JP2008178301A

JP2008178301A - アスコルビン酸オキシダーゼ

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Publication number: JP2008178301A
Application number: JP2007012233A
Authority: JP
Inventors: Shinichi Sakasegawa; 信一酒瀬川; Kazuo Houriyou; 一生芳陵; Koji Isaka; 光二井阪
Original assignee: Asahi Kasei Pharma Corp
Current assignee: Asahi Kasei Pharma Corp
Priority date: 2007-01-23
Filing date: 2007-01-23
Publication date: 2008-08-07
Anticipated expiration: 2027-01-23
Also published as: JP5071964B2

Abstract

【課題】本発明は、所定のアスコルビン酸オキシダーゼ活性を有し、カタラーゼ活性を有しないか、あるいは所定以下であり、経済的に高純度かつ高品質で実用的な酵素成分を生産する方法およびそれにより得られる酵素成分の提供を課題とする。
【解決手段】カタラーゼ分泌量が少ないＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍに、コスミドｐｃｓＭＡＯ１−ｄＯを導入することにより、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ変異株を得て、当該株の培養物又はその精製物よりカタラーゼの混在が少ない目的の酵素成分を得た。
【選択図】なし

Description

本発明は、アスコルビン酸オキシダーゼ（Ａｓｃｏｒｂａｔｅｏｘｉｄａｓｅ、以下ＡＯＸと略する場合がある）活性が２１．６ｍｌ以上であり、かつカタラーゼ活性が４．６９Ｕ／ｍｌ以下である酵素成分、これを産生する、新規なＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ変異株に関する。

ＡＯＸは１分子の酸素の存在下、２分子のＬ−アスコルビン酸を２分子のデヒドロアスコルビン酸と２分子の水に酸化する酵素である（ＥＣ１．１０．３．３）。
公知のＡＯＸとしては、キュウリ（例えば、非特許文献１参照）、カボチャ（例えば、非特許文献２参照）など植物により生産されるものが知られている。
また、糸状菌であるＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｓｐ．ＨＩ−２５株（ＦＥＲＭＰ−１５３２８）も、ＡＯＸを生産していることが知られている（たとえば、特許文献１参照）。以下、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｓｐ．ＨＩ−２５株（ＦＥＲＭＰ−１５３２８）が生産するＡＯＸをＡＳＯＭと表記する。当該ＡＳＯＭは植物由来のＡＯＸに比べて、耐熱性が高いという特徴を有する。

さらに、安価にＡＯＸを得ることを目的として、ＡＯＸの生産能を有していないＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍに属する微生物にＡＯＸ遺伝子を含むコスミドｐｃｓＭＡＯ１を導入した例が報告されている（例えば、特許文献２および非特許文献３参照）。このようにして得られたＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｐｃｓＭＡＯ１は、ＡＯＸ遺伝子を保持したことで、耐熱性が高いＡＯＸを生産することが可能となった。以下、ＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｐｃｓＭＡＯ１が生産するＡＯＸをＡＳＯＭＩＩと表記する。

しかし、ＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｐｃｓＭＡＯ１はＡＳＯＭＩＩと同時に菌体外にカタラーゼを多量に分泌するため、ＡＳＯＭＩＩとカタラーゼの分離精製が困難であるという問題があった。ＡＯＸとカタラーゼが混在すると不利である理由を以下に説明する。
体外診断方法として、血清などの検体中の過酸化水素を定量することで測定する方法が知られている。ところが、血清などの検体中には、この過酸化水素を還元して分解する作用のあるアスコルビン酸が共存している場合があり、このアスコルビン酸の影響を除去する目的で、体外診断薬においてＡＯＸが用いられる。
一方、カタラーゼは２分子の過酸化水素を１分子の酸素と２分子の水に分解する酵素である（ＥＣ１．１１．１．６）。そのため、体外診断薬にカタラーゼが混在することは望ましくなく、カタラーゼの分離精製が困難なＡＳＯＭＩＩは本来のアスコルビン酸除去を目的に使用できないことになる。

例えば血中コレステロールは、コレステロールオキシダーゼによるコレステロールの酸化反応に伴って発生する過酸化水素を定量することで測定される。ここで、アスコルビン酸が血清検体中に共存する影響を避けるために、血中コレステロール定量試薬にＡＯＸが予め添加されている。しかし、この血中コレステロール定量試薬に、ＡＯＸとともにカタラーゼが混在していると、過酸化水素を分解してしまうので、本来の目的に使用できない結果となる。
過酸化水素を定量する方法を用いる体外診断薬としては、トリグリセライド、膵リパーゼ、尿酸、ＨＤＬ、ＬＤＬなどの多くの測定試薬があり、ほぼ全ての試薬にＡＯＸが予め添加されている。また、過酸化水素を定量する別の方法として、発光を利用する方法もあるが、これに用いる体外診断薬にもＡＯＸが予め添加されている場合がある。

体外診断薬中のカタラーゼの影響を排除する方法として、カタラーゼの強力な阻害剤であるアジ化ナトリウムを用いる方法が知られている。しかし、アジ化ナトリウムはＡＯＸの強力な阻害剤でもあるため、これを用いることは困難である。
このように、カタラーゼとの分離精製が容易であり、経済的に高純度かつ高品質で実用的なＡＯＸを生産する方法が望まれている。
特開平３−２３６７６６号公報特開平９−１６８３８９号公報ＴＡＫＡＯＮＡＫＡＭＵＲＡ，ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆＡｓｃｏｒｂａｔｅＯｘｉｄａｓｅｆｒｏｍＣｕｃｕｍｂｅｒ、ＪＢｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１９６８６４：１８９−１９５．ＧｅｏｒｇｅＲ．ＳｔａｒｋａｎｄＣｈａｒｌｅｓＲ．Ｄａｗｓｏｎ、ＯｎｔｈｅＡｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙｏｆＳｕｌｆｈｙｄｒｙｌＧｒｏｕｐｓｉｎＡｓｃｏｒｂｉｃＡｃｉｄＯｘｉｄａｓｅ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｍａｒ１９６２；２３７：７１２−７１６ＫａｙｏｋｏＴａｋｅｄａ，ＣｌｏｎｉｎｇｏｆａｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅａｓｃｏｒｂａｔｅｏｘｉｄａｓｅｇｅｎｅｆｒｏｍＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｓｐ．ＨＩ−２５ａｎｄｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｚｉｄｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｅｎｚｙｍｅｂｙｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ（ＢＢＡ）−ＰｒｏｔｅｉｎｓａｎｄＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、Ｖｏｌｕｍｅ１３８８，Ｉｓｓｕｅ２、１９８８、４４４−４５６

本発明は、所定のＡＯＸ活性を有し、及びカタラーゼ活性は有しないか、あるいは所定以下であり、経済的に高純度かつ高品質で実用的な酵素成分を生産する方法およびそれにより得られる酵素成分の提供を課題とする。

上記課題を解決するために本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、ＡＯＸの生産能がないＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍを薬剤で変異する事により、菌体外へのカタラーゼ分泌量が少ない株を得る事に成功した。そして、変異させたＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍに、ＡＯＸ遺伝子を含むコスミドｐｃｓＭＡＯ１を導入して、ＡＯＸ遺伝子を保持した形質転換体を得た。これによりＡＯＸを生産するが、菌体外へのカタラーゼ分泌量が少ないＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ変異株を創製するに至った。
さらに、本発明で創製したＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ変異株が産生するＡＯＸ（以下、ＡＳＯＭＩＩＩと表記する）は、従来のＡＳＯＭと比べて、保存安定性にも優れていることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は次の（１）〜（１３）に関する。
（１）アスコルビン酸オキシダーゼ活性が２１．６Ｕ／ｍｌ以上であり、かつカタラーゼ活性が４．７Ｕ／ｍｌ以下である酵素成分を生産する、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ変異株。
（２）アスコルビン酸オキシダーゼ活性が６９．６Ｕ／ｍｌ以上であり、かつカタラーゼ活性が３．８Ｕ／ｍｌ以下である酵素成分を生産する、上記（１）に記載のＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ変異株。
（３）ＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｐｃｓＭＡＯ１−ｄＯ株（ＦＥＲＭＰ−２１１２３）。
（４）配列表配列番号１に示すＤＮＡ配列を有する上記（１）〜（３）のいずれかに記載の株。
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の株を培養して得られる、アスコルビン酸オキシダーゼ活性が２１．６Ｕ／ｍｌ以上であり、かつカタラーゼ活性が４．７Ｕ／ｍｌ以下である酵素成分。
（６）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の株を培養して得られる、アスコルビン酸オキシダーゼ活性が６９．６Ｕ／ｍｌ以上であり、かつカタラーゼ活性が３．８Ｕ／ｍｌ以下である酵素成分。
（７）カタラーゼの混在率が２０％未満である上記（５）又は（６）に記載の酵素成分。
（８）カタラーゼの混在率が１４．８％以下である上記（５）に記載の酵素成分。
（９）カタラーゼの混在率が２．６％以下である上記（６）に記載の酵素成分。
（１０）以下の（ａ）〜（ｆ）の工程によって得られる酵素成分。
（ａ）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の変異株を培養する工程
（ｂ）培養液から菌体を分離して除く工程
（ｃ）Ｑｓｅｐ．ＢＢを用いたイオン交換カラムクロマトグラム工程
（ｄ）要すればＰｈｅｎｙｌｓｅｐ．ＦＦを用いた疎水カラムクロマトグラム工程
（ｅ）Ｑｓｅｐ．ＨＰを用いたイオン交換カラムクロマトグラム工程
（ｆ）Ｇ−２５を用いた脱塩工程
（１１）上記（５）〜（１０）のいずれかに記載の酵素成分に含まれる、以下の１）〜７）の特性を有するアスコルビン酸オキシダーゼ。
１）作用
１分子の酸素の存在下、２分子のＬ−アスコルビン酸を２分子のデヒドロアスコルビン酸と２分子の水に酸化する。
２）熱安定性
５０℃、６０分間の熱処理で、９５％以上の活性を保持する。
３）保存安定性
ｐＨ７．５の緩衝液中で防腐剤の存在下、濃度４Ｕ／ｍｌで３７℃、２週間保存した場合３０％以上の活性を保持する。
４）至適ｐＨ
ｐＨ５．５±０．５。
５）ｐＨ安定性
ｐＨ４から１０の範囲の緩衝液中で、３７℃、２４時間で保存した場合８０％以上の活性を保持する。
６）分子量
ＴＳＫ−ＧＥＬＧ３０００ＳＷ_ＸＬによる分子量が、１９００００〜３３００００。
７）Ｋｍ値
アスコルビン酸に対して０．３〜０．４ｍＭ。
（１２）配列表配列番号１に示すアミノ酸配列を有する上記（１１）に記載のアスコルビン酸オキシダーゼ。
（１３）ＡＯＸの生産能がないＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの変異株に配列表配列番号１に記載のアスコルビン酸オキシダーゼ遺伝子を導入した形質転換体。
（１４）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の変異株又は上記（１３）に記載の形質転換体を培養することを特徴とする酵素成分の製造方法。
（１５）血清中の目的成分を過酸化水素の定量を行うことによって定量する体外診断薬において、上記（１１）又は（１２）に記載のアスコルビン酸オキシダーゼを含む体外診断薬。

ＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｐｃｓＭＡＯ１−ｄＯの培養物から、経済的に高純度かつ高品質で実用的なＡＯＸを生産する方法が可能になった。さらに、ＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｐｃｓＭＡＯ１−ｄＯの培養物から、精製されたＡＯＸはＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｓｐ．ＨＩ−２５（ＦＥＲＭＰ−１５３２８）の培養物から、精製されたＡＯＸに比べて保存安定性が向上しており、産業上、特に体外診断薬用酵素として優位である。

本発明でいう酵素成分の精製純度は、本発明の効果を有する程度であればよく、各種カラムで分離し単一成分とした精製物の他に、経済的な方法で精製した精製物、あるいは菌体分離しか行っていない未精製物もここでいう酵素成分に含む。また、本発明でいう酵素成分とは、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ変異株を培養して得られる、アスコルビン酸オキシダーゼ活性が高く、かつ、カタラーゼ活性が低い酵素成分をいう。アスコルビン酸オキシダーゼ活性はより高いものが望ましく、具体的には下限値としては、２１．６Ｕ／ｍｌ以上が好ましく、６９．６Ｕ／ｍｌ以上がより好ましく、９０．８Ｕ／ｍｌ以上が特に好ましい。また、カタラーゼ活性としては検出限界以下が最も好ましいが、４．７Ｕ／ｍｌ以下が好ましく、３．８Ｕ／ｍｌ以下がより好ましく、２Ｕ／ｍｌ以下がさらに好ましく、１Ｕ／ｍｌ以下が特に好ましい。また、本酵素成分のカタラーゼの混在率は、未精製の酵素成分の場合は検出限界以下であることが最も望ましいが、具体的には２０％未満が好ましく、１４．８％以下であればさらに好ましく、２．６％以下であれば特に望ましい。単一成分とした精製物、経済的な精製を施した精製物のカタラーゼの混在率は、検出限界以下が最も望ましいが、０．０７２％以下であれば好ましく、０．０２％以下であれば大変好ましい。
Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ変異株としては、前記酵素成分が得られる変異株であればよく、例えば、ｐｃｓＭＡＯ１−ｄＯ株（ＦＥＲＭＰ−２１１２３）、又は配列表配列番号1に示すＤＮＡ配列を有する変異株が挙げられる。
本発明のＡＯＸ活性とは、ＡＯＸ（ＥＣ１．１０．３．３）の触媒作用を指す（参考文献１、２参照）。また、本発明のカタラーゼ活性とは、カタラーゼ（ＥＣ１．１１．１．６）の触媒作用を指すが（参考資料１、２参照）、本発明では過酸化水素分解活性をもつ蛋白質の総称とした。例えば、ペルオキシダーゼ（ＥＣ１．１１．１．７）は式１の反応を触媒する酵素であるが、過酸化水素を分解する反応を触媒するので、本発明のカタラーゼ活性の範疇となる。さらに、カタラーゼ活性とペルオキシダーゼ活性を併せ持つ酵素、ｃａｔａｌａｓｅ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、が近年報告されているが（参考文献３参照）これも過酸化水素を分解する反応を触媒するので、本発明のカタラーゼ活性の範疇となる。その他、過酸化水素を分解する反応を触媒する酵素として、ＥＣナンバーが１．１１．１に属する酵素が含まれる。
［参考文献１］酵素ハンドブック、朝倉書店、１９８４年
［参考資料２］Ｅｎｚｙｍｅｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｃａ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｅｎｚｙｍｅ／）
［参考文献３］ＪＩｎｏｒｇＢｉｏｃｈｅｍ．２００６Ａｐｒ；１００（４）：５６８−８５．Ｅｐｕｂ２００６Ｍａｒ３．Ｒｅｖｉｅｗ、Ｐｒｏｂｉｎｇｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙｏｆｃａｔａｌａｓｅ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＫａｔＧ）．）、ｃａｔａｌａｓｅ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＶａｎｉｔｔａｎａｋｏｍＮ，ＣｏｏｐｅｒＣＲＪｒ，ＦｉｓｈｅｒＭＣ，ＳｉｒｉｓａｎｔｈａｎａＴ．

［式１］
Ｄｏｎｏｒ＋Ｈ_２Ｏ_２ → ｏｘｉｄｉｚｅｄｄｏｎｏｒ＋２Ｈ_２Ｏ

本発明のＡＳＯＭＩＩＩは、配列表配列番号２の１から５５１のアミノ酸で表されるアミノ酸配列を有する。また、当該アミノ酸配列のＮ末端側のＭｅｔの上流にはさらに一個または複数のアミノ酸残基を有してもよく、またＣ末端側のＶａｌの下流には、さらに一個以上のアミノ酸残基を有してもよい。

さらに、本発明のＡＳＯＭＩＩＩを構成するアミノ酸配列は、ＡＳＯＭＩＩＩと同様の酵素活性を有してもよく、配列表配列番号２のアミノ酸配列から１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であってもよく、付加するアミノ酸としてはシグナルペプチドまたはＴ７タグ、Ｈｉｓタグ、Ｓタグ、Ｔｒｘタグ、ＣＢＤタグ、ＤｓｂＡタグ、ＧＳＴタグ、Ｎｕｓタグなどが挙げられる。本発明のＡＳＯＭＩＩＩをコードするＤＮＡは、そのＮ末端側及びＣ末端側のアミノ酸残基またはポリペプチド残基を含めたアミノ酸配列の各アミノ酸に対応する一連のコドンのうちいずれか１個のコドンからなるＤＮＡであればよい。

さらに、本発明のＡＳＯＭＩＩＩを構成するアミノ酸配列をコードするＤＮＡは配列表配列番号２のアミノ酸配列の１から５５１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドによる酵素活性発現と同様の効果を発現する配列表配列番号２のアミノ酸配列の１から５５１で表されるアミノ酸配列の一部分のアミノ酸配列をコードするＤＮＡであってもよい。

上記ＤＮＡの代表例として、５’末端側より配列表配列番号１の塩基配列の１から１６５３までで表される塩基配列で表される塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができる。該ＤＮＡは、５’末端の上流側にアミノ酸をコードするコドンを１個以上有したものでもよく、ＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡ以外のコドンであればよい。３’末端たるＧＴＡの下流側には、アミノ酸をコードするコドンを１個以上有するか、又は翻訳終止コドンを有するかのいずれでもよい。

さらに該ＤＮＡは、真核生物宿主で発現させる場合には、コードするアミノ酸配列に影響を与えない、イントロンＤＮＡ配列を配列中に含んでもよい。イントロンを含むＤＮＡは、例えば配列表配列番号３の塩基配列の８０８から８６４までで表される（イントロンの前半部分のアミノ酸配列を配列表配列番号４に表わし、イントロンの後半部分のアミノ酸配列を配列番号５に表わした）。配列表配列番号２の１から５５１までのアミノ酸配列で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを取得するには、例えば、ＡＳＯＭＩＩＩを生産するＡＯＸ遺伝子の供与体である微生物より該微生物のＤＮＡを分離精製した後、超音波、制限酵素などを用いて切断した該ＤＮＡと切断してリニヤーにした発現ベクターとを両ＤＮＡの平滑または接着末端部においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉環させ、かくして得られた組み換えＤＮＡベクターのマーカーを指標としてスクリーニングして取得した組み換えＤＮＡベクターを保持する微生物を培養し、該培養菌体から該組み換えＤＮＡベクターを分離精製し、次いで該組み換えＤＮＡベクターからＡＯＸ遺伝子であるＤＮＡを取得すればよい。

ＤＮＡの供与体である供与微生物としては、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｓｐ．ＨＩ−２５株（ＦＥＲＭＰ−１５３２８）を利用するとよい。
遺伝子の供与体である微生物に由来するＤＮＡを採取するには以下の如く行うが、その操作法のうち常法とされるものは、例えばティー・マニアティスらの方法（例えば、参考文献４参照）や、市販の各種酵素、キット類に添付された手順に従えば実施できるものである。
［参考文献４］Ｔ．ｍａｎｉａｔｉｓ．，ｅｔａｌ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ１９８２，１９８９

例えば、上述の供与体である微生物を、液体培地で約３日間通気撹拌培養し、得られる培養物を遠心分離して集菌し、次いでこれを溶菌させることによってＡＯＸ遺伝子を含有する溶菌物を調製する。溶菌方法としては、例えばザイモリアーゼなどの細胞壁溶解酵素による処理が施され、必要によりプロテアーゼなどの他の酵素やドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤が併用される。さらに細胞壁の物理的破壊法である凍結融解（例えば、参考文献５参照）やフレンチプレス処理を上述の溶菌法と組み合わせで行ってもよい。
［参考文献５］特開昭６３−１８５３７１号公報

この様にして得られた溶菌物からＤＮＡを分離精製するには、常法に従って、例えばフェノール抽出による除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。
分離精製された微生物ＤＮＡを切断する方法は、常法に従って制限酵素処理により行えばよく、特に得られるＤＮＡ断片とベクターとの結合を容易ならしめるため、とりわけ特定ヌクレオチド配列に作用する、例えば、ＳａｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＭｌｕＩなどのＩＩ形制限酵素が適している。

微生物ＤＮＡ断片を組み込むベクターとしては、宿主微生物体内で自律的に増殖しうるファージ又はプラスミドから遺伝子組み換え用として構築されたものが適しており、ファージベクターとしては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）を宿主微生物とする場合にはλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢなどが使用できる。また、プラスミドベクターとしては、例えば、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＩＮＩなどが使用できる。

このようなベクターを、微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素で生成するＤＮＡ末端と、同じ末端を生成する制限酵素で切断してベクター断片を作成し、微生物ＤＮＡ断片とベクター断片とを、ＤＮＡリガーゼ酵素により常法に従って結合させればよい。
微生物ＤＮＡの断片を結合したベクターを移入する宿主微生物としては、組み換えＤＮＡが安定かつ自律的に増殖可能であればよく、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリに属する微生物の場合、エシェリヒア・コリＤＨ１、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＷ３１１０、エシェリヒア・コリＣ６００、等が利用できる。

宿主微生物に組み換えＤＮＡを移入する方法としては、例えば、宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、常法に従ってコンピテントセル化した宿主菌株に組み換えＤＮＡの移入を行えばよい。
宿主微生物への目的組み換えＤＮＡ移入の有無についての選択は配列表配列番号６に例示した（配列表配列番号６でコードされるアミノ酸配列は配列表配列番号７に示した）予め合成したＡＯＸ遺伝子のＤＮＡプローブを３２Ｐ等で放射能ラベルし、予め作製した遺伝子ライブラリーとのコロニーハイブリダイゼーション法によりポジティブ株を目的の形質転換体とすればよい。

かくして得られる形質転換体である微生物からは、常法によりＡＯＸ遺伝子を含むＤＮＡ断片を分離でき、これを他の宿主微生物に移入することも容易に実施できる。
上記の方法により分離されるＡＯＸ遺伝子にイントロンが存在する、また蛋白への糖鎖の付加などの問題で、原核生物を宿主として本遺伝子を使用するＡＯＸ生産が困難である場合、真核微生物を宿主として、新たにベクターを使用してＡＯＸ遺伝子を導入する必要がある。
宿主としては遺伝子の供与微生物であるＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｓｐ．ＨＩ−２５と同属のＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍが使用できるが、ＡＯＸの生産能を有せず、かつ、菌体外へのカタラーゼ分泌量が少ないＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍが望ましい。そのためにＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍを薬剤、紫外線、放射線、育種などによって菌体外にカタラーゼを分泌しないように変異した株を用いる事ができるが、最適にはＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ −ｄＯ株を用いると良い。
本発明ではＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ−ｄＯ株を宿主としてＡＯＸ遺伝子を導入し、新規なＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｐｃｓＭＡＯ１−ｄＯＦＥＲＭＰ−２１１２３株を作成しているが、導入されるＡＯＸをコードするＤＮＡは、これによりなんら限定されるものではない。

ベクターとしては、宿主で作用する薬剤耐性または栄養要求性遺伝子マーカーを保有するベクターであればよく、宿主真核微生物がＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ−ｄＯの場合、プラスミドｐＰＧＫＭ５、ｐＡＣＴＨＹ８３、ｐＥＧＡＰ８３（例えば、参考文献６参照）、コスミドｐＢＳＦＡＨＹ８３、ｐＢＳＦＰＫＭ５（例えば、参考文献７参照）等が使用できる。
［参考文献６］特開平４−５８８９１号公報
［参考文献７］特開平４−１０４７９２号公報

このようなベクターを、制限酵素で切断してベクター断片を作成し、微生物ＤＮＡ断片とＤＮＡリガーゼ酵素により常法に従って結合させればよい。また、１つのベクターに複数のＡＯＸ遺伝子を結合させることも可能である。

宿主糸状菌に組み換えＤＮＡを移入する方法としては、例えば、Ｑｕｅｅｎｅｒらの方法（例えば、参考文献８参照）に準じて行えばよい。
上記の遺伝子操作に一般的に使用される量的関係は、供与微生物からのＤＮＡ及びプラスミドまたはコスミドＤＮＡを０．１〜１０μｇに対し、制限酵素を約１〜１０ｕ、リガーゼ約３００ｕ、その他の酵素約１〜１０ｕ、程度が例示される。
［参考文献８］Ｑｕｅｅｎｅｒ．，ｅｔａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１９８５．ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（１９８５）４６８−４７２．

かくして得られた新規なＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｐｃｓＭＡＯ１−ｄＯＦＥＲＭＰ−２１１２３株に属する微生物は、栄養培地に培養されることにより、菌体外にカタラーゼを分泌することなく多量のＡＯＸを安定して産生し得る。
また必要なら、得られた組換え体プラスミドから、ＡＯＸ遺伝子を含むより限定的なＤＮＡ断片を、ゾラーの方法による部位特異的変異法（例えば、参考文献９参照）による制限酵素認識部位の作製や、制限酵素による切り出しにより分離し、新たにベクターに組み込んで作製したプラスミドまたはコスミドにより、さらに効率のよい形質転換体を作成し、より多量のＡＯＸを安定に産生させてもよい。
［参考文献９］Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄＳｍｉｔｈ，Ｍ．ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３６７．（１９８３）

また、同様に部位特異的変異法により該ＡＯＸ遺伝子中のイントロンを除去し、制限酵素などにより該遺伝子を含むＤＮＡをコードするＤＮＡを切り出し、前記と同様な方法により切断して得られる他の開環ベクター末端とを結合させて新規な特徴を有する組み換えＤＮＡを作製して、他の宿主に移入してＡＯＸを産生させることも容易に実施できる。

また、本発明のＡＯＸは公知の遺伝子操作手段によりペプチドの変異をなしてもよく、このようなムテインのＤＮＡは、本発明のＡＯＸ遺伝子から遺伝子工学的手法により作製される人工変異遺伝子を意味し、この人工変異遺伝子は部位特異的塩基変換法及び目的遺伝子の特定ＤＮＡ断片を人工変異ＤＮＡで置換するなどの種々なる遺伝子工学的方法を使用して得られ、かくして取得された人工変異遺伝子のうち特に優れた性質を有するＡＯＸムテインＤＮＡについては最終的にはこのムテインＤＮＡをベクターに挿入せしめて組み換えＤＮＡを作成し、これを宿主微生物に移入させることによって、ＡＯＸムテインの製造が可能である。

形質転換体を具体的に例示すれば、配列表配列番号１に示されたＤＮＡ配列を有するＤＮＡをコスミドｐＢＳＦＡＨＹ８３に組み込み、宿主微生物Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ −ｄＯ株に導入して染色体に挿入させ、ＡＯＸを生成する微生物を選択して得た形質転換体ＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｐｃｓＭＡＯ１−ｄＯＦＥＲＭＰ−２１１２３株が挙げられる。

上述の方法によって得られたＡＯＸを構成するポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列は、ジデオキシ法（例えば、参考文献１０参照）で解読し、またＡＯＸを構成するポリペプチドの全アミノ酸配列は、塩基配列より予測決定した。また、以下の方法により培養精製した該ＡＯＸであるポリペプチドを用いて、液相プロテインシーケンサー（ベックマン社製：ＢＥＣＫＭＡＮＳｙｓｔｅｍ８９０ＭＥ）によりその部分アミノ酸配列が、予測決定されたアミノ酸配列の一部と一致することを確認した。
［参考文献１０］Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１２０５−１２１０（１９８１）

形質転換体により該ＡＯＸを製造するに当たっては、該形質転換体を栄養培地で培養し、菌体中または培養液中に該ＡＯＸを産生せしめ、培養終了後、もし生産物が菌体内にある場合には、得られた培養物を濾過又は遠心分離などの手段により菌体を採集し、次いでこの菌体を機械的方法又はリゾチームなどの酵素的方法で破壊して菌体抽出液を得る。また生産物が菌体外に放出される場合には遠心分離または濾過により培養液中の菌体及び不溶成分を除去すればよい。また、必要に応じてＥＤＴＡ、プロテアーゼ阻害剤であるＰＭＳＦ及び／又は適当な界面活性剤などを添加して該ＡＯＸの水溶液を濃縮するか、又は濃縮する事なく硫安分画、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーにより処理して、純度のよい該ＡＯＸを得ることができる。

形質転換体である微生物の培養条件はその栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すれば良く、通常多くの場合は、液体培養で行うが、工業的には深部通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用されうる。
炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコース、サッカロース、ラクトース、マルトース、フラクトース、グリセロール、糖蜜などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であれば良く、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、大豆タンパク、カゼイン加水分解物などが使用される。

その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛、銅などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
培養温度は微生物が発育し、ＡＯＸを生産する範囲で適宜変更し得るが、ＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｐｃｓＭＡＯ１−ｄＯＦＥＲＭＰ−２１１２３株の場合、好ましくは２５〜３４℃、最適には２８〜３２℃程度である。培養条件は、条件によって多少異なるが、ＡＯＸが最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、ＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｐｃｓＭＡＯ１−ｄＯＦＥＲＭＰ−２１１２３株の場合、通常は２〜５日間程度であり、好ましくは３〜４日間程度である。培地ｐＨは菌が発育し、ＡＯＸを生産する範囲で適宜変更し得るが、ＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｐｃｓＭＡＯ１−ｄＯＦＥＲＭＰ−２１１２３株の場合、好ましくはｐＨ６程度である。

培養物中のＡＯＸは、菌体を含む培養液そのままを採取し、利用することもできるが、一般には常法に従って、ＡＳＯＭＩＩＩが培養液中に存在する場合には、濾過、遠心分離などによりＡＳＯＭＩＩＩ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。菌体及び不溶成分の除去は、濾過が困難な場合はパーライトなど濾過助剤の使用検討、遠心分離が困難な場合はイオン交換基をもつ可溶性ポリマーなどの凝集剤の使用検討を行い、適当な経済的な工程を加えることは常法である。ＡＳＯＭＩＩＩが菌体内に存在する場合には、得られた培養物を濾過又は遠心分離などの手段により、菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法又はリゾチーム、ザイモリアーゼなどの酵素的方法で破壊し、又、必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤、ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤及び／又は界面活性剤を添加してＡＳＯＭＩＩＩを可溶化し水溶液として分離採取する。

この様にして得られたＡＳＯＭＩＩＩ含有溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に、硫安、硫酸ナトリウムなどの塩析処理などによる分別沈澱法により沈澱せしめればよい。
次いでこの沈澱物を、水に溶解し、半透膜にて透析せしめて、より低分子量の不純物を除去することができる。また、吸着剤あるいはゲル濾過剤などによるゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等により精製し、これらの手段を用いて得られるＡＳＯＭＩＩＩ含有溶液から、減圧濃縮凍結乾燥等の処理により精製されたＡＳＯＭＩＩＩが得られる。

＜ＡＯＸ活性測定方法＞
アスコルビン酸オキシダーゼ活性測定溶液
０．５ｍＭＬ−アスコルビン酸
０．４５ｍＭエチレンジアミン四酢酸
９０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５（２５℃））

ＡＯＸ活性測定溶液１ｍｌを層長１ｃｍの石英セル中で３０℃５分間予備加温した後、０．０５％ＢＳＡを含む１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５（２５℃））で希釈した酵素液０．１ｍｌを混和して酵素反応を開始し、反応開始後１分後から５分後までの２４５ｎｍにおけるＬ−アスコルビン酸の吸光度差を測定する（Ａｓ）。盲検として蒸留水を用いて同一の操作を行って吸光度差を測定する（Ａｂ）。この酵素液使用の吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）より酵素活性を求める。酵素活性１単位（１ユニット）は３０℃で１分間に１マイクロモルのＬ−アスコルビン酸を変化する酵素量とし、上記反応液中でのＬ−アスコルビン酸のミリモル分子吸光係数は１０ｃｍ^２／μｍｏｌとして、Ａｓ−Ａｂより酵素活性を求める。

＜カタラーゼ活性測定方法＞
酵素溶解溶液
１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０
基質溶液
０．１０５％過酸化水素溶液

酵素溶解液で適当な濃度に希釈したＡＯＸ２ｍｌを４ｍｌ容の石英セルにいれ、２５℃で５分間予備加温する。その後、２５℃に予備加温した基質溶液１ｍｌを加え、静かに転倒攪拌して２５℃で反応を開始する。反応開始後１分目から２分目の吸光度変化をＡｓ／ｍｉｎとする。同様の操作を酵素溶解液のみで行いブランク、Ａｂ／ｍｉｎ、とする。ΔＡ／ｍｉｎ＝Ａｓ／ｍｉｎ―Ａｂ／ｍｉｎ、過酸化水素のこの条件下でのミリモル分子吸光係数を０．０４ｃｍ^２／μｍｏｌとしてカタラーゼ活性を求める。

＜タンパク質濃度測定方法＞
本明細書中に記載するタンパク質濃度は、バイオラッド社のプロテインアッセイキットを用いて使用説明書記載の方法に従って測定し、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）をスタンダードとして算出した。

＜酵素作用＞
本発明のＡＳＯＭＩＩＩのアスコルビン酸を基質として用いたときの触媒反応式は式２である。

［式２］
２Ｌ−ａｓｃｏｒｂａｔｅ＋Ｏ_２ → ２ｄｅｈｙｄｒｏａｓｃｏｒｂａｔｅ＋２Ｈ_２Ｏ

以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されることはない。なお、実施例中、常法に従い、と記述した遺伝子操作技術は、例えばマニアティスらの方法（例えば、参考文献１１参照）や蛋白質・酵素の基礎実験法（例えば、参考文献１２参照）、市販の各種酵素、キット類に添付された手順に従えば実施できるものである。試薬は、特に断らない限り、和光純薬工業株式会社、国際試薬株式会社、関東化学株式会社、タカラバイオ株式会社などから購入した特級品を使用した。
［参考文献１１］Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔａｌ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ１９８２，１９８９
［参考文献１２］改訂第２版、堀尾武一、１９９４年南光堂

＜Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｓｐ．からのＤＮＡの抽出＞
ＣＭ培地（ショ糖２０ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ／ｌ、リン酸水素二カリウム０．５ｇ／ｌ、塩化カリウム０．５ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．５ｇ／ｌ、硫酸第１鉄・７水塩０．０１ｇ／ｌ、硝酸ナトリウム３ｇ／ｌ、酵母エキス４ｇ／ｌ、ペプトン１０ｇ／ｌ）に、ＡＯＸ生産菌であるＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｓｐ．（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｓｐ．）ＨＩ−２５株（ＦＥＲＭＰ−１５３２８）を植菌し２８℃で３日間撹拌培養した。培養液２０ｍｌを遠心分離（３，０００Ｇ、４℃、１０分）し、集菌した菌体を２４ｍｌのＴＥＳ（５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、５０ｍＭのエチレンジアミン４酢酸ナトリウム（以下ＥＤＴＡと略す）ｐＨ８．０、１５％ショ糖）に懸濁した。最終濃度が４μｇ／ｍｌになるようにザイモリアーゼ１００Ｔ（生化学工業社製）と、同じく最終濃度０．４ｍｇのＲＮａｓｅＡ（ＳＩＧＭＡ社製）を加え、３７℃で１時間処理し、細胞壁を破壊した。

これに２０％ドデシル硫酸ナトリウム（以下ＳＤＳと略す）１ｍｌを加え、３７℃に２時間置き菌体を溶解した。さらに２ｍｇ／ｍｌ濃度のプロテイナーゼＫ（ＳＩＧＭＡ社製）２ｍｌと１５ｍｌのクロロホルム・イソアミルアルコール２４対１混合液を加え、３７℃で１０時間緩やかに振盪撹拌し蛋白を分解した。これを遠心分離（２５，０００Ｇ、１５分）し、分離した水層を他の容器に移し、その上に２４ｍｌの−２０℃エタノールを重層し、界面に析出してくる染色体をガラス棒にからめて取得した。

この染色体を２０ｍｌのＴＥ（１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））に溶解し、常法に従ってフェノール・クロロホルム処理、エタノール沈澱及び乾燥操作を行った。
以上の操作によりＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｓｐ．ＨＩ−２５の染色体標品２ｍｇを得た。

＜放射性ＤＮＡプローブの作製＞
Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｓｐ．ＨＩ−２５株により生産された酵素ＡＯＸを精製し、その部分アミノ酸配列をエドマン分解法により決定した。なお、当初Ｎ末端のアミノ酸配列を決定しようとしたが、全く解析データが得られず、決定を断念した。

判明した部分アミノ酸配列を基に、その遺伝子の部分塩基配列を予想した。この予想配列を基に設計されるオリゴヌクレオチドプローブには無数の形状があり、そのうち６種類のプローブを作成したが、本発明で有効であったのはＡＯ−１と命名したオリゴヌクレオチドのみであった。ＡＯ−１の塩基配列構造を配列表配列番号６に示した。

このオリゴヌクレオチドは外部業者（株式会社ＢＥＸ）により依託合成され、完成したオリゴヌクレオチド２００ｎｇに、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより常法に従ってラジオアイソトープ３２Ｐを取り込ませ、放射性オリゴヌクレオチドプローブとした。

＜ＡＯＸ遺伝子含有ＤＮＡフラグメントの検定＞
実施例１の操作で得られたＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｓｐ．ＨＩ−２５株の染色体ＤＮＡから遺伝子ライブラリーを作成するため、本染色体を各種制限酵素で切断し、目的遺伝子が含有されるＤＮＡフラグメントの鎖長を検定する操作を行った。即ち、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｓｐ．ＨＩ−２５株の染色体ＤＮＡ（５μｇ）を各種制限酵素で常法に従って切断し、１．５％アガロースゲル（タカラバイオ社アガロースゲルＨ１４）中で常法に従い電気泳動した。泳動後のアガロースゲルから、常法に従ったサザンブロッティング法により、ナイロンメンブレンフィルター（ＰＡＬＬ社製：バイオダインＡ）にＤＮＡを移行・固定させた。このフィルターに対して、実施例２で調製した放射性ＤＮＡプローブＡＯ−１を使用して、常法に従いサザンハイブリダイゼーションを行い、各制限酵素による切断染色体が示すポジティブバンドのサイズを観察した。

その結果、ＥｃｏＲＩ切断により約２．５ｋｂ（キロベース：ＤＮＡ鎖長の単位、１，０００塩基）、ＳａｃＩ切断により約３．８ｋｂのＤＮＡフラグメント上にＡＯＸ遺伝子が含有されることが明らかとなり、ＥｃｏＲＩで切断した染色体ＤＮＡの２．５ｋｂフラグメント、ＳａｃＩで切断した染色体ＤＮＡの３．８ｋｂフラグメントのそれぞれから遺伝子ライブラリーを作成することとした。

＜遺伝子ライブラリーの作成＞
実施例１の操作で得られたＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｓｐ．ＨＩ−２５株の染色体ＤＮＡ１０μｇを常法に従い、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した約２．５ｋｂ、ＳａｃＩで切断した約３．８ｋｂのＤＮＡフラグメントを、低融点アガロース電気泳動を使用してそれぞれ分離した。

このＤＮＡフラグメントを、それぞれ同じ制限酵素で切断しアルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）１ｕで切断末端を脱リン酸化したｐＵＣ１１８２μｇと、ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔで連結させた。これを用いてＫ．Ｓｈｉｇｅｓａｄａの方法（例えば、参考文献１３参照）によってコンピテント細胞としたエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｒｅｌＡ１，ｓｕｐＥ４４，ｅｎｄＡ１，ｈｓｄＲ１７，ｇｙｒＡ９６，ｒｅｃＡ１，ｔｈｉ，△（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）／Ｆ’［ｔｒａＤ３６，ｐｒｏＡＢ＋，ｌａｃＩｑ，ｌａｃＺ△Ｍ１５］，ｍｃｒＡ−，ｍｃｒＢ＋（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．（１９８５）Ｇｅｎｅ，３３，１１９．））をトランスフォーメーションし、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有Ｌ平板寒天培地（バクトトリプトン（ＤＩＦＣＯ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製）５ｇ／ｌ、１０ｇ／ｌの塩化ナトリウム、バクトアガー（ＤＩＦＣＯ社製）１５ｇ／ｌ）にて一夜培養した。ＥｃｏＲＩフラグメントからは約２５００個、ＳａｃＩフラグメントからは２８００個のアンピシリン耐性コロニーを得、遺伝子ライブラリーとした。
［参考文献１３］細胞工学２，６１６−６２６，１９８３

＜ＡＯＸ遺伝子含有クローンのスクリーニング＞
実施例４により得た遺伝子ライブラリーを、ナイロンメンブレンフィルター（ＰＡＬＬ社製：バイオダインＡ）にレプリカし、このフィルターを別の５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有Ｌ平板寒天培地上に、コロニー面が上になるように重ね、３７℃で１６時間培養した。培養後このフィルターに対して、実施例２で調製された放射性ＤＮＡプローブＡＯ−１を使用して、常法に従いコロニーハイブリダイゼーションを行った。その結果、ポジティブシグナルをしめすコロニーをＥｃｏＲＩライブラリーから２個、ＳａｃＩライブラリーから１個確認した。

＜組み換えプラスミドの抽出＞
実施例５で選ばれたポジティブシグナルを示すコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ液体培地（バクトトリプトン（ＤＩＦＣＯ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製）５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／ｌ）１．５ｍｌに植菌し３７℃で１６時間振盪培養した後、常法に従いプラスミドを抽出した。その結果、ＥｃｏＲＩライブラリーより分離した２つのコロニーより抽出したプラスミドは同じものであり、これをｐｃＡＳＯＭ１と命名した。またＳａｃＩライブラリーより分離したコロニーから抽出したプラスミドをｐｃＡＳＯＭ２と命名した。なお、ｐｃＡＳＯＭ１は約２．５ｋｂ、ｐｃＡＳＯＭ２は約３．８ｋｂの染色体由来ＤＮＡを保有し、そのうち約１．５ｋｂの領域は双方に共通に保有されていた。

＜ＡＯＸ遺伝子配列の決定＞
実施例６で調製したプラスミドｐｃＡＳＯＭ１、ｐｃＡＳＯＭ２よりＡＯＸをコードしていると推定される部分についてジデオキシ法により塩基配列を決定した。その結果、ＡＯＸ遺伝子の全ＤＮＡ配列が決定された。

＜ｃＤＮＡ由来ＡＯＸ遺伝子の分離と比較＞
実施例８で決定したＡＯＸの遺伝子配列と、実施例２のＡＯＸの部分アミノ酸配列を照合したところ、遺伝子中に真核生物特有のイントロンが存在することが判明した。そこで遺伝子のエクソンとイントロンの領域を確定するため、ＡＯＸ遺伝子のｃＤＮＡを分離することにした。

ＣＭ培地に、ＡＯＸ生産菌であるＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｓｐ．ＨＩ−２５株を植菌し２８℃で３日間撹拌培養し、培養液２０ｍｌを遠心分離（３，０００Ｇ、４℃、１０分）し、集菌した菌体を乳鉢に入れ、液体窒素を注いで瞬間凍結させた。これを乳棒ですりつぶし、破砕した菌体０．５ｇを２０％グアニジン塩酸に懸濁し、このサンプルより、ファルマシア社のｍＲＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットを使用して、添付のマニュアルに従ってメッセンジャーＲＮＡ抽出を行った。さらにこのメッセンジャーＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡの合成を、ファルマシア社のｃＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓキットを使用して、添付のマニュアルに従って行った。以上の操作によりＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｓｐ．ＨＩ−２５株のｃＤＮＡ約５０μｇが分離された。

続いて、実施例７で明らかになったＡＯＸ遺伝子の５’末端の正鎖と、３’末端の相補鎖と同じ塩基配列を有する２種の２０塩基のオリゴヌクレオチドを、実施例２と同様に合成した。このオリゴヌクレオチドをプライマーとし、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｓｐ．ＨＩ−２５株のｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応操作（例えば、参考文献１４参照）を、ＤＮＡＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒとＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＲｅａｇｅｎｔＫｉｔｗｉｔｈＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ともにＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を使用して、添付のマニュアルに従って実施した。その結果約１．７ｋｂのＤＮＡフラグメントが合成され、このＤＮＡフラグメントの塩基配列を実施例７と同様にして決定した。
［参考文献１４］Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，４８７−４９１（１９８８）

その結果、このＤＮＡフラグメントがｃＤＮＡ由来のＡＯＸ遺伝子であることが確認され、染色体ＤＮＡ由来のＡＯＸ遺伝子の塩基配列との比較により、染色体ＤＮＡ由来のＡＯＸ遺伝子中のイントロン領域が確定した。また染色体ＤＮＡ由来ＡＯＸ遺伝子のエクソン領域の塩基配列は、ｃＤＮＡ由来のＡＯＸ遺伝子の塩基配列と完全に一致することが確認された。ｃＤＮＡ由来のＡＯＸ遺伝子の塩基配列、すなわちＡＯＸ遺伝子のエクソン領域の塩基配列と、そのコードするＡＯＸアミノ酸配列を配列表配列番号１および２に、染色体ＤＮＡ由来の、イントロン領域を含むＡＯＸ遺伝子および周辺領域の塩基配列を配列表配列番号３に示した。

＜ＡＯＸ遺伝子の染色体組み込み用コスミドｐｃｓＭＡＯ１の作製＞
当初、実施例８で得たｃＤＮＡ由来のＡＳＯ遺伝子を、大腸菌を始めとするバクテリアに導入しＡＯＸを生産させることを試みたが、活性を有する蛋白は遂に得られなかった。そこで、新たに糸状菌を遺伝子導入用宿主とすることにし、ＡＯＸ遺伝子を染色体へ組み込むためのベクターの作成を行った。

２μｇのｐｃＡＳＯＭ２をＮｓｐＶで切断し、ＤＮＡＢｌｕｎｔｉｎｇＫｉｔを使用して添付のマニュアルに従って切断末端を平滑化した後さらにＳａｃＩで切断し、低融点アガロース電気泳動を使用して１．９ｋｂのＤＮＡフラグメントを分離した。このフラグメントをＳａｃＩとＳｍａＩで切断しＢＡＰ１ｕで切断末端を脱リン酸化した２μｇのｐｃＡＳＯＭ１と、ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔで連結させた。

これを用いてＫ．Ｓｈｉｇｅｓａｄａの方法によってコンピテント細胞としたエシェリヒア・コリＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）（Ｆ−，ｒｅｃＡ１，ｅｎｄＡ１，ｇｙｒＡ９６，ｔｈｉ−１，ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−，ｍｋ＋），ｓｕｐＥ４４，ｒｅｌＡ１，λ−（Ｔ．ｍａｎｉａｔｉｓ．，ｅｔａｌ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ（１９８２），５０４−５０６））をトランスフォーメーションし、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有Ｌ平板寒天培地（バクトトリプトン（ＤＩＦＣＯ社製）１０ｇ／ｌ，酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製）５ｇ／ｌ，１０ｇ／ｍｌの塩化ナトリウム，バクトアガー（ＤＩＦＣＯ社製）１５ｇ／ｌ）にて一夜培養し、形質転換体を得た。この形質転換体より常法に従ってプラスミドを抽出、精製し、このプラスミドをｐｃＡＳＯＭ３と命名した。

このｐｃＡＳＯＭ３２μｇをＸｂａＩとＢａｍＨＩで切断し、約２．６ｋｂのＤＮＡフラグメントを、低融点アガロース電気泳動を使用して分離した。また、プラスミドｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトの両端に制限酵素ＳｆｉＩ認識部位を付加したプラスミドｐＳＦＩ−２（例えば、参考文献７参照）を制限酵素ＸｂａＩとＢａｍＨＩで切断し、このｐＳＦＩ−２１００ｎｇと先の２．６ｋｂのＤＮＡフラグメント１００ｎｇを、ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔで連結させた。これを用いてエシェリヒア・コリＤＨ１のコンピテント細胞をトランスフォーメーションし、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有Ｌ平板寒天培地にて一夜培養し、形質転換体を得た。この形質転換体より常法に従ってプラスミドを抽出、精製し、このプラスミドをｐＳＦＡＯ１と命名した。

次に、２μｇのプラスミドｐＳＦＡＯ１をＳｆｉＩ（東洋紡績社製）で切断し、ＡＯＸ遺伝子を含む約２．２ｋｂのＤＮＡフラグメントを分離し、同じくＳｆｉＩで切断したコスミドｐＢＳＦＡＨＹ８３（例えば、参考文献７参照）とを、反応液中のモル濃度比１５：１でＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔを用いて複数連結し、λＤＮＡパッケージングキット（ファルマシア社製）を用い添付のマニュアルに従って、新たなコスミドＤＮＡをファージ粒子に封入し、これをエシェリヒア・コリＤＨ１に感染させて形質転換体を作製した。この形質転換体よりプラスミド抽出と同様にしてコスミドを抽出、精製し、このコスミドをｐｃｓＭＡＯ１と命名した。

＜コスミドｐｃｓＭＡＯ１のＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ株への導入と形質転換＞
ＣＭ寒天培地（ＣＭ培地＋１．５％寒天）上で３０℃、５日間培養したＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍＡＴＣＣ１１５５０株の菌糸体をＣＭ培地５０ｍｌに接種し、３０℃で３日間振盪培養した。この培養液１ｍｌをＧＡ培地（４０ｇ／ｌグリセロール、４ｇ／ｌアスパラギン、０．１ｇ塩化カルシウム、０．１ｇ／ｌ塩化ナトリウム、０．１ｇ／ｌ硫酸マグネシウム（７水塩）、０．０１ｇ／ｌ硫酸第１鉄（７水塩）、４ｍｇ／ｌ硫酸マンガン（４水塩）、０．０１ｇ／ｌ硫酸亜鉛（７水塩）、１ｍｇ／ｌ無水硫酸銅、３ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０）５０ｍｌに植菌し、さらに３０℃２０時間培養した。

培養後、菌体を３５００ｒｐｍで５分遠心して集菌し、菌体を０．９％塩化ナトリウム溶液で洗浄した後、１０ｍＭジチオスレイトール含有マクイルベイン緩衝液（１２．９ｍＭクエン酸、１８７ｍＭリン酸水素２ナトリウム）に懸濁して３０℃にゆっくり旋回撹拌しながら１時間置いた。これを再び３０００ｒｐｍ、５分遠心して集菌し、菌体を１０ｍｇ／ｍｌノボザイム（ノボ社製）を添加したプロトプラスト緩衝液（０．６Ｍ塩化カリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、２５ｍＭ塩化カルシウム）に懸濁し３０℃にゆっくり旋回撹拌しながら３０分放置し菌体をプロトプラスト化した。反応終了後３０００ｒｐｍで１０分遠心して集菌し、プロトプラスト緩衝液に菌体を懸濁し、再び遠心集菌して菌体洗浄を行った。

菌体は再びプロトプラスト緩衝液１０ｍｌに懸濁して１５ｍｌ滅菌試験管中に１０分静置して菌糸塊を沈澱させ、懸濁液上部２／３程度を分取してプロトプラスト懸濁液とした。この懸濁液を血球計算板上にのせ、顕微鏡観察下プロトプラスト濃度を計算し、遠心集菌と懸濁により１×１０の７乗ｃｅｌｌ／ｍｌにプロトプラスト濃度を調整した。調整したプロトプラスト懸濁液１００μｌに、実施例８で調製したコスミドｐｃｓＭＡＯ１３〜５μｇを５ｍｇ／ｍｌヘパリン溶液１０μｌに溶解したものを添加し、さらに５０μｌのポリエチレングリコール溶液（１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、５０ｍＭ塩化カルシウム、２５％ポリエチレングリコール４０００（シグマ社製）、０．６Ｍ塩化カリウム）を添加し、氷中に２５分放置した。

これにさらに１ｍｌのポリエチレングリコール溶液を添加し、室温下に３０分置き、コスミドを菌体中に取り込ませた。この懸濁液をＢＲＭ寒天平板培地（２７．５％シュークロース、０．２％硝酸ナトリウム、０．１％リン酸２水素カリウム、１％ブレインハートインフュージョン（ＤＩＦＣＯ社製）、２％グルコース、２ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭ塩化カルシウム、０．７５％寒天：１枚当たり２５ｍｌ）上に２００μｌを広げ、１５℃に１晩置き、菌体細胞壁の修復を待った。

その後、０．５ｍｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（和光純薬社製）含有ＢＲＭ寒天培地を５ｍｌ重層し、さらに３０℃で７〜１０日培養を行った。培養後寒天培地上に生育してきたコロニーを、染色体中に先のｐｃｓＭＡＯ１が組み込まれ、ハイグロマイシンＢ薬剤耐性を獲得した形質転換体として取得し、これをＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｐｃｓＭＡＯ１と命名した。

＜ＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｐｃｓＭＡＯ１などの培養＞
ＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｐｃｓＭＡＯ１などは次の培地成分で培養した。
グリセロール８％
プロテンＳＳ３％
ＭｇＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ０．０２％
塩化銅２水和物６ｐｐｍ
ＣＳＬ１．２％
ミースト１．２％
培地のｐＨは６に合わせ、２８℃で１５０時間培養し、この培養液を１２０００ｒｐｍで２分遠心し、上清を分取した。

＜培養上清中のＡＯＸ酵素活性およびカタラーゼ活性の確認＞
実施例１１の方法でＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｐｃｓＭＡＯ１を２０〜２２０Ｌで合計５回培養した。これらのＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｐｃｓＭＡＯ１の培養上清中のＡＳＯＭＩＩ酵素活性およびカタラーゼ活性を、上記ＡＯＸ活性測定方法とカタラーゼ活性測定方法によって測定した。比較として、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｓｐ．ＨＩ−２５（ＦＥＲＭＰ−１５３２８）も２０Ｌで１回培養して同様に確認した。

その結果、表１に示したようにＡＳＯＭＩＩの培養活性はＡＳＯＭの培養活性に比べて改善され経済的になった。その一方で、ＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｐｃｓＭＡＯ１の培養上清中には、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｓｐ．ＨＩ−２５（ＦＥＲＭＰ−１５３２８）の培養上清中に比べてカタラーゼ活性が高いという問題点があった。なお、カタラーゼ混在率、またはカタラーゼ混在比率とは上記ＡＯＸ活性測定方法とカタラーゼ活性測定方法によって測定したＡＯＸ活性値およびカタラーゼ活性値から式３で計算した値である。

［式３］
カタラーゼ混在（比）率（％）＝（カタラーゼ活性値／ＡＯＸ活性値）×１００

表１で明らかなように、ＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｐｃｓＭＡＯ１株を培養して得られる酵素成分は、アスコルビン酸オキシダーゼ活性が１３０〜２４４Ｕ／ｍｌであり、かつカタラーゼ活性が３１〜１２９Ｕ／ｍｌであった。また、カタラーゼ混在率が少なくとも２０％以上であった。

＜ＡＳＯＭＩＩとカタラーゼの分離＞
「従来の技術」に記載したようにＡＯＸとカタラーゼが混在すると実用的ではないので、実施例１２の培養ロット２〜５の培養上精を用いてＡＳＯＭＩＩとカタラーゼの分離を試みた。分離精製は、実施例１２のロット２〜５の培養上精を別々に、次のようにして行った。

ブロスアウト（ＢＯ）した培養液は菌体を濾過して分離後、そのまま１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＱｓｅｐ．ＢＢ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に吸着させた（イオン交換カラムクロマトグラム工程）。１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で充分に洗浄した後、０及び０．５Ｍの塩化カリウムを含む１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分に最終濃度２０％になるように硫酸アンモニウム添加し、２０％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＰｈｅｎｙｌｓｅｐ．ＦＦ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に吸着して２０及び０％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いたリニアグラジェントにて溶出した（疎水カラムクロマトグラム工程）。活性画分は１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＧ−２５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）で脱塩した後、１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＱｓｅｐ．ＨＰに吸着し、０及び０．５Ｍの塩化カリウムを含む１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いたリニアグラジェントにて溶出した（イオン交換カラムクロマトグラム工程）。活性画分は０．５Ｍの塩化カリウムを含む１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した塩化銅をキレーティングしているｃｈｅｌａｔｉｎｇｓｅｐ．ＨＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に吸着させた。０．５Ｍの塩化カリウムを含む１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で充分に洗浄した後、０及び０．５Ｍのイミダゾールを含む０．５Ｍの塩化カリウムを含む１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分は０．１５Ｍを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．０で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｐ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）でゲル濾過した。最後に、６０℃３０分の加熱処理を行い、精製ＡＳＯＭＩＩを得た。

培養ロット２〜５の各精製工程のＡＳＯＭＩＩの活性収率（％）とカタラーゼ混在率（％）をまとめて表２に示した。この精製の結果、カタラーゼ混在率を、培養ロット２から精製した酵素成分は０．００１６％、培養ロット３から精製した酵素成分は０．０１９％、培養ロット４から経済的に精製した酵素成分は２．３％、培養ロット５から精製した酵素成分は０．０７２％であった。培養ロット２、３および５から精製した酵素成分は本発明の使用に耐える混在率であるが、これらの製造工程は最大６工程必要であり、また、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｐによるゲル濾過は一度に大量の酵素を高速にクロマト分画できない問題点もあるために経済的にＡＳＯＭＩＩを製造できる工程とは言い難い。また、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇｓｅｐ．ＨＰカラムクロマトグラム工程は大量の塩化銅の廃液が出るという環境上の問題点もある。培養ロット４は経済的にＡＳＯＭＩＩを製造できる工程で精製したが、カタラーゼ混在率が２．３％と高く、さらに精製工程が必要であり、本発明の使用に耐える混在率とは言えない。
すなわち、ＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｐｃｓＭＡＯ１株を培養して得られる酵素成分は、未精製ではカタラーゼ混在率が少なくとも２０％以上（表１）である為に、本発明の使用に耐えない。また、経済的な精製を施した精製物はカタラーゼ混在率が２．３％である為に本発明の使用に耐えない。さらに、各種カラムで分離し単一成分とした精製物は、カタラーゼ混在率を０．０７２％以下である為に本発明の使用に耐えるが、不経済である。
以上のように、ＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｐｃｓＭＡＯ１の培養によるＡＳＯＭＩＩの生産は、酵素生産量については改善されたが、該菌株を培養して得られる未精製の酵素成分のカタラーゼ混在率が少なくとも２０％以上であるために、経済的に高純度かつ高品質で実用的なＡＯＸを製造する方法ではないと結論づけた。
表２中、−はその工程を実施しなかった事を示し、空欄はカタラーゼ混在率を測定しなかった事を示す。

＜ＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍＡＴＣＣ１１５５０株の変異＞
実施例１２および１３で示したとおり、ＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｐｃｓＭＡＯ１の培養によるＡＳＯＭＩＩの製造方法は、該菌株を培養して得られる酵素成分のカタラーゼ混在率が少なくとも２０％以上であるために、経済的に高純度かつ高品質で実用的なＡＯＸを製造する方法はなかった。そこで、本発明者らは、培養して得られる酵素成分のカタラーゼ混在率が２０％未満であれば、経済的に高純度かつ高品質で実用的なＡＯＸを製造する方法の開発が可能であると考え、ＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍＡＴＣＣ１１５５０株の菌体外にカタラーゼを分泌しない変異株の取得を行った。

ＡＴＣＣ１１５５０株をポテトデキストロース寒天培地上で２６℃、７日間培養後、Ｓｕｃｒｏｓｅ２％、Ｐｅｐｔｏｎｅ１％、Ｙｅａｓｔｅｘｔ．０．４％、ＮａＮＯ_３０．３％、ＫＨ_２ＰＯ_４０．０５％、Ｋ_２ＨＰＯ_４０．０５％、ＫＣｌ０．０５％、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．０５％、ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．００１％を含み、ＮａＯＨでｐＨ７に調整した液体培地（１００ｍｌ／三角フラスコ５００ｍｌ）に一白金時移植し、２６℃、９日間振とう培養を行い、培養後の液を滅菌したガーゼで濾過し、胞子懸濁液を得た。得られた胞子懸濁液５ｍｌを遠心分離にて集菌し、滅菌した０．５％食塩水１ｍｌで再懸濁し、さらに終濃度０．０３ｍｇ／ｍｌになるようＮＴＧを添加し、３０℃、３０分間ゆっくりと振とうした。ＮＴＧ処理液を０．５ｍｌ食塩水で２回洗浄後、同食塩水で希釈を行い、ポテトデキストロース寒天培地上に塗布し、３０℃、５日間培養を行った。得られたコロニー上に１０％過酸化水素水を数滴滴下し、発泡の無いコロニーを選択することにより、カタラーゼを分泌しない変異株を取得した。

＜菌体外にカタラーゼを分泌しない変異ＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍＡＴＣＣ１１５５０株へのＡＯＸ遺伝子の導入＞
実施例１４で取得したカタラーゼ分泌量が少なくなったＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍＡＴＣＣ１１５５０株を実施例１０で記載した方法と同様にしてプロトプラスト化し、実施例８で調製したコスミドｐｃｓＭＡＯ１を導入してハイグロマイシンＢ薬剤耐性を獲得した遺伝子組換え体を取得した。

＜菌体外にカタラーゼを分泌しない変異ＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍＡＴＣＣ１１５５０のＡＯＸ遺伝子組換え体の選択＞
実施例１５で取得したカタラーゼ分泌量が少なくなった変異ＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍＡＴＣＣ１１５５０のＡＯＸ遺伝子組換え体１８株を実施例１１に記載の方法で１０ｍｌで培養し、培養上清中のＡＯＸ活性およびカタラーゼ活性を、上記ＡＯＸ活性測定方法とカタラーゼ活性測定方法によって測定した。その結果を、表３に示した。実施例１５で取得したカタラーゼ分泌量が少なくなった変異ＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍＡＴＣＣ１１５５０のＡＯＸ遺伝子組換え体１８株を培養して得られる酵素成分は、未精製でカタラーゼ混在率が２０％未満であり、経済的に高純度かつ高品質で実用的な本発明の使用に耐えるＡＯＸを製造する方法の開発に利用できると考えられた。特に１８株中ＡＯＸ活性が高く、かつ、カタラーゼ活性が低い株として、菌株Ｎｏ１、２、４〜７、９〜１８を挙げることができる。

実施例１６に記載の菌株Ｎｏ．１、２、４〜７、９〜１８株の中で、ＢＯ後の菌体の遠心分離が容易に行える生育状況（菌体の性状）であったこと、または、濾過による除菌工程が、濾紙、濾布、またはガラスフィルターに目詰まりしないこと等の理由で容易に行える生育状況（菌体の性状）であった菌株Ｎｏ４、７、１８を本試験に供する菌株として選択した。菌株Ｎｏ４、７、１８を実施例１１の方法で１．６Ｌで培養し、培養上清中のＡＯＸ活性およびカタラーゼ活性の経時変化を、上記ＡＯＸ活性測定方法とカタラーゼ活性測定方法によって測定した。その結果を図１〜図３に示した。比較のためにＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｓｐ．ＨＩ−２５（ＦＥＲＭＰ−１５３２８）も同様の試験を行い図４に示した。

図１〜図４で明らかなように、ＡＯＸ生産量が高く、かつ、カタラーゼ生産量の少ないＡＯＸ生産菌株Ｎｏ．４、７、１８を得る事ができた。菌株Ｎｏ４、７、１８のうち、特に菌株Ｎｏ．４をＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｐｃｓＭＡＯ１−ｄＯと命名し、平成１８年１２月５日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１中央第６）に寄託した。受託番号はＦＥＲＭＰ−２１１２３である。図１〜図４中黒丸はＡＯＸ活性、白丸はカタラーゼ活性を示す。

＜ＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｐｃｓＭＡＯ１−ｄＯの培養＞
ＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｐｃｓＭＡＯ１−ｄＯは次の培地成分で培養した。
グリセロール８％
プロテンＳＳ３％
ＭｇＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ０．０２％
塩化銅２水和物９ｐｐｍ
ＣＳＬ１．２％
ミースト１．２％
培地のｐＨは６に合わせ、２８℃で培養し、カタラーゼコンタミ率が少ない適当な培養時間にＢＯした。培養は２０〜４０Ｌで合計４回実施し、それぞれ培養ロット６、７、８、９とした。

＜ＡＳＯＭＩＩＩの精製＞
精製は、実施例１８の培養ロット６〜９の培養上精を用いて別々に、次のようにして行った。ＢＯした培養液は菌体を濾過して分離後、そのまま１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＱｓｅｐ．ＢＢに吸着させた（イオン交換カラムクロマトグラム工程）。１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で充分に洗浄した後、０及び０．５Ｍの塩化カリウムを含む１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分に最終濃度２０％になるように硫酸アンモニウム添加し、２０％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＰｈｅｎｙｌｓｅｐ．ＦＦに吸着して２０及び０％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いたリニアグラジェントにて溶出した（疎水カラムクロマトグラム工程）。活性画分は１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＧ−２５で脱塩した後、１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＱｓｅｐ．ＨＰに吸着し、０及び０．５Ｍの塩化カリウムを含む１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いたリニアグラジェントにて溶出した（イオン交換カラムクロマトグラム工程）。活性画分は１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＧ−２５で脱塩し、精製ＡＳＯＭＩＩＩを得た。ロット６〜９の各精製工程のＡＳＯＭＩＩＩの活性収率（％）をまとめて表４に示した。なお、空欄はその工程を実施しなかった事を示す。

本実施例の工程は、最大でも４工程であり、また、Ｑｓｅｐ．ＢＢ、Ｐｈｅｎｙｌｓｅｐ．ＦＦ、および、Ｑｓｅｐ．ＨＰを用いたカラムクロマト工程は高速分画が可能であり、実施例１３の工程に比べて経済的な精製工程といえる。

この精製の結果、カタラーゼ混在率を全ての培養ロットで０．０２％以下に下げる事ができた。また、図１〜図３で示したように、ＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｐｃｓＭＡＯ１−ｄＯ株の培養によるＡＳＯＭＩＩＩの生産は、培養活性が、培地、培養スケール、及び培養時間を変更する事で、２００〜２５０ｕ／ｍｌに上げる事ができたことから、経済的に高純度かつ高品質で実用的なＡＯＸを生産する方法が確立できた。
すなわち、ＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｐｃｓＭＡＯ１−ｄＯ株を培養して得られる酵素成分は、未精製ではカタラーゼ混在率が２．６％（表３のＮｏ．４）であり、経済的な精製工程でカタラーゼ混在率を０．０２％以下にできる為に、経済的に高純度かつ高品質で実用的な本発明の使用に耐えるＡＯＸを製造する方法の開発に利用できる。また、菌株Ｎｏ．１、２、５〜７、９〜１８株も、未精製でのカタラーゼ混在率がＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｐｃｓＭＡＯ１株よりも大幅に下がっているという事、菌株Ｎｏ．４と同様の培養スケールや培養時間を変更する事、図１〜図３から明らかなようにＢＯ時期を適当に選択する事、そして経済的な精製を施すことなどの組み合わせなどで、経済的に高純度かつ高品質で実用的な本発明の使用に耐えるＡＯＸを製造する方法の開発に利用できると考えられる。特に、菌株Ｎｏ．１、６、７、１３、１７、１８株は未精製でのカタラーゼ混在率が約２．６％以下であるために、経済的な精製を施すことで経済的に高純度かつ高品質で実用的な本発明の使用に耐えるＡＯＸを製造する方法の開発に利用できることは言うまでもない。

＜ＡＳＯＭＩＩＩとＡＳＯＭの熱安定性の比較＞
ＡＳＯＭおよびＡＳＯＭＩＩＩを１ｍｇ／ｍｌになるように１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶解し、各温度で１時間インキュベートした後の残存活性を上記ＡＯＸ活性測定方法で測定した。その結果、図５で示すように、ＡＳＯＭとＡＳＯＭＩＩＩで熱安定性に大きな差は認められず、ＡＳＯＭおよびＡＳＯＭＩＩＩは５０℃、６０分間の熱処理で、９５％以上の活性を保持することが分かった。なお、図５中黒丸はＡＳＯＭ、白丸はＡＳＯＭＩＩＩを示す。

＜ＡＳＯＭＩＩＩとＡＳＯＭの保存安定性の比較＞
２００ｐｐｍプロクリン３００を含む５０ｍＭＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨｐＨ７．５中でＡＳＯＭおよびＡＳＯＭＩＩＩ４Ｕ／ｍｌを添加し、３７℃で保存してその残存活性を上記ＡＯＸ活性測定方法で測定した。その結果、図６で示すように、２週間後の残存活性はＡＳＯＭが２２％、ＡＳＯＭＩＩＩが３０％となり、保存安定性がＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｓｐ．ＨＩ−２５が生産するＡＳＯＭに比べ、新規なＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｐｃｓＭＡＯ１−ｄＯＦＥＲＭＰ−２１１２３株が生産するＡＳＯＭＩＩＩの方が向上しているという産業上優位な性質を備えた新規なＡＯＸであることを見出した。なお、図６中黒丸はＡＳＯＭ、白丸はＡＳＯＭＩＩＩを示す。

＜ＡＳＯＭＩＩＩとＡＳＯＭの至適ｐＨの比較＞
上記ＡＯＸ活性測定方法において、ｐＨ４〜６はクエン酸−ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ５．５〜７はＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ６．５〜８はリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８〜９はトリス塩酸緩衝液、に変化してＡＳＯＭおよびＡＳＯＭＩＩＩ活性を測定した。その結果、図７及び図８で示すように、ＡＳＯＭおよびＡＳＯＭＩＩＩはｐＨ５．５±０．５付近である事が分かった。なお、図７はＡＳＯＭの至適ｐＨを示し、及び図８はＡＳＯＭＩＩＩの至適ｐＨを示す。図７及び図８中白丸はクエン酸−ＮａＯＨ緩衝液、黒丸はＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液、白三角はリン酸カリウム緩衝液、黒三角はトリス塩酸緩衝液を示す。

＜ＡＳＯＭＩＩＩとＡＳＯＭのｐＨ安定性の比較＞
ＡＳＯＭおよびＡＳＯＭＩＩＩを１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように、５０ｍＭのｐＨ４〜５．５はクエン酸−ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ５．５〜７はＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ６．５〜８はリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８〜９はトリス塩酸緩衝液、に溶解し、３７℃２４時間で保存してその残存活性を上記ＡＯＸ活性測定方法で測定した。その結果、図９及び図１０で示すように、ＡＳＯＭおよびＡＳＯＭＩＩＩはｐＨ４から１０の範囲の緩衝液中で８０％以上の活性を保持する事が分かった。なお、図９はＡＳＯＭのｐＨ安定性を示し、図１０はＡＳＯＭＩＩＩのｐＨ安定性を示す。図９及び図１０中白丸はクエン酸−ＮａＯＨ緩衝液、黒丸はＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液、白三角はリン酸カリウム緩衝液、黒三角はトリス塩酸緩衝液を示す。

＜ＡＳＯＭＩＩＩとＡＳＯＭのＫｍ値の比較＞
上記ＡＯＸ活性測定方法において、基質であるＬ−アスコルビン酸濃度を１．６７〜２０ｍＭ^−１になるように変化してＡＳＯＭおよびＡＳＯＭＩＩＩの反応速度を測定し、ラインウェーバー・バーク逆数プロットにより各見かけのＫｍ値を算出した。その結果、ＡＳＯＭの見かけのＫｍ値は０．３４３ｍＭ、ＡＳＯＭＩＩＩの見かけのＫｍ値は０．３７２〜０．３９３ｍＭと算出された。

＜ＡＳＯＭＩＩＩとＡＳＯＭの分子量の比較＞
実施例１９のＱｓｅｐ．ＨＰを用いたイオン交換カラムクロマトグラム工程で、０及び０．５Ｍの塩化カリウムを含む１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いたリニアグラジェントにてＡＳＯＭＩＩＩを溶出すると、ＫＣｌ濃度が０．２５Ｍ付近と０．３５Ｍ付近に２つのＡＯＸ活性ピークが得られた。この２つの活性ピークを分取して２００ｍＭのＮａＣｌを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．５を移動相としたＴＳＫ−ＧＥＬＧ３０００ＳＷ_ＸＬ（東ソー）を用いて分子量を測定した。比較のためにＡＳＯＭも同様の試験を行い、その結果を図１１に示した。図中実線の分子量マーカーを用いた検量線から、ＡＳＯＭの分子量は１０１０００、ＡＳＯＭＩＩＩの０．３５Ｍ画分の分子量は１９２０００，ＡＳＯＭＩＩＩの０．２５Ｍ画分の分子量は３２９０００であった。

ＡＳＯＭは糖鎖修飾される酵素なので、生産菌がＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｓｐ．ＨＩ−２５からＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｐｃｓＭＡＯ１株に変わった事で、受ける糖鎖修飾が変わったと予想された。そして、糖鎖の影響でＡＳＯＭＩＩＩの分子量は１９００００〜３３００００の範囲に分散していると考えられる。酵素の安定化剤として糖が汎用され、糖の種類や添加量によって安定化効果が異なることは周知である。従ってＡＳＯＭとＡＳＯＭＩＩＩの糖鎖の違いが実施例２１の保存安定性の違いに影響を与えていると考えられる。

＜ＡＳＯＭＩＩＩとＡＳＯＭのアジ化ナトリウムの影響の比較＞
上記ＡＯＸ活性測定方法において、図１２横軸の濃度のアジ化ナトリウムを含むＡＯＸ活性測定溶液を作成して、ＡＳＯＭＩＩＩとＡＳＯＭの活性を測定した。その結果、図１２で示すように、ＡＳＯＭおよびＡＳＯＭＩＩＩは同様にアジ化ナトリウムにより強い阻害を受ける事が分かった。すなわち、例えば体外診断薬で、カタラーゼによる負誤差の影響を回避するためにアジ化ナトリウムを使用する方法は困難である事が示された。なお、図１２中白丸はＡＳＯＭＩＩＩ、黒丸はＡＳＯＭを示す。

Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ−ｄＯＮｏ．４の培養におけるＡＯＸ活性とカタラーゼ活性の経時変化を表す。Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ−ｄＯＮｏ．７の培養におけるＡＯＸ活性とカタラーゼ活性の経時変化を表す。Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ−ｄＯＮｏ．１８の培養におけるＡＯＸ活性とカタラーゼ活性の経時変化を表す。ＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｐｃｓＭＡＯ１の培養におけるＡＯＸ活性とカタラーゼ活性の経時変化を表す。ＡＳＯＭＩＩＩとＡＳＯＭの熱安定性の比較を表す。ＡＳＯＭＩＩＩとＡＳＯＭの保存安定性の比較を表す。ＡＳＯＭの至適ｐＨを表す。ＡＳＯＭＩＩＩの至適ｐＨを表す。ＡＳＯＭのｐＨ安定性を表す。ＡＳＯＭＩＩＩのｐＨ安定性を表す。ＡＳＯＭＩＩＩのＱｓｅｐＨＰカラムクロマトグラム０．２５Ｍ画分、ＡＳＯＭＩＩＩのＱｓｅｐＨＰカラムクロマトグラム０．３５Ｍ画分およびＡＳＯＭの分子量の比較を表す。ＡＳＯＭＩＩＩとＡＳＯＭのアジ化ナトリウムによる阻害の比較を表す。

Claims

アスコルビン酸オキシダーゼ活性が２１．６Ｕ／ｍｌ以上であり、かつカタラーゼ活性が４．７Ｕ／ｍｌ以下である酵素成分を生産する、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ変異株。
アスコルビン酸オキシダーゼ活性が６９．６Ｕ／ｍｌ以上であり、かつカタラーゼ活性が３．８Ｕ／ｍｌ以下である酵素成分を生産する、請求項１に記載のＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ変異株。
ＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｐｃｓＭＡＯ１−ｄＯ株（ＦＥＲＭＰ−２１１２３）。
配列表配列番号１に示すＤＮＡ配列を有する請求項１〜３のいずれかに記載の株。
請求項１〜４のいずれかに記載の株を培養して得られる、アスコルビン酸オキシダーゼ活性が２１．６Ｕ／ｍｌ以上であり、かつカタラーゼ活性が４．７Ｕ／ｍｌ以下である酵素成分。
請求項１〜４のいずれかに記載の株を培養して得られる、アスコルビン酸オキシダーゼ活性が６９．６Ｕ／ｍｌ以上であり、かつカタラーゼ活性が３．８Ｕ／ｍｌ以下である酵素成分。
カタラーゼの混在率が２０％未満である請求項５又は６に記載の酵素成分。
カタラーゼの混在率が１４．８％以下である請求項５に記載の酵素成分。
カタラーゼの混在率が２．６％以下である請求項６に記載の酵素成分。
以下の（ａ）〜（ｆ）の工程によって得られる酵素成分。
（ａ）請求項１〜４のいずれかに記載の変異株を培養する工程
（ｂ）培養液から菌体を分離して除く工程
（ｃ）Ｑｓｅｐ．ＢＢを用いたイオン交換カラムクロマトグラム工程
（ｄ）要すればＰｈｅｎｙｌｓｅｐ．ＦＦを用いた疎水カラムクロマトグラム工程
（ｅ）Ｑｓｅｐ．ＨＰを用いたイオン交換カラムクロマトグラム工程
（ｆ）Ｇ−２５を用いた脱塩工程
請求項５〜１０のいずれかに記載の酵素成分に含まれる、以下の（１）〜（７）の特性を有するアスコルビン酸オキシダーゼ。
（１）作用
１分子の酸素の存在下、２分子のＬ−アスコルビン酸を２分子のデヒドロアスコルビン酸と２分子の水に酸化する。
（２）熱安定性
５０℃、６０分間の熱処理で、９５％以上の活性を保持する。
（３）保存安定性
ｐＨ７．５の緩衝液中で防腐剤の存在下、濃度４Ｕ／ｍｌで３７℃、２週間保存した場合３０％以上の活性を保持する。
（４）至適ｐＨ
ｐＨ５．５±０．５。
（５）ｐＨ安定性
ｐＨ４から１０の範囲の緩衝液中で、３７℃、２４時間で保存した場合８０％以上の活性を保持する。
（６）分子量
ＴＳＫ−ＧＥＬＧ３０００ＳＷ_ＸＬによる分子量が、１９００００〜３３００００。
（７）Ｋｍ値
アスコルビン酸に対して０．３〜０．４ｍＭ。
配列表配列番号１に示すアミノ酸配列を有する請求項１１に記載のアスコルビン酸オキシダーゼ。
ＡＯＸの生産能がないＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの変異株に配列表配列番号１に記載のアスコルビン酸オキシダーゼ遺伝子を導入した形質転換体。
血清中の目的成分を過酸化水素の定量を行うことによって定量する体外診断薬において、請求項１１又は１２に記載のアスコルビン酸オキシダーゼを含む体外診断薬。