230 235 CTA TCT CTT GTT AGC ATG GGC TTT GAG GGC CAT CAA AAT CTC ACC ATC 1371 Leu Ser Leu Val Ser Met Gly Phe Glu Gly His Gln Asn Leu Thr Ile 240 245 250 255 ATT CAG GTT GAT GGT GGA GAA TGG ACA AAG CCA GCC TCA GTT GAC AGG 1419 Ile Gln Val Asp Gly Gly Glu Trp Thr Lys Pro Ala Ser Val Asp Arg 260 265 270 ATA CAG CTG GCG TCT GGG CAG CGG TTT GAT GCA CTA TTC AAA GCA AAA 1467 Ile Gln Leu Ala Ser Gly Gln Arg Phe Asp Ala Leu Phe Lys Ala Lys 275 280 285 ACA GAG GAG GAG CTT GCA TCA GAA GGC CGG CAA ACA TAT TTC ATT CAG 1515 Thr Glu Glu Glu Leu Ala Ser Glu Gly Arg Gln Thr Tyr Phe Ile Gln 290 295 300 TTT GAG ACG CGC GAC CGG CCT GAG GTC TAT CGG GGC TAT GCA GTA ATT 1563 Phe Glu Thr Arg Asp Arg Pro Glu Val Tyr Arg Gly Tyr Ala Val Ile 305 310 315 CGG TAC TCG AAG GCT AGC ACG ACG CCT CAT GTT CCA ACA ATA CCT CCG 1611 Arg Tyr Ser Lys Ala Ser Thr Thr Pro His Val Pro Thr Ile Pro Pro 320 325 330 335 CTC ACC CTT CCG AAC AAC ACA TAC GAC TGG CTC GAA TAC GAA CTT CGA 1659 Leu Thr Leu Pro Asn Asn Thr Tyr Asp Trp Leu Glu Tyr Glu Leu Arg 340 345 350 CCC CTC ATC GAA ACA GTG ACT CAG CCA ACT CTG GGC GAA GTC ACG CGT 1707 Pro Leu Ile Glu Thr Val Thr Gln Pro Thr Leu Gly Glu Val Thr Arg 355 360 365 CGA GTA ATA ATC AAT GCC TCT CAG TTG ACC GAT CCC CAA AAC CAA CAT 1755 Arg Val Ile Ile Asn Ala Ser Gln Leu Thr Asp Pro Gln Asn Gln His 370 375 380 GTC GTT TGG CGG CTT GCG AAT CTT TCT TGG ACA GAA GCG GTG CGC CAG 1803 Val Val Trp Arg Leu Ala Asn Leu Ser Trp Thr Glu Ala Val Arg Gln 385 390 395 ACA CCT CTG CTA GTT GAT ATA TAC AAA TTT GGC GAC CTC GCT ATC CCG 1851 Thr Pro Leu Leu Val Asp Ile Tyr Lys Phe Gly Asp Leu Ala Ile Pro 400 405 410 415 AAC TAC GAC GCT GCG CTG GCA AAT TAT GGC TGG GAC CCT GAG ACT CGG 1899 Asn Tyr Asp Ala Ala Leu Ala Asn Tyr Gly Trp Asp Pro Glu Thr Arg 420 425 430 GCA TTT CCT GCC AAG GTA GGA GAG GTG CTC GAG ATT GTC TTC CAG AAC 1947 Ala Phe Pro Ala Lys Val Gly Glu Val Leu Glu Ile Val Phe Gln Asn 435 440 445 ACG GGA TCT CTC GTG GGA AGT GAC GGT GCT GTA GAT ATA CAT CCT TTT 1995 Thr Gly Ser Leu Val Gly Ser Asp Gly Ala Val Asp Ile His Pro Phe 450 455 460 CAT GCT CAT GGC GAG CAC TTT TAT GAC ATC GGA AGC GGC GAC GGC GTT 2043 His Ala His Gly Glu His Phe Tyr Asp Ile Gly Ser Gly Asp Gly Val 465 470 475 TAT GAT GCT GAG GCC AAT GAG GCA AAA CTC GTC GCC ATG AAC TAC ACA 2091 Tyr Asp Ala Glu Ala Asn Glu Ala Lys Leu Val Ala Met Asn Tyr Thr 480 485 490 495 GCC GTG AAG AGG GAC ACG ACC ATG CTA TAT CAC TAC GCT GCC ACT ACA 2139 Ala Val Lys Arg Asp Thr Thr Met Leu Tyr His Tyr Ala Ala Thr Thr 500 505 510 ACT CCA GGG GCA CCC GCT GGC TGG CGA GCC TGG CGA CTC AGA GTG ACC 2187 Thr Pro Gly Ala Pro Ala Gly Trp Arg Ala Trp Arg Leu Arg Val Thr 515 520 525 CAA CCT GGA GTG TGG ATG ATT CAC TGC CAT ATT CTG CAG CAC ATG GTA 2235 Gln Pro Gly Val Trp Met Ile His Cys His Ile Leu Gln His Met Val 530 535 540 ATG GGT AAG TCC GCA GAT GCT GTA TAAAATGCAA GAATTCGACA AGCGTTCTGA 2289 Met Gly Lys Ser Ala Asp Ala Val 545 550 CTGTTATAGG AATGCAATCA ATCTGGGTAG TTGGCAATGC TTCGGAGATT CAGAGAGTAC 2349 CCTTTGGGTA TGCGCAAGGA TATTTGGAGT ATGGAGGCGA TGCCTATGGA AATAGAACGC 2409 ATGCGCCAAC CTGTATTCAC GAATTTGAAT GCGAGTTGGA GGACAACTGA CAACTGTGAG 2469 GAATCTGGGT CACGTACATA TTGAGCATAG TATATTAACC GCACTGAAAT ACGTGCCGAT 2529 TAGGGCAAAA CATCCGATGC AATGCTGAAA GCGTGAGGCG CTTCGGTATG TTGGTTGGTA 2589 CGGCTTTGCT TGTCGCAGCT GCCAACGAGA AGCGGCACAA TTCCAGTGTC TCTTCGAA 2647

【００７４】

【配列表】

配列番号：３ 配列の長さ：５０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ
（合成ＤＮＡ） 配列の特徴 Ｓ ＣＤＳ 配列 GCC TTC CCC GCC AAG GTC GGC GAG GTC CTC GAG ATC GTC TTC CAG AAC 48 Ala Phe Pro Ala Lys Val Gly Glu Val Leu Glu Ile Val Phe Gln Asn 1 5 10 15 AC 50 Thr

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:645）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表配列番号１のアミノ酸配列の１か
   ら５５１で表されるアミノ酸配列で構成されるアスコル
   ビン酸オキシダーゼポリペプチドをコードすることを特
   徴とするＤＮＡ。
2. 【請求項２】 ＤＮＡが配列表配列番号１の塩基配列の
   １から１６５３で表される塩基配列で構成される請求項
   １記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 アスコルビン酸オキシダーゼを生産する
   ことを特徴とするアクレモニウム・クリソゲナム。
4. 【請求項４】 アスコルビン酸オキシダーゼを生産する
   アクレモニウム・クリソゲナムが、配列表配列番号１の
   アミノ酸配列の１から５５１で表されるアミノ酸配列で
   構成されるアスコルビン酸オキシダーゼポリペプチドを
   コードするＤＮＡを保有することを特徴とする請求項３
   記載のアクレモニウム・クリソゲナム。
5. 【請求項５】 アクレモニウム・クリソゲナムが、アク
   レモニウム・クリソゲナム ＡＴＣＣ１１５５０・ｐｃ
   ｓＭＡＯ１「ＦＥＲＭ Ｐ−１５３２９」である請求項
   ４記載の新規なアクレモニウム・クリソゲナム。