JP3289726B2 - クラバラン酸の生合成遺伝子 - Google Patents
クラバラン酸の生合成遺伝子Info
- Publication number
- JP3289726B2 JP3289726B2 JP14200989A JP14200989A JP3289726B2 JP 3289726 B2 JP3289726 B2 JP 3289726B2 JP 14200989 A JP14200989 A JP 14200989A JP 14200989 A JP14200989 A JP 14200989A JP 3289726 B2 JP3289726 B2 JP 3289726B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- host
- vector
- clavulanic acid
- fragment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/188—Heterocyclic compound containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen atoms and oxygen atoms as the only ring heteroatoms
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
更に詳しくはクラバラン酸の生合成に関与する酵素をコ
ードする1つ以上の遺伝子を有する挿入DNA断片をもつ
微生物宿主の形質転換に用いる組換え体ベクターに関す
る。
ブリゲルス(Streptomyces clavuligerus)によって産
生される強いβ−ラクタマーゼ阻害剤であり[リーディ
ング・シーとコール・エム(Reading,C.and Cole,M),A
ntimicrolbial Agents and Chemotherapy,11巻,852−85
7頁,1977年参照]、β−ラクタマーゼに対して不安定な
β−ラクタム抗生物質の分解を阻止するので、臨床上価
値の高い化合物である。それ故醗酵法でクラバラン酸の
収量(力価)を増大させる方法は、商業上非常に重要で
ある。
れてきたのは、エス・クラブリゲルス(S.clavuligeru
s)を宿主細胞として用いる組換えDNA法である。この方
法については、クラバラン酸の生合成に関与する遺伝子
をエス・クラブリゲルスの染色体DNAから分離すれば有
望な出発点になるであろうと示唆されていた[シー・ア
ール・ベイリーら(C.R.Bailey et al),Biotechnolog
y,2巻,808−811頁,1981年参照]。しかし、今までのと
ころ、クラバラン酸の力価を増大するのに価値のあるい
かなるDNAも、具体的に同定されていない。
いると考えられるが、酵素のクラバラン酸シンターゼ
は、これまで特性決定がなされていない。クラバラン酸
シンターゼ(以下CASと略称する)は、プロクラバミン
酸をクラバミン酸(これらの化合物はクラバラン酸の生
合成経路における中間体である)に変換する、2−オク
ソグルタレートで連結されたオキシゲナーゼである。こ
れらの詳細については、エス・ダブリュ・エルスンら
(S.W.Elson et al),J.Chem.Soc.Chem.Commun.,1936,1
738および1739頁,1987年ならびに欧州特許願公開第0213
914号公報に記載されている。
る。
である。
である。
である。
ある。
アーゼの通常の略記号であり、DNAの近似の長さをキロ
塩基(kb)で示したが、アガロースゲルの電気泳動法に
よる大きさ決定実験で決定したものである。なおこれら
の図面は、図示されたDNA断片に存在する可能性がある
すべての制限部位を必ずしも示すものではない。
図のDNA断片(I)に示す、制限部位の配置を有するこ
とを特徴とする。クラバラン酸の生合成に関与する少な
くとも1つの酵素をコードする配列を有するDNAを提供
するものである。
わちエス・クラブリゲルスの染色体DNA内で見いだされ
たままのもの)のものではなく、精製し単離して、隣接
するDNAから分離したものである。
合成に関与し、かつ以下に述べるように利用できる1つ
以上の遺伝子を有し、クラバラン酸産生生物によって産
生されるクラバラン酸の収量を増大することである。特
にこの利点は、野生型のストレプトミセス属の種、例え
ばエス・クラブリゲルスATCC 27064内でクラバラン酸の
力価を、著しく増大することができることである。そし
てこの菌株は、天然のままでは、ごく低レベルのクラバ
ラン酸しか産生しない。
の生合成に関与する1つ以上の無傷の遺伝子を有する場
合、上記のしかたで利用することもできる。
ブ断片(Subfragment)のDNAを提供するものであり、但
し、このサブ断片が、第2図に示すDNA(II)のサブ断
片である場合は、該サブ断片は、第3図に示すDNA(II
I)と同一か、または該DNA(III)のサブ断片である。
素で公知の方法で切断して誘導することができる。また
この発明のサブ断片は、大きいDNAサブ断片を適当な制
限酵素で切断するか、または小さいサブ断片を公知の方
法を用いて連結することによって製造することができ
る。
部位の配置をもっており、すなわちDNA(III)のサブ断
片である。
に示す断片を有する。
(I)がCAS活性をコードする配列を有することが見い
だされた。
ン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺
伝子からなるDNAを提供するものである。
(IX)内に位置しているので、DNA断片(IX)は、この
発明の他の好ましいサブフラグメントである。
クレオチドの欠失、置換、付加および逆位化を行う標準
法によって誘導されたものであれば、第1〜4図に示す
制限部位の正確な配置を持っていないDNAもこの発明に
含まれる。
C 27064由来のDNAであり、第1〜4図がエス・クラブリ
ゲルスのDNAを示す。
適切なクラバラン酸産生微生物から得られたDNA配列も
含まれ、その配列は、第1〜4図に示す制限部位の配置
をもっていないが、好ましくは高度のストリンジエンシ
イ(Stringency)の条件下で第3図に示すDNA(III)も
しくはそのサブ断片と雑種形成し、クラバラン酸の生合
成に関与する酵素をコードする配列である。
ス・ジュモニネンシス(S.jumoninensis)ATCC 29864と
エス・カツラハマヌス(S.katsurahamanus)T−272が
挙げられる。
のいずれかの態様のDNAからなる組換え体DNAを提供する
ものである。
クター、さらに好ましくは、クラバラン酸産生生物に形
質転換しかつ該生物内で自律複製が可能なベクター、ま
たは挿入DNAを、相同組換えによってクラバラン酸産生
生物の染色体に組込みうるベクターである。
現ベクターである。
法、例えば付着端の直接結合法、ホモポリマーテーリン
グ法(homopolymer tailing)またはリンカーもしくは
アダプターの分子によって適切なベクターに導入するこ
とができる。好ましい態様のベクターは放線菌科の菌株
(Streptomycete)由来のものである。
のベクター[リジエイト,ディ・ジェイら(Lydiate D.
J.et al),Gene,35巻,223−235頁,1985年に記載されて
いる]。
のベクター[カッツ,エフら(Katz,F.et al)J.Gen.Mi
crobiol,129巻,2703−2714頁,1983年に記載されてい
る]。
tic Manipulation of Streptomyces,1985年に記載され
ている。実験室のマニュアル。The John Innes Foundat
ion]。
e)由来のベクター、例えばコスミドpTCF[グロスベル
トら(Grosveld et al),Mucleic Acids Research,10
巻,6715−6732頁,1982年]またはプラスミドpAT153[ツ
イッグ,エイ・ジエイとシェラット,ディ(Twigg,A.J.
and Sherratt,D.),Nature,283巻,216〜218頁,1980年]
であってもよい。
2つの配向の1つの配向の挿入DNAを持っていることは
理解されるであろう。両方の配向を有する組換え体ベク
ターはこの発明の範囲に含まれる。従って例えば、挿入
DNA断片が(IV)に示す制限部位の配置(第4図)をも
ち、該DNA断片が導入されるプラスミドベクターがpIJ91
3の場合に得られた組換え体プラスミド(pBROC 41AとpB
ROC41Bと呼称する)制限地図を第5(a)図と5(b)
図に示す。これらのプラスミドのうち、pBROC41B(第5
(b)図)が好ましい。
作製された好ましい組換え体ベクターを第6図に示し、
これをpBROC31と命名した。
しては次のように命名されたベクターがあり、すなわち
pWOR10(上記のDNA断片(IX)をPIJ680のBamH I部位に
連結することによって構築した)と、pBROC44(同じDNA
断片(IX)をPIJ702のBgl II部位に連結することによっ
て構築した)である。pWOR10において、断片IXのユニー
クBcl I部はpIJ680ベクターのユニークXho I部位から2.
45kbのところにある。またpBROC 44において、断片IXの
Bcl I部位は、pIJ 702ベクターのユニークBamH I部位か
ら3kbのところにある。
クターにサブクローン化することができる。例えば第5
(b)図に示すように特性決定された組換え体プラスミ
ドpBROC 41Bは次のようにして得られる。
図)から大きなEcoR I−EcoR Iセグメント(14.35kb)
を分離し、次いで b)上記のEcoR I−EcoR Iセグメントを、EcoR Iで切断
することによって直線化されたpIJ913に連結する方法で
ある。
に、ランダムアレイの染色体DNAフラグメントが、エス
・クラブリゲルス(ATCC27064)のDNAを通常の制限酵素
で部分消化することによって作製される。エンドヌクレ
アーゼMbo Iとそのアイソシゾマーがこの目的のために
特に適切である。
5kbの長さの断片を含有する画分を採取する[グロスベ
ルトら(Grosveld et al)Nucleic Acids Research,10
巻,6715〜6732頁,1982年]。次いで得られたDNA断片
を、切断されたベクターに通常のショットガン法によっ
て連結して、“クローンバンク”を作製する。
片が、電気泳動溶出法を用いてアガロースゲル以上でサ
イズ分画することによって得ることができる。次にこれ
らの小さなDNA断片は上記のクローンバンクを作製する
のに用いられる。
スミドであり(大きなDNA片を持つことができる)、こ
の目的のためには、コスミドpTCF(グロスベルトらの上
記文献参照)が特に適切である。
バンクを形成するのに用いるのに有利である。
なベクターに挿入され次いでクラバラン酸産生宿主の非
産生突然変異菌株(遮断された突然変異体)に形質され
たときに、宿主がクラバラン酸を合成する能力を復活す
ることができるDNA片を、雑種形成プローブとして用い
て通常の方法でプローブすることができる。このプロー
ブは、放射能で例えば32Pで標識され、前記DNA片自体、
または該DNAを含有するベクターで構成されていること
が分かる。但し、前記ベクターは、プローブされるクロ
ーンバンクを形成するのに用いたベクターに対して明確
な相同性がない。
iley et al),Biotechnology,2巻,808−811頁,1984年に
記載の方法で分離できる。
文献に記載のプラスミドpWOR 1である。
を実施するには、クラバラン酸を産生する能力を欠いた
エス・クラブリゲルスの突然変異菌株のエス・クラブリ
ゲルスdclc 8を入手する必要がある。エス・クラブリゲ
ルスdclc 8の寄託、誘導および特性に関する詳細は次の
とおりである。
Collection of Industrial and Marine Bacteria(英
国、スコットランド・アバディーン)に1986年2月19日
に寄託され、その寄託(受け入れ番号:NCIB 12209号)
は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブ
タペスト条約に基づく規則によって行われた。
ろ、種々の形態を示した。14種のタイプが確認された。
これらのうちの1つを分離してエス・クラブリゲルスSC
−2と命名した。
Mのエチジウムブロミドで処理し、そのプレートを10日
間培養した。生存菌を、クラバラン酸産生について検定
した。HPLCで検定した際に(230mmで検出)、検出可能
なクラバラン酸を全く産生しなかった1つの分離物をdc
lC8菌株と命名し、上記の受け入れ番号NCIB 12209号で
寄託した。
態様を形成する。
態学上の特性は、エス・クラブリゲルスATCC 27064の上
記特性と本質的に類似していることが見出されたが、後
者の菌株の特性は、米国特許第3,862,008号公報とヒギ
ンズ,シー・イーとキャストナー,アール・イー(Higg
ins,C.E.and Kastner,R.E.),Int.J.Systematic Bacter
ol.21巻,326−331頁,1971年に記載されている。上記の
ようにして作製したクローンバンクを、適切な雑種形成
プローブ、例えばpWOR1を用いて雑種形成試験をするこ
とによって、前記クローンバンク中に存在し前記プロー
ブと雑種形成するエス・クラブリゲルスの染色体DNA断
片を同定して地図を作成する。これらの断片は、この発
明のDNAより長いかまたは短かいDNAである。この発明DN
Aは、上記のDNAを、標準の方法を用いて、連結したりま
たは制限酵素で切断することによって得ることができ
る。
得られた場合は、新しく分離したDNA断片自体を、雑種
形成プローブとして用い(通常の方法例えばニックトラ
ンスレーション法で放射能標識した後)、クローンバン
ク中の別の正のコロニーを同定することができ、その挿
入DNAは制限マップによって分析でき、必要に応じて、
適当な制限酵素で切断することによって修飾することが
できる。
で反復される。
って形質転換される宿主を提供するものである。
ものであってもよく、例えば、イー・コリ(E.Coli)も
しくはエス・リビダンス(S.lividans)が挙げられる。
これらの宿主は、遺伝子操作技術上価値のあるもので、
クラバラン酸の生合成に関与する酵素、例えばCAS活性
を有する酵素を大量に発現するのに有利に使用すること
ができる。
養された場合にクラバラン酸を自然に産生する宿主か、
またはクラバラン酸の生合成性を阻止された上記宿主の
クラバラン酸非産生突然変異体であって、この発明のDN
Aで修復することができ、その結果クラバラン酸の合成
が回復し、好ましくは強化された宿主である。このタイ
プの好ましい宿主は、エス・クラブリゲルスATCC 2706
4、エス・ユーモニネンシスATCC 29864およびエス・カ
ツラハマヌスT−272、またはこれら由来の宿主であ
る。
クターで形質転換した後に、適当な条件下で、力価が増
大したクラバラン酸が得られることである。
る宿主か、または該宿主の阻止されたクラバラン酸非産
生突然変異体由来の宿主にクラバラン酸を産生させる方
法であって、 (a)前記の宿主またはその非産生突然変異体を、この
発明の組換え体ベクターで形質転換し、 (b)適当な条件下で形成された形質転換体を培養し、
クラバラン酸を産生させる工程からなるクラバラン酸の
製造法を提供するものである。
培養する一般的な方法は、英国特許第1,508,977号明細
書に記載されている。
リゲルスATCC 27064もしくはこれから誘導された宿主で
ある。
は、上記のpWOR10である。
するものではない。
ブラリイの、コスミドベクターpTCF内での構築 エス・クラブリゲルスATCC 27064の染色体DNAをヨー
ロッパ特許願公開第0233715号公報に記載してあるのと
同様にして分離した。20μgの染色体DNAを含有する3
つのアリコートを、Mbo I(0.5単位/μg DNA)を用い
て、標準条件下、5分、10分および15分間、部分的に消
化した。3つのアリコートを合して、塩(1.25M−5M Na
Cl)/トリスEDTA勾配液で分画し、SW40.1ベックマンロ
ーターを用い39000rpmで3時間遠心分離した。12個の画
分が収集され、5〜9の画分からDNAを分離して、大き
さが約35〜45kbのMbo I DNA断片10μgを得た。
ジー,ルント,テイ、マレイ,イー・ジェイ,メラー,
エイ・エル、ダール,エイチ・エイチ、フラベル,アー
ル・エイ(Grosveld F.G,Lund,T.,Murray,E.J.、Mellor
A.L.,Dahl,H.H.,Flavell,R.A.)Nucleic Acids Resear
ch、10巻、6715−6732頁、1982年に記載の方法に基づい
て行った。
5:3:3の比率で連結し、混合物をパッケージし、グロス
ベルトらの上記文献に記載されているのと同様にして、
イー・コリ ED 8767の形質導入に用いた。この方法に
よって、パッケージされたDNA1μg当り4×106のコロ
ニーを得た。
るpTCFを含有するイー・コリED8767の5000個のコロニー
を、ニトロセルロースフィルターに固定して溶解した。
プラスミドpWOR1(ベイリー、シー・アールら前記文
献)を単離し、切断修復で標識し、標準のコロニー雑種
形成法によって前記フィルターをプローブするのに用い
た。両者を合したところ、第1図に示す60kbのDNA Iセ
グメントを有する2つの雑種形成コロニーを得た。
ブラリイのpAT153内での構築 エス・グラブリゲルスATCC 27064の染色体DNAを、ヨ
ーロッパ特許願公開第0233715号に記載されているのと
同様にして分離した。
で部分的に消化し、アガロースゲルで分画した。マニア
ティス,テイ,フリッチ,イー・エフ、サムブルーク,
ジェイ・(Maniatis T.,Fritsch,E.F.,Sambrook,J.)Mo
lecular Cloning:実験室マニュアル(コールド・スプリ
ング・ハーバー研究所)、1982年に記載の電気泳動溶出
法で10kbより大きい大きさの断片を含有する画分からDN
Aを分離した。
をBamH Iで消化し、子ウシ腸アルカリホスファターゼで
処理し、末端のリン酸基を除いて画循環(recircularis
ation)を防止した。このベクターと、エス・グラブリ
ゲルスATCC 27064 DNAの10kb以上の断片を連結し、イー
・コリーDH1を形質転換するのに用いた。
T153を含有するイー・コリーDH1の6000個のコロニーを
ニトロセルロースフィルターに固定して溶解した。pWOR
1から、2.2kbのSph I−Bgl II挿入断片[ベイリーら
(前記文献)の第3図の部位3〜4]を分離し、切断修
復で標識し、標準コロニー雑種形成法で前記フィルター
をプロープするのに用いた。
種形成コロニーを得た。
酸力価の、プラスミドpWOR10による増大 Bgl II−Bgl II断片IX(第4図)を、pIJ680[ホップ
ウッドら(Hopwood et al)、Genetic Manipulation of
Streptomyces,実験室マニュアル、The John Innes Fou
ndation]のBam H1部位に連結することによってプラス
ミドpWOR10を構築した。
記文献に記載されているのと類似の方法で、エス・クラ
ブリゲルスSC2(野生型の再分離物)に形質転換した。
形質転換体を採取して5μg/mのチオストレプトン含
有のM5D培地[デキストリン1.0%;K2HPO4、0.1%;MgSO4
0.1%;NaCl20.1%;(NH4)2SO4、0.1%;CaCO30.4%;
瘍跡の元素(FeSO40.0001%;MnCl20.0001%;ZnSO40.000
1%);寒天2.0%]に再び画線接種した。各形質転換体
の細胞を、5MD培地に穿刺接種を行い6日間26℃で培養
した。
イとコール,エム(Reading,C,and cole,M.)、Antimic
rob.Agents Chemother.,11巻、852−587頁、1977年に記
載されているようにして、クレブシェラ・エロゲネス
(Klebsiella aerogenes)菌株、4%テトラゾリウム塩
および5μg/mペニシリンGを含む血液軟寒天(oxoi
d)をそそいだ。26℃で一夜培養した後、阻止域を測定
した。対象の培養物より大きい阻止域を示す形質転換体
を、正確な力価を評価するために振盪フラスコ培養に付
した。細胞を、英国特許第1,508,977号の明細書に記載
の適切な種培地25mに接種し、振盪しながら26℃で3
日間培養する。1mの種培養物を、英国特許1,508,977
号明細書に記載の最終段階の場合に接種し、4日間26℃
で培養する。
バード,エー・イーら(Bird,A.E.et al)、Analyst,10
7巻、1241−1245頁、1982年およびホールストン,エム
とリーディング,シー(Foulston M.and Reading
C.)、Antimicrob Agents Chemother.22巻、753−762
頁、1982年に記載されているのと同様にしてクラバラン
酸の生産性を検定した。
スSC2に比べて、チオストレプトンなしで培養した培養
物では53%力価が増大し、チオストレプトンありで培養
した培養物では39%力価が増大した。すべての場合、自
律性pWOR10が存在することが見出された。
換 Bgl II−Bgl II断片IX(第4図)をpIJ702のBgl II部
位に連結することによって、pBROC44を作製した(ホッ
プウッドらの前記文献参照)。
入った25mのプロトプラスト種培地(トリプトン・大
豆ブロス+1%マルトース)に接種し、振盪しながら30
℃で3日間培養した。1mの種培養物を、コイルばね付
きの250m振盪フラスコに入っている25mの最終段階
のプロトプラスティング培地[1%マルトース+10mT
SB+0.5%グリシン+1%マルトース含有のYEME(ホッ
プウッドら前記文献参照)15mで構成されている]に
移した。30℃で一夜(16時間)培養した。培養物を滅菌
遠心分離管で収穫し、10.3%ショ糖溶液で菌糸を洗浄し
た。細胞ペレットを1.5mのリゾチーム混合物中に再懸
濁させ、時々混合しながら25℃で1時間培養した。プロ
トプラスが形成するのを顕微鏡を用いて監視した。プロ
トプラスト緩衝液(PB)(4m)(ホップウッドら前記
文献参照)を添加して混合し、次いで細胞懸濁物を滅菌
木綿わたフィルターで濾過した。プロトプラスト懸濁液
を遠心分離し、PB中でかんたんに洗浄し、最終的に2m
PB中に再懸濁した。プロトプラストの濃度は、トーマカ
ウンティングチャンバー(Thoma counting chamber)を
用いて測定した。
入れ、5mのPBを加えて遠心分離してペレット化した。
プロトプラストを約400μのPB中に再懸濁させた。こ
のプロトプラスト懸濁液に5μの連結混合物を加え、
30秒以内に0.5mの形質転換培地(ホップウツドらの前
記文献246頁)を加えた。10秒後に5mのPBを添加し
て、プロトプラストを遠心分離した。
まで希釈した。各希釈液の試料0.1mを再生培地R2YE
[トリプソン,シー・ジェイ,ワード,ジェイ・エムお
よびホップウッド,ディ・エー(Thompson,C.J.,Ward,
J.M.and Hopwood D.A.)、Nature、286巻、525−527
頁、1980年参照]にプレートした。寒天プレートを30℃
で培養した。20時間後に、プレートに、500μg/mのチ
オストレプトン含有の栄養軟寒天2mをそそいだ。寒天
プレートをさらに3日間培養した。チオストレプトン耐
性の形質転換体を再生プレートから採取し、清浄なR2YE
寒天に再び画線接種した。3〜4日間の培養後、形質転
換体を50μg/mのチオストレプトン含有の種培地に接
種し、振盪しながら2日間30℃で培養した。プラスミド
をホップウッドらの前記文献の方法によって分離した。
pBROC44と命名されたプラスミドの正しい構造を、マニ
アティスらの前記文献(1982年)に記載の制限エンドヌ
クレアーゼ消化法で確認した。
内のクラバミン酸シンターゼの活性の証明 下記実験は、pBROC44で形質転換されたエス・リビダ
ンス(実施例6)内に、クラバミン酸シンターゼ(CA
S)活性が存在すことを証明している。
6) 培養物(i)と(ii)は、(iii)に対して負の対象
として作用した。
ているので、このベクターを含有する上記の2つの培養
物はチオストレプトンの存在下(50μg/m)で培養し
た。宿主自体はチオストレプトンなしで培養した。
それぞれ5mMと50mMになるように加えて補充した。
し、培養物を、250mもしくは500mのスプリング付き
振盪フラスコ中、31℃で培養した。
理をして(3×5秒処理)、同容積の、50mMトリス塩酸
/10mM MgCl2/10mM KCl/10%グリセロール/1mM PMSE(フ
ェニルメチルスルホニルフルオリド)/pH7.5中で細胞内
酵素を放出させた。
理物(115μ)を、Fe2+(115μ,10mM)、α−ケト
グルタレート(15μ,10mM)およびCASの基質[5−ア
ミノ−3−ヒドロキシ−2−(2−オキソアゼチジン−
1−イル)バレレート;プロクラバミン酸;ヨーロッパ
特許公開(EP−A−O)第0213914号明細書に記載]
(5μ,5mg/m)ととも室温で5分間培養し、次いで
イミダゾール(37.5μ,20%,pH6.8)とともに10分間
培養し、0.1M NaH2PO4/6%MeOH/pH3.2で飽和させた30cm
Waters C18カラムを用いるHPLC(高速液体クロマトグ
ラフィ)で2m/分で溶出し、312nmで検出することに
よって、誘導生成物を検出した。ソフトゲルパーミエー
ションクロマトグラフィを、前記の音波処理緩衝液で飽
和させたウルトロゲルACA54(Ultrogel ACA 54)の2.6
×45cmカラムを用い、20m/hrで4℃にて実施した。画
分のCAS活性を上記のようにして検定した。タンパク質
の検定は、ブラドホード(Bradford)、Analityical Bi
ochem,72巻、248−254頁、1976年の方法で行った。
ス・リビダンンス、およびpBROC44で形質転換したエス
・リビダンンスを48時間培養して不透明のブロスを得
た。各培養物の菌糸体を収穫し、音波処理し、遠心分離
して音波処理したものについてCAS活性を検定した。HPL
Cデータによれば、pBROC44で形質転換したエス・リビダ
ンスが、下記の特性を有するHPLCのピーク部分を生成す
ることが分かった。
に共溶出する(2.5分)。
ンスのみと、挿入部なしのpIJ702を含有するエス・リビ
ダンンス)の培養物には生成しなかった。
ケトグルタレートもしくは基質なしで検定したところ、
上記ピーク部はなかった。
活性を発生するというとを示している。
性は、0.0036μ mole/min/mg/タンパク質であることが
見出された。この値は、エス・グラブリゲルスATCC 270
64(再分離物SC2)由来のCASの値、0.008〜0.06μ mole
/min/mgタンパク質に匹敵するものである。このクロー
ン化されたCASの比活性は、天然のCASの比活性よりわず
かに低いけれども、このデータは、酵素が完全に翻訳さ
れ、pBROC44が完全なCAS遺伝子を含有することを示して
いる。
図;第3図はDNA IIIの制限地図;第4図は、DNA III由
来の7つの制限断片の制限地図;第5a図は、組換え体プ
ラスミドpBROC 41Aの制限地図;第5b図は、組換え体プ
ラスミドpBROC 41Bの制限地図;第6図は、組換え体プ
ラスミドpBROC 31の制限地図である。
Claims (15)
- 【請求項1】クラバラン酸の生合成に関与する少なくと
もひとつの酵素をコードするストレプトミセス・クラブ
リゲルス(ATCC27064)菌株由来のDNA断片を含むDNAで
あって、該DNAが約60kbの長さを有し、下図: のDNA断片(I)に示す制限部位の配置を有することを
特徴とするDNA。 - 【請求項2】サブ断片が、下図: に示すDNA断片(III)と同一か、または該DNA断片(II
I)のサブ断片であり、クラバミン酸シンターゼ活性を
有するタンパク質をコードする遺伝子を含む請求項1記
載のDNAのサブ断片。 - 【請求項3】DNAが、下図: のDNA断片(IX)に示す制限部位の配置を有する請求項
2に記載のDNA。 - 【請求項4】請求項2に示すDNA断片(III)と高度にス
トリンジェントな条件下で雑種形成し、かつクラバミン
酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするスト
レプトミセス・クラブリゲルス由来のDNA。 - 【請求項5】エス・クラブリゲルス由来の請求項1〜4
のいずれか1つに記載のDNA。 - 【請求項6】請求項1〜5のいずれか1つに記載のDNA
を有する組換えベクター。 - 【請求項7】pWOR10、pBROC44、pBROC31、pBROC41Aまた
はpBROC41Bと命名されている請求項6に記載のベクタ
ー。 - 【請求項8】高発現ベクターである請求項6に記載のベ
クター。 - 【請求項9】請求項6〜8のいずれか1つに記載のベク
ターで形質転換された宿主。 - 【請求項10】放線菌科の菌株またはイー・コリである
請求項9に記載の宿主。 - 【請求項11】天然で、クラバラン酸を産生する請求項
10に記載の放線菌科の菌株の宿主。 - 【請求項12】エス・クラブリゲルスATCC 27064または
これらの突然変異体である請求項10または11に記載の宿
主。 - 【請求項13】天然にクラバラン酸を産生する宿主か、
または/この宿主の、阻止されたクラバラン酸非産生突
然変異体由来の宿主にクラバラン酸を産生させる方法で
あって、下記工程: (a)前記宿主もしくはこの宿主のクラバラン酸非産生
突然変異体を、請求項6〜8のいずれか1つに記載のベ
クターで形質転換させ、ついで (b)得られた形質転換体を適当な条件下で培養し、ク
ラバラン酸を産生させることからなるクラバラン酸の産
生方法。 - 【請求項14】形質転換体が請求項12に記載の宿主から
なる請求項13に記載の方法。 - 【請求項15】エス・クラブリゲルスATCC 27064から誘
導されるクラバラン酸非産生菌株であって、National C
ollection of Industrial and Marine Bacteriaに寄託
された菌株NCIB 12209。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB888813055A GB8813055D0 (en) | 1988-06-02 | 1988-06-02 | Novel substance |
GB8813055.4 | 1988-06-02 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0242989A JPH0242989A (ja) | 1990-02-13 |
JP3289726B2 true JP3289726B2 (ja) | 2002-06-10 |
Family
ID=10637947
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP14200989A Expired - Lifetime JP3289726B2 (ja) | 1988-06-02 | 1989-06-02 | クラバラン酸の生合成遺伝子 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5759831A (ja) |
EP (1) | EP0349121B1 (ja) |
JP (1) | JP3289726B2 (ja) |
AT (1) | ATE140971T1 (ja) |
DE (1) | DE68926893T2 (ja) |
ES (1) | ES2090036T3 (ja) |
GB (1) | GB8813055D0 (ja) |
GR (1) | GR3021071T3 (ja) |
PT (1) | PT90697B (ja) |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8813055D0 (en) * | 1988-06-02 | 1988-07-06 | Beecham Group Plc | Novel substance |
US6037156A (en) * | 1989-05-30 | 2000-03-14 | Beecham Group P.L.C. | DNA molecules and vectors encoding clavulanic acid biosynthesis enzymes |
ES2130392T3 (es) * | 1992-12-02 | 1999-07-01 | Smithkline Beecham Plc | Procedimiento para la preparacion de acido clavulanico. |
GB9302041D0 (en) * | 1993-02-02 | 1993-03-17 | Smithkline Peecham P L C | Novel compounds |
GB9315393D0 (en) * | 1993-07-24 | 1993-09-08 | Smithkline Beecham Plc | Novel product |
US20030219867A1 (en) * | 1993-07-24 | 2003-11-27 | Smithkline Beecham Plc | Clavulanic acid dehydrogenase, preparation and use for the production of clavulanic acid |
US6589775B1 (en) | 1993-10-08 | 2003-07-08 | The Governors Of The University Of Alberta | DNA sequence encoding enzymes of clavulanic acid biosynthesis |
US6232106B1 (en) | 1993-10-08 | 2001-05-15 | The Governors Of The University Of Alberta | DNA sequence encoding enzymes of clavulanic acid biosynthesis |
GB9511679D0 (en) * | 1995-06-09 | 1995-08-02 | Smithkline Beecham Plc | Novel process |
ES2131001B1 (es) * | 1997-06-16 | 2000-04-01 | Antibioticos Sau | Procedimiento para incrementar la produccion de acido clavulanico mediante la expresion de genes reguladores y biosinteticos de streptomyces clavuligerus. |
AU9254498A (en) * | 1997-07-03 | 1999-01-25 | Gist-Brocades B.V. | Preparation of enzyme with reduced beta-lactamase activity |
AU7983400A (en) * | 1999-09-16 | 2001-04-17 | Johns Hopkins University, The | Improvement of clavulanic acid production |
EP1442123A2 (en) * | 2001-11-07 | 2004-08-04 | Smithkline Beecham Plc | Polynucleotides and polypeptides involved in clavulinic acid biosynthesis and use thereof |
CN109913392A (zh) * | 2019-03-30 | 2019-06-21 | 山东睿智医药科技有限公司 | 高产克拉维酸的棒状链霉菌菌株、其胁迫选育方法及其用途 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0061253A3 (en) * | 1981-03-18 | 1982-12-08 | Beecham Group Plc | Process for the transfer of genetic material into actinomycete cells, prepared cells and method of culturing these cells and isolating a metabolite |
GB8521516D0 (en) * | 1985-08-29 | 1985-10-02 | Beecham Group Plc | Compounds |
EP0463707A1 (en) * | 1985-12-17 | 1992-01-02 | Lubrizol Genetics Inc. | Production of polyketide antibiotics |
DE3789880T2 (de) * | 1986-01-31 | 1994-09-08 | Beecham Group Plc | Isolierung und Expression von bei der Biosynthese von Beta-Laktamen beteiligten Genen. |
GB8813055D0 (en) * | 1988-06-02 | 1988-07-06 | Beecham Group Plc | Novel substance |
-
1988
- 1988-06-02 GB GB888813055A patent/GB8813055D0/en active Pending
-
1989
- 1989-05-30 DE DE68926893T patent/DE68926893T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-30 EP EP89305415A patent/EP0349121B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-30 ES ES89305415T patent/ES2090036T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-30 AT AT89305415T patent/ATE140971T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-06-01 PT PT90697A patent/PT90697B/pt not_active IP Right Cessation
- 1989-06-02 JP JP14200989A patent/JP3289726B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-12-01 US US08/159,950 patent/US5759831A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-09-18 GR GR960402439T patent/GR3021071T3/el unknown
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
BIO’TECHNOLOGY 2[9](1984)P808〜811 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
GR3021071T3 (en) | 1996-12-31 |
DE68926893D1 (de) | 1996-09-05 |
US5759831A (en) | 1998-06-02 |
ATE140971T1 (de) | 1996-08-15 |
EP0349121A3 (en) | 1990-09-12 |
ES2090036T3 (es) | 1996-10-16 |
PT90697A (pt) | 1989-12-29 |
EP0349121A2 (en) | 1990-01-03 |
DE68926893T2 (de) | 1997-01-23 |
PT90697B (pt) | 1995-06-30 |
JPH0242989A (ja) | 1990-02-13 |
EP0349121B1 (en) | 1996-07-31 |
GB8813055D0 (en) | 1988-07-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3289726B2 (ja) | クラバラン酸の生合成遺伝子 | |
JP2815847B2 (ja) | ホスフィノトリシン耐性遺伝子の使用 | |
EP0333033A1 (en) | Glutamine synthesis gene and glutamine synthetase | |
Steiert et al. | A Gene Coding for a Membrane–Bound Hydrolase is Expressed as a Secreted, Soluble Enzyme in Streptomyces Lividans | |
JPH028714B2 (ja) | ||
JP2930546B2 (ja) | 蛋 白 | |
WO1989006688A2 (en) | Novel enzyme | |
Windhövel et al. | On the operon structure of the cfx gene clusters in Alcaligenes eutrophus | |
JPH0661261B2 (ja) | ペニシリンアシラーゼの増産方法 | |
EP0173327B1 (en) | Bialaphos producing gene | |
JP2970918B2 (ja) | 新規物質 | |
Xu et al. | Positive and negative regulation of sequences upstream of the form II cbb CO2 fixation operon of Rhodobacter sphaeroides | |
US6037156A (en) | DNA molecules and vectors encoding clavulanic acid biosynthesis enzymes | |
KR100514964B1 (ko) | 클라불란산 생산이 증가된 미생물 | |
JP2960775B2 (ja) | ノカルジオフォーム微生物由来のdna配列の発現 | |
JP3658323B2 (ja) | トレハロースシンターゼ蛋白質、遺伝子、プラスミド、微生物、及びトレハロースの製造方法 | |
EP0757101B1 (en) | Circular plasmids from Rhodococcus | |
EP0115936A1 (en) | Chimeric plasmids | |
JP3330670B2 (ja) | アルケンモノオキシゲナーゼ、これをコードする遺伝子及び形質転換微生物並びにアルケンのエポキシ化方法 | |
JPH08506021A (ja) | クラブラン酸生合成用調節遺伝子 | |
KR19990028533A (ko) | 페니실륨 크리소제눔 유래의 페닐아세틸-CoA 리가제 | |
JP2003521883A (ja) | クロラムフェニコール生合成経路および遺伝子クラスターの特徴付け | |
JPH05244953A (ja) | プラスミドpNC500 | |
JPS63237788A (ja) | 新規多コピ−性プラスミド | |
JPS61124386A (ja) | 新規プラスミド及びその製法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080322 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090322 Year of fee payment: 7 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100322 Year of fee payment: 8 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100322 Year of fee payment: 8 |