JP3399685B2

JP3399685B2 - コレステロールオキシダーゼ活性を有する改変酵素

Info

Publication number: JP3399685B2
Application number: JP04733995A
Authority: JP
Inventors: 西矢　　芳昭; 尚子原田; 和巳山本; 真一手嶋; 重典愛水
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1995-03-07
Filing date: 1995-03-07
Publication date: 2003-04-21
Anticipated expiration: 2018-04-21
Also published as: JPH08242860A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、コレステロールオキシ
ダーゼ活性を有する新規な改変酵素をコードする遺伝子
および該遺伝子から改変酵素を製造する方法ならびに該
製造法から得られた改変酵素に関する。

【０００２】

【従来の技術】コレステロールオキシダーゼ（EC 1.1.
3.6）は、従来からストレプトマイセス属（特開昭６２
−２８５７８９号公報）、ブレビバクテリウム属（特開
平４−２１８３６７号公報）、ロードコッカス属（特開
昭６１−２４７３８１号公報）等の細菌が生産すること
が知られている。これらの細菌より生産されるコレステ
ロールオキシダーゼは、臨床検査用試薬に用いられるこ
とが可能であり、実際にその目的で利用されている。し
かしながら、近年の臨床検査の発展及び液状試薬への移
行により、より安定な、あるいはより信頼性の高いコレ
ステロールオキシダーゼの開発が望まれている。

【０００３】近年、遺伝子組換え技術によるコレステロ
ールオキシダーゼの高効率生産が、ノカルディア属（特
表平３−５０３４８７号公報）、ブレビバクテリウム属
（特開平４−２１０５９２号公報、特開平５−８０７２
６１）、ストレプトマイセス属（特開昭６２−２８５７
８９号公報）、シュウドモナス属（特開平６−１８９７
５４号公報）に属する細菌において報告されている。し
かしながら、生産されたコレステロールオキシダーゼの
基本構造は、天然の細菌から従来の方法にて生産された
コレステロールオキシダーゼと変わるものではなかっ
た。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、天然
に存在するコレステロールオキシダーゼとはアミノ酸構
造（アミノ酸配列）が相違し、コレステロールオキシダ
ーゼ活性を有し、さらに他の理化学的性質が改良された
新規な改変酵素を遺伝子工学的に造成し、提供すること
にある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するため種々検討した結果、ストレプトマイセス
属に属する細菌、特にストレプトマイセスｓｐ．ＳＡ−
ＣＯＯが産生するコレステロールオキシダーゼのアミノ
末端から活性部位に至るアミノ酸配列のうち、少なくと
も一つアミノ酸残基の改変を遺伝子工学的に生じさせる
ことにより、親酵素と実質的に同等のコレステロールオ
キシダーゼ活性を有し、さらに親酵素に比べて熱安定性
が優れた新規酵素を造成できることを見い出し、本発明
を完成するに至った。

【０００６】すなわち本発明はコレステロールオキシダ
ーゼの前駆体タンパク質の一次構造において、アミノ末
端から活性部位に至るアミノ酸配列のうち、少なくとも
一つのアミノ酸残基を置換、挿入あるいは欠失させたア
ミノ酸配列をコードするコレステロールオキシダーゼ活
性を有する改変酵素遺伝子である。

【０００７】本発明の一実施態様はストレプトマイセス
ｓｐ．ＳＡ−ＣＯＯが産生するコレステロールオキシダ
ーゼの前駆体タンパク質の一次構造（配列表・配列番号
１）において、アミノ末端より３５５位に至るアミノ酸
配列のうち、少なくとも一つのアミノ酸残基を欠失させ
た、または該アミノ酸配列のうち、少なくとも一つのア
ミノ酸残基に他のアミノ酸残基を置換させた、または該
アミノ酸配列に少なくとも一つのアミノ酸残基を挿入さ
せたアミノ酸配列をコードするコレステロールオキシダ
ーゼ活性を有する改変酵素遺伝子である。

【０００８】また本発明は上記遺伝子をベクターに組み
込んだ組換え発現ベクターである。

【０００９】さらに本発明は宿主細胞を上記組換え発現
ベクターで形質転換させた形質転換細胞である。

【００１０】本発明は上記形質転換細胞を栄養培地で培
養し、培養物からコレステロールオキシダーゼ活性を有
する改変酵素を採取することを特徴とするコレステロー
ルオキシダーゼ活性を有する改変酵素の製造法である。

【００１１】また本発明は上記製造法により製造された
コレステロールオキシダーゼ活性を有する改変酵素であ
る。

【００１２】さらに本発明は上記コレステロールオキシ
ダーゼ、ペルオキシダーゼおよび過酸化水素検出試薬お
よび必要によりコレステロールエステラーゼを含有する
ことを特徴とするコレステロール測定用試薬である。

【００１３】本発明のコレステロールオキシダーゼ活性
を有する改変酵素は、遺伝子工学的手法を用いることに
より、造成が可能となる。本発明のコレステロールオキ
シダーゼの起源は、好ましく微生物であって、具体的な
例としては、ストレプトマイセス属、ブレビバクテリウ
ム属、ロードコッカス属、ノカルディア属、シュウドモ
ナス属などの細菌が例示される。また、ブレビバクテリ
ウム・ステロリカムの活性部位と補酵素(FAD) 結合部位
は知られている（Journal of Molecular Biology, 219,
533-554, 1991) 。

【００１４】本発明の一例であるストレプトマイセスｓ
ｐ．ＳＡ−ＣＯＯが産生するコレステロールオキシダー
ゼの前駆体タンパク質の一次構造は、配列表・配列番号
１に記載されるアミノ酸配列（５４６個）を有する。ス
トレプトマイセスｓｐ．ＳＡ−ＣＯＯから、自然状態で
は、アミノ末端より４２番目のAla と４３番目のAspに
てプロセッシングが行われ、４３番目のAsp から始まる
５０４個のアミノ酸配列を有する成熟タンパク質が得ら
れていた。また、ブレビバクテリウム・ステロリカムの
コレステロールオキシダーゼの前駆体タンパク質の一次
構造との比較から、活性部位は３５８番目のAsn から５
２２番目のAsn にあり、補酵素の結合部位は５４番目の
Gly から５９番目のAla にある。該アミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡ配列については、配列表・配列番号８に記
載される(Journal of Bacteriology Vol.171, 596-601
(1989)) 。

【００１５】好ましい具体例としては、コレステロール
オキシダーゼの前駆体タンパク質の一次構造（配列表・
配列番号１）において、アミノ末端より９６位から３５
５位に至る、活性部位および補酵素（ＦＡＤ）結合部位
に直接影響を与えない２６０残基（配列表・配列番号１
の96〜355 ）から成るアミノ酸配列セグメントをコード
するコレステロールオキシダーゼ遺伝子（ＤＮＡ配列）
のうち、少なくとも一部分の遺伝子に対し、アミノ酸残
基の置換が生じる部位特異的変異を導入する方法、例え
ばトランスフォーマー・サイトダイレクティッドミュー
タジェネシス・キット（東洋紡製）を用いた部位特異的
変異処理法、アミノ酸残基の挿入に対応する合成ＤＮＡ
を挿入する方法、或いはアミノ酸残基の欠失に対応する
デレーション操作を行う方法などを実施する。

【００１６】本発明の改変酵素遺伝子の一実施態様は、
配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有する
コレステロールオキシダーゼの前駆体タンパク質の一次
構造において、１０３位のセリン残基をスレオニン残基
に置換させたアミノ酸配列（配列表・配列番号２）をコ
ードするコレステロールオキシダーゼ活性を有する改変
酵素遺伝子である。

【００１７】本発明の改変酵素遺伝子の別な実施態様
は、配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有
するコレステロールオキシダーゼの前駆体タンパク質の
一次構造において、１２１位のバリン残基をアラニン残
基に置換させたアミノ酸配列（配列表・配列番号３）を
コードするコレステロールオキシダーゼ活性を有する改
変酵素遺伝子である。

【００１８】本発明の改変酵素遺伝子のさらに別な実施
態様は、配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列
を有するコレステロールオキシダーゼの前駆体タンパク
質の一次構造において、１３５位のアルギニン残基をヒ
スチジン残基に置換させたアミノ酸配列（配列表・配列
番号４）をコードするコレステロールオキシダーゼ活性
を有する改変酵素遺伝子である。

【００１９】本発明の改変酵素遺伝子の一実施態様は、
配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有する
コレステロールオキシダーゼの前駆体タンパク質の一次
構造において、１４５位のバリン残基をグルタミン酸残
基に置換させたアミノ酸配列（配列表・配列番号５）を
コードするコレステロールオキシダーゼ活性を有する改
変酵素遺伝子である。

【００２０】本発明の改変酵素遺伝子の別な実施態様
は、配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有
するコレステロールオキシダーゼの前駆体タンパク質の
一次構造において、１０３位のセリン残基をスレオニン
残基に、および１４５位のバリン残基をグルタミン酸残
基に置換させたアミノ酸配列（配列表・配列番号６）を
コードするコレステロールオキシダーゼ活性を有する改
変酵素遺伝子である。

【００２１】本発明の改変酵素遺伝子のさらに別な実施
態様は、配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列
を有するコレステロールオキシダーゼの前駆体タンパク
質の一次構造において、１０３位のセリン残基をスレオ
ニン残基に、１２１位のバリン残基をアラニン残基に、
および１４５位のバリン残基をグルタミン酸残基に置換
させたアミノ酸配列（配列表・配列番号７）をコードす
るコレステロールオキシダーゼ活性を有する改変酵素遺
伝子である。

【００２２】本発明の組換え発現ベクターは、上記改変
遺伝子をベクターに導入したものである。ベクターとし
ては、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces
lividans) 3130のベクターであるｐＩＪ７２０(Thio Re
sistance, melt),ｐＵＣ１９，ブルースクリプト−ＳＫ
などが例示される。組換え発現ベクターの製造法として
は、染色体ＤＮＡおよびベクターを適切な制限酵素、例
えばＢａｍＨＩなどにより切断した断片をＤＮＡリガー
ゼによりタイゲートする方法などがある。

【００２３】本発明の形質転換細胞は、上記組換え発現
ベクターで宿主細胞を形質転換したものである。宿主細
胞としては、ストレプトマイセス・リビダンス(Strepto
myces lividans) 1326などが例示される。形質転換法と
しては、トンプソン等の方法 (ジャーナル・オブ・バク
テリオロジー、 151巻、668-677 頁、1982年) などがあ
る。

【００２４】本発明のコレステロールオキシダーゼを製
造する具体的な方法としては、例えば配列表・配列番号
２、３、４、５、６または７に記載のアミノ酸配列をコ
ードする遺伝子を組み込んだ組換え発現ベクターで形質
転換した宿主細胞を栄養培地で培養し、該培養物から改
変コレステロールオキシダーゼを採取する。

【００２５】栄養培地とは炭素源、窒素源、無機イオ
ン、更に必要に応じて硝酸塩、リン酸塩等を含有するも
のである。炭素源としては、澱粉あるいは澱粉加水分解
物、糖密、ペプトン類等が用いられる。窒素源として
は、ポリペプトン、トリプトン、肉エキス、酵母エキス
等が使用できる。培養は好気的条件下で培地のｐＨおよ
び温度を適宜調節することが望ましいが、必ずしもその
必要はない。培養時間は培養物のコレステロールオキシ
ダーゼ活性が最高になるところまで行われる。

【００２６】培養物より、コレステロールオキシダーゼ
活性を有する改変酵素を精製するには、以下の様な方法
が用いられる。培養物を遠心分離して集菌し、次いでこ
れを溶菌させることによってコレステロールオキシダー
ゼ含有溶菌物を調製する。溶菌方法としては、例えばリ
ゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素によ
る処理や超音波破砕、フレンチプレス処理等の物理的破
砕法が好適である。コレステロールオキシダーゼ活性を
有する新規酵素が培地上清に分泌生産される場合は、上
記溶菌操作は不要であり、培養物を遠心分離して上清を
調製すればよい。

【００２７】このようにして得られた溶菌物、或いは上
清を硫安沈澱分画し、脱塩した後、DEAE Sepharose CL-
6Bカラム（ファルマシアLKB）等のイオン交換により分
離を行う担体にかけて分画を行う。このステップは省略
してしまうことも可能である。また、分画したサンプル
は、疎水性クロマトグラフィーや高速液体クロマトグラ
フィー等を用い、さらに高純度とすることが可能であ
る。この精製標品は、SDS ポリアクリルアミドゲル電気
泳動(SDS-PAGE)で単一バンドになっている。なお、カラ
ムクロマトグラフィーの組合せは上記ステップに限ら
ず、その組合せ、種類を変えることは可能である。

【００２８】本発明のコレステロールオキシダーゼ活性
を有する改変酵素は上記製造法により製造されたもので
ある。該方法により生産される酵素は、形質転換された
宿主細胞壁によりプロセッシングを受けるか、あるいは
受けないタンパクである。したがって、本発明のコレス
テロール活性を有する改変酵素の一例は、ストレプトマ
イセスｓｐ．ＳＡ−ＣＯＯが産生するコレステロールオ
キシダーゼの前駆体タンパク質の一次構造（配列表・配
列番号１）において、アミノ末端より３５５位に至るア
ミノ酸配列のうち、少なくとも一つのアミノ酸残基を欠
失させた、または該アミノ酸配列のうち、少なくも一つ
のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換させた、また
は該アミノ酸配列中に少なくとも一つのアミノ酸残基を
挿入させたアミノ酸配列を有する前駆体タンパクから、
形質転換細胞により、プロセンシングを受けた、あるい
は受けないタンパクである。

【００２９】本発明の改変酵素の一実施態様は、配列表
・配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するコレス
テロールオキシダーゼの前駆体タンパク質の一次構造に
おいて、１０３位のセリン残基、１２１位のバリン残
基、１３５位のアルギニン残基および１４５位のバリン
残基のうち、少なくともひとつの部位におけるアミノ酸
残基を他のアミノ酸残基に置換させたアミノ酸配列を有
する前駆体タンパクから、形質転換細胞により、プロセ
ッシングを受けた、あるいは受けないコレステロールオ
キシダーゼ活性を有する改変酵素である。

【００３０】本発明の改変酵素の別な実施態様は、配列
表・配列番号２、３、４、５、６または７に記載された
アミノ酸配列を有する前駆体タンパクから、形質転換細
胞により、プロセッシングを受けた、あるいは受けない
コレステロールオキシダーゼ活性を有する改変酵素であ
る。

【００３１】また本発明は上記コレステロールオキシダ
ーゼ活性を有する改変酵素、ペルオキシダーゼおよび過
酸化水素検出試薬および必要によりコレステロールエス
テラーゼ、を含有することを特徴とするコレステロール
測定用試薬である。過酸化水素検出試薬としては、4-ア
ミノアンチピリンおよびフェノール誘導体またはアニリ
ン誘導体など周知のものが挙げられる。

【００３２】本発明のコレステロールオキシダーゼ活性
を有する改変酵素の一例は、親酵素であるストレプトマ
イセス・エスピーＳＡ−ＣＯＯ由来のコレステロールオ
キシダーゼ（特開昭６２−２８５７８９号公報）と同等
の酵素活性を有し、図４に示すように、親酵素と比べ
て、熱安定性に優れている。

【００３３】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。なお、実施例中、コレステロールオキシダーゼの活
性測定は以下のように行なった。すなわち、87mMリン酸
カリウム緩衝液(pH7.0) 、0.89mMコレステロール、1.4m
M４−アミノアンチピリン、21mMフェノール、0.34% ト
リトンＸ−１００、64mMコール酸ナトリウム、33μg/ml
ＢＳＡ、5U/ml ペルオキシダーゼ中で酵素を３７℃、３
〜４分反応させ、500nm における吸光度の増加を測定す
る。酵素活性の１単位は、この条件下で１分間当たり１
マイクロモルの過酸化水素を生成する酵素量とした。

【００３４】参考例１（１）コレステロールオキシダーゼ生産能の遺伝情報を
もつ染色体ＤＮＡの調製コレステロールオキシダーゼを生産する能力を有するス
トレプトマイセス(Streptomuces)ＳＰ．ＳＡ−ＣＯＯ株
をグルコース１％、酵母エキス0.2 ％、ＮａＣｌ 0.5
％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０２５％、ペプトン 0.4
％、牛肉エキス 0.2％、ｐＨ 7.0で３０℃、３日間培養
した菌体を集菌後、Mumur 法で染色体ＤＮＡを抽出、精
製し、染色体ＤＮＡ20mgを調製した。（２）染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入（１）で得た染色体ＤＮＡをとり、制限酵素BanHI を加
え部分消化した後、(10 〜30％）蔗糖密度勾配遠心法
(32,000tpm ×22Hr、４℃) を行い、分画して５Ｋｂ以
上のフラグメントを集めてエタノール沈殿をおこない、
BamHI 消化ＤＮＡを得た。他方、ストレプトマイセス・
リビダンス(Sterptomyces lividans)3130 のベクターで
あるpIJ702(Thio Resistance, mel ＋) 10μg をBamHI
15単位で37℃、１時間反応させた。フェノール処理を２
回繰り返しエーテルでフェノールを除去した後、−20℃
で酢酸ナトリウム0.1 容量と95% エタノール２容量を添
加してエタノール沈殿させた。ＤＮＡ沈殿物を４℃、1
2,000×Ｇで10分間遠心分離によって集めた。沈殿物を
ＴＥ緩衝液17μl 中、再溶解した。この試料をライゲー
ションに用いた。次に前記したBamHI 染色体ＤＮＡ消化
物とBamHI で線状化したベクターを混合し、Ｔ₄ファー
ジ由来のＤＮＡリガーゼ１単位を加え、反応液15℃、24
時間保持し、以後の形質転換に用いるライゲーション混
合液とした。

【００３５】（３）コレステロールオキシダーゼの生産
に関与した遺伝情報を担うプラスミドによる形質転換ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces livida
ns) 1326をＲ₂培地（ブドウ糖 1.0％、酵母エキス 0.2
％、ペプトン 0.4％、牛肉エキス 0.4％、ＮａＣｌ 0.5
％、ＭｇＣＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.025％、グリシン 0.5％、
ｐＨ７．０からなる培地）で28℃、30時間生育させた
後、次いでこれをプロトプラスト化した後、（２）で得
られたライゲーション混合液を添加して形質転換体を得
た。形質転換及び再生方法はトンプソン等の方法によっ
た〔トンプソン他、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ
ー、151 巻、668 〜677 頁、1982年〕。即ち、形質転換
後のプロトプラストは、Ｒ２ＹＥ再生培地（Ｒ２培地に
酵母エキス 0.5％添加したもの）に偏平培養した。28℃
で24時間培養後、チオストレプトン50μg/mlを含む 0.4
％ Difco NAagr培地 2.5mlを重層し、さらに28℃で培養
を続けた。

【００３６】次いで8,000 個のThio耐性コロニーより１
株のクローンが得られた。クローンをストレプトマイセ
ス・リビダンス(Streptmyces lividans)1326(pCO-1) と
した。なお、組換え頻度は約13％であった。得られたク
ローンよりプラスミド(pCO-1) を分離し、各種制限酵素
で消化した（図１）。次いでPstIによる欠失法により2.
1 Kbp 以内に本酵素生産遺伝子の必須領域があることを
明らかにした。なお、この領域を含むPstIフラグメント
をもつプラスミドをｐＣＯ２と命名した。同様にSacIに
よる欠失法によりｐＣＯ３と命名したプラスミドを得た
（図１）。さらにｐＣＯ２及びｐＣＯ３を形質転換して
ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces livida
ns)1326(pCO-2)及びストレプトマイセス・リビダンス(S
treptomyces lividans) 1326(pCO-3)(生命工学工業研究
所寄託番号第8789号) を得た。

【００３７】参考例２コレステロールオキシダーゼ遺伝子発現ベクターpCO-11
7 の構築プラスミドpUC19(東洋紡製) を制限酵素EcoRI とSphIで
完全分解し、ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー381Aにて合
成した配列表の配列番号９記載のＤＮＡとT4 DNAリガー
ゼにて連結した。これによって作成したプラスミドpCO-
105 を、さらにSphIで分解し、コレステロールオキシダ
ーゼ遺伝子を有するプラスミドpCO-3 をSphIで切断して
得られる断片と連結した。この操作で、合成DNA を含む
コレステロールオキシダーゼ遺伝子を有するプラスミド
pCO-104 が作成された。さらに、pCO-104 を制限酵素Ec
oRI とHindIII で切断後、コレステロールオキシダーゼ
遺伝子を有する断片を抽出し、発現ベクターpKK223-3
(ファルマシア製) をEcoRIとHindIII で切断したものと
連結することにより、コレステロールオキシダーゼ遺伝
子発現ベクターpCO-117 を作成することができた（図
２）。

【００３８】実施例１コレステロールオキシダーゼ遺伝子発現ベクターpCO110
の構築コレステロールオキシダーゼ遺伝子発現ベクターpCO110
は、図３に記載の流れに沿って構築した。すなわち、参
考例１および２にて作成したストレプトマイセス・エス
ピーＳＡ−ＣＯＯのコレステロールオキシダーゼ遺伝子
を有するプラスミドpCO117を制限酵素NruIとBamHI で完
全分解し、Klenow fragment にて末端を平滑化した後、
T4DNA リガーゼにて自己連結して、プラスミドpCO111を
作成した（図３）。これによって作成したプラスミドpC
O111をBstEIIで分解して得られる、0.85Kbの断片とpBlu
escript-SK（東洋紡製）のEcoRV 消化物を、T4DNA リガ
ーゼにて連結し、プラスミドpBSCO1を作成した（図
３）。プラスミドpCO111とプラスミドpBSCO1を制限酵素
ApaI及びHindIII にて、それぞれ完全分解し、T4DNA リ
ガーゼにて連結することにより、コレステロールオキシ
ダーゼ遺伝子発現ベクターpCO110を作成することが出来
た（図３）。

【００３９】実施例２新規コレステロールオキシダーゼ遺伝子発現ベクターの
構築コレステロールオキシダーゼ遺伝子発現ベクターpCO110
（図３）の制限酵素SphI切断部位からApaI切断部位に至
る、約0.8Kb のＤＮＡ断片をターゲットとし、配列表の
配列番号１に記載されたストレプトマイセス・エスピー
ＳＡ−ＣＯＯのコレステロールオキシダーゼ前駆体タン
パク質の一次構造において、１０３位のセリン残基のス
レオニン残基への置換（遺伝子 AGCから ACCへ置換）、
１２１位のバリン残基のアラニン残基への置換（遺伝子
GTCからGCC へ置換）、１３５位のアルギニン残基のヒ
スチジン残基への置換（遺伝子 CGTからCAT へ置換）、
１４５位のバリン残基のグルタミン酸残基への置換（遺
伝子 GTGからGAG へ置換）を、トランスフォーマー・サ
イトダイレクティッドミュータジェネシス・キット（東
洋紡製）を用いた部位特異的変異処理を、そのプロトコ
ールに従って施すことにより、それぞれ生じさせ、Ｓ１
０３Ｔ、Ｖ１２１Ａ、Ｒ１３５Ｈ、Ｖ１４５Ｅの４種類
の新規コレステロールオキシダーゼの生産能力を有する
改変コレステロールオキシダーゼ遺伝子発現ベクター、
pCO110-S103T、pCO110-V121A、pCO110-R135H、pCO110-V
145Eをそれぞれ構築した。

【００４０】また、同様の手法により、コレステロール
オキシダーゼ前駆体タンパク質の一次構造において、１
０３位のセリン残基のスレオニン残基への置換及び１４
５位のバリン残基のグルタミン酸残基への置換を施し、
改変コレステロールオキシダーゼ（Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４
５Ｅ）の生産能力を有する改変コレステロールオキシダ
ーゼ遺伝子発現ベクター、pCO110-S103T+V145Eを構築し
た。

【００４１】さらに、コレステロールオキシダーゼ前駆
体タンパク質の一次構造において、１０３位のセリン残
基のスレオニン残基への置換及び１２１位のバリン残基
のアラニン残基への置換及び１４５位のバリン残基のグ
ルタミン酸残基への置換を施し、新規コレステロールオ
キシダーゼ（Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１２１Ａ＋Ｖ１４５Ｅ）の
生産能力を有する新規コレステロールオキシダーゼ遺伝
子発現ベクター、pCO110-S103T+V121A+V145Eも構築し
た。

【００４２】それぞれの改変コレステロールオキシダー
ゼ前駆体タンパク質の一次構造は、配列表の配列番号２
（Ｓ１０３Ｔ）、３（Ｖ１２１Ａ）、４（Ｒ１３５
Ｈ）、５（Ｖ１４５Ｅ）、６（Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５
Ｅ）、７（Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１２１Ａ＋Ｖ１４５Ｅ）にそ
れぞれ記載した。

【００４３】実施例３改変コレステロールオキシダーゼの生産と特性評価エシェリヒアコリーJM109 のコンピテントセル（東洋紡
製）を、計６種類の新規コレステロールオキシダーゼ遺
伝子発現ベクターおよびプラスミドpCO110でそれぞれ形
質転換することにより、改変コレステロールオキシダー
ゼ生産菌株６種類及び親酵素生産菌株を造成した。これ
らの菌株をＬ培地（1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、
0.5%塩化ナトリウム）でそれぞれ37℃、12時間培養し、
約100-500mU/mlのコレステロールオキシダーゼ活性を得
た。

【００４４】上記方法にて培養した菌体を集め、10mMリ
ン酸カリウム緩衝液(pH7.0) に再懸濁後、ポリエチレン
イミンを用いた除核酸、硫酸アンモニウムを用いた塩析
により、コレステロールオキシダーゼを分画した。さら
にＤＥＡＥ−セルロースイオン交換クロマトグラフィー
およびフェニルセファロース疎水クロマトグラフィーを
実施し、コレステロールオキシダーゼを精製した。全６
種類の新規コレステロールオキシダーゼ酵素標品の特性
評価を行ったところ、親酵素と実質的に同等のコレステ
ロールオキシダーゼ活性を有し、表１に示すように、ミ
ハエリス定数も親酵素と同等のレベルであった。しかし
ながら、図４に示すように、親酵素と比べ、熱安定性が
明らかに向上しており、酵素性能の向上が認められた。

【００４５】

【表１】

【００４６】

【発明の効果】本発明のコレステロールオキシダーゼ活
性を有する改変酵素は、コレステロールオキシダーゼの
前駆体タンパク質の一次構造において、アミノ末端から
活性部位および補酵素結合部位に至るアミノ酸配列のう
ち、少なくとも一つのアミノ酸残基を置換、挿入または
欠失することにより、親酵素に対し熱安定性が向上した
酵素が得られる。従って、本発明のコレステロールオキ
シダーゼ活性を有する改変酵素を臨床検査用試薬等に用
いることにより、より安定性の高い、或いはより信頼性
の高いコレステロール活性測定を行うことが可能にな
る。

【００４７】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：５４６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質起源生物名：ストレプトマイセス・エスピー(Streptomyces
sp.) 株名：ＳＡ−ＣＯＯ配列 Met Thr Ala Gln Gln His Leu Ser Arg Arg Arg Met Leu Gly Met Ala 1 5 10 15 Ala Phe Gly Ala Ala Ala Leu Ala Gly Gly Thr Thr Ile Ala Ala Pro 20 25 30 Arg Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ser Ala Ala Asp Asn Gly Gly Tyr Val 35 40 45 Pro Ala Val Val Ile Gly Thr Gly Tyr Gly Ala Ala Val Ser Ala Leu 50 55 60 Arg Leu Gly Glu Ala Gly Val Gln Thr Leu Met Leu Glu Met Gly Gln 65 70 75 80 Leu Trp Asn Gln Pro Gly Pro Asp Gly Asn Ile Phe Cys Gly Met Leu 85 90 95 Asn Pro Asp Lys Arg Ser Ser Trp Phe Lys Asn Arg Thr Glu Ala Pro 100 105 110 Leu Gly Ser Phe Leu Trp Leu Asp Val Val Asn Arg Asn Ile Asp Pro 115 120 125 Tyr Ala Gly Val Leu Asp Arg Val Asn Tyr Asp Gln Met Ser Val Tyr 130 135 140 Val Gly Arg Gly Val Gly Gly Gly Ser Leu Val Asn Gly Gly Met Ala 145 150 155 160 Val Glu Pro Lys Arg Ser Tyr Phe Glu Glu Ile Leu Pro Arg Val Asp 165 170 175 Ser Ser Glu Met Tyr Asp Arg Tyr Phe Pro Arg Ala Asn Ser Met Leu 180 185 190 Arg Val Asn His Ile Asp Thr Lys Trp Phe Glu Asp Thr Glu Trp Tyr 195 200 205 Lys Phe Ala Arg Val Ser Arg Glu Gln Ala Gly Lys Ala Gly Leu Gly 210 215 220 Thr Val Phe Val Pro Asn Val Tyr Asp Phe Gly Tyr Met Gln Arg Glu 225 230 235 240 Ala Ala Gly Glu Val Pro Lys Ser Ala Leu Ala Thr Glu Val Ile Tyr 245 250 255 Gly Asn Asn His Gly Lys Gln Ser Leu Asp Lys Thr Tyr Leu Ala Ala 260 265 270 Ala Leu Gly Thr Gly Lys Val Thr Ile Gln Thr Leu His Gln Val Lys 275 280 285 Thr Ile Arg Gln Thr Lys Asp Gly Gly Tyr Ala Leu Thr Val Glu Gln 290 295 300 Lys Asp Thr Asp Gly Lys Leu Leu Ala Thr Lys Glu Ile Ser Cys Arg 305 310 315 320 Tyr Leu Phe Leu Gly Ala Gly Ser Leu Gly Ser Thr Glu Leu Leu Val 325 330 335 Arg Ala Arg Asp Thr Gly Thr Leu Pro Asn Leu Asn Ser Glu Val Gly 340 345 350 Ala Gly Trp Gly Pro Asn Gly Asn Ile Met Thr Ala Arg Ala Asn His 355 360 365 Met Trp Asn Pro Thr Gly Ala His Gln Ser Ser Ile Pro Ala Leu Gly 370 375 380 Ile Asp Ala Trp Asp Asn Ser Asp Ser Ser Val Phe Ala Glu Ile Ala 385 390 395 400 Pro Met Pro Ala Gly Leu Glu Thr Trp Val Ser Leu Tyr Leu Ala Ile 405 410 415 Thr Lys Asn Pro Gln Arg Gly Thr Phe Val Tyr Asp Ala Ala Thr Asp 420 425 430 Arg Ala Lys Leu Asn Trp Thr Arg Asp Gln Asn Ala Pro Ala Val Asn 435 440 445 Ala Ala Lys Ala Leu Phe Asp Arg Ile Asn Lys Ala Asn Gly Thr Ile 450 455 460 Tyr Arg Tyr Asp Leu Phe Gly Thr Gln Leu Lys Ala Phe Ala Asp Asp 465 470 475 480 Phe Cys Tyr His Pro Leu Gly Gly Cys Val Leu Gly Lys Ala Thr Asp 485 490 495 Asp Tyr Gly Arg Val Ala Gly Tyr Lys Asn Leu Tyr Val Thr Asp Gly 500 505 510 Ser Leu Ile Pro Gly Ser Val Gly Val Asn Pro Phe Val Thr Ile Thr 515 520 525 Ala Leu Ala Glu Arg Asn Val Glu Arg Ile Ile Lys Gln Asp Val Thr 530 535 540 Ala Ser 545

【００４８】配列番号：２配列の長さ：５４６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質起源生物名：ストレプトマイセス・エスピー(Streptomycess
p.) 株名：ＳＡ−ＣＯＯ配列 Met Thr Ala Gln Gln His Leu Ser Arg Arg Arg Met Leu Gly Met Ala 1 5 10 15 Ala Phe Gly Ala Ala Ala Leu Ala Gly Gly Thr Thr Ile Ala Ala Pro 20 25 30 Arg Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ser Ala Ala Asp Asn Gly Gly Tyr Val 35 40 45 Pro Ala Val Val Ile Gly Thr Gly Tyr Gly Ala Ala Val Ser Ala Leu 50 55 60 Arg Leu Gly Glu Ala Gly Val Gln Thr Leu Met Leu Glu Met Gly Gln 65 70 75 80 Leu Trp Asn Gln Pro Gly Pro Asp Gly Asn Ile Phe Cys Gly Met Leu 85 90 95 Asn Pro Asp Lys Arg Ser Thr Trp Phe Lys Asn Arg Thr Glu Ala Pro 100 105 110 Leu Gly Ser Phe Leu Trp Leu Asp Val Val Asn Arg Asn Ile Asp Pro 115 120 125 Tyr Ala Gly Val Leu Asp Arg Val Asn Tyr Asp Gln Met Ser Val Tyr 130 135 140 Val Gly Arg Gly Val Gly Gly Gly Ser Leu Val Asn Gly Gly Met Ala 145 150 155 160 Val Glu Pro Lys Arg Ser Tyr Phe Glu Glu Ile Leu Pro Arg Val Asp 165 170 175 Ser Ser Glu Met Tyr Asp Arg Tyr Phe Pro Arg Ala Asn Ser Met Leu 180 185 190 Arg Val Asn His Ile Asp Thr Lys Trp Phe Glu Asp Thr Glu Trp Tyr 195 200 205 Lys Phe Ala Arg Val Ser Arg Glu Gln Ala Gly Lys Ala Gly Leu Gly 210 215 220 Thr Val Phe Val Pro Asn Val Tyr Asp Phe Gly Tyr Met Gln Arg Glu 225 230 235 240 Ala Ala Gly Glu Val Pro Lys Ser Ala Leu Ala Thr Glu Val Ile Tyr 245 250 255 Gly Asn Asn His Gly Lys Gln Ser Leu Asp Lys Thr Tyr Leu Ala Ala 260 265 270 Ala Leu Gly Thr Gly Lys Val Thr Ile Gln Thr Leu His Gln Val Lys 275 280 285 Thr Ile Arg Gln Thr Lys Asp Gly Gly Tyr Ala Leu Thr Val Glu Gln 290 295 300 Lys Asp Thr Asp Gly Lys Leu Leu Ala Thr Lys Glu Ile Ser Cys Arg 305 310 315 320 Tyr Leu Phe Leu Gly Ala Gly Ser Leu Gly Ser Thr Glu Leu Leu Val 325 330 335 Arg Ala Arg Asp Thr Gly Thr Leu Pro Asn Leu Asn Ser Glu Val Gly 340 345 350 Ala Gly Trp Gly Pro Asn Gly Asn Ile Met Thr Ala Arg Ala Asn His 355 360 365 Met Trp Asn Pro Thr Gly Ala His Gln Ser Ser Ile Pro Ala Leu Gly 370 375 380 Ile Asp Ala Trp Asp Asn Ser Asp Ser Ser Val Phe Ala Glu Ile Ala 385 390 395 400 Pro Met Pro Ala Gly Leu Glu Thr Trp Val Ser Leu Tyr Leu Ala Ile 405 410 415 Thr Lys Asn Pro Gln Arg Gly Thr Phe Val Tyr Asp Ala Ala Thr Asp 420 425 430 Arg Ala Lys Leu Asn Trp Thr Arg Asp Gln Asn Ala Pro Ala Val Asn 435 440 445 Ala Ala Lys Ala Leu Phe Asp Arg Ile Asn Lys Ala Asn Gly Thr Ile 450 455 460 Tyr Arg Tyr Asp Leu Phe Gly Thr Gln Leu Lys Ala Phe Ala Asp Asp 465 470 475 480 Phe Cys Tyr His Pro Leu Gly Gly Cys Val Leu Gly Lys Ala Thr Asp 485 490 495 Asp Tyr Gly Arg Val Ala Gly Tyr Lys Asn Leu Tyr Val Thr Asp Gly 500 505 510 Ser Leu Ile Pro Gly Ser Val Gly Val Asn Pro Phe Val Thr Ile Thr 515 520 525 Ala Leu Ala Glu Arg Asn Val Glu Arg Ile Ile Lys Gln Asp Val Thr 530 535 540 Ala Ser 545

【００４９】配列番号：３配列の長さ：５４６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質起源生物名：ストレプトマイセス・エスピー(Streptomycess
p.) 株名：ＳＡ−ＣＯＯ配列 Met Thr Ala Gln Gln His Leu Ser Arg Arg Arg Met Leu Gly Met Ala 1 5 10 15 Ala Phe Gly Ala Ala Ala Leu Ala Gly Gly Thr Thr Ile Ala Ala Pro 20 25 30 Arg Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ser Ala Ala Asp Asn Gly Gly Tyr Val 35 40 45 Pro Ala Val Val Ile Gly Thr Gly Tyr Gly Ala Ala Val Ser Ala Leu 50 55 60 Arg Leu Gly Glu Ala Gly Val Gln Thr Leu Met Leu Glu Met Gly Gln 65 70 75 80 Leu Trp Asn Gln Pro Gly Pro Asp Gly Asn Ile Phe Cys Gly Met Leu 85 90 95 Asn Pro Asp Lys Arg Ser Ser Trp Phe Lys Asn Arg Thr Glu Ala Pro 100 105 110 Leu Gly Ser Phe Leu Trp Leu Asp Ala Val Asn Arg Asn Ile Asp Pro 115 120 125 Tyr Ala Gly Val Leu Asp Arg Val Asn Tyr Asp Gln Met Ser Val Tyr 130 135 140 Val Gly Arg Gly Val Gly Gly Gly Ser Leu Val Asn Gly Gly Met Ala 145 150 155 160 Val Glu Pro Lys Arg Ser Tyr Phe Glu Glu Ile Leu Pro Arg Val Asp 165 170 175 Ser Ser Glu Met Tyr Asp Arg Tyr Phe Pro Arg Ala Asn Ser Met Leu 180 185 190 Arg Val Asn His Ile Asp Thr Lys Trp Phe Glu Asp Thr Glu Trp Tyr 195 200 205 Lys Phe Ala Arg Val Ser Arg Glu Gln Ala Gly Lys Ala Gly Leu Gly 210 215 220 Thr Val Phe Val Pro Asn Val Tyr Asp Phe Gly Tyr Met Gln Arg Glu 225 230 235 240 Ala Ala Gly Glu Val Pro Lys Ser Ala Leu Ala Thr Glu Val Ile Tyr 245 250 255 Gly Asn Asn His Gly Lys Gln Ser Leu Asp Lys Thr Tyr Leu Ala Ala 260 265 270 Ala Leu Gly Thr Gly Lys Val Thr Ile Gln Thr Leu His Gln Val Lys 275 280 285 Thr Ile Arg Gln Thr Lys Asp Gly Gly Tyr Ala Leu Thr Val Glu Gln 290 295 300 Lys Asp Thr Asp Gly Lys Leu Leu Ala Thr Lys Glu Ile Ser Cys Arg 305 310 315 320 Tyr Leu Phe Leu Gly Ala Gly Ser Leu Gly Ser Thr Glu Leu Leu Val 325 330 335 Arg Ala Arg Asp Thr Gly Thr Leu Pro Asn Leu Asn Ser Glu Val Gly 340 345 350 Ala Gly Trp Gly Pro Asn Gly Asn Ile Met Thr Ala Arg Ala Asn His 355 360 365 Met Trp Asn Pro Thr Gly Ala His Gln Ser Ser Ile Pro Ala Leu Gly 370 375 380 Ile Asp Ala Trp Asp Asn Ser Asp Ser Ser Val Phe Ala Glu Ile Ala 385 390 395 400 Pro Met Pro Ala Gly Leu Glu Thr Trp Val Ser Leu Tyr Leu Ala Ile 405 410 415 Thr Lys Asn Pro Gln Arg Gly Thr Phe Val Tyr Asp Ala Ala Thr Asp 420 425 430 Arg Ala Lys Leu Asn Trp Thr Arg Asp Gln Asn Ala Pro Ala Val Asn 435 440 445 Ala Ala Lys Ala Leu Phe Asp Arg Ile Asn Lys Ala Asn Gly Thr Ile 450 455 460 Tyr Arg Tyr Asp Leu Phe Gly Thr Gln Leu Lys Ala Phe Ala Asp Asp 465 470 475 480 Phe Cys Tyr His Pro Leu Gly Gly Cys Val Leu Gly Lys Ala Thr Asp 485 490 495 Asp Tyr Gly Arg Val Ala Gly Tyr Lys Asn Leu Tyr Val Thr Asp Gly 500 505 510 Ser Leu Ile Pro Gly Ser Val Gly Val Asn Pro Phe Val Thr Ile Thr 515 520 525 Ala Leu Ala Glu Arg Asn Val Glu Arg Ile Ile Lys Gln Asp Val Thr 530 535 540 Ala Ser 545

【００５０】配列番号：４配列の長さ：５４６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質起源生物名：ストレプトマイセス・エスピー(Streptomyces
sp.) 株名：ＳＡ−ＣＯＯ配列 Met Thr Ala Gln Gln His Leu Ser Arg Arg Arg Met Leu Gly Met Ala 1 5 10 15 Ala Phe Gly Ala Ala Ala Leu Ala Gly Gly Thr Thr Ile Ala Ala Pro 20 25 30 Arg Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ser Ala Ala Asp Asn Gly Gly Tyr Val 35 40 45 Pro Ala Val Val Ile Gly Thr Gly Tyr Gly Ala Ala Val Ser Ala Leu 50 55 60 Arg Leu Gly Glu Ala Gly Val Gln Thr Leu Met Leu Glu Met Gly Gln 65 70 75 80 Leu Trp Asn Gln Pro Gly Pro Asp Gly Asn Ile Phe Cys Gly Met Leu 85 90 95 Asn Pro Asp Lys Arg Ser Ser Trp Phe Lys Asn Arg Thr Glu Ala Pro 100 105 110 Leu Gly Ser Phe Leu Trp Leu Asp Val Val Asn Arg Asn Ile Asp Pro 115 120 125 Tyr Ala Gly Val Leu Asp His Val Asn Tyr Asp Gln Met Ser Val Tyr 130 135 140 Val Gly Arg Gly Val Gly Gly Gly Ser Leu Val Asn Gly Gly Met Ala 145 150 155 160 Val Glu Pro Lys Arg Ser Tyr Phe Glu Glu Ile Leu Pro Arg Val Asp 165 170 175 Ser Ser Glu Met Tyr Asp Arg Tyr Phe Pro Arg Ala Asn Ser Met Leu 180 185 190 Arg Val Asn His Ile Asp Thr Lys Trp Phe Glu Asp Thr Glu Trp Tyr 195 200 205 Lys Phe Ala Arg Val Ser Arg Glu Gln Ala Gly Lys Ala Gly Leu Gly 210 215 220 Thr Val Phe Val Pro Asn Val Tyr Asp Phe Gly Tyr Met Gln Arg Glu 225 230 235 240 Ala Ala Gly Glu Val Pro Lys Ser Ala Leu Ala Thr Glu Val Ile Tyr 245 250 255 Gly Asn Asn His Gly Lys Gln Ser Leu Asp Lys Thr Tyr Leu Ala Ala 260 265 270 Ala Leu Gly Thr Gly Lys Val Thr Ile Gln Thr Leu His Gln Val Lys 275 280 285 Thr Ile Arg Gln Thr Lys Asp Gly Gly Tyr Ala Leu Thr Val Glu Gln 290 295 300 Lys Asp Thr Asp Gly Lys Leu Leu Ala Thr Lys Glu Ile Ser Cys Arg 305 310 315 320 Tyr Leu Phe Leu Gly Ala Gly Ser Leu Gly Ser Thr Glu Leu Leu Val 325 330 335 Arg Ala Arg Asp Thr Gly Thr Leu Pro Asn Leu Asn Ser Glu Val Gly 340 345 350 Ala Gly Trp Gly Pro Asn Gly Asn Ile Met Thr Ala Arg Ala Asn His 355 360 365 Met Trp Asn Pro Thr Gly Ala His Gln Ser Ser Ile Pro Ala Leu Gly 370 375 380 Ile Asp Ala Trp Asp Asn Ser Asp Ser Ser Val Phe Ala Glu Ile Ala 385 390 395 400 Pro Met Pro Ala Gly Leu Glu Thr Trp Val Ser Leu Tyr Leu Ala Ile 405 410 415 Thr Lys Asn Pro Gln Arg Gly Thr Phe Val Tyr Asp Ala Ala Thr Asp 420 425 430 Arg Ala Lys Leu Asn Trp Thr Arg Asp Gln Asn Ala Pro Ala Val Asn 435 440 445 Ala Ala Lys Ala Leu Phe Asp Arg Ile Asn Lys Ala Asn Gly Thr Ile 450 455 460 Tyr Arg Tyr Asp Leu Phe Gly Thr Gln Leu Lys Ala Phe Ala Asp Asp 465 470 475 480 Phe Cys Tyr His Pro Leu Gly Gly Cys Val Leu Gly Lys Ala Thr Asp 485 490 495 Asp Tyr Gly Arg Val Ala Gly Tyr Lys Asn Leu Tyr Val Thr Asp Gly 500 505 510 Ser Leu Ile Pro Gly Ser Val Gly Val Asn Pro Phe Val Thr Ile Thr 515 520 525 Ala Leu Ala Glu Arg Asn Val Glu Arg Ile Ile Lys Gln Asp Val Thr 530 535 540 Ala Ser 545

【００５１】配列番号：５配列の長さ：５４６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質起源生物名：ストレプトマイセス・エスピー(Streptomyces
sp.) 株名：ＳＡ−ＣＯＯ配列 Met Thr Ala Gln Gln His Leu Ser Arg Arg Arg Met Leu Gly Met Ala 1 5 10 15 Ala Phe Gly Ala Ala Ala Leu Ala Gly Gly Thr Thr Ile Ala Ala Pro 20 25 30 Arg Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ser Ala Ala Asp Asn Gly Gly Tyr Val 35 40 45 Pro Ala Val Val Ile Gly Thr Gly Tyr Gly Ala Ala Val Ser Ala Leu 50 55 60 Arg Leu Gly Glu Ala Gly Val Gln Thr Leu Met Leu Glu Met Gly Gln 65 70 75 80 Leu Trp Asn Gln Pro Gly Pro Asp Gly Asn Ile Phe Cys Gly Met Leu 85 90 95 Asn Pro Asp Lys Arg Ser Ser Trp Phe Lys Asn Arg Thr Glu Ala Pro 100 105 110 Leu Gly Ser Phe Leu Trp Leu Asp Val Val Asn Arg Asn Ile Asp Pro 115 120 125 Tyr Ala Gly Val Leu Asp Arg Val Asn Tyr Asp Gln Met Ser Val Tyr 130 135 140 Glu Gly Arg Gly Val Gly Gly Gly Ser Leu Val Asn Gly Gly Met Ala 145 150 155 160 Val Glu Pro Lys Arg Ser Tyr Phe Glu Glu Ile Leu Pro Arg Val Asp 165 170 175 Ser Ser Glu Met Tyr Asp Arg Tyr Phe Pro Arg Ala Asn Ser Met Leu 180 185 190 Arg Val Asn His Ile Asp Thr Lys Trp Phe Glu Asp Thr Glu Trp Tyr 195 200 205 Lys Phe Ala Arg Val Ser Arg Glu Gln Ala Gly Lys Ala Gly Leu Gly 210 215 220 Thr Val Phe Val Pro Asn Val Tyr Asp Phe Gly Tyr Met Gln Arg Glu 225 230 235 240 Ala Ala Gly Glu Val Pro Lys Ser Ala Leu Ala Thr Glu Val Ile Tyr 245 250 255 Gly Asn Asn His Gly Lys Gln Ser Leu Asp Lys Thr Tyr Leu Ala Ala 260 265 270 Ala Leu Gly Thr Gly Lys Val Thr Ile Gln Thr Leu His Gln Val Lys 275 280 285 Thr Ile Arg Gln Thr Lys Asp Gly Gly Tyr Ala Leu Thr Val Glu Gln 290 295 300 Lys Asp Thr Asp Gly Lys Leu Leu Ala Thr Lys Glu Ile Ser Cys Arg 305 310 315 320 Tyr Leu Phe Leu Gly Ala Gly Ser Leu Gly Ser Thr Glu Leu Leu Val 325 330 335 Arg Ala Arg Asp Thr Gly Thr Leu Pro Asn Leu Asn Ser Glu Val Gly 340 345 350 Ala Gly Trp Gly Pro Asn Gly Asn Ile Met Thr Ala Arg Ala Asn His 355 360 365 Met Trp Asn Pro Thr Gly Ala His Gln Ser Ser Ile Pro Ala Leu Gly 370 375 380 Ile Asp Ala Trp Asp Asn Ser Asp Ser Ser Val Phe Ala Glu Ile Ala 385 390 395 400 Pro Met Pro Ala Gly Leu Glu Thr Trp Val Ser Leu Tyr Leu Ala Ile 405 410 415 Thr Lys Asn Pro Gln Arg Gly Thr Phe Val Tyr Asp Ala Ala Thr Asp 420 425 430 Arg Ala Lys Leu Asn Trp Thr Arg Asp Gln Asn Ala Pro Ala Val Asn 435 440 445 Ala Ala Lys Ala Leu Phe Asp Arg Ile Asn Lys Ala Asn Gly Thr Ile 450 455 460 Tyr Arg Tyr Asp Leu Phe Gly Thr Gln Leu Lys Ala Phe Ala Asp Asp 465 470 475 480 Phe Cys Tyr His Pro Leu Gly Gly Cys Val Leu Gly Lys Ala Thr Asp 485 490 495 Asp Tyr Gly Arg Val Ala Gly Tyr Lys Asn Leu Tyr Val Thr Asp Gly 500 505 510 Ser Leu Ile Pro Gly Ser Val Gly Val Asn Pro Phe Val Thr Ile Thr 515 520 525 Ala Leu Ala Glu Arg Asn Val Glu Arg Ile Ile Lys Gln Asp Val Thr 530 535 540 Ala Ser 545

【００５２】配列番号：６配列の長さ：５４６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質起源生物名：ストレプトマイセス・エスピー(Streptomyces
sp.) 株名：ＳＡ−ＣＯＯ配列 Met Thr Ala Gln Gln His Leu Ser Arg Arg Arg Met Leu Gly Met Ala 1 5 10 15 Ala Phe Gly Ala Ala Ala Leu Ala Gly Gly Thr Thr Ile Ala Ala Pro 20 25 30 Arg Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ser Ala Ala Asp Asn Gly Gly Tyr Val 35 40 45 Pro Ala Val Val Ile Gly Thr Gly Tyr Gly Ala Ala Val Ser Ala Leu 50 55 60 Arg Leu Gly Glu Ala Gly Val Gln Thr Leu Met Leu Glu Met Gly Gln 65 70 75 80 Leu Trp Asn Gln Pro Gly Pro Asp Gly Asn Ile Phe Cys Gly Met Leu 85 90 95 Asn Pro Asp Lys Arg Ser Thr Trp Phe Lys Asn Arg Thr Glu Ala Pro 100 105 110 Leu Gly Ser Phe Leu Trp Leu Asp Val Val Asn Arg Asn Ile Asp Pro 115 120 125 Tyr Ala Gly Val Leu Asp Arg Val Asn Tyr Asp Gln Met Ser Val Tyr 130 135 140 Glu Gly Arg Gly Val Gly Gly Gly Ser Leu Val Asn Gly Gly Met Ala 145 150 155 160 Val Glu Pro Lys Arg Ser Tyr Phe Glu Glu Ile Leu Pro Arg Val Asp 165 170 175 Ser Ser Glu Met Tyr Asp Arg Tyr Phe Pro Arg Ala Asn Ser Met Leu 180 185 190 Arg Val Asn His Ile Asp Thr Lys Trp Phe Glu Asp Thr Glu Trp Tyr 195 200 205 Lys Phe Ala Arg Val Ser Arg Glu Gln Ala Gly Lys Ala Gly Leu Gly 210 215 220 Thr Val Phe Val Pro Asn Val Tyr Asp Phe Gly Tyr Met Gln Arg Glu 225 230 235 240 Ala Ala Gly Glu Val Pro Lys Ser Ala Leu Ala Thr Glu Val Ile Tyr 245 250 255 Gly Asn Asn His Gly Lys Gln Ser Leu Asp Lys Thr Tyr Leu Ala Ala 260 265 270 Ala Leu Gly Thr Gly Lys Val Thr Ile Gln Thr Leu His Gln Val Lys 275 280 285 Thr Ile Arg Gln Thr Lys Asp Gly Gly Tyr Ala Leu Thr Val Glu Gln 290 295 300 Lys Asp Thr Asp Gly Lys Leu Leu Ala Thr Lys Glu Ile Ser Cys Arg 305 310 315 320 Tyr Leu Phe Leu Gly Ala Gly Ser Leu Gly Ser Thr Glu Leu Leu Val 325 330 335 Arg Ala Arg Asp Thr Gly Thr Leu Pro Asn Leu Asn Ser Glu Val Gly 340 345 350 Ala Gly Trp Gly Pro Asn Gly Asn Ile Met Thr Ala Arg Ala Asn His 355 360 365 Met Trp Asn Pro Thr Gly Ala His Gln Ser Ser Ile Pro Ala Leu Gly 370 375 380 Ile Asp Ala Trp Asp Asn Ser Asp Ser Ser Val Phe Ala Glu Ile Ala 385 390 395 400 Pro Met Pro Ala Gly Leu Glu Thr Trp Val Ser Leu Tyr Leu Ala Ile 405 410 415 Thr Lys Asn Pro Gln Arg Gly Thr Phe Val Tyr Asp Ala Ala Thr Asp 420 425 430 Arg Ala Lys Leu Asn Trp Thr Arg Asp Gln Asn Ala Pro Ala Val Asn 435 440 445 Ala Ala Lys Ala Leu Phe Asp Arg Ile Asn Lys Ala Asn Gly Thr Ile 450 455 460 Tyr Arg Tyr Asp Leu Phe Gly Thr Gln Leu Lys Ala Phe Ala Asp Asp 465 470 475 480 Phe Cys Tyr His Pro Leu Gly Gly Cys Val Leu Gly Lys Ala Thr Asp 485 490 495 Asp Tyr Gly Arg Val Ala Gly Tyr Lys Asn Leu Tyr Val Thr Asp Gly 500 505 510 Ser Leu Ile Pro Gly Ser Val Gly Val Asn Pro Phe Val Thr Ile Thr 515 520 525 Ala Leu Ala Glu Arg Asn Val Glu Arg Ile Ile Lys Gln Asp Val Thr 530 535 540 Ala Ser 545

【００５３】配列番号：７配列の長さ：５４６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質起源生物名：ストレプトマイセス・エスピー(Streptomyces
sp.) 株名：ＳＡ−ＣＯＯ配列 Met Thr Ala Gln Gln His Leu Ser Arg Arg Arg Met Leu Gly Met Ala 1 5 10 15 Ala Phe Gly Ala Ala Ala Leu Ala Gly Gly Thr Thr Ile Ala Ala Pro 20 25 30 Arg Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ser Ala Ala Asp Asn Gly Gly Tyr Val 35 40 45 Pro Ala Val Val Ile Gly Thr Gly Tyr Gly Ala Ala Val Ser Ala Leu 50 55 60 Arg Leu Gly Glu Ala Gly Val Gln Thr Leu Met Leu Glu Met Gly Gln 65 70 75 80 Leu Trp Asn Gln Pro Gly Pro Asp Gly Asn Ile Phe Cys Gly Met Leu 85 90 95 Asn Pro Asp Lys Arg Ser Thr Trp Phe Lys Asn Arg Thr Glu Ala Pro 100 105 110 Leu Gly Ser Phe Leu Trp Leu Asp Ala Val Asn Arg Asn Ile Asp Pro 115 120 125 Tyr Ala Gly Val Leu Asp Arg Val Asn Tyr Asp Gln Met Ser Val Tyr 130 135 140 Glu Gly Arg Gly Val Gly Gly Gly Ser Leu Val Asn Gly Gly Met Ala 145 150 155 160 Val Glu Pro Lys Arg Ser Tyr Phe Glu Glu Ile Leu Pro Arg Val Asp 165 170 175 Ser Ser Glu Met Tyr Asp Arg Tyr Phe Pro Arg Ala Asn Ser Met Leu 180 185 190 Arg Val Asn His Ile Asp Thr Lys Trp Phe Glu Asp Thr Glu Trp Tyr 195 200 205 Lys Phe Ala Arg Val Ser Arg Glu Gln Ala Gly Lys Ala Gly Leu Gly 210 215 220 Thr Val Phe Val Pro Asn Val Tyr Asp Phe Gly Tyr Met Gln Arg Glu 225 230 235 240 Ala Ala Gly Glu Val Pro Lys Ser Ala Leu Ala Thr Glu Val Ile Tyr 245 250 255 Gly Asn Asn His Gly Lys Gln Ser Leu Asp Lys Thr Tyr Leu Ala Ala 260 265 270 Ala Leu Gly Thr Gly Lys Val Thr Ile Gln Thr Leu His Gln Val Lys 275 280 285 Thr Ile Arg Gln Thr Lys Asp Gly Gly Tyr Ala Leu Thr Val Glu Gln 290 295 300 Lys Asp Thr Asp Gly Lys Leu Leu Ala Thr Lys Glu Ile Ser Cys Arg 305 310 315 320 Tyr Leu Phe Leu Gly Ala Gly Ser Leu Gly Ser Thr Glu Leu Leu Val 325 330 335 Arg Ala Arg Asp Thr Gly Thr Leu Pro Asn Leu Asn Ser Glu Val Gly 340 345 350 Ala Gly Trp Gly Pro Asn Gly Asn Ile Met Thr Ala Arg Ala Asn His 355 360 365 Met Trp Asn Pro Thr Gly Ala His Gln Ser Ser Ile Pro Ala Leu Gly 370 375 380 Ile Asp Ala Trp Asp Asn Ser Asp Ser Ser Val Phe Ala Glu Ile Ala 385 390 395 400 Pro Met Pro Ala Gly Leu Glu Thr Trp Val Ser Leu Tyr Leu Ala Ile 405 410 415 Thr Lys Asn Pro Gln Arg Gly Thr Phe Val Tyr Asp Ala Ala Thr Asp 420 425 430 Arg Ala Lys Leu Asn Trp Thr Arg Asp Gln Asn Ala Pro Ala Val Asn 435 440 445 Ala Ala Lys Ala Leu Phe Asp Arg Ile Asn Lys Ala Asn Gly Thr Ile 450 455 460 Tyr Arg Tyr Asp Leu Phe Gly Thr Gln Leu Lys Ala Phe Ala Asp Asp 465 470 475 480 Phe Cys Tyr His Pro Leu Gly Gly Cys Val Leu Gly Lys Ala Thr Asp 485 490 495 Asp Tyr Gly Arg Val Ala Gly Tyr Lys Asn Leu Tyr Val Thr Asp Gly 500 505 510 Ser Leu Ile Pro Gly Ser Val Gly Val Asn Pro Phe Val Thr Ile Thr 515 520 525 Ala Leu Ala Glu Arg Asn Val Glu Arg Ile Ile Lys Gln Asp Val Thr 530 535 540 Ala Ser 545

【００５４】配列番号：８配列の長さ：１６３８配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ起源生物名：ストレプトマイセス・エスピー(Streptomyces
sp.) 株名：ＳＡ−ＣＯＯ配列 GTG ACT GCA CAA CAG CAC CTG TCC CGC CGC CGC ATG CTC GGC ATG GCC 48 Met Thr Ala Gln Gln His Leu Ser Arg Arg Arg Met Leu Gly Met Ala 1 5 10 15 GCC TTC GGC GCC GCC GCC CTC GCC GGG GGC ACC ACC ATC GCC GCC CCC 96 Ala Phe Gly Ser Ala Ala Leu Ala Gly Gly Thr Thr Ile Ala Ala Pro 20 25 30 CGT GCG GCC GCC GCC GCC AAG TCC GCG GCG GAC AAC GGC GGT TAC GTC 144 Arg Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ser Ala Ala Asp Asn Gly Gly Tyr Val 35 40 45 CCC GCC GTC GTC ATC GGC ACC GGC TAC GGC GCG GCC GTC TCC GCG CTG 192 Pro Ala Val Val Ile Gly Thr Gly Tyr Gly Ala Ala Val Ser Ala Leu 50 55 60 CGC CTC GGC GAG GCG GGT GTG CAG ACC CTG ATG CTG GAG ATG GGC CAG 240 Arg Leu Gly Glu Ala Gly Val Gln Thr Leu Met Leu Glu Met Gly Gln 65 70 75 80 CTG TGG AAC CAG CCC GGC CCC GAC GGC AAC ATC TTC TGC GGC ATG CTC 288 Leu Trp Asn Gln Pro Gly Pro Asp Gly Asn Ile Phe Cys Gly Met Leu 85 90 95 AAC CCG GAC AAG CGG TCC AGC TGG TTC AAG AAC CGC ACC GAG GCC CCG 336 Asn Pro Asp Lys Arg Ser Ser Trp Phe Lys Asn Arg Thr Glu Ala Pro 100 105 110 CTC GGC AGC TTC CTC TGG CTC GAC GTC GTC AAC CGG AAC ATC GAC CCC 384 Leu Gly Ser Phe Leu Trp Leu Asp Val Val Asn Arg Asn Ile Asp Pro 115 120 125 TAC GCG GGT GTC CTG GAC CGT GTG AAC TAC GAC CAG ATG TCG GTC TAC 432 Tyr Ala Gly Val Leu Asp Arg Val Asn Tyr Asp Gln Met Ser Val Tyr 130 135 140 GTG GGC CGC GGC GTC GGC GGC GGC TCG CTC GTC AAC GGC GGC ATG GCC 480 Val Gly Arg Gly Val Gly Gly Gly Ser Leu Val Asn Gly Gly Met Ala 145 150 155 160 GTG GAG CCC AAG CGC TCG TAC TTC GAG GAG ATC CTC CCG CGG GTC GAC 528 Val Glu Pro Lys Arg Ser Tyr Phe Glu Glu Ile Leu Pro Arg Val Asp 165 170 175 TCC TCC GAG ATG TAC GAC CGC TAC TTC CCC CGC GCC AAC TCC ATG CTC 576 Ser Ser Glu Met Tyr Asp Arg Tyr Phe Pro Arg Ala Asn Ser Met Leu 180 185 190 CGC GTC AAC CAC ATC GAC ACC AAG TGG TTC GAG GAC ACC GAG TGG TAC 624 Arg Val Asn His Ile Asp Thr Lys Trp Phe Glu Asp Thr Glu Trp Tyr 195 200 205 AAG TTC GCC CGC GTC TCG CGC GAG CAG GCG GGC AAG GCC GGT CTC GGC 672 Lys Phe Ala Arg Val Ser Arg Glu Gln Ala Gly Lys Ala Gly Leu Gly 210 215 220 ACC GTC TTC GTC CCC AAC GTC TAC GAC TTC GGC TAC ATG CAG CGC GAG 720 Thr Val Phe Val Pro Asn Val Tyr Asp Phe Gly Tyr Met Gln Arg Glu 225 230 235 240 GCC GCG GGC GAG GTG CCC AAG TCC GCC CTG GCG ACC GAG GTC ATC TAC 768 Ala Ala Gly Glu Val Pro Lys Ser Ala Leu Ala Thr Glu Val Ile Tyr 245 250 255 GGC AAC AAC CAC GGC AAG CAG AGC CTG GAC AAG ACC TAC CTG GCC GCC 816 Gly Asn Asn His Gly Lys Gln Ser Leu Asp Lys Thr Tyr Leu Ala Ala 260 265 270 GCA CTC GGC ACC GGC AAG GTC ACC ATC CAG ACC CTG CAC CAG GTC AAG 864 Ala Leu Gly Thr Gly Lys Val Thr Ile Gln Thr Leu His Gln Val Lys 275 280 285 ACG ATC CGT CAG ACG AAG GAC GGC GGC TAC GCG CTG ACC GTC GAG CAG 912 Thr Ile Arg Gln Thr Lys Asp Gly Gly Tyr Ala Leu Thr Val Glu Gln 290 295 300 AAG GAC ACC GAC GGC AAG CTC CTG GCC ACC AAG GAG ATC TCC TGC CGC 960 Lys Asp Thr Asp Gly Lys Leu Leu Ala Thr Lys Glu Ile Ser Cys Arg 305 310 315 320 TAC CTG TTC CTC GGC GCG GGC AGC CTC GGC TCC ACC GAA CTG CTG GTG 1008 Tyr Leu Phe Leu Gly Ala Gly Ser Leu Gly Ser Thr Glu Leu Leu Val 325 330 335 CGC GCC CGC GAC ACC GGC ACC CTG CCG AAC CTC AAC TCC GAG GTG GGC 1056 Arg Ala Arg Asp Thr Gly Thr Leu Pro Asn Leu Asn Ser Glu Val Gly 340 345 350 GCG GGC TGG GGC CCC AAC GGC AAC ATC ATG ACC GCC CGG GCC AAC CAC 1104 Ala Gly Trp Gly Pro Asn Gly Asn Ile Met Thr Ala Arg Ala Asn His 355 360 365 ATG TGG AAC CCC ACC GGC GCC CAC CAG TCC TCC ATC CCC GCC CTC GGC 1152 Met Trp Asn Pro Thr Gly Ala His Gln Ser Ser Ile Pro Ala Leu Gly 370 375 380 ATC GAC GCG TGG GAC AAC AGC GAC TCC TCG GTC TTC GCG GAG ATC GCC 1200 Ile Asp Ala Trp Asp Asn Ser Asp Ser Ser Val Phe Ala Glu Ile Ala 385 390 395 400 CCC ATG CCG GCC GGC CTG GAG ACG TGG GTC AGC CTC TAC CTC GCG ATC 1248 Pro Met Pro Ala Gly Leu Glu Thr Trp Val Ser Leu Tyr Leu Ala Ile 405 410 415 ACC AAG AAC CCC CAG CGC GGC ACC TTC GTG TAC GAC GCC GCG ACG GAC 1296 Thr Lys Asn Pro Gln Arg Gly Thr Phe Val Tyr Asp Ala Ala Thr Asp 420 425 430 CGC GCG AAG CTC AAC TGG ACC CGT GAC CAG AAC GCC CCC GCG GTC AAC 1344 Arg Ala Lys Leu Asn Trp Thr Arg Asp Gln Asn Ala Pro Ala Val Asn 435 440 445 GCA GCC AAG GCG CTG TTC GAC CGG ATC AAC AAG GCG AAC GGC ACG ATC 1392 Ala Ala Lys Ala Leu Phe Asp Arg Ile Asn Lys Ala Asn Gly Thr Ile 450 455 460 TAC CGG TAC GAC CTC TTC GGC ACC CAG CTG AAG GCC TTC GCC GAC GAC 1440 Tyr Arg Tyr Asp Leu Phe Gly Thr Gln Leu Lys Ala Phe Ala Asp Asp 465 470 475 480 TTC TGC TAC CAC CCG CTC GGC GGC TGC GTC CTG GGC AAG GCG ACG GAC 1488 Phe Cys Tyr His Pro Leu Gly Gly Cys Val Leu Gly Lys Ala Thr Asp 485 490 495 GAC TAC GGC CGC GTC GCC GGT TAC AAG AAC CTC TAC GTG ACC GAC GGT 1536 Asp Tyr Gly Arg Val Ala Gly Tyr Lys Asn Leu Tyr Val Thr Asp Gly 500 505 510 TCG CTG ATC CCG GGT TCC GTC GGC GTC AAC CCG TTC GTG ACC ATC ACG 1584 Ser Leu Ile Pro Gly Ser Val Gly Val Asn Pro Phe Val Thr Ile Thr 515 520 525 GCG CTG GCC GAG CGG AAC GTC GAG CGC ATC ATC AAG CAG GAC GTC ACG 1632 Ala Leu Ala Glu Arg Asn Val Glu Arg Ile Ile Lys Gln Asp Val Thr 530 535 540 GCG TCG 1638 Ala Ser 545

【００５５】配列番号：９配列の長さ：２９２配列の型：デオキシリボヌクレオチドトポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（合成）起源生物名：ストレプトマイセス・エスピー(Streptomyces
sp.) 株名：ＳＡ−ＣＯＯ配列の特徴他の情報：従来のコレステロールオキシダーゼ構造遺伝
子にコードされたポリペプチド鎖に対応した合成ＤＮＡ
プローブ配列 GAATTCATGA CTGCACAACA GCATCTGTCC CGTCGTCGTA TGCTGGGTAT GGCTGCATTC 60 GGCGCCGCAG CTCTGGCAGG GGGTACTACT ATTGCTGCTC CACGTGCTGC AGCTGCAGCT 120 AAGTCCGCGG CGGATAACGG TGGTTATGTA CCAGCTGTTG TAATTGGTAC CGGTTATGGT 180 GCTGCAGTTT CCGCTCTGCG TCTGGGTGAA GCTGGTGTAC AGACTCTGAT GCTCGAGATG 240 GGTCAGCTGT GGAACCAGCC AGGTCCAGAT GGTAACATTT TCTGCGGCAT GC 292

【図面の簡単な説明】

【図１】コレステロールオキシダーゼ遺伝子組換えベク
ターｐＣＯ１から組換えベクターｐＣＯ３の作成を示す
図である。

【図２】コレステロールオキシダーゼ遺伝子発現ベクタ
ーpCO-117 作成の流れを示す図である。

【図３】コレステロールオキシダーゼ遺伝子発現ベクタ
ーpCO110作成の流れを示す図である。

【図４】本発明の改変酵素（６種類）と親酵素との熱安
定性の比較を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩ // Ｃ１２Ｑ 1/28 Ｃ１２Ｑ 1/44 1/44 Ｃ１２Ｒ 1:19 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者愛水重典福井県敦賀市東洋町10番24号東洋紡績株式会社敦賀バイオ研究所内 (56)参考文献Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，1989年, 171（１），596−601 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 9/04 ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳｅｑＰｕｂＭｅｄ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表・配列番号２に記載されたアミノ
酸配列をコードするコレステロールオキシダーゼ活性を
有する改変酵素遺伝子。
【請求項２】配列表・配列番号３に記載されたアミノ
酸配列をコードするコレステロールオキシダーゼ活性を
有する改変酵素遺伝子。
【請求項３】配列表・配列番号４に記載されたアミノ
酸配列をコードするコレステロールオキシダーゼ活性を
有する改変酵素遺伝子。
【請求項４】配列表・配列番号５に記載されたアミノ
酸配列をコードするコレステロールオキシダーゼ活性を
有する改変酵素遺伝子。
【請求項５】配列表・配列番号６に記載されたアミノ
酸配列をコードするコレステロールオキシダーゼ活性を
有する改変酵素遺伝子。
【請求項６】配列表・配列番号７に記載されたアミノ
酸配列をコードするコレステロールオキシダーゼ活性を
有する改変酵素遺伝子。
【請求項７】請求項１〜６のいずれか１項に記載の遺
伝子をベクターに組み込んだ組換え発現ベクター。
【請求項８】宿主細胞を請求項７記載の組換え発現ベ
クターで形質転換させた形質転換細胞。
【請求項９】請求項８記載の形質転換細胞を栄養培地
で培養し、培養物からコレステロールオキシダーゼ活性
を有する改変酵素を採取することを特徴とするコレステ
ロールオキシダーゼ活性を有する改変酵素の製造法。
【請求項１０】請求項９記載の製造法により製造され
たコレステロールオキシダーゼ活性を有する改変酵素。
【請求項１１】配列表・配列番号２、３、４、５、６
または７に記載されたアミノ酸配列を有する前駆体タン
パク質から、形質転換細胞により、プロセッシングを受
けた、あるいは受けないコレステロールオキシダーゼ活
性を有する改変酵素。
【請求項１２】請求項１０〜１１のいずれか１項に記
載のコレステロールオキシダーゼ活性を有する改変酵
素、ペルオキシダーゼおよび過酸化水素検出試薬および
必要によりコレステロールエステラーゼを含有すること
を特徴とするコレステロール測定用試薬。