JP2960775B2 - ノカルジオフォーム微生物由来のｄｎａ配列の発現 - Google Patents
ノカルジオフォーム微生物由来のｄｎａ配列の発現Info
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol
Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は遺伝子発現に関する。
Bergey's Manual of Systematic Bacteriolgy（Willi
ams及びWilkins,1986年,1458〜1481頁）においてノカル
ジオフォーム（Nocardioform）として分類される生物は
系統分類上コリネバクテリウム属（Corynebacteriu
m），アスロバクター属（Athrobacter）及びマイコバク
テリウム属（Mycobacterium）に近い９つの属を含む。
ノカルジア属（Nocardia）及びロードコッカス属（Rhod
ococcus）を含むノカルジオフォームのメンバーは下記
を含む広範囲の有用な代謝活性を示す：アルカン及び芳
香族炭化水素のような異例の化合物の同化作用；リグニ
ン，洗浄剤及び殺虫薬の分解；生体異物変換において有
用な酵素の産生；抗生物質，アミノ酸及びバイオサーフ
ァクタントの生合成。特に、この細菌群は、それらが血
液及び血清中のコレステロールレベルを求めるための診
断アセイにおいて用いられる、コレステロールエステラ
ーゼ及びコレステロールオキシダーゼを含む重要なステ
ロイド修飾酵素を産生するために利用されてきた。
ams及びWilkins,1986年,1458〜1481頁）においてノカル
ジオフォーム（Nocardioform）として分類される生物は
系統分類上コリネバクテリウム属（Corynebacteriu
m），アスロバクター属（Athrobacter）及びマイコバク
テリウム属（Mycobacterium）に近い９つの属を含む。
ノカルジア属（Nocardia）及びロードコッカス属（Rhod
ococcus）を含むノカルジオフォームのメンバーは下記
を含む広範囲の有用な代謝活性を示す：アルカン及び芳
香族炭化水素のような異例の化合物の同化作用；リグニ
ン，洗浄剤及び殺虫薬の分解；生体異物変換において有
用な酵素の産生；抗生物質，アミノ酸及びバイオサーフ
ァクタントの生合成。特に、この細菌群は、それらが血
液及び血清中のコレステロールレベルを求めるための診
断アセイにおいて用いられる、コレステロールエステラ
ーゼ及びコレステロールオキシダーゼを含む重要なステ
ロイド修飾酵素を産生するために利用されてきた。
コレステロールを分解する能力はノカルジオフォーム
と異なる微生物の中で応汎である。例えば、コレステロ
ールオキシダーゼは、また、マイコバクテリウム属、シ
ュードモナス属（Pseudomonas）及びストレプトミセス
属（Streptomyces）の種から単離された。ノカルジオフ
ォームタイプのコレステロールオキシダーゼが他の微生
物コレステロールオキシダーゼと異なることは、科学及
び特許文献からよく知られている。
と異なる微生物の中で応汎である。例えば、コレステロ
ールオキシダーゼは、また、マイコバクテリウム属、シ
ュードモナス属（Pseudomonas）及びストレプトミセス
属（Streptomyces）の種から単離された。ノカルジオフ
ォームタイプのコレステロールオキシダーゼが他の微生
物コレステロールオキシダーゼと異なることは、科学及
び特許文献からよく知られている。
ノカルジオフォーム酵素は広いpH範囲（pH6.0〜8.0）
にわたって極めて安定かつ活性であり、コレステロール
についてのKmは25℃において1.4×10-5モル／リットル
であり、酵素はΔ４−或はΔ５−３β−ステロイドに対
して極めて特異的である。コレステロールオキシダーゼ
は、ノカルジオフォームで産生されると、膜が付随し、
精製するために洗浄剤抽出及び脂質除去を必要とする。
にわたって極めて安定かつ活性であり、コレステロール
についてのKmは25℃において1.4×10-5モル／リットル
であり、酵素はΔ４−或はΔ５−３β−ステロイドに対
して極めて特異的である。コレステロールオキシダーゼ
は、ノカルジオフォームで産生されると、膜が付随し、
精製するために洗浄剤抽出及び脂質除去を必要とする。
Singer,等,J.Bacteriol.,1988年,170巻,638〜645頁
は、Ｅ．coli及びストレプトミセスsp.の両方からの遺
伝子のロードコッカスsp.における発現及びＥ．coliプ
ラスミドに基づき且つロードコッカス属プラスミド由来
の複製のオリジンを含有するシャトルプラスミドの開発
を記載している、このプラスミドはＥ．coliにおいて及
び試験するロードコッカス属の種の全てではないがいく
つかにおいて複製することができる。
は、Ｅ．coli及びストレプトミセスsp.の両方からの遺
伝子のロードコッカスsp.における発現及びＥ．coliプ
ラスミドに基づき且つロードコッカス属プラスミド由来
の複製のオリジンを含有するシャトルプラスミドの開発
を記載している、このプラスミドはＥ．coliにおいて及
び試験するロードコッカス属の種の全てではないがいく
つかにおいて複製することができる。
発明の要約 本発明者等は、ノカルジオフォーム微生物由来の組換
えDNA配列を宿主微生物において効率的に発現させ得る
ことを見出した。
えDNA配列を宿主微生物において効率的に発現させ得る
ことを見出した。
発明は、一態様において、ノカルジオフォーム生物由
来のDNA配列を宿主微生物において発現させるクローニ
ングベクターを特徴とする、好ましい実施態様では、DN
A配列はロードコッカスsp.NCIB10554（スコットラン
ド，アバディーン在 National Collection of Industr
ial Bacteria）に由来し、このDNA配列はコレステロー
ルオキシダーゼをコード化し、クローニングベクターが
ノカルジオフォームDNAを発現することができる生物は
グラム陽性微生物であり、一層好ましくはストレプトミ
セス属の種であり、最も好ましくはS.リビダンス（livi
dans）であり、クローニングベクターはプラスミドpSL8
1である。
来のDNA配列を宿主微生物において発現させるクローニ
ングベクターを特徴とする、好ましい実施態様では、DN
A配列はロードコッカスsp.NCIB10554（スコットラン
ド，アバディーン在 National Collection of Industr
ial Bacteria）に由来し、このDNA配列はコレステロー
ルオキシダーゼをコード化し、クローニングベクターが
ノカルジオフォームDNAを発現することができる生物は
グラム陽性微生物であり、一層好ましくはストレプトミ
セス属の種であり、最も好ましくはS.リビダンス（livi
dans）であり、クローニングベクターはプラスミドpSL8
1である。
コレステロールオキシダーゼは、発明に従い、ノカル
ジオフォーム微生物に由来するコレステロールオキシダ
ーゼをコードするDNA配列を含有するクローニングベク
ターを準備し、クローニングベクターで宿主細胞を形質
転換して組換え宿主細胞を得、組換え宿主細胞をDNA配
列の発現を可能のする条件下で培養し、コレステロール
オキシダーゼを回収することによって産生する。好まし
い実施態様では、ノカルジオフォーム生物はロードコッ
カスsp.NCIB 10554であり、宿主細胞はグラム陽性微生
物であり、好ましくはストレプトミセス属の種であり、
一層好ましくはS.リビダンスであり、クローニングベク
ターはプラスミドspL81である。
ジオフォーム微生物に由来するコレステロールオキシダ
ーゼをコードするDNA配列を含有するクローニングベク
ターを準備し、クローニングベクターで宿主細胞を形質
転換して組換え宿主細胞を得、組換え宿主細胞をDNA配
列の発現を可能のする条件下で培養し、コレステロール
オキシダーゼを回収することによって産生する。好まし
い実施態様では、ノカルジオフォーム生物はロードコッ
カスsp.NCIB 10554であり、宿主細胞はグラム陽性微生
物であり、好ましくはストレプトミセス属の種であり、
一層好ましくはS.リビダンスであり、クローニングベク
ターはプラスミドspL81である。
発明に従って作るコレステロールオキシダーゼは、サ
ンプルに組換えコレステロールオキシダーゼを接触させ
てコレステロールの酸化の程度を求め、特に酸素電極で
酸素消費を測定し、或は過酸化水素の生成を測定し、或
はΔ４−コレステノンへのコレステロール転化を分光測
光により求めることによってサンプル中のコレステロー
ルを測定するのに用いることができる。
ンプルに組換えコレステロールオキシダーゼを接触させ
てコレステロールの酸化の程度を求め、特に酸素電極で
酸素消費を測定し、或は過酸化水素の生成を測定し、或
はΔ４−コレステノンへのコレステロール転化を分光測
光により求めることによってサンプル中のコレステロー
ルを測定するのに用いることができる。
発明は、ノカルジオフォーム微生物由来のDNA配列
を、クローニング技法が知られている元の生物それ自体
に比べて商業生産の条件下で扱うのが一層容易な宿主微
生物において発現させる方法を提供する。ノカルジオフ
ォーム微生物に由来する組換えコレステロールオキシダ
ーゼを、酵素を相当に多く生成するに至ることができる
発現状態で細胞外タンパク質として発現させる。その
上、発現はインデューサーを加えることを必要とせず、
発現させた酵素はノカルジオフォーム膜の脂質を含まな
い。
を、クローニング技法が知られている元の生物それ自体
に比べて商業生産の条件下で扱うのが一層容易な宿主微
生物において発現させる方法を提供する。ノカルジオフ
ォーム微生物に由来する組換えコレステロールオキシダ
ーゼを、酵素を相当に多く生成するに至ることができる
発現状態で細胞外タンパク質として発現させる。その
上、発現はインデューサーを加えることを必要とせず、
発現させた酵素はノカルジオフォーム膜の脂質を含まな
い。
発明のその他の特徴及び利点は下記の発明の好ましい
実施態様の説明及び請求の範囲の記載から明らかになる
ものと思う。
実施態様の説明及び請求の範囲の記載から明らかになる
ものと思う。
好ましい実施態様の説明 初めに図面を説明することにする。
図面 第１図はプラスミドpSL81の制御エンドヌクレアーゼ
マップである。
マップである。
第２図（2.1〜2.6）はロードコッカス10554コレステ
ロールオキシダーゼ遺伝子の配列記載である。
ロールオキシダーゼ遺伝子の配列記載である。
第３図はプラスミドpSL81の制御エンドヌクレアーゼ
マップであり、pSL81△15断片の位置を示す。
マップであり、pSL81△15断片の位置を示す。
遺伝子分離及び発現 ノカルジオフォーム微生物由来のDNA配列の発現は、
一般的に、初めに所望の宿主生物と適合し得る適した複
製のオリジンを含有する適したクローニングベクターに
DNA配列を組込んでゲノムバンク或はライブラリーを構
築することによって達成することができる。次に、任意
の微生物、有利には、例えばストレプトミセス属或はバ
チルス属（Bacillus）の種のような任意のグラム陽性微
生物からの宿主細胞を、DNA配列を含有するベクターで
形質転換させる。次いで、形質転換体を、所望の遺伝子
生成物の活性についてスクリーンし、活性なクローンを
分離し、特性表示する。
一般的に、初めに所望の宿主生物と適合し得る適した複
製のオリジンを含有する適したクローニングベクターに
DNA配列を組込んでゲノムバンク或はライブラリーを構
築することによって達成することができる。次に、任意
の微生物、有利には、例えばストレプトミセス属或はバ
チルス属（Bacillus）の種のような任意のグラム陽性微
生物からの宿主細胞を、DNA配列を含有するベクターで
形質転換させる。次いで、形質転換体を、所望の遺伝子
生成物の活性についてスクリーンし、活性なクローンを
分離し、特性表示する。
ライブラリーの構築 下記のプロトコル（例示のために提示する）は、ロー
ドコッカスsp.NCIB 10554（ロードコッカス10554）DNA
のゲノムライブラリーを元の微生物からのDNAを発現す
ることができるS.リビダンスのような宿主において構築
することを記載する。下記の例で、このライブラリーを
用いて作った形質転換された細胞集団をスクリーンし、
ロードコッカス10554のコレステロールオキシダーゼ遺
伝子を発現させる。
ドコッカスsp.NCIB 10554（ロードコッカス10554）DNA
のゲノムライブラリーを元の微生物からのDNAを発現す
ることができるS.リビダンスのような宿主において構築
することを記載する。下記の例で、このライブラリーを
用いて作った形質転換された細胞集団をスクリーンし、
ロードコッカス10554のコレステロールオキシダーゼ遺
伝子を発現させる。
一般的に、ロードコッカス10554DNAのゲノムライブラ
リーを、分離し且つ制限酵素Sau3Aで切断して４〜８キ
ロベース対の大きさの範囲の断片を生じておいた高分子
量のDNAから構築した。ロードコッカス10554からのサイ
ズ分画したDNAを、次いで、Bal IIで消化しておいたク
ローニングプラスミドpIJ702にライゲートさせた。pIJ7
02プラスミドはAmerican Type Culture Collection（US
A,メリーランド，ロックビル）を通して市販されてい
る。ライブラリーのハイブリッドプラスミドをS.リビダ
ンス属細胞に入れて形質転換させて宿主微生物において
ロードコッカス10554DNAのゲノムライブラリーを生成し
た。
リーを、分離し且つ制限酵素Sau3Aで切断して４〜８キ
ロベース対の大きさの範囲の断片を生じておいた高分子
量のDNAから構築した。ロードコッカス10554からのサイ
ズ分画したDNAを、次いで、Bal IIで消化しておいたク
ローニングプラスミドpIJ702にライゲートさせた。pIJ7
02プラスミドはAmerican Type Culture Collection（US
A,メリーランド，ロックビル）を通して市販されてい
る。ライブラリーのハイブリッドプラスミドをS.リビダ
ンス属細胞に入れて形質転換させて宿主微生物において
ロードコッカス10554DNAのゲノムライブラリーを生成し
た。
手順の詳細は下記の通りであった：ロードコッカス10
554の単一コロニーを用いて１リットル当りDifco普通ブ
イヨン8g及びDifco酵母エキス5gを含有するMBYE培地50m
lに接種した。ロードコッカスsp.を成育させることが記
載されているその他の適当な培地を用いることもでき
る。培養を30℃において48時間成育させ、SS−34ロータ
を使用したSorvall RC−5B遠心機で10,000rpmにおいて
15分間遠心分離して細胞を捕集した。細胞をトリス−グ
ルコース（10mMトリス−HCl,pH8.0,10mM EDTA,25％w/v
グルコース）18ml中に再懸濁させ、リゾチーム溶液（ト
リス−グルコース溶液中のリゾチーム（シグマ）10mg/m
l）2mlを加えた。その混合物を37℃において60分間イン
キュベートした。次に、10％w/vドデシル硫酸ナトリウ
ム（シグマ）2.4mlを加え、混合物を激しく攪拌して溶
解させた細胞の均一な溶液を形成した。溶解させた細胞
を55℃において２時間インキュベートし、次いで5M Na
ClO4（シグマ）2.7mlを加えた。溶解させた細胞溶液を
クロロホルム：イソアミルアルコール（24:1）20mlで２
回抽出し、Sorvall SS−34ロータで12,000rpmにおいて
10分間遠心分離して相を分離させることによって変性タ
ンパク質及び細胞砕片（debris）を除いた。水性相を取
り出し、冷エタノール２容積を加えた。溶液をゆっくり
混合し、Marmur等,1961年,J.Mol.Biol.,3巻,203〜218頁
が記載する通りにガラス棒を用いて高分子量のDNAを捕
集した。捕集したDNAを70％エタノールで２回洗浄し、T
E（10mMトリス,1mM EDTA,pH8.0）5mlに溶解した。DNA
溶液にDNAseフリーのRNAse（シグマ）を100mg/ml加え、
42℃において30分間インキュベートした。次に、10％w/
vのドデシル硫酸ナトリウム0.6ml及び5M NaCl0.6mlを
加え、混合物をフェノール：クロロホルム（1:1）で１
回及びクロロホルム：イソアミルアルコール（24:1）で
１回抽出した。DNAをエタノール２容積で沈殿させ、前
の通りにしてガラス棒を使用して捕集した。DNAを70％
エタノールで１回洗浄し、風乾した後にTE中に再び懸濁
させて最終濃度およそ1mg/mlにした。
554の単一コロニーを用いて１リットル当りDifco普通ブ
イヨン8g及びDifco酵母エキス5gを含有するMBYE培地50m
lに接種した。ロードコッカスsp.を成育させることが記
載されているその他の適当な培地を用いることもでき
る。培養を30℃において48時間成育させ、SS−34ロータ
を使用したSorvall RC−5B遠心機で10,000rpmにおいて
15分間遠心分離して細胞を捕集した。細胞をトリス−グ
ルコース（10mMトリス−HCl,pH8.0,10mM EDTA,25％w/v
グルコース）18ml中に再懸濁させ、リゾチーム溶液（ト
リス−グルコース溶液中のリゾチーム（シグマ）10mg/m
l）2mlを加えた。その混合物を37℃において60分間イン
キュベートした。次に、10％w/vドデシル硫酸ナトリウ
ム（シグマ）2.4mlを加え、混合物を激しく攪拌して溶
解させた細胞の均一な溶液を形成した。溶解させた細胞
を55℃において２時間インキュベートし、次いで5M Na
ClO4（シグマ）2.7mlを加えた。溶解させた細胞溶液を
クロロホルム：イソアミルアルコール（24:1）20mlで２
回抽出し、Sorvall SS−34ロータで12,000rpmにおいて
10分間遠心分離して相を分離させることによって変性タ
ンパク質及び細胞砕片（debris）を除いた。水性相を取
り出し、冷エタノール２容積を加えた。溶液をゆっくり
混合し、Marmur等,1961年,J.Mol.Biol.,3巻,203〜218頁
が記載する通りにガラス棒を用いて高分子量のDNAを捕
集した。捕集したDNAを70％エタノールで２回洗浄し、T
E（10mMトリス,1mM EDTA,pH8.0）5mlに溶解した。DNA
溶液にDNAseフリーのRNAse（シグマ）を100mg/ml加え、
42℃において30分間インキュベートした。次に、10％w/
vのドデシル硫酸ナトリウム0.6ml及び5M NaCl0.6mlを
加え、混合物をフェノール：クロロホルム（1:1）で１
回及びクロロホルム：イソアミルアルコール（24:1）で
１回抽出した。DNAをエタノール２容積で沈殿させ、前
の通りにしてガラス棒を使用して捕集した。DNAを70％
エタノールで１回洗浄し、風乾した後にTE中に再び懸濁
させて最終濃度およそ1mg/mlにした。
一部消化された（digested）高分子量ロードコッカス
10554DNAを分離する条件を確立するために、Sau3A制限
酵素の濃度を変えてDNAを消化する試験反応液を用意し
た。反応混合物をDNA0.1μ,10×Sau3A緩衝剤（200mM
トリスHCl,pH7.4,50mM MgCl2,500mM KCl）15μ及び
水125μで調製した。アリコート15μを１〜９のラ
ベルを付けたチューブ中に分散させて氷上で冷却した。
Sau3A酵素（10単位／μ BRL）を正確に４単位チュー
ブ１に加えてよく混合した。チューブ１から逐次チュー
ブ８まで通して反応混合物を順次に２倍希釈して、Sau3
A酵素を２倍減少した濃度で含有する反応混合物を生じ
た。チューブ９は酵素を含有せず、未消化対照反応を示
した。チューブを37℃において１時間インキュベート
し、チューブを氷に戻しかつEDTA（20mM）を加えて停止
させた。各々のチューブにおける消化の程度をアガロー
スゲル電気泳動によってモニターし、およそ２〜20Kbの
範囲のDNA断片を生じたサンプルを200倍スケールアップ
した反応を繰り返した。消化されたロードコッカス属10
554DNAを、低ゲル化温度アガロース（SeaPlaque,FMC）
を用いてアガロースゲル電気泳動によって分離した。４
〜8Kbの大きさの範囲のDNA断片を含有するゲルの領域を
殺菌したメスで切り取り、DNAを電気溶離によって回収
した。DNAを慣用法で沈殿させ、沈殿をTE中に再懸濁さ
せて濃度0.025mg/mlにした。
10554DNAを分離する条件を確立するために、Sau3A制限
酵素の濃度を変えてDNAを消化する試験反応液を用意し
た。反応混合物をDNA0.1μ,10×Sau3A緩衝剤（200mM
トリスHCl,pH7.4,50mM MgCl2,500mM KCl）15μ及び
水125μで調製した。アリコート15μを１〜９のラ
ベルを付けたチューブ中に分散させて氷上で冷却した。
Sau3A酵素（10単位／μ BRL）を正確に４単位チュー
ブ１に加えてよく混合した。チューブ１から逐次チュー
ブ８まで通して反応混合物を順次に２倍希釈して、Sau3
A酵素を２倍減少した濃度で含有する反応混合物を生じ
た。チューブ９は酵素を含有せず、未消化対照反応を示
した。チューブを37℃において１時間インキュベート
し、チューブを氷に戻しかつEDTA（20mM）を加えて停止
させた。各々のチューブにおける消化の程度をアガロー
スゲル電気泳動によってモニターし、およそ２〜20Kbの
範囲のDNA断片を生じたサンプルを200倍スケールアップ
した反応を繰り返した。消化されたロードコッカス属10
554DNAを、低ゲル化温度アガロース（SeaPlaque,FMC）
を用いてアガロースゲル電気泳動によって分離した。４
〜8Kbの大きさの範囲のDNA断片を含有するゲルの領域を
殺菌したメスで切り取り、DNAを電気溶離によって回収
した。DNAを慣用法で沈殿させ、沈殿をTE中に再懸濁さ
せて濃度0.025mg/mlにした。
S.リビダンス/pIJ702の単一コロニーを用いて１リッ
トル当り、Difco酵母エキス3g;Difcoペプトン5g;Oxoid
麦芽エキス3g;グルコース3g;スクロース340g;5mMのMgCl
2及び0.4％w/vのグリシンを含有するYEME50mlに接種
し、かつプラスミド選択剤チオストレプトン（CalBioch
em）を50μg/ml補った。ストレプトミセス属用に記載さ
れている他の培地を用いることもできる。培養を30℃に
おいて３日間インキュベートした。Sorvall遠心機及びS
S−34ロータを使用して10,000rpmにおいて30分間遠心分
離して細胞を収穫した。ペレットを、リゾチーム10mgを
含有するTSEバッファー（25mMトリス,pH8.0;0.3Mスクロ
ース;25mM EDTA）5ml中に再懸濁させた。細胞を37℃に
おいて30分間インキュベートした。アルカリ性SDS溶液
（0.3M NaOH,2％w/vドデシル硫酸ナトリウム）3ml容量
を加え、混合物を室温において10分間かつ70℃において
10分間インキュベートした。溶解させた細胞溶液を室温
に冷却し、フェノール：クロロホルム（1:1）１容積で
抽出した。水性相を清浄なチューブに取り出し、0.3M酢
酸ナトリウム（pH4.8）及びイソプロパノール１容積を
加えた。DNAを−20℃において30分間沈殿させ、Sorvall
SS−34ロータを10,000rpmにおいて10分間使用して遠
心分離して回収した。ペレットをTE2ml中に再懸濁さ
せ、プラスミドDNAを超遠心分離によって精製し、既知
の技法に従って塩化セシウム密度勾配法で平衡にした。
トル当り、Difco酵母エキス3g;Difcoペプトン5g;Oxoid
麦芽エキス3g;グルコース3g;スクロース340g;5mMのMgCl
2及び0.4％w/vのグリシンを含有するYEME50mlに接種
し、かつプラスミド選択剤チオストレプトン（CalBioch
em）を50μg/ml補った。ストレプトミセス属用に記載さ
れている他の培地を用いることもできる。培養を30℃に
おいて３日間インキュベートした。Sorvall遠心機及びS
S−34ロータを使用して10,000rpmにおいて30分間遠心分
離して細胞を収穫した。ペレットを、リゾチーム10mgを
含有するTSEバッファー（25mMトリス,pH8.0;0.3Mスクロ
ース;25mM EDTA）5ml中に再懸濁させた。細胞を37℃に
おいて30分間インキュベートした。アルカリ性SDS溶液
（0.3M NaOH,2％w/vドデシル硫酸ナトリウム）3ml容量
を加え、混合物を室温において10分間かつ70℃において
10分間インキュベートした。溶解させた細胞溶液を室温
に冷却し、フェノール：クロロホルム（1:1）１容積で
抽出した。水性相を清浄なチューブに取り出し、0.3M酢
酸ナトリウム（pH4.8）及びイソプロパノール１容積を
加えた。DNAを−20℃において30分間沈殿させ、Sorvall
SS−34ロータを10,000rpmにおいて10分間使用して遠
心分離して回収した。ペレットをTE2ml中に再懸濁さ
せ、プラスミドDNAを超遠心分離によって精製し、既知
の技法に従って塩化セシウム密度勾配法で平衡にした。
上述した通りにして調製したプラスミドpIJ702をTE中
に再懸濁させて濃度1mg/mlにした。DNA約10μ（10μ
ｇ）を10×Bal II緩衝剤（500mMトリスHCl,pH7.4;50mM
MgCl2;500mM KCl），蒸留水32μ及びBal II制限酵素
（10単位／μ,BRL）３μに加え、37℃において２時
間インキュベートした。反応を、フェノール：クロロホ
ルム（1:1）による１回の抽出及びクロロホルム：イソ
アミルアルコール（24:1）による１回の抽出によって停
止させた。7.5M酢酸アンモニウム半容積及び冷エタノー
ル２容積を加えてDNAを沈殿させた。−20℃において少
なくとも２時間インキュベートした後に、DNAをエッペ
ンドルフ小型遠心機（microfuge）で10分間遠心分離し
て捕集した。DNAペレットを70％エタノールで１回洗浄
し、乾燥し、50mMトリスHCl（pH8.0）50μ中に再懸濁
させた。DNAを脱リン酸化するために、仔ウシ腸アルカ
リホスファターゼ（2U/μ,IBI）１μを加え、反応
を37℃において30分間インキュベートした。停止緩衝剤
（10mMトリスHCl,pH7.5;1mM EDTA,pH7.5;200mM NaCl;
0.5％w/vドデシル硫酸ナトリウム）150μを加えて反
応を停止させ、次いで、フェノール：クロロホルム（1:
1）で１回及びクロロホルム：イソアミルアルコール（2
4:1）で１回抽出した。DNAをエタノールで沈殿させ、乾
燥し、TE中に再び懸濁させて最終濃度0.05mg/mlにし、
−20℃において貯蔵した。
に再懸濁させて濃度1mg/mlにした。DNA約10μ（10μ
ｇ）を10×Bal II緩衝剤（500mMトリスHCl,pH7.4;50mM
MgCl2;500mM KCl），蒸留水32μ及びBal II制限酵素
（10単位／μ,BRL）３μに加え、37℃において２時
間インキュベートした。反応を、フェノール：クロロホ
ルム（1:1）による１回の抽出及びクロロホルム：イソ
アミルアルコール（24:1）による１回の抽出によって停
止させた。7.5M酢酸アンモニウム半容積及び冷エタノー
ル２容積を加えてDNAを沈殿させた。−20℃において少
なくとも２時間インキュベートした後に、DNAをエッペ
ンドルフ小型遠心機（microfuge）で10分間遠心分離し
て捕集した。DNAペレットを70％エタノールで１回洗浄
し、乾燥し、50mMトリスHCl（pH8.0）50μ中に再懸濁
させた。DNAを脱リン酸化するために、仔ウシ腸アルカ
リホスファターゼ（2U/μ,IBI）１μを加え、反応
を37℃において30分間インキュベートした。停止緩衝剤
（10mMトリスHCl,pH7.5;1mM EDTA,pH7.5;200mM NaCl;
0.5％w/vドデシル硫酸ナトリウム）150μを加えて反
応を停止させ、次いで、フェノール：クロロホルム（1:
1）で１回及びクロロホルム：イソアミルアルコール（2
4:1）で１回抽出した。DNAをエタノールで沈殿させ、乾
燥し、TE中に再び懸濁させて最終濃度0.05mg/mlにし、
−20℃において貯蔵した。
脱リン酸化したBal II消化pIJ702DNA約10μ（0.5μ
ｇ）をSau3A消化ロードコッカスDNA約20μ（0.5μ
ｇ）に加えた。５×リガーゼ緩衝剤（BRL）のアリコー
ト20μ，リガーゼ（NEB）0.5μ及び水50μを加
え、このライゲーション反応液を14℃において20時間イ
ンキュベートした。混合物を65℃に10分間加熱して反応
を停止させ、サンプルを−20℃において貯蔵した。
ｇ）をSau3A消化ロードコッカスDNA約20μ（0.5μ
ｇ）に加えた。５×リガーゼ緩衝剤（BRL）のアリコー
ト20μ，リガーゼ（NEB）0.5μ及び水50μを加
え、このライゲーション反応液を14℃において20時間イ
ンキュベートした。混合物を65℃に10分間加熱して反応
を停止させ、サンプルを−20℃において貯蔵した。
培地がチオストレプトンを含有しない他は、S.リビダ
ンス/pIJ702の調製について記載した通りにして、S.リ
ビダンスを培養肉汁25mlにおいて成育させて栄養体接種
物を調製した。細胞をベンチトップ遠心機において3,00
0rpmで10分間収穫し、10.3％w/vスクロース10mlで２回
洗浄した。細胞ペレットをリゾチーム培地（Ｌ−培地,T
hompson等,1982年,J.Bacteriol,151巻,668〜677頁）4ml
中に再懸濁させ、30℃において30分間インキュベートし
た。プロトプラスト培地（Ｐ−培地，オカニシ，等,197
4年,J.Gen.Microbiol.,80巻,389〜400頁）のアリコート
5mlを加え、溶液をピペットで上下に移して混合した。
プロトプラストをグラスウール（菌糸を捕獲するが、プ
ロトプラストを通過させる）に通して濾過し、遠心分離
して収穫し、Ｐ−培地2ml中に再懸濁させた。プロトプ
ラストをフレッシュで用い或は−70℃のＰ−培地で凍結
貯蔵した。
ンス/pIJ702の調製について記載した通りにして、S.リ
ビダンスを培養肉汁25mlにおいて成育させて栄養体接種
物を調製した。細胞をベンチトップ遠心機において3,00
0rpmで10分間収穫し、10.3％w/vスクロース10mlで２回
洗浄した。細胞ペレットをリゾチーム培地（Ｌ−培地,T
hompson等,1982年,J.Bacteriol,151巻,668〜677頁）4ml
中に再懸濁させ、30℃において30分間インキュベートし
た。プロトプラスト培地（Ｐ−培地，オカニシ，等,197
4年,J.Gen.Microbiol.,80巻,389〜400頁）のアリコート
5mlを加え、溶液をピペットで上下に移して混合した。
プロトプラストをグラスウール（菌糸を捕獲するが、プ
ロトプラストを通過させる）に通して濾過し、遠心分離
して収穫し、Ｐ−培地2ml中に再懸濁させた。プロトプ
ラストをフレッシュで用い或は−70℃のＰ−培地で凍結
貯蔵した。
ライゲーション緩衝液中のライゲートされたプラスミ
ドDNA3μまでとS.リビダンス属プロトルプラスト50μ
とを小さい滅菌チューブ中で静かに混合した。この混
合物に、形質転換用緩衝液（Ｔ−緩衝剤,Thompson,等,1
982年,J.Bacteriol,151巻,668〜667頁）20μを加え、
ピペットで移して混合した。直ぐに、細胞をR2YE培地
（Thompson,等,1980年,Nature（ロンドン）,286巻,525
〜527頁）に静かに広げかつ30℃において一晩インキュ
ベートした。再生したプロトプラストを、チオストレプ
トン100μg/mlを含有する濾紙（Whatman 541,9.0cm）
で覆い、30℃において３日間インキュベートした。これ
らの形質転換条件を用いてプレート当り約200〜500の形
質転換体が得られた。およそ12,000のチオストレプトン
耐性のS.リビダンス形質転換体がこの方法で得られた。
ミニプレプDNA分析によって推定して、これらの形質転
換体の70％を越えるものが組換えpIJ702プラスミドを含
有していた。これらの組換えプラスミドがロードコッカ
ス10554DNAのゲノムライブラリーを代表した。
ドDNA3μまでとS.リビダンス属プロトルプラスト50μ
とを小さい滅菌チューブ中で静かに混合した。この混
合物に、形質転換用緩衝液（Ｔ−緩衝剤,Thompson,等,1
982年,J.Bacteriol,151巻,668〜667頁）20μを加え、
ピペットで移して混合した。直ぐに、細胞をR2YE培地
（Thompson,等,1980年,Nature（ロンドン）,286巻,525
〜527頁）に静かに広げかつ30℃において一晩インキュ
ベートした。再生したプロトプラストを、チオストレプ
トン100μg/mlを含有する濾紙（Whatman 541,9.0cm）
で覆い、30℃において３日間インキュベートした。これ
らの形質転換条件を用いてプレート当り約200〜500の形
質転換体が得られた。およそ12,000のチオストレプトン
耐性のS.リビダンス形質転換体がこの方法で得られた。
ミニプレプDNA分析によって推定して、これらの形質転
換体の70％を越えるものが組換えpIJ702プラスミドを含
有していた。これらの組換えプラスミドがロードコッカ
ス10554DNAのゲノムライブラリーを代表した。
コレステロールオキシダーゼ活性についてのスクリーニ
ング ノカルジオフォーム微生物由来の−DNA配列の発現を
示す例として、ロードコッカス10554DNAのゲノムライブ
ラリーを含有する組換えS.リビダンス細胞をスクリーン
してコレステロールオキシダーゼ活性を発現させた。コ
レステロールオキシダーゼはAllain等,1974年,Physical
Chem.,20巻,470〜475頁の改良法を用いて測定した。濾
紙ディスクを、４−アミノアンチピリン，フェノール，
セイヨウワサビペルオキシダーゼ及びトリトン−X100を
含有するアセイ緩衝液中に浸漬し、コレステロール基質
を含有する寒天培地上で成育するコロニーの上にのせ
た。別法として、これらのコロニーを、コレステロール
を含有する寒天培地上でのハロ生成によってアセイする
ことができ、この場合、ハロ生成は可溶性コレステロー
ルオキシダーゼによってコレステロールがコレステノン
に転化することに依存する。コレステロールオキシダー
ゼを産生した組換えS.リビダンスコロニーを精製し、特
性表示した。
ング ノカルジオフォーム微生物由来の−DNA配列の発現を
示す例として、ロードコッカス10554DNAのゲノムライブ
ラリーを含有する組換えS.リビダンス細胞をスクリーン
してコレステロールオキシダーゼ活性を発現させた。コ
レステロールオキシダーゼはAllain等,1974年,Physical
Chem.,20巻,470〜475頁の改良法を用いて測定した。濾
紙ディスクを、４−アミノアンチピリン，フェノール，
セイヨウワサビペルオキシダーゼ及びトリトン−X100を
含有するアセイ緩衝液中に浸漬し、コレステロール基質
を含有する寒天培地上で成育するコロニーの上にのせ
た。別法として、これらのコロニーを、コレステロール
を含有する寒天培地上でのハロ生成によってアセイする
ことができ、この場合、ハロ生成は可溶性コレステロー
ルオキシダーゼによってコレステロールがコレステノン
に転化することに依存する。コレステロールオキシダー
ゼを産生した組換えS.リビダンスコロニーを精製し、特
性表示した。
コレステロールオキシダーゼ活性についてのゲノムラ
イブラリーのスクリーニングの詳細は下記の通りであっ
た:S.リビダンス形質転換体を選択するためにチオスト
レプトン薬剤をR2YE形質転換用プレートに適用するのに
用いた濾紙をもち上げ、コレステロール（1.6mM,シグ
マ）及びチオストレプトン（50μg/ml）と共にスクリー
ニングプレート［下記を１リットル当り含有する培地：
寒天15g;グリセロール,20g;酵母エキス,1g;MgSO4,0.66
g;緩衝塩,66ml（１リットル当り:Na2HPO4,28g;NaH2PO4,
30g;K2HPO4,20g;（NH4）2SO4,127.5g）及び微量の塩,2m
l（１リットル当り：濃HCl,250ml;CaCl2,3.57g;ZnSO4,2
0g;CuCl2,0.85g;NaMoO4,4.8g;MnCl2,2.0g;FeCl3,5.4g;
ホウ酸,0.3g;CoCl2,2.4g）］にのせた。これらのレプリ
カプレートを30℃において３日間インキュベートした。
レプリカフィルターを取り去り、滅菌した濾紙ディスク
をコレステロールオキシダーゼアセイ試薬（100mMクエ
ン酸緩衝液,pH6.0;0.2mM4−アミノアンチピリン（Aldri
ch）；セイヨウワサビペルオキシダーゼI,600単位／リ
ットル;6.4mMコレステロール;10mMフェノール及び４％w
/vトリトンX100）に浸漬したものに替えた。プレートを
30℃においてインキュベートし、コロニーを４時間かけ
てスクリーンして白色濾紙上に拡散するコレステロール
オキシダーゼ活性による赤色或を展開させた。30℃のお
いて４時間インキュベートした後に、アセイ試薬濾紙を
スクリーニングプレートから取り去り、プレートを30℃
において一晩再インキュベートしてコレステロールのコ
レステロールオキシダーゼ分解に伴うクリアハロの生成
を認めた。スクリーンしたおよそ8,000の組換えS.リビ
ダンスコロニーから、２つがコレステロールオキシダー
ゼ活性を示した。これらの分離株の内と１つからのプラ
スミドDNAをpSL81と呼び、更に分析した。
イブラリーのスクリーニングの詳細は下記の通りであっ
た:S.リビダンス形質転換体を選択するためにチオスト
レプトン薬剤をR2YE形質転換用プレートに適用するのに
用いた濾紙をもち上げ、コレステロール（1.6mM,シグ
マ）及びチオストレプトン（50μg/ml）と共にスクリー
ニングプレート［下記を１リットル当り含有する培地：
寒天15g;グリセロール,20g;酵母エキス,1g;MgSO4,0.66
g;緩衝塩,66ml（１リットル当り:Na2HPO4,28g;NaH2PO4,
30g;K2HPO4,20g;（NH4）2SO4,127.5g）及び微量の塩,2m
l（１リットル当り：濃HCl,250ml;CaCl2,3.57g;ZnSO4,2
0g;CuCl2,0.85g;NaMoO4,4.8g;MnCl2,2.0g;FeCl3,5.4g;
ホウ酸,0.3g;CoCl2,2.4g）］にのせた。これらのレプリ
カプレートを30℃において３日間インキュベートした。
レプリカフィルターを取り去り、滅菌した濾紙ディスク
をコレステロールオキシダーゼアセイ試薬（100mMクエ
ン酸緩衝液,pH6.0;0.2mM4−アミノアンチピリン（Aldri
ch）；セイヨウワサビペルオキシダーゼI,600単位／リ
ットル;6.4mMコレステロール;10mMフェノール及び４％w
/vトリトンX100）に浸漬したものに替えた。プレートを
30℃においてインキュベートし、コロニーを４時間かけ
てスクリーンして白色濾紙上に拡散するコレステロール
オキシダーゼ活性による赤色或を展開させた。30℃のお
いて４時間インキュベートした後に、アセイ試薬濾紙を
スクリーニングプレートから取り去り、プレートを30℃
において一晩再インキュベートしてコレステロールのコ
レステロールオキシダーゼ分解に伴うクリアハロの生成
を認めた。スクリーンしたおよそ8,000の組換えS.リビ
ダンスコロニーから、２つがコレステロールオキシダー
ゼ活性を示した。これらの分離株の内と１つからのプラ
スミドDNAをpSL81と呼び、更に分析した。
S.リビダンス/pSL81組換え体からのプラスミドDNAを
分離し、pIJ702を分離しかつ形質転換することについて
記載した同じ手順を用いてS.リビダンスに戻し形質転換
した（transformed back）。得られたチオストレプトン
耐性の形質転換体は全ておよそ6KbのインサートDNAを有
する同じプラスミドpIJ702を含有し、元の組換え体の特
性を表示するコレステロールオキシダーゼ活性を示し
た。S.リビダンス細胞からプラスミドpSL81を生長によ
り薬剤選択性圧力を存在させずに治癒した場合、チオス
トレプトン耐性及びコレステロールオキシダーゼ活性を
同時に失うに至った。サザンハイブリダイゼーション
は、インサートDNAがロードコッカス属10554ゲノムに由
来することを立証した。第１図を参照すれば、pSL81と
表示した組換えプラスミドはクローニングベクターpIJ7
02 12及びロードコッカス10554からのインサートDNA14
を含み、かつ制限エンドヌクレアーゼ部位を示す通りに
有する。
分離し、pIJ702を分離しかつ形質転換することについて
記載した同じ手順を用いてS.リビダンスに戻し形質転換
した（transformed back）。得られたチオストレプトン
耐性の形質転換体は全ておよそ6KbのインサートDNAを有
する同じプラスミドpIJ702を含有し、元の組換え体の特
性を表示するコレステロールオキシダーゼ活性を示し
た。S.リビダンス細胞からプラスミドpSL81を生長によ
り薬剤選択性圧力を存在させずに治癒した場合、チオス
トレプトン耐性及びコレステロールオキシダーゼ活性を
同時に失うに至った。サザンハイブリダイゼーション
は、インサートDNAがロードコッカス属10554ゲノムに由
来することを立証した。第１図を参照すれば、pSL81と
表示した組換えプラスミドはクローニングベクターpIJ7
02 12及びロードコッカス10554からのインサートDNA14
を含み、かつ制限エンドヌクレアーゼ部位を示す通りに
有する。
上述した通りにして調製したプラスミドpSL81を用い
てコレステロールオキシダーゼを産生するロードコッカ
スNCIB10554,R.エリトロポリス（erythropolis）NCIB91
58,ノカルジアエリトロポリスATCC17895及びノカルジア
エリトロポリスATCC4277からの染色体消化物を検査し
た。菌株は、全て、これらのノカルジオフォームにおけ
るコレステロールオキシダーゼコーディング領域が同じ
であることを示唆するクロス−ハイブリダイジングDNA
バンドを示した。プラスミドpSL81はコレステロールオ
キシダーゼを産生するストレプトミセス属、すなわちス
トレプトミセスビオラセン（violascene）NRRL Ｂ−27
00から分離したDNAとの特異的クロスハイブリダイゼー
ションを示さなかった。
てコレステロールオキシダーゼを産生するロードコッカ
スNCIB10554,R.エリトロポリス（erythropolis）NCIB91
58,ノカルジアエリトロポリスATCC17895及びノカルジア
エリトロポリスATCC4277からの染色体消化物を検査し
た。菌株は、全て、これらのノカルジオフォームにおけ
るコレステロールオキシダーゼコーディング領域が同じ
であることを示唆するクロス−ハイブリダイジングDNA
バンドを示した。プラスミドpSL81はコレステロールオ
キシダーゼを産生するストレプトミセス属、すなわちス
トレプトミセスビオラセン（violascene）NRRL Ｂ−27
00から分離したDNAとの特異的クロスハイブリダイゼー
ションを示さなかった。
DNA配列決定 コレステロールオキシダーゼ遺伝子を配列決定するた
めに、pSL81のサブクローンを構築し、コレステロール
オキシダーゼコーディング領域をサブクローンpSL81△1
5における2.8kb Bgl II断片に局在化させた（第３
図）。次いで、この断片をプラスミドpBR322にてE.coli
に導入し、利用可能な制限部位を用いて一連の欠失誘導
体を構築した。配列決定を、Sanger等、PNAS USA、74
巻、5463〜67頁のジデオキシ連鎖停止反応法を用いて変
性した二本鎖プラスミドDNAについて行った。特には、S
equenase Version2.0キット（United States Biochemic
al Corp.）を製造業者の仕様書に従って使用した。配列
決定するDNAの特定領域のＧ＋Ｃ含量の度合に応じてデ
オキシグアニジントリホスフェート或はデオキシ−７−
デアゾグアニジントリホスフェートを用いて連鎖重合反
応を停止させた。変性用６％ポリアクリルアミド上で、
プライマー伸長させたオリゴヌクレオチドを電気泳動に
かけ、隣接するDNA断片のDNA配列をまとめてコレステロ
ールオキシダーゼ遺伝子の完全なDNA配列を構築した。
配列を第２図に示す。
めに、pSL81のサブクローンを構築し、コレステロール
オキシダーゼコーディング領域をサブクローンpSL81△1
5における2.8kb Bgl II断片に局在化させた（第３
図）。次いで、この断片をプラスミドpBR322にてE.coli
に導入し、利用可能な制限部位を用いて一連の欠失誘導
体を構築した。配列決定を、Sanger等、PNAS USA、74
巻、5463〜67頁のジデオキシ連鎖停止反応法を用いて変
性した二本鎖プラスミドDNAについて行った。特には、S
equenase Version2.0キット（United States Biochemic
al Corp.）を製造業者の仕様書に従って使用した。配列
決定するDNAの特定領域のＧ＋Ｃ含量の度合に応じてデ
オキシグアニジントリホスフェート或はデオキシ−７−
デアゾグアニジントリホスフェートを用いて連鎖重合反
応を停止させた。変性用６％ポリアクリルアミド上で、
プライマー伸長させたオリゴヌクレオチドを電気泳動に
かけ、隣接するDNA断片のDNA配列をまとめてコレステロ
ールオキシダーゼ遺伝子の完全なDNA配列を構築した。
配列を第２図に示す。
pSL81△15におけるロードコッカスコレステロールオ
キシダーゼ遺伝子のサブクローニングはコレステロール
オキシダーゼタンパク質の発現を増大させるに至り得
る。組換えS.リビダンス細胞を、チオストレプトン50μ
g/mlを含有するRZYE寒天上で成育させた。30℃において
２〜３日インキュベートした後に、菌糸及び胞子を寒天
の表面からかき取り、50mlYEME＋12.5μg/mlチオストレ
プトンシード培養に接種するのに用いた。これらの培養
を30℃において激しく降盪しながら成育させ、48時間し
た後に、YEME＋12.5μg/mlチオストレプトンを収容する
２の発酵槽にこのシードを接種した。発酵を28℃及び
pH7.0において0.5／分でエアレーションしかつ1000rp
mで攪拌しながら調節した。コレステロールオキシダー
ゼ活性は48時間後にピークに達し、このようないくつか
の培養では、発現は、S.リビダンス/pSL81発酵に比べて
S.リビダンス/pSL81△15発酵の場合に、相当に大きかっ
た。
キシダーゼ遺伝子のサブクローニングはコレステロール
オキシダーゼタンパク質の発現を増大させるに至り得
る。組換えS.リビダンス細胞を、チオストレプトン50μ
g/mlを含有するRZYE寒天上で成育させた。30℃において
２〜３日インキュベートした後に、菌糸及び胞子を寒天
の表面からかき取り、50mlYEME＋12.5μg/mlチオストレ
プトンシード培養に接種するのに用いた。これらの培養
を30℃において激しく降盪しながら成育させ、48時間し
た後に、YEME＋12.5μg/mlチオストレプトンを収容する
２の発酵槽にこのシードを接種した。発酵を28℃及び
pH7.0において0.5／分でエアレーションしかつ1000rp
mで攪拌しながら調節した。コレステロールオキシダー
ゼ活性は48時間後にピークに達し、このようないくつか
の培養では、発現は、S.リビダンス/pSL81発酵に比べて
S.リビダンス/pSL81△15発酵の場合に、相当に大きかっ
た。
タンパク質特性表示 チオストレプトン（50μg/ml）を含有するYEME（25m
l）中で成育させたS.リビダンス/pSL81細胞を３日した
培養から、組換えコレステロールオキシダーゼを分離し
た。寒天で固体化してないスクリーニングプレートに用
いたのと同じ培地である液体生産培地で成育させた48時
間ロードコッカス10554培養から、非組換えコレステロ
ールオキシダーゼを分離した。ステロールをインデュー
サーとして存在させて同じ成育条件を用い、誘導実験を
行った。細胞内及び細胞外フラクションを遠心分離によ
って回収し、コレステロールオキシダーゼ特異的診断ア
セイを使用してコレステロールオキシダーゼ活性をアセ
イした。S.リビダンスからの組換えコレステロールオキ
シダーゼ及びロードコッカス10554からの精製したコレ
ステロールオキシダーゼの特異性を、種々のステロール
基質を用いて比較した。両方の酵素は同様のプロフィル
を示し、活性の順序はコレステロール、プレグネノロ
ン、ジヒドロキシコレステロール、スチグマステロー
ル、エルゴステロールであった。
l）中で成育させたS.リビダンス/pSL81細胞を３日した
培養から、組換えコレステロールオキシダーゼを分離し
た。寒天で固体化してないスクリーニングプレートに用
いたのと同じ培地である液体生産培地で成育させた48時
間ロードコッカス10554培養から、非組換えコレステロ
ールオキシダーゼを分離した。ステロールをインデュー
サーとして存在させて同じ成育条件を用い、誘導実験を
行った。細胞内及び細胞外フラクションを遠心分離によ
って回収し、コレステロールオキシダーゼ特異的診断ア
セイを使用してコレステロールオキシダーゼ活性をアセ
イした。S.リビダンスからの組換えコレステロールオキ
シダーゼ及びロードコッカス10554からの精製したコレ
ステロールオキシダーゼの特異性を、種々のステロール
基質を用いて比較した。両方の酵素は同様のプロフィル
を示し、活性の順序はコレステロール、プレグネノロ
ン、ジヒドロキシコレステロール、スチグマステロー
ル、エルゴステロールであった。
S.リビダンス/pSL81からの組換えコレステロールオキ
シダーゼは、コレステロールを測定する標準の診断アセ
イにおいて機能的であった。YEME成育組換え細胞の３日
した培養からの細胞フリー上澄のアルコートにコレステ
ロールオキシダーゼアセイ試薬（0.1Mホスフェート緩衝
液、pH7.0、0.05％トリトンＸ−100（w/v）中の0.33mg/
ml4−アミノフェナゾン1.4ml;ホスフェート−トリトリ
Ｘ緩衝液中1mg/mlフェノール1.4ml;4mMコレステロール
0.1ml;及び10mg/mlペルオキシダーゼ0.01ml）を混合
し、30℃においてインキュベートした。コレステロール
を酸化する間に生成しかつアセイ混合物中のアミノアン
チピリンとキレート化した過酸化水素を、水を含有する
試薬ブランクに対して505nmにおける赤色錯体の吸収を
測定して求めた。また、組換え酵素によるコレステロー
ル分解速度を△４−コレステノン生成による240nmにお
ける吸光度の増加をたどって直接測定した。キュベット
中のリン酸ナトリウム緩衝液（0.1M、pH7.0）2.9mlに、
３％トリトンＸ−100（w/v）100μ及び6mMコレステロ
ール溶液50μを加えた。酵素を緩衝液中におよそ0.2U
/mlに希釈して加え、240nmにおける吸光度をベックマン
分光光度計を使用してモニターした。コレステロールオ
キシダーゼ活性を下記の通りにして計算した： ここで、 RV＝反応容積 DF＝希釈率 SV＝サンプル容積 PC＝タンパク質濃度 S.リビダンス/pSL81からの組換えコレステロールオキ
シダーゼのそれ以上の特性表示は、酵素を、また、ペル
オキシダーゼ共役反応を用いて血清中のコレステロール
を求めるのに用い得ることを立証した。
シダーゼは、コレステロールを測定する標準の診断アセ
イにおいて機能的であった。YEME成育組換え細胞の３日
した培養からの細胞フリー上澄のアルコートにコレステ
ロールオキシダーゼアセイ試薬（0.1Mホスフェート緩衝
液、pH7.0、0.05％トリトンＸ−100（w/v）中の0.33mg/
ml4−アミノフェナゾン1.4ml;ホスフェート−トリトリ
Ｘ緩衝液中1mg/mlフェノール1.4ml;4mMコレステロール
0.1ml;及び10mg/mlペルオキシダーゼ0.01ml）を混合
し、30℃においてインキュベートした。コレステロール
を酸化する間に生成しかつアセイ混合物中のアミノアン
チピリンとキレート化した過酸化水素を、水を含有する
試薬ブランクに対して505nmにおける赤色錯体の吸収を
測定して求めた。また、組換え酵素によるコレステロー
ル分解速度を△４−コレステノン生成による240nmにお
ける吸光度の増加をたどって直接測定した。キュベット
中のリン酸ナトリウム緩衝液（0.1M、pH7.0）2.9mlに、
３％トリトンＸ−100（w/v）100μ及び6mMコレステロ
ール溶液50μを加えた。酵素を緩衝液中におよそ0.2U
/mlに希釈して加え、240nmにおける吸光度をベックマン
分光光度計を使用してモニターした。コレステロールオ
キシダーゼ活性を下記の通りにして計算した： ここで、 RV＝反応容積 DF＝希釈率 SV＝サンプル容積 PC＝タンパク質濃度 S.リビダンス/pSL81からの組換えコレステロールオキ
シダーゼのそれ以上の特性表示は、酵素を、また、ペル
オキシダーゼ共役反応を用いて血清中のコレステロール
を求めるのに用い得ることを立証した。
S.リビダンス/pSL81からの組換えコレステロールオキ
シダーゼ及び精製したロードコッカス10554コレステロ
ールオキシダーゼを、10％ポリアクリルアミドゲル及び
Laemelli、1970年、Nature、227巻、680頁以降の緩衝シ
ステムを用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
って分析した。両方の酵素は、Biorad分子量規準に比べ
た場合、大きさがおよそ55kDであることが求められた。
シダーゼ及び精製したロードコッカス10554コレステロ
ールオキシダーゼを、10％ポリアクリルアミドゲル及び
Laemelli、1970年、Nature、227巻、680頁以降の緩衝シ
ステムを用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
って分析した。両方の酵素は、Biorad分子量規準に比べ
た場合、大きさがおよそ55kDであることが求められた。
ペプチド配列決定法 S.リビダンス/pSL81△15からの組換えコレステロール
オキシダーゼ及びR.ロードコッカスからの非組換えコレ
ステロールオキシダーゼをポリアクリルアミドゲルから
単一バンドとして分離し、タンパク質シークエネーター
を使用してアミノ末端ペプチド配列を求めた。２つのペ
プチド配列を組換えタンパク質バンドから回収した： これらのペプチド配列は、位置280〜320及び位置283
〜320のDNA配列から直接推定されるものとそれぞれ同じ
である。一方の組換え配列のＮ−末端においてグリシン
残基が除かれているのは、おそらく、宿主細胞による後
翻訳過程が相違することによるのであろう。
オキシダーゼ及びR.ロードコッカスからの非組換えコレ
ステロールオキシダーゼをポリアクリルアミドゲルから
単一バンドとして分離し、タンパク質シークエネーター
を使用してアミノ末端ペプチド配列を求めた。２つのペ
プチド配列を組換えタンパク質バンドから回収した： これらのペプチド配列は、位置280〜320及び位置283
〜320のDNA配列から直接推定されるものとそれぞれ同じ
である。一方の組換え配列のＮ−末端においてグリシン
残基が除かれているのは、おそらく、宿主細胞による後
翻訳過程が相違することによるのであろう。
R.ロードコッカスからのコレステロールオキシダーゼ
のアミノ末端配列決定は下記の配列を確認した： これは、位置300〜346のDNA配列から推定されるペプ
チド配列に一致する。従って、S.リビダンス/pSL81△15
培地において見られる酵素は、R.ロードコッカスにおい
て見られる膜結合した酵素に比べてアミノ酸が６或は７
のいずれか長い。
のアミノ末端配列決定は下記の配列を確認した： これは、位置300〜346のDNA配列から推定されるペプ
チド配列に一致する。従って、S.リビダンス/pSL81△15
培地において見られる酵素は、R.ロードコッカスにおい
て見られる膜結合した酵素に比べてアミノ酸が６或は７
のいずれか長い。
グラム陽性の分泌タンパク質のプロセッシングは、し
ばしば、シグナル配列開裂及びその後の第二プロセッシ
ング部位における加水分解を含む。天然コレステロール
オキシダーゼの場合、この第二部位はトレオニンにあた
る。タンパク質がS.リビダンスによって合成されかつ細
胞外分泌される場合に、このような第二開裂が起きない
のは明らかである。
ばしば、シグナル配列開裂及びその後の第二プロセッシ
ング部位における加水分解を含む。天然コレステロール
オキシダーゼの場合、この第二部位はトレオニンにあた
る。タンパク質がS.リビダンスによって合成されかつ細
胞外分泌される場合に、このような第二開裂が起きない
のは明らかである。
他の実施態様 他の実施態様は下記の請求の範囲内にある。例えば、
ロードコッカスNCIB10554、R.エリトロポリスNCIB915
8、ノカルジアエリトロポリスATCC17895及びノカルジア
エリトロポリスATCC4277を含むノカルジオフォームの内
のいずれかの属の内の他の種を用いて染色体ライブラリ
ーを作ることができ、或はライブラリーは例えば下記の
ような有用な代謝活性のためにスクリーンすることがで
きる：アルカン及び芳香族炭化水素の同化；リグニン、
洗浄剤及び殺虫剤の分解；生体異物転換において有用な
酵素の産生；抗生物質、アミノ酸及びバイオサーファク
タントの生合成；コレステロールエステラーゼのような
他のステロイド修飾酵素の産生、 その他のストレプトミセス属及びバチルス属の種も異
種遺伝子を発現することについてS.リビダンスと利点を
共にするので、それらもまたノカルジオフォーム微生物
に由来するDNA配列を発現するために適した宿主として
働くことができる。ノカルジオフォーム、マイコバクテ
リウム属、コリネバクテリウム属及びアスロバクター属
の内のいずれかを含むグラム陽性細菌の高いＧ＋Ｃサブ
ディビジョンに属する他の細胞はノカルジオフォーム微
生物由来のDNA配列をクローン化するのに適した宿主に
なる。
ロードコッカスNCIB10554、R.エリトロポリスNCIB915
8、ノカルジアエリトロポリスATCC17895及びノカルジア
エリトロポリスATCC4277を含むノカルジオフォームの内
のいずれかの属の内の他の種を用いて染色体ライブラリ
ーを作ることができ、或はライブラリーは例えば下記の
ような有用な代謝活性のためにスクリーンすることがで
きる：アルカン及び芳香族炭化水素の同化；リグニン、
洗浄剤及び殺虫剤の分解；生体異物転換において有用な
酵素の産生；抗生物質、アミノ酸及びバイオサーファク
タントの生合成；コレステロールエステラーゼのような
他のステロイド修飾酵素の産生、 その他のストレプトミセス属及びバチルス属の種も異
種遺伝子を発現することについてS.リビダンスと利点を
共にするので、それらもまたノカルジオフォーム微生物
に由来するDNA配列を発現するために適した宿主として
働くことができる。ノカルジオフォーム、マイコバクテ
リウム属、コリネバクテリウム属及びアスロバクター属
の内のいずれかを含むグラム陽性細菌の高いＧ＋Ｃサブ
ディビジョンに属する他の細胞はノカルジオフォーム微
生物由来のDNA配列をクローン化するのに適した宿主に
なる。
S.リビダンス/pSL81はコレステロールオキシダーゼコ
ーディング領域の範囲外の１つ或はそれ以上の領域にお
いて再配列を受けることができ、かつコレステロールオ
キシダーゼ形質転換活性を保持することができる。この
ようなS.リビダンス/pSL81再配列プラスミドの１種は、
制限マッピングで測定して未変化の6kbロードコッカスD
NAの内の少なくとも3.6kbを有する。この再配列S.リビ
ダンス/pSL81プラスミドでは、およそ2.5kbのDNAの挿入
がPvuII部位の右側の領域において生じた。コレステロ
ールオキシダーゼは、この再配列プラスミドによって形
質転換されたS.リビダンスの培養から、S.リビダンス/p
SL81培養からの場合に比べて少ない量で回収可能であっ
た。
ーディング領域の範囲外の１つ或はそれ以上の領域にお
いて再配列を受けることができ、かつコレステロールオ
キシダーゼ形質転換活性を保持することができる。この
ようなS.リビダンス/pSL81再配列プラスミドの１種は、
制限マッピングで測定して未変化の6kbロードコッカスD
NAの内の少なくとも3.6kbを有する。この再配列S.リビ
ダンス/pSL81プラスミドでは、およそ2.5kbのDNAの挿入
がPvuII部位の右側の領域において生じた。コレステロ
ールオキシダーゼは、この再配列プラスミドによって形
質転換されたS.リビダンスの培養から、S.リビダンス/p
SL81培養からの場合に比べて少ない量で回収可能であっ
た。
なお他の実施態様では、当業者にとって明らかな通り
に、コレステロールオキシダーゼの発現は、更にpSL81
△15クローンを扱うことによって増大させることができ
る。例えば、Hopwood等、1985年Genetic Manipulation
of Streptomyces:A Laboratory Manualに記載されてい
るpIJ303のようなコピー数の一層大きいベクターを用い
ることができる。遺伝子発現は、また、コレステロール
オキシダーゼプロモーターを、例えば下記のような一層
強い外因性プロモーターに置き換えることによって高め
ることができる:Bibb等、1985年、Gene、38巻、15〜226
頁に記載されているErmEプロモーター;Hopwood等、1985
年に記載されているaphプロモーター；或はAmman等、19
84年、Gene、25巻、167頁以降に記載されているtacプロ
モーター。
に、コレステロールオキシダーゼの発現は、更にpSL81
△15クローンを扱うことによって増大させることができ
る。例えば、Hopwood等、1985年Genetic Manipulation
of Streptomyces:A Laboratory Manualに記載されてい
るpIJ303のようなコピー数の一層大きいベクターを用い
ることができる。遺伝子発現は、また、コレステロール
オキシダーゼプロモーターを、例えば下記のような一層
強い外因性プロモーターに置き換えることによって高め
ることができる:Bibb等、1985年、Gene、38巻、15〜226
頁に記載されているErmEプロモーター;Hopwood等、1985
年に記載されているaphプロモーター；或はAmman等、19
84年、Gene、25巻、167頁以降に記載されているtacプロ
モーター。
寄託 特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタ
ペスト条約により、プラスミドpSL81の寄託をUSA、メリ
ーランド、ロックビルのAmerican Type Culture Collec
tion（ATCC）に行い、寄託はAccessionナンバーATCC678
53を与えられた。
ペスト条約により、プラスミドpSL81の寄託をUSA、メリ
ーランド、ロックビルのAmerican Type Culture Collec
tion（ATCC）に行い、寄託はAccessionナンバーATCC678
53を与えられた。
出願人の譲受人であるGenzyme Corporationは、ATCC
が寄託の永続かつ特許が付与されるならば公衆が容易に
入手するのを可能にする保管所であると考える。そのよ
うに寄託した物質を公衆が入手し得ることに関する全て
の制限は、最終的に特許が付与された際に除かれること
になる。その物質は特許出願が係属している間は、37CF
R1.14及び35U.S.C.122条で特許局長が受ける権利がある
と決めた者にとって入手可能である。寄託された物質
は、寄託されたプラスミドのサンプルの分譲に係る請求
があった場合には、当該最新の請求を受領後少なくとも
５年間及びいかなる場合にも、寄託の日の後少なくとも
30年間あるいは特許の実施可能な寿命の間のいずれか長
い方の期間の間、寄託された物質の生存させかつ汚染さ
せないでおくために必要なあらゆる注意を払いつつ保管
されることになる。出願人の譲受人は、仮に保管所が要
求された際に、寄託の事情によりサンプルを供給するこ
とができないならば、寄託の代りを入れる義務を認識し
ている。
が寄託の永続かつ特許が付与されるならば公衆が容易に
入手するのを可能にする保管所であると考える。そのよ
うに寄託した物質を公衆が入手し得ることに関する全て
の制限は、最終的に特許が付与された際に除かれること
になる。その物質は特許出願が係属している間は、37CF
R1.14及び35U.S.C.122条で特許局長が受ける権利がある
と決めた者にとって入手可能である。寄託された物質
は、寄託されたプラスミドのサンプルの分譲に係る請求
があった場合には、当該最新の請求を受領後少なくとも
５年間及びいかなる場合にも、寄託の日の後少なくとも
30年間あるいは特許の実施可能な寿命の間のいずれか長
い方の期間の間、寄託された物質の生存させかつ汚染さ
せないでおくために必要なあらゆる注意を払いつつ保管
されることになる。出願人の譲受人は、仮に保管所が要
求された際に、寄託の事情によりサンプルを供給するこ
とができないならば、寄託の代りを入れる義務を認識し
ている。
フロントページの続き (73)特許権者 999999999 オストロフ，ゲアリー アール. アメリカ合衆国 02192 マサチューセ ッツ，ニーダム，ホーソーン アベニュ ー 48 (72)発明者 ロング，スーザン アメリカ合衆国 01880 マサチューセ ッツ，ウェイクフィールド，ウェイブ アベニュー 44 (72)発明者 オストロフ，ゲアリー アール. アメリカ合衆国 02192 マサチューセ ッツ，ニーダム，ホーソーン アベニュ ー 48 (56)参考文献 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏ ｌ．170，Ｎｏ．２，Ｐ．638−645 （1988) Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒ ｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ｏｇｙ，Ｖｏｌ．52，Ｎｏ．６，Ｐ. 1382−1385（1986) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 C12N 1/21 C12N 9/04 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (22)
- 【請求項１】ロードコッカスNCIB 10554、ロードコッ
カスエリトロポリスNCIB9158、ノカルジアエリトロポリ
スATCC17895及びノカルジアエリトロポリスATCC4277よ
りなる群から選択するノカルジオフォーム微生物に由来
するDNA配列を含むクローニングベクターであって、該D
NA配列は、コレステロールオキシダーゼをコードし、且
つ該クローニングベクターが該DNA配列をストレプトミ
セス属の種において発現することができる、当該クロー
ニングベクター。 - 【請求項２】前記ノカルジオフォーム微生物がロードコ
ッカスsp.NCIB10554である請求の範囲第１項記載のクロ
ーニングベクター。 - 【請求項３】前記ストレプトミセス属の種がS.リビダン
スである請求の範囲第１項記載のクローニングベクタ
ー。 - 【請求項４】下記の構造を有するプラスミドpSL81。
- 【請求項５】請求の範囲第１項記載のクローニングベク
ターで形質転換されたストレプトミセス属の種の細胞。 - 【請求項６】請求の範囲第３項記載のクローニングベク
ターで形質転換されたS.リビダンス種の細胞。 - 【請求項７】コレステロールオキシダーゼをコードする
DAN配列を発現させる方法であって、 請求項１のクローニングベクターを準備し、 該クローニングベクターで宿主ストレプトミセス細胞を
形質転換して組換え宿主細胞を得、 該組換え宿主細胞を該DNA配列の発現を可能にする条件
下で培養することを含む方法。 - 【請求項８】請求項１に記載のクローニングベクターで
形質転換した細胞を準備し、 その細胞をコレステロールオキシダーゼをコードする該
DNA配列の発現を可能にする条件下で培養し、 コレステロールオキシダーゼを回収する ことを含むコレステロールオキシダーゼの製造方法。 - 【請求項９】前記ノカルジオフォーム微生物がロードコ
ッカスsp.NCIB10554である請求の範囲第８項記載の方
法。 - 【請求項１０】前記宿主細胞がS.リビダンスである請求
の範囲第８項記載の方法。 - 【請求項１１】前記クローニングベクターが下記の構造
を有するプラスミドpSL81である請求の範囲第８項記載
の方法。 - 【請求項１２】ロードコッカスNCIB 10554、ロードコ
ッカスエリトロポリスNCIB9158、ノカルジアエリトロポ
リスATCC17895及びノカルジアエリトロポリスATCC4277
よりなる群から選択するノカルジオフォーム微生物に由
来する、コレステロールオキシダーゼをコードするDNA
配列で形質転換されたストレプトミセス細胞。 - 【請求項１３】前記DNA配列が下記の配列： を含むアミノ酸配列をコードする請求の範囲第１項記載
のクローニングベクター。 - 【請求項１４】前記DNA配列が下記の配列： を含むアミノ酸配列をコードする請求の範囲第13項記載
のクローニングベクター。 - 【請求項１５】前記DNA配列が下記の配列： を含む請求の範囲第１項記載のクローニングベクター。
- 【請求項１６】前記DNA配列が下記の配列： を含む請求の範囲第15項記載のクローニングベクター。
- 【請求項１７】前記ノカルジオフォーム微生物がR.エリ
トロポリスNCIB9158である請求の範囲第１項記載のクロ
ーニングベクター。 - 【請求項１８】前記ノカルジオフォーム微生物がノカル
ジアエリトロポリスATCC17895である請求の範囲第１項
記載のクローニングベクター。 - 【請求項１９】前記ノカルジオフォーム微生物がノカル
ジアエリトロポリスATCc4277である請求の範囲第１項記
載のクローニングベクター。 - 【請求項２０】更に、ErmEプロモーターを含む請求の範
囲第１項記載のベクター。 - 【請求項２１】更に、aphプロモーターを含む請求の範
囲第１項記載のベクター。 - 【請求項２２】更に、tacプロモーターを含む請求の範
囲第１項記載のベクター。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US26966988A | 1988-11-14 | 1988-11-14 | |
| US269,669 | 1988-11-14 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03503487A JPH03503487A (ja) | 1991-08-08 |
| JP2960775B2 true JP2960775B2 (ja) | 1999-10-12 |
Family
ID=23028204
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2500428A Expired - Lifetime JP2960775B2 (ja) | 1988-11-14 | 1989-11-14 | ノカルジオフォーム微生物由来のｄｎａ配列の発現 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0426768B1 (ja) |
| JP (1) | JP2960775B2 (ja) |
| AT (1) | ATE149207T1 (ja) |
| AU (1) | AU641372B2 (ja) |
| CA (1) | CA1340449C (ja) |
| DE (1) | DE68927802T2 (ja) |
| WO (1) | WO1990005788A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5602017A (en) * | 1990-04-10 | 1997-02-11 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Cholesterol oxidase |
| JPH04218367A (ja) * | 1990-04-10 | 1992-08-07 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 新規コレステロール・オキシダーゼ |
| US5763245A (en) * | 1991-09-23 | 1998-06-09 | Monsanto Company | Method of controlling insects |
| JP3679805B2 (ja) * | 1992-06-10 | 2005-08-03 | 協和醗酵工業株式会社 | コレステロール低減化物質の製造法 |
| ATE446370T1 (de) | 1999-04-12 | 2009-11-15 | Monsanto Technology Llc | Öl, das brassicastanol enthält |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1385319A (en) * | 1971-09-22 | 1975-02-26 | Nat Res Dev | Enzyme preparations |
| SE419903B (sv) * | 1980-03-05 | 1981-08-31 | Enfors Sven Olof | Enzymelektrod |
| US4409326A (en) * | 1980-07-10 | 1983-10-11 | Modrovich Ivan Endre | Stabilized enzymatic solutions and method for determining total cholesterol in human serum |
-
1989
- 1989-09-28 CA CA000614329A patent/CA1340449C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-11-14 AU AU46269/89A patent/AU641372B2/en not_active Ceased
- 1989-11-14 DE DE68927802T patent/DE68927802T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-11-14 AT AT89912918T patent/ATE149207T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-11-14 JP JP2500428A patent/JP2960775B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-11-14 EP EP89912918A patent/EP0426768B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-11-14 WO PCT/US1989/005112 patent/WO1990005788A1/en active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５２，Ｎｏ．６，Ｐ．１３８２−１３８５（１９８６） |
| Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１７０，Ｎｏ．２，Ｐ．６３８−６４５（１９８８） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU641372B2 (en) | 1993-09-23 |
| DE68927802T2 (de) | 1997-06-12 |
| ATE149207T1 (de) | 1997-03-15 |
| EP0426768B1 (en) | 1997-02-26 |
| CA1340449C (en) | 1999-03-16 |
| JPH03503487A (ja) | 1991-08-08 |
| WO1990005788A1 (en) | 1990-05-31 |
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| AU4626989A (en) | 1990-06-12 |
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