JP3289726B2

JP3289726B2 - クラバラン酸の生合成遺伝子

Info

Publication number: JP3289726B2
Application number: JP14200989A
Authority: JP
Inventors: ジョン・エドワード・ハドソン; アリスン・ジエーン・アール
Original assignee: ビーチヤム・グループ・ピーエルシー
Priority date: 1988-06-02
Filing date: 1989-06-02
Publication date: 2002-06-10
Anticipated expiration: 2017-06-10
Also published as: EP0349121A3; US5759831A; PT90697B; DE68926893T2; PT90697A; ES2090036T3; GR3021071T3; DE68926893D1; EP0349121B1; EP0349121A2; ATE140971T1; GB8813055D0; JPH0242989A

Description

【発明の詳細な説明】（イ）産業上の利用分野この発明は、DNA分子、特に組換え体DNA分子に関し、
更に詳しくはクラバラン酸の生合成に関与する酵素をコ
ードする１つ以上の遺伝子を有する挿入DNA断片をもつ
微生物宿主の形質転換に用いる組換え体ベクターに関す
る。

（ロ）従来の技術及び発明が解決しようとする課題クラバラン酸は、菌糸型細菌ストレプトミセス・クラ
ブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）によって産
生される強いβ−ラクタマーゼ阻害剤であり［リーディ
ング・シーとコール・エム（Reading,C.and Cole,M）,A
ntimicrolbial Agents and Chemotherapy,11巻,852−85
7頁,1977年参照］、β−ラクタマーゼに対して不安定な
β−ラクタム抗生物質の分解を阻止するので、臨床上価
値の高い化合物である。それ故醗酵法でクラバラン酸の
収量（力価）を増大させる方法は、商業上非常に重要で
ある。

クラバラン酸の収量を改善する方法として従来考えら
れてきたのは、エス・クラブリゲルス（S.clavuligeru
s）を宿主細胞として用いる組換えDNA法である。この方
法については、クラバラン酸の生合成に関与する遺伝子
をエス・クラブリゲルスの染色体DNAから分離すれば有
望な出発点になるであろうと示唆されていた［シー・ア
ール・ベイリーら（C.R.Bailey et al）,Biotechnolog
y,2巻,808−811頁,1981年参照］。しかし、今までのと
ころ、クラバラン酸の力価を増大するのに価値のあるい
かなるDNAも、具体的に同定されていない。

いくつもの酵素が、クラバラン酸の生合成に関与して
いると考えられるが、酵素のクラバラン酸シンターゼ
は、これまで特性決定がなされていない。クラバラン酸
シンターゼ（以下CASと略称する）は、プロクラバミン
酸をクラバミン酸（これらの化合物はクラバラン酸の生
合成経路における中間体である）に変換する、２−オク
ソグルタレートで連結されたオキシゲナーゼである。こ
れらの詳細については、エス・ダブリュ・エルスンら
（S.W.Elson et al）,J.Chem.Soc.Chem.Commun.,1936,1
738および1739頁,1987年ならびに欧州特許願公開第0213
914号公報に記載されている。

（ハ）課題を解決するための手段本願発明を明確にするために、以下の図面を使用す
る。

第１図はDNA Iの制限地図である。

第２図はDNA IIの制限地図である。

第３図はDNA IIIの制限地図である。

第４図は、DNA III由来の７つの制限断片の制限地図
である。

第5a図は、組換え体プラスミドpBROC 41Aの制限地図
である。

第5b図は、組換え体プラスミドpBROC 41Bの制限地図
である。

第６図は、組換え体プラスミドpBROC 31の制限地図で
ある。

図中の略記号EcoR I、Pst Iなどは制限エンドヌクレ
アーゼの通常の略記号であり、DNAの近似の長さをキロ
塩基（kb）で示したが、アガロースゲルの電気泳動法に
よる大きさ決定実験で決定したものである。なおこれら
の図面は、図示されたDNA断片に存在する可能性がある
すべての制限部位を必ずしも示すものではない。

第１の態様として、この発明は、長さが約60kbで第１
図のDNA断片（Ｉ）に示す、制限部位の配置を有するこ
とを特徴とする。クラバラン酸の生合成に関与する少な
くとも１つの酵素をコードする配列を有するDNAを提供
するものである。

この発明のDNA（Ｉ）は、その“天然”の状態（すな
わちエス・クラブリゲルスの染色体DNA内で見いだされ
たままのもの）のものではなく、精製し単離して、隣接
するDNAから分離したものである。

この発明の利点は、DNA（Ｉ）が、クラバラン酸の生
合成に関与し、かつ以下に述べるように利用できる１つ
以上の遺伝子を有し、クラバラン酸産生生物によって産
生されるクラバラン酸の収量を増大することである。特
にこの利点は、野生型のストレプトミセス属の種、例え
ばエス・クラブリゲルスATCC 27064内でクラバラン酸の
力価を、著しく増大することができることである。そし
てこの菌株は、天然のままでは、ごく低レベルのクラバ
ラン酸しか産生しない。

またDNA（Ｉ）のある種の制限断片は、クラバラン酸
の生合成に関与する１つ以上の無傷の遺伝子を有する場
合、上記のしかたで利用することもできる。

したがってこの発明は、第１図に示すDNA（Ｉ）のサ
ブ断片（Subfragment）のDNAを提供するものであり、但
し、このサブ断片が、第２図に示すDNA（II）のサブ断
片である場合は、該サブ断片は、第３図に示すDNA（II
I）と同一か、または該DNA（III）のサブ断片である。

この発明のサブ断片は、DNA（Ｉ）を、適当な制限酵
素で公知の方法で切断して誘導することができる。また
この発明のサブ断片は、大きいDNAサブ断片を適当な制
限酵素で切断するか、または小さいサブ断片を公知の方
法を用いて連結することによって製造することができ
る。

好ましいサブ断片は、第３図のDNA（III）に示す制御
部位の配置をもっており、すなわちDNA（III）のサブ断
片である。

DNA（III）の特定のサブ断片は、下記のような第４図
に示す断片を有する。

ａ） EcoR I−BamH I 断片（IV）ｂ） Bcl I−Bcl I 断片（Ｖ）ｃ） Bcl I−Bcl I 断片（VI）ｄ） Bql II−Bql II 断片（VII）ｅ） Bql II−Bql II 断片（VIII）ｆ） Bql II−Bql II 断片（IX）ｇ） Sph I−Sph I 断片（Ｘ）以上に述べる適切な実験によって、第１図に示すDNA
（Ｉ）がCAS活性をコードする配列を有することが見い
だされた。

したがって、別の態様として、この発明は、クラバミ
ン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺
伝子からなるDNAを提供するものである。

CAS活性に関与する遺伝子は、第４図に示すDNA断片
（IX）内に位置しているので、DNA断片（IX）は、この
発明の他の好ましいサブフラグメントである。

前記DNAが、上記のこの発明の態様のDNAについて、ヌ
クレオチドの欠失、置換、付加および逆位化を行う標準
法によって誘導されたものであれば、第１〜４図に示す
制限部位の正確な配置を持っていないDNAもこの発明に
含まれる。

この発明の好ましいDNAは、エス・クラブリゲルスATC
C 27064由来のDNAであり、第１〜４図がエス・クラブリ
ゲルスのDNAを示す。

しかし、この発明には、エス・クラブリゲルス以外の
適切なクラバラン酸産生微生物から得られたDNA配列も
含まれ、その配列は、第１〜４図に示す制限部位の配置
をもっていないが、好ましくは高度のストリンジエンシ
イ（Stringency）の条件下で第３図に示すDNA（III）も
しくはそのサブ断片と雑種形成し、クラバラン酸の生合
成に関与する酵素をコードする配列である。

その他の公知のクラバラン酸産生微生物としては、エ
ス・ジュモニネンシス（S.jumoninensis）ATCC 29864と
エス・カツラハマヌス（S.katsurahamanus）Ｔ−272が
挙げられる。

さらに別の態様として、この発明は、上記のこの発明
のいずれかの態様のDNAからなる組換え体DNAを提供する
ものである。

この発明の組換え体DNAは、好ましくは、組換え体ベ
クター、さらに好ましくは、クラバラン酸産生生物に形
質転換しかつ該生物内で自律複製が可能なベクター、ま
たは挿入DNAを、相同組換えによってクラバラン酸産生
生物の染色体に組込みうるベクターである。

好ましい態様において、組換え体ベクターは高度の発
現ベクターである。

この発明の態様のDNAは、当該技術分野で公知の方
法、例えば付着端の直接結合法、ホモポリマーテーリン
グ法（homopolymer tailing）またはリンカーもしくは
アダプターの分子によって適切なベクターに導入するこ
とができる。好ましい態様のベクターは放線菌科の菌株
（Streptomycete）由来のものである。

上記ベクターの具体例は次のとおりである。

（１）pIJ913（分子量15.7メガダルトン）：低コピー数
のベクター［リジエイト，ディ・ジェイら（Lydiate D.
J.et al）,Gene,35巻,223−235頁,1985年に記載されて
いる］。

（２）pIJ702（分子量3.7メガダルトン）：高コピー数
のベクター［カッツ，エフら（Katz,F.et al）J.Gen.Mi
crobiol,129巻,2703−2714頁,1983年に記載されてい
る］。

（３）pIJ680［ホップウッドら（Hopwood et al）,Gene
tic Manipulation of Streptomyces,1985年に記載され
ている。実験室のマニュアル。The John Innes Foundat
ion］。

またはベクターは、非放線菌科（non−Streplomycet
e）由来のベクター、例えばコスミドpTCF［グロスベル
トら（Grosveld et al）,Mucleic Acids Research,10
巻,6715−6732頁,1982年］またはプラスミドpAT153［ツ
イッグ，エイ・ジエイとシェラット，ディ（Twigg,A.J.
and Sherratt,D.）,Nature,283巻,216〜218頁,1980年］
であってもよい。

上記の方法で作製された組換えベクターは、とりうる
２つの配向の１つの配向の挿入DNAを持っていることは
理解されるであろう。両方の配向を有する組換え体ベク
ターはこの発明の範囲に含まれる。従って例えば、挿入
DNA断片が（IV）に示す制限部位の配置（第４図）をも
ち、該DNA断片が導入されるプラスミドベクターがpIJ91
3の場合に得られた組換え体プラスミド（pBROC 41AとpB
ROC41Bと呼称する）制限地図を第５（ａ）図と５（ｂ）
図に示す。これらのプラスミドのうち、pBROC41B（第５
（ｂ）図）が好ましい。

第３図のDNA（III）をpAT153に挿入することによって
作製された好ましい組換え体ベクターを第６図に示し、
これをpBROC31と命名した。

この発明によるその外の好ましい組換え体ベクターと
しては次のように命名されたベクターがあり、すなわち
pWOR10（上記のDNA断片（IX）をPIJ680のBamH I部位に
連結することによって構築した）と、pBROC44（同じDNA
断片（IX）をPIJ702のBgl II部位に連結することによっ
て構築した）である。pWOR10において、断片IXのユニー
クBcl I部はpIJ680ベクターのユニークXho I部位から2.
45kbのところにある。またpBROC 44において、断片IXの
Bcl I部位は、pIJ 702ベクターのユニークBamH I部位か
ら3kbのところにある。

１つのベクターへの挿入DNAは、標準の方法で他のベ
クターにサブクローン化することができる。例えば第５
（ｂ）図に示すように特性決定された組換え体プラスミ
ドpBROC 41Bは次のようにして得られる。

ａ）EcoR Iで切断することによって、pBROC31（第６
図）から大きなEcoR I−EcoR Iセグメント（14.35kb）
を分離し、次いでｂ）上記のEcoR I−EcoR Iセグメントを、EcoR Iで切断
することによって直線化されたpIJ913に連結する方法で
ある。

この発明のDNAと組換え体ベクターとを製造するため
に、ランダムアレイの染色体DNAフラグメントが、エス
・クラブリゲルス（ATCC27064）のDNAを通常の制限酵素
で部分消化することによって作製される。エンドヌクレ
アーゼMbo Iとそのアイソシゾマーがこの目的のために
特に適切である。

次いでDNA断片を塩勾配法でサイズ分画を行い約35〜4
5kbの長さの断片を含有する画分を採取する［グロスベ
ルトら（Grosveld et al）Nucleic Acids Research,10
巻,6715〜6732頁,1982年］。次いで得られたDNA断片
を、切断されたベクターに通常のショットガン法によっ
て連結して、“クローンバンク”を作製する。

所望により、例えば長さが10kb以上のような小さな断
片が、電気泳動溶出法を用いてアガロースゲル以上でサ
イズ分画することによって得ることができる。次にこれ
らの小さなDNA断片は上記のクローンバンクを作製する
のに用いられる。

クローンバンクを作製するために用いるベクターはコ
スミドであり（大きなDNA片を持つことができる）、こ
の目的のためには、コスミドpTCF（グロスベルトらの上
記文献参照）が特に適切である。

プラスミドpAT153は、小さなDNA片を有するクローン
バンクを形成するのに用いるのに有利である。

上記のようにして作製されたクローンバンクは、適切
なベクターに挿入され次いでクラバラン酸産生宿主の非
産生突然変異菌株（遮断された突然変異体）に形質され
たときに、宿主がクラバラン酸を合成する能力を復活す
ることができるDNA片を、雑種形成プローブとして用い
て通常の方法でプローブすることができる。このプロー
ブは、放射能で例えば³²Pで標識され、前記DNA片自体、
または該DNAを含有するベクターで構成されていること
が分かる。但し、前記ベクターは、プローブされるクロ
ーンバンクを形成するのに用いたベクターに対して明確
な相同性がない。

適切なプローブはシー・アール・ベイリーら（C.R.Ba
iley et al）,Biotechnology,2巻,808−811頁,1984年に
記載の方法で分離できる。

好ましいプローブは、シー・アール・ベイリーら上記
文献に記載のプラスミドpWOR 1である。

Biotechnology,2巻,808−811頁,1984年に記載の方法
を実施するには、クラバラン酸を産生する能力を欠いた
エス・クラブリゲルスの突然変異菌株のエス・クラブリ
ゲルスdclc 8を入手する必要がある。エス・クラブリゲ
ルスdclc 8の寄託、誘導および特性に関する詳細は次の
とおりである。

寄託エス・クラブリゲルスdclC 8の菌株は、the National
Collection of Industrial and Marine Bacteria（英
国、スコットランド・アバディーン）に1986年２月19日
に寄託され、その寄託（受け入れ番号:NCIB 12209号）
は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブ
タペスト条約に基づく規則によって行われた。

エス・クラブリゲルスNCIB 12209の誘導エ・クラブリゲルスATCC 27064の試料を取出したとこ
ろ、種々の形態を示した。14種のタイプが確認された。
これらのうちの１つを分離してエス・クラブリゲルスSC
−２と命名した。

エス・クラブリゲルスSC−２を、ペトリ皿上で、10μ
Ｍのエチジウムブロミドで処理し、そのプレートを10日
間培養した。生存菌を、クラバラン酸産生について検定
した。HPLCで検定した際に（230mmで検出）、検出可能
なクラバラン酸を全く産生しなかった１つの分離物をdc
lC8菌株と命名し、上記の受け入れ番号NCIB 12209号で
寄託した。

エス・クラブリゲルスNCIB 12209は、この発明の別の
態様を形成する。

エス・クラブリゲルスNCIB 112209の分類エス・クラブリゲルスNCIB 12209の分類学上および形
態学上の特性は、エス・クラブリゲルスATCC 27064の上
記特性と本質的に類似していることが見出されたが、後
者の菌株の特性は、米国特許第3,862,008号公報とヒギ
ンズ，シー・イーとキャストナー，アール・イー（Higg
ins,C.E.and Kastner,R.E.）,Int.J.Systematic Bacter
ol.21巻,326−331頁,1971年に記載されている。上記の
ようにして作製したクローンバンクを、適切な雑種形成
プローブ、例えばpWOR1を用いて雑種形成試験をするこ
とによって、前記クローンバンク中に存在し前記プロー
ブと雑種形成するエス・クラブリゲルスの染色体DNA断
片を同定して地図を作成する。これらの断片は、この発
明のDNAより長いかまたは短かいDNAである。この発明DN
Aは、上記のDNAを、標準の方法を用いて、連結したりま
たは制限酵素で切断することによって得ることができ
る。

不適当なまたは短すぎるDNA片がプロービング工程で
得られた場合は、新しく分離したDNA断片自体を、雑種
形成プローブとして用い（通常の方法例えばニックトラ
ンスレーション法で放射能標識した後）、クローンバン
ク中の別の正のコロニーを同定することができ、その挿
入DNAは制限マップによって分析でき、必要に応じて、
適当な制限酵素で切断することによって修飾することが
できる。

上記の工程は、この発明に必要なDNAが分離されるま
で反復される。

さらにこの発明は、この発明の組換え体ベクターによ
って形質転換される宿主を提供するものである。

宿主は標準的な方法で形質転換することができる。

１つの態様として、宿主はクラバラン酸を産生しない
ものであってもよく、例えば、イー・コリ（E.Coli）も
しくはエス・リビダンス（S.lividans）が挙げられる。
これらの宿主は、遺伝子操作技術上価値のあるもので、
クラバラン酸の生合成に関与する酵素、例えばCAS活性
を有する酵素を大量に発現するのに有利に使用すること
ができる。

しかし、宿主として好ましいのは、適切な培地内で培
養された場合にクラバラン酸を自然に産生する宿主か、
またはクラバラン酸の生合成性を阻止された上記宿主の
クラバラン酸非産生突然変異体であって、この発明のDN
Aで修復することができ、その結果クラバラン酸の合成
が回復し、好ましくは強化された宿主である。このタイ
プの好ましい宿主は、エス・クラブリゲルスATCC 2706
4、エス・ユーモニネンシスATCC 29864およびエス・カ
ツラハマヌスＴ−272、またはこれら由来の宿主であ
る。

これらの宿主を用いる利点は、この発明の組換え体ベ
クターで形質転換した後に、適当な条件下で、力価が増
大したクラバラン酸が得られることである。

したがってこの発明は、天然でクラバラン酸を産生す
る宿主か、または該宿主の阻止されたクラバラン酸非産
生突然変異体由来の宿主にクラバラン酸を産生させる方
法であって、（ａ）前記の宿主またはその非産生突然変異体を、この
発明の組換え体ベクターで形質転換し、（ｂ）適当な条件下で形成された形質転換体を培養し、
クラバラン酸を産生させる工程からなるクラバラン酸の
製造法を提供するものである。

クラバラン酸を得るように、クラバラン酸産生生物を
培養する一般的な方法は、英国特許第1,508,977号明細
書に記載されている。

上記の方法において、好ましい宿主は、エス・クラブ
リゲルスATCC 27064もしくはこれから誘導された宿主で
ある。

上記の方法に用いられる好ましい組換え体ベクター
は、上記のpWOR10である。

次いでこの発明を実施例で説明するがこの発明を限定
するものではない。

（ニ）実施例実施例１エス・クラブリゲルスATCC 27064DNAのライ
ブラリイの、コスミドベクターpTCF内での構築エス・クラブリゲルスATCC 27064の染色体DNAをヨー
ロッパ特許願公開第0233715号公報に記載してあるのと
同様にして分離した。20μｇの染色体DNAを含有する３
つのアリコートを、Mbo I（0.5単位／μg DNA）を用い
て、標準条件下、５分、10分および15分間、部分的に消
化した。３つのアリコートを合して、塩（1.25M−5M Na
Cl）／トリスEDTA勾配液で分画し、SW40.1ベックマンロ
ーターを用い39000rpmで３時間遠心分離した。12個の画
分が収集され、５〜９の画分からDNAを分離して、大き
さが約35〜45kbのMbo I DNA断片10μｇを得た。

pTCFベクターアームの製造は、グロスベルト，エフ・
ジー，ルント，テイ、マレイ，イー・ジェイ，メラー，
エイ・エル、ダール，エイチ・エイチ、フラベル，アー
ル・エイ（Grosveld F.G,Lund,T.,Murray,E.J.、Mellor
A.L.,Dahl,H.H.,Flavell,R.A.）Nucleic Acids Resear
ch、10巻、6715−6732頁、1982年に記載の方法に基づい
て行った。

エス・グラブリゲルスのDNA断片とベクターアームを
5:3:3の比率で連結し、混合物をパッケージし、グロス
ベルトらの上記文献に記載されているのと同様にして、
イー・コリ ED 8767の形質導入に用いた。この方法に
よって、パッケージされたDNA1μｇ当り４×10⁶のコロ
ニーを得た。

実施例２ DNA Iの製造エス・グラブリゲルスATCC 27064 DNAの挿入物を有す
るpTCFを含有するイー・コリED8767の5000個のコロニー
を、ニトロセルロースフィルターに固定して溶解した。
プラスミドpWOR1（ベイリー、シー・アールら前記文
献）を単離し、切断修復で標識し、標準のコロニー雑種
形成法によって前記フィルターをプローブするのに用い
た。両者を合したところ、第１図に示す60kbのDNA Iセ
グメントを有する２つの雑種形成コロニーを得た。

実施例３エス・グラブリゲルスATCC 27064DNAのライ
ブラリイのpAT153内での構築エス・グラブリゲルスATCC 27064の染色体DNAを、ヨ
ーロッパ特許願公開第0233715号に記載されているのと
同様にして分離した。

60μｇのエス・グラブリゲルスATCC 27064DNAをMbo I
で部分的に消化し、アガロースゲルで分画した。マニア
ティス，テイ，フリッチ，イー・エフ、サムブルーク，
ジェイ・（Maniatis T.,Fritsch,E.F.,Sambrook,J.）Mo
lecular Cloning:実験室マニュアル（コールド・スプリ
ング・ハーバー研究所）、1982年に記載の電気泳動溶出
法で10kbより大きい大きさの断片を含有する画分からDN
Aを分離した。

10μｇのpAT153（ツィッグとシェラットの前記文献）
をBamH Iで消化し、子ウシ腸アルカリホスファターゼで
処理し、末端のリン酸基を除いて画循環（recircularis
ation）を防止した。このベクターと、エス・グラブリ
ゲルスATCC 27064 DNAの10kb以上の断片を連結し、イー
・コリーDH1を形質転換するのに用いた。

実施例４ DNA IIIの製造エス・グラブリゲルスATCC 27064の挿入物を有するpA
T153を含有するイー・コリーDH1の6000個のコロニーを
ニトロセルロースフィルターに固定して溶解した。pWOR
1から、2.2kbのSph I−Bgl II挿入断片［ベイリーら
（前記文献）の第３図の部位３〜４］を分離し、切断修
復で標識し、標準コロニー雑種形成法で前記フィルター
をプロープするのに用いた。

第３図に示す13.1kbのDNA III断片を有する１つの雑
種形成コロニーを得た。

実施例５エス・グラブリゲルス菌株SC2内クラバラン
酸力価の、プラスミドpWOR10による増大 Bgl II−Bgl II断片IX（第４図）を、pIJ680［ホップ
ウッドら（Hopwood et al）、Genetic Manipulation of
Streptomyces,実験室マニュアル、The John Innes Fou
ndation］のBam H1部位に連結することによってプラス
ミドpWOR10を構築した。

プラスミドpWOR10を、シー・アール・ベイリーらの前
記文献に記載されているのと類似の方法で、エス・クラ
ブリゲルスSC2（野生型の再分離物）に形質転換した。
形質転換体を採取して５μg/mのチオストレプトン含
有のM5D培地［デキストリン1.0％;K₂HPO₄、0.1％;MgSO₄
0.1％;NaCl₂0.1％；（NH₄）₂SO₄、0.1％;CaCO₃0.4％；
瘍跡の元素（FeSO₄0.0001％;MnCl₂0.0001％;ZnSO₄0.000
1％）；寒天2.0％］に再び画線接種した。各形質転換体
の細胞を、5MD培地に穿刺接種を行い６日間26℃で培養
した。

次いでバイオアッセイプレートに、リーディング，シ
イとコール，エム（Reading,C,and cole,M.）、Antimic
rob.Agents Chemother.,11巻、852−587頁、1977年に記
載されているようにして、クレブシェラ・エロゲネス
（Klebsiella aerogenes）菌株、４％テトラゾリウム塩
および５μg/mペニシリンＧを含む血液軟寒天（oxoi
d）をそそいだ。26℃で一夜培養した後、阻止域を測定
した。対象の培養物より大きい阻止域を示す形質転換体
を、正確な力価を評価するために振盪フラスコ培養に付
した。細胞を、英国特許第1,508,977号の明細書に記載
の適切な種培地25mに接種し、振盪しながら26℃で３
日間培養する。1mの種培養物を、英国特許1,508,977
号明細書に記載の最終段階の場合に接種し、４日間26℃
で培養する。

培養ブロスの試料を、３〜４日間の培養後に取出し、
バード，エー・イーら（Bird,A.E.et al）、Analyst,10
7巻、1241−1245頁、1982年およびホールストン，エム
とリーディング，シー（Foulston M.and Reading
C.）、Antimicrob Agents Chemother.22巻、753−762
頁、1982年に記載されているのと同様にしてクラバラン
酸の生産性を検定した。

試験結果試験した21個の分離物中１個が、エス・クラブリゲル
スSC2に比べて、チオストレプトンなしで培養した培養
物では53％力価が増大し、チオストレプトンありで培養
した培養物では39％力価が増大した。すべての場合、自
律性pWOR10が存在することが見出された。

実施例６エス・リビダンスの、pBROC44による形質転
換 Bgl II−Bgl II断片IX（第４図）をpIJ702のBgl II部
位に連結することによって、pBROC44を作製した（ホッ
プウッドらの前記文献参照）。

エス・リビダンスの胞子を、250mの振盪フラスコに
入った25mのプロトプラスト種培地（トリプトン・大
豆ブロス＋１％マルトース）に接種し、振盪しながら30
℃で３日間培養した。1mの種培養物を、コイルばね付
きの250m振盪フラスコに入っている25mの最終段階
のプロトプラスティング培地［１％マルトース＋10mT
SB＋0.5％グリシン＋１％マルトース含有のYEME（ホッ
プウッドら前記文献参照）15mで構成されている］に
移した。30℃で一夜（16時間）培養した。培養物を滅菌
遠心分離管で収穫し、10.3％ショ糖溶液で菌糸を洗浄し
た。細胞ペレットを1.5mのリゾチーム混合物中に再懸
濁させ、時々混合しながら25℃で１時間培養した。プロ
トプラスが形成するのを顕微鏡を用いて監視した。プロ
トプラスト緩衝液（PB）（4m）（ホップウッドら前記
文献参照）を添加して混合し、次いで細胞懸濁物を滅菌
木綿わたフィルターで濾過した。プロトプラスト懸濁液
を遠心分離し、PB中でかんたんに洗浄し、最終的に2m
PB中に再懸濁した。プロトプラストの濃度は、トーマカ
ウンティングチャンバー（Thoma counting chamber）を
用いて測定した。

４×10⁹個のプロトプラストを清浄な遠心分離管内に
入れ、5mのPBを加えて遠心分離してペレット化した。
プロトプラストを約400μのPB中に再懸濁させた。こ
のプロトプラスト懸濁液に５μの連結混合物を加え、
30秒以内に0.5mの形質転換培地（ホップウツドらの前
記文献246頁）を加えた。10秒後に5mのPBを添加し
て、プロトプラストを遠心分離した。

プロトプラストを1mのPBに再懸濁させて、PBで10^-3
まで希釈した。各希釈液の試料0.1mを再生培地R2YE
［トリプソン，シー・ジェイ，ワード，ジェイ・エムお
よびホップウッド，ディ・エー（Thompson,C.J.,Ward,
J.M.and Hopwood D.A.）、Nature、286巻、525−527
頁、1980年参照］にプレートした。寒天プレートを30℃
で培養した。20時間後に、プレートに、500μg/mのチ
オストレプトン含有の栄養軟寒天2mをそそいだ。寒天
プレートをさらに３日間培養した。チオストレプトン耐
性の形質転換体を再生プレートから採取し、清浄なR2YE
寒天に再び画線接種した。３〜４日間の培養後、形質転
換体を50μg/mのチオストレプトン含有の種培地に接
種し、振盪しながら２日間30℃で培養した。プラスミド
をホップウッドらの前記文献の方法によって分離した。
pBROC44と命名されたプラスミドの正しい構造を、マニ
アティスらの前記文献（1982年）に記載の制限エンドヌ
クレアーゼ消化法で確認した。

実施例７ pBROC44で形質転換されたエス・リビダンス
内のクラバミン酸シンターゼの活性の証明下記実験は、pBROC44で形質転換されたエス・リビダ
ンス（実施例６）内に、クラバミン酸シンターゼ（CA
S）活性が存在すことを証明している。

下記３つの培養物を試験した。

（ｉ）エス・リビダンス宿主（ii）pIJ702を含有するエス・リビダンス（iii）pBROC44を含有するエス・リビダンス（実施例
６）培養物（ｉ）と（ii）は、（iii）に対して負の対象
として作用した。

ベクターpIJ702はチオストレプトン耐性の部位をもっ
ているので、このベクターを含有する上記の２つの培養
物はチオストレプトンの存在下（50μg/m）で培養し
た。宿主自体はチオストレプトンなしで培養した。

用いた培地は次のとおりである。

ディフコ（Difco）酵母エキス 3g ディフコバクトペプトン 3g オキソイド（oxoid）麦芽エキス 3g １水グルコース 10g ショ糖 340g 次いで、加圧滅菌後、MgCl₂とグリシンを最終濃度が
それぞれ5mMと50mMになるように加えて補充した。

上記の培地に胞子プレートからの単寒天フラグを接種
し、培養物を、250mもしくは500mのスプリング付き
振盪フラスコ中、31℃で培養した。

48時間の培養後、菌糸体を遠心分離で収穫し、音波処
理をして（３×５秒処理）、同容積の、50mMトリス塩酸
/10mM MgCl₂/10mM KCl/10％グリセロール/1mM PMSE（フ
ェニルメチルスルホニルフルオリド）/pH7.5中で細胞内
酵素を放出させた。

CAS活性を検定するために、前記の遠心分離・音波処
理物（115μ）を、Fe²⁺（115μ,10mM）、α−ケト
グルタレート（15μ,10mM）およびCASの基質［５−ア
ミノ−３−ヒドロキシ−２−（２−オキソアゼチジン−
１−イル）バレレート；プロクラバミン酸；ヨーロッパ
特許公開（EP−Ａ−Ｏ）第0213914号明細書に記載］
（５μ,5mg/m）ととも室温で５分間培養し、次いで
イミダゾール（37.5μ,20％,pH6.8）とともに10分間
培養し、0.1M NaH₂PO₄/6％MeOH/pH3.2で飽和させた30cm
Waters C18カラムを用いるHPLC（高速液体クロマトグ
ラフィ）で2m／分で溶出し、312nmで検出することに
よって、誘導生成物を検出した。ソフトゲルパーミエー
ションクロマトグラフィを、前記の音波処理緩衝液で飽
和させたウルトロゲルACA54（Ultrogel ACA 54）の2.6
×45cmカラムを用い、20m/hrで４℃にて実施した。画
分のCAS活性を上記のようにして検定した。タンパク質
の検定は、ブラドホード（Bradford）、Analityical Bi
ochem,72巻、248−254頁、1976年の方法で行った。

試験結果エス・リビダンスのみ、ベクターpIJ702を含有するエ
ス・リビダンンス、およびpBROC44で形質転換したエス
・リビダンンスを48時間培養して不透明のブロスを得
た。各培養物の菌糸体を収穫し、音波処理し、遠心分離
して音波処理したものについてCAS活性を検定した。HPL
Cデータによれば、pBROC44で形質転換したエス・リビダ
ンスが、下記の特性を有するHPLCのピーク部分を生成す
ることが分かった。

（ｉ）上記のピーク部分は、標準のクラバミン酸ととも
に共溶出する（2.5分）。

（ii）上記ピーク部分は、２つの対照（エス・リビダン
ンスのみと、挿入部なしのpIJ702を含有するエス・リビ
ダンンス）の培養物には生成しなかった。

（iii）pBROC44で形質転換された培養物を、Fe²⁺、α−
ケトグルタレートもしくは基質なしで検定したところ、
上記ピーク部はなかった。

上記の結果は、pBROC44で形質転換された培養物がCAS
活性を発生するというとを示している。

エス・リビダンス/pBROC44から精製されたCASの比活
性は、0.0036μ mole/min/mg/タンパク質であることが
見出された。この値は、エス・グラブリゲルスATCC 270
64（再分離物SC2）由来のCASの値、0.008〜0.06μ mole
/min/mgタンパク質に匹敵するものである。このクロー
ン化されたCASの比活性は、天然のCASの比活性よりわず
かに低いけれども、このデータは、酵素が完全に翻訳さ
れ、pBROC44が完全なCAS遺伝子を含有することを示して
いる。

【図面の簡単な説明】

第１図はDNA Iの制限地図；第２図はDNA IIの制限地
図；第３図はDNA IIIの制限地図；第４図は、DNA III由
来の７つの制限断片の制限地図；第5a図は、組換え体プ
ラスミドpBROC 41Aの制限地図；第5b図は、組換え体プ
ラスミドpBROC 41Bの制限地図；第６図は、組換え体プ
ラスミドpBROC 31の制限地図である。

フロントページの続き (72)発明者アリスン・ジエーン・アールイギリス、ウエスト・サセックスビーエヌ14 ８キユーエイチ、ウオーシングクラレンドン・ロード（番地なし) (56)参考文献ＢＩＯ’ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ２［９］（1984）Ｐ808〜811 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 C12N 1/21

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】クラバラン酸の生合成に関与する少なくと
もひとつの酵素をコードするストレプトミセス・クラブ
リゲルス（ATCC27064）菌株由来のDNA断片を含むDNAで
あって、該DNAが約60kbの長さを有し、下図：のDNA断片（Ｉ）に示す制限部位の配置を有することを
特徴とするDNA。
【請求項２】サブ断片が、下図：に示すDNA断片（III）と同一か、または該DNA断片（II
I）のサブ断片であり、クラバミン酸シンターゼ活性を
有するタンパク質をコードする遺伝子を含む請求項１記
載のDNAのサブ断片。
【請求項３】DNAが、下図：のDNA断片（IX）に示す制限部位の配置を有する請求項
２に記載のDNA。
【請求項４】請求項２に示すDNA断片（III）と高度にス
トリンジェントな条件下で雑種形成し、かつクラバミン
酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするスト
レプトミセス・クラブリゲルス由来のDNA。
【請求項５】エス・クラブリゲルス由来の請求項１〜４
のいずれか１つに記載のDNA。
【請求項６】請求項１〜５のいずれか１つに記載のDNA
を有する組換えベクター。
【請求項７】pWOR10、pBROC44、pBROC31、pBROC41Aまた
はpBROC41Bと命名されている請求項６に記載のベクタ
ー。
【請求項８】高発現ベクターである請求項６に記載のベ
クター。
【請求項９】請求項６〜８のいずれか１つに記載のベク
ターで形質転換された宿主。
【請求項１０】放線菌科の菌株またはイー・コリである
請求項９に記載の宿主。
【請求項１１】天然で、クラバラン酸を産生する請求項
10に記載の放線菌科の菌株の宿主。
【請求項１２】エス・クラブリゲルスATCC 27064または
これらの突然変異体である請求項10または11に記載の宿
主。
【請求項１３】天然にクラバラン酸を産生する宿主か、
または／この宿主の、阻止されたクラバラン酸非産生突
然変異体由来の宿主にクラバラン酸を産生させる方法で
あって、下記工程：（ａ）前記宿主もしくはこの宿主のクラバラン酸非産生
突然変異体を、請求項６〜８のいずれか１つに記載のベ
クターで形質転換させ、ついで（ｂ）得られた形質転換体を適当な条件下で培養し、ク
ラバラン酸を産生させることからなるクラバラン酸の産
生方法。
【請求項１４】形質転換体が請求項12に記載の宿主から
なる請求項13に記載の方法。
【請求項１５】エス・クラブリゲルスATCC 27064から誘
導されるクラバラン酸非産生菌株であって、National C
ollection of Industrial and Marine Bacteriaに寄託
された菌株NCIB 12209。