PT90697B

PT90697B - Processo para a transformacao de uma celula hospedeira com um vector recombinante e metodo para a producao de acido clavulanico por meio de cultura dos transformantes assim obtidos

Info

Publication number: PT90697B
Application number: PT90697A
Authority: PT
Inventors: John Edward Hodgson; Alison Jane Earl
Original assignee: Beecham Group Ltd
Priority date: 1988-06-02
Filing date: 1989-06-01
Publication date: 1995-06-30
Also published as: US5759831A; PT90697A; GR3021071T3; EP0349121B1; JPH0242989A; DE68926893T2; DE68926893D1; ATE140971T1; EP0349121A3; EP0349121A2; ES2090036T3; GB8813055D0; JP3289726B2

Description

O processo para a transformação dos referidos hospedeiros compreende a mistura conjunta do ho£ pedeiro e do vector recombinante, sob condições de transformação , em que o vector recombinante compreender DNA de aproximadamente 60 kb.

O presente invento está relacionado com moléculas de DNA, especialmente moléculas de DNA recombinante e, em particular, com vectores para usar na transformação de um hospedeiro microbiano que contem fragmentos de DNA inseridos portadores de um ou mais codificadores de enzimas envolvidos na biosíntese do ácido clavulânico.

O ácido clavulânico é um inibidor potente da p-lactamose produzido pela bactéria micelial Streptomyces clavuligerus (ver Reading, C., e Cole, M., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1977, 11, 852-857) e é um composto de grande importância clínica uma vez que protege da degradação os antibióticos ^-lactam sensíveis à B-lactamase. Assim, os métodos para aumentar a produção (título) de ácido clavulânico nos processos de fermentação são potencialmente de considerável importância comercial.

Uma abordagem para o problema dõ melhoramento de produção de ácido clavulânico considerado envolve a utilização de técnicas de DNA recombinante usando £3. clavuligerus como células hospedeira. Relacionado com isto foi sugerido que o isolamento de genes envolvidos na biossíntese de ácido clavulânico a partir do DNA cromossómico de £L clavuligerus seria um possível ponto de partida (ver C. R. Bailey et al, Biotechnology, 1984, .2, 808-811). No entanto até agora nenhum DNA foi especificamente identificado como sendo de valor para aumentar o título de ácido clavulânico.

Se bem que se pense que várias enzimas estarão envolvidas na biossíntese do ácido clavulânico, apenas a enzimasácido clavaminico-sintetase foi até agora caracterizada. Ácido clavaminico-sintetase (daquiem diante abreviada para CAS) é uma oxigenase ligada a 2-oxoglutarato que converte ácido proclavamínico em ácido clavamínico (estes são intermediários na via da biossíntese do ácido clavulâmico) Para mais detalhes ver as publicações de S.W. Elson et al em J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1987, páginas 1736, 1738 e 1739.

-4Ver também o Pedido de Patente Europeia Publicação NS 0 213 914.

Para definir claramente o invento é feita referência aos desenhos juntos em que:

Fig.l é um mapa de restrição do DNA I

Fig. 2 é um mapa de restrição do DNA II

Fig. 3 é um mapa de restrição do DNA III

Fig. 4 é um mapa de restrição de sete fragmentos de restrição derivados do DNA III

Fig. 5a é um mapa de restrição do plasmídeo recombinante pBROC 41A;

Fig. 5b é um mapa de restrição do plasmídeo recombinante pBROC 41B; e

Fig. 6 é um mapa de restrição do plasmídeo recombinante pBROC 31.

Nas figuras as abreviaturas Eco RI Pst I etc., são abreviaturas convencionais para endonucleases de restrição e o tamanho aproximado em quilobases (kb) do DNA, conforme determinado em experiências para determinação do tamanho foi efectuado por electroforese em gel de agarose, está indicado. Deve-se entender que as Figuras não pretendem mostrar necessáriamente todos os sítios de restrição possíveis presentes nas fragmentos de DNA ilustrados.

Num primeiro aspecto, o presente invento proporciona DNA compreendendo uma sequência que codifica pelo menos uma enzima envolvida na biosíntese do ácido clavulânico caracterizado por o DNA ter aproximadamente 60 kb de comprimento e ter a configuração dos sítios de restrição mostrados no fragmento de DNA (I) na Figura 1.

Será apreciado que o DNA (Ij do invento não está no seu estado natural (i.e. conforme encon-5trado no DNA cromossómico de S_. clavuligerus) tendo sido purificado e isolado para se separar do DNA delimitante.

A vantagem do invento é que o

DNA (I) compreende um ou mais genes envolvidos na biossíntese de ácido clavulânico os quais podem ser utilizados, como abaixo descrito, para aumentar a produção de ácido clavulânico produzido por um organismo produtor de ácido clavulânico. Uma vantagem particular é que o título de ácido clavulânico pode ser substancialmente aumentado em espécies de Streptomyces tipo selvagem, por exemplo S. clavuligerus ATCC 27064, que na turalmente tende a produzir apenas níveis muito baixos de áci do clavulânico.

Certos fragmentos de restrição do DNA (I) podem também ser utilizados como descrito desde que contenham um ou mais genes intactos envolvidos na biosíntese de ácido clavulânico.

Assim, o presente invento proporciona ainda DNA que é um subfragmento do DNA (I) apresentado r.a figura 1, com a condição de se o fragmento for um subfragmento do DNA (II) mostrado na Figura 2, o subfragmento é idên tico ou é um subfragmento do DNA (III) apresentado na Figura 3 .

O subfragmento de acordo com o in vento poderá ser derivado por clivagem do DNA (I) com enzimas de restrição adequadas por métodos conhecidos. Os fragmentos de acordo com o invento podem também ser preparados por clivagem de DNA maior, subfragmentos com enzimas de restrição ade quadas ou por ligação de subfragmentos mais pequenos usnado métodos conhecidos.

Um subfragmento preferido tem a configuração dos sítios de restrição mostrados no DNA (III) na Figura 3 ou é um seu subfragmento.

-6Subfragmentos particulares do DNA (III) incluem os mostrados na Figura 4, viz:

a )	f ragmento	EcoRI-BamHI	(IV)
b)	fragmento	Bell - Bell	( V )
c)	fragmento	Bell - Bell	(VI)
d)	f ragmento	BglII- BglII	(VII)
e )	fragmento	BglII- BglII	(VIII)
f )	f ragmento	BglII- BglII	(IX)
g)	fragmento	Sphl - Sphl	(X)

Através de experiências adequadas aqui descritas abaixo encontrou-se que o DNA (I) mostrado na Figura 1 compreende uma sequência codificadora de actividade CAS.

Assim, num outro aspecto, o presente invento proporciona DNA compreendendo um gene codificador de uma proteína com actividade ácido clavaminico-sintetase.

O gene para a actividade CAS está situado dentro do fragmento de DNA (IX) mostrado na Figura 4 e portanto, o fragmento de DNA (IX) é um outro subfragmento preferido de acordo com o invento.

Deverá entender-se que o invento inclui DNA que pode não ter a configuração precisa dos sítios de restrição ilustrados nas Figuras 1 a 4 se o referido DNA tiver derivado por técnicas convencionais incluindo deleção, substituição, adição ou inversão de nucleotídeos a partir do DNA de acordo com qualquer aspecto do invento descrito atrás.

-ΊDe preferência o DNA deste invento deriva de S.clavuligerus ATCC 27Θ64 e as Figuras 1 a 4 mos tram o DNA de S.clavuligerus.

No entanto o invento também abran ge sequências de DNA obtidas a partir de outros organismos adequados produtores de ácido clavulânico além de S.clavuligerus , sequências essas que não possuem a configuração dos sí tios de restrição ilustrados nas Figuras 1-4 mas que hibridam de preferência em condições altamente restrictivas, com o DNA (III) apresentado na Figura 3 ou um seu subfragmento e que co dificam uma enzima envolvida na biosíntese do ácido clavulâni^ co.

Outros organismos conhecidos produtores de ácido clavulânico incluem S. jumonjinensis ATCC 29864 e S. katsurahamanus T-272.

Num outro aspecto o invento pro porciona DNA recombinate compreendendo o DNA de qualquer as pecto do invento conforme aqui foi descrito.

De preferência o DNA recombinante do invento compreende um vector recombinante, mais preferive.1 mente um vector capaz de fazer transformação e replicação autónoma num organismo produtor de ácido clavulânico ou um vector a partir do qual o DNA inserido pode ser integrado no cro mossoma do organismo produtor de ácido clavulânico via recombinação homóloga.

Num aspecto preferido o vector re combinante é um vector de expressão elevada.

DNA de acordo com qualquer as pecto deste invento pode ser introduzido em qualquer vector adequado por métodos bem conhecidos, por exemplo por combinação directa de extremos coesivos, formação de caudas homopol^

-8méricas ou por meio de uma molécula adaptadora.

Num aspecto preferido, o vector é derivado de um Streptomycete.

Exemplos específicos de tais vectores incluem os seguintes (1) pIJ 913 (peso molecular 15,7 megadaltons) um vector de baixo número de cópias descrito em hydiate, D.J. et al, Gene (1989) 35 , 223-235;

(2) pIJ 702 (peso molecular 3,7 megadaltons) um vector de elevado número de cópias descrito em katz, E. et al.,

J. Gen. Microbiol (1983), 129, 2703-2714.

(3) pIJ 680 descrito por Hopwood et al., (1985) Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual. The John Innes Foundation.

O vector pode também ser derivado de um organismo que não seja Estreptomicete; por exemplo o cosmídeo pTCF (Grosveld et al., Nuclaic Acids Research, 1982, 10, 6715-6732) ou o plasmídeo pAT 153 (Twigg, A.J. e Sherratt,

D., Nature, 1980, 283., 216-218).

Será apreciado que os vectores recombinantes preparados de acordo com os métodos atrás descritos podem conter o DNA inserido numa de duas orientações possíveis. Os vectores recombinantes contendo ambas as orienta ções estão incluídos dentro do âmbito do invento. Assim, por exemplo, quando o fragmento de DNA inserido tem a configura ção dos sítios de restrição mostrados em IV (Figura 4) e o vector plasmídeo no qual é introduzido é pIJ 413, os mapas de restrição dos plasmídeos recombinantes resultantes, referidos como pBROC 41A e pBROC 41B, estão apresentados nas Figuras 5(a) e 5(b). Destes plasmídeos pBROC 41B /Figura 5(b)/ é o

-9preferido.

Um vector recombinante preferido que pode ser preparado por absorção do DNA(III) na Figura 3 em pAT 153 está apresentada na Figura 6 e foi designado pBROC 31.

Outros vectores recombinantes preferidos de acordo com o invento incluem os designados pWORlO (construídos através da ligação do fragmento de DNA IX como atrás definido no sítio Bam HI de pIJ680) e pBROC44 (construi do por ligação do mesmo fragmento do DNA IX no sítio BglII de pIJ702). No pWORlO o sítio Bell único no fragmento IX é 2,45 kb a partir do sítio Xholúnico no vector pIJ 680. No pBROC 44 o sítio Bell único no fragmento IX é 3kb a partir do sítio Bam HI único do vector pIJ 702.

O DNA inserido num vector pode ser subclonado num outro vector por processos convencionais. Por exemplo, o plasmídeo recombinante pBROC 41B caracterizado como se mostra na Figura 5(b), pode ser obtido por:

a) isolamento do segmento grande EcoRI - Eco RI (14,35kb) a partir de pBROC 31 (Figura 6) por clivagem com Eco RI; e

b) ligação do fragmento Eco RI - Eco RI atrás a pIJ 913, linearizado por clivagem com Eco RI.

Para preparar o DNA e vectores r£ combinantes do invento, pode ser gerado num arranjo ao acaso de fragmentos de DNA cronossómico por digestão parcial de DNA de S. clavuligerus (ATCC 27064) por qualquer enzima de res trição adequada. A endonuclease MBOI e os seus isosquisómeros poderá ser particularmente adequada para este fim.

Os fragmentos de DNA podem então ser fraccionados de acordo com o seu tamanho num gradiente sa

-10lino e as fracções contendo fragmentos à volta de 35-45kb de comprimento podem ser colhidos (ver Grosveld et al, Nucleid Acids Research, 1982, 10 , 6715-6732). Os fragmentos de DNA podem então ser ligados por métodos convencionais shot-gum a um vector clivado para formar um banco de clones.

Caso se pretenda, fragmentos mais pequenos, por exemplo com 10 kb ou mais de comprimento, po dem ser obtidos por fraccionamento num gel de agarose usando eluição electroforética. Estes fragmentos de DNA mais peque nos podem ser usados para formar um banco de clones como descrito atrás.

vector usado para formar o banco de clones pode ser um cosmídeo (capaz de incorporar grandes pedaços de DNA) e para esta finalidade o cosmídeo pTCF (ver Grosveld et al, loc. cit. ) é particularmente adequado.

O plasmídeo pAT 153 pode também com vantagem ser usado na formação de um banco de clones para ser portador de pequenos pedaços de DNA.

Um banco de clones preparado como descrito atrás pode então ser despistado por meios conven cionais usando como sonda de hibridação num pedaço de DNA capaz, quando inserido num vector adequado e usado para trans fomar uma estirpe mutante não produtora de um hospedeiro produtor de ácido clavulânico (um mutante bloqueado), de res taurar a capacidade do hospedeiro para sintetizar ácido clavu lânico. Será apreciado que a sonda será marcada radioactiva 32 mente, por exemplo com P e pode compreender o proprio pedaço de DNA ou consistir num vector contendo o referido DNA des^ de que o referido vector não tenha homologia apreciável com o vector usado para formar o banco de clones a ser despistado.

Sondas adequadas podem ser isola das pelo processo descrito por C.R. Bailey et al., em

-11Biotecnology, 1984, 2., 808-811.

Uma sonda preferida é o plasmídeo pWORl descrita por C.R. Bailey et al., (loc. cit. )

Para realizar o processo descrito em Biotecnology, 1984, 2, 808-811, é necessário ter acesso a S. clavuligerus dclC8, numa estirpe mutante de S. clavulige rus que não possui a capacidade de produzir -ácido clavulânico. Os detalhes relacionados com o depósito, derivação e carac terísticas de S. clavuligerus dC!C8, são as que se seguem.

Depósito

A estirpe S. clavuligerus dclC8 foi depositada na Nation Collection of Industrial and Marine Bacte ria, Aberdeen, Scotland em 19 de Fevereiro de 1986, o depósito (número de acesso NCIB 12209) tendo sido feito nos termos do Tratado de Budapeste sobre Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para Fins de Processo de Patente.

Derivação de S. clavuligerus NCIB 12209

Uma variedade de morfologias foi observada partindo de uma amostra de 5. clavuligerus ATCC 27064. Foram reconhecidos quatorze tipos diferentes. Um destes foi isolado como S. clavuligerus SC-2.

O tratamento de S. clavuligerus 3C-2 com 10 uM de brometo de etídio foi então efectuado em placas de Petri e as placas foram incubadas durante 10 dias.

Os sobreviventes foram testados quanto à produção de ácido clavulânico. Um isolado que não produziu ácido clavulânico detectável quando testado por HPLC (detecção a 230mm) foi desi gnado como estirpe dclC8 e depositado com o número de acesso

NCIB 12209 como aqui descrito atrás.

-12S_. clavuligerus NCIB 12209 constitui um outro aspecto do presente invento.

Taxonomia de 5. clavuligerus NCIB 12209

Encontrou-se que as propriedades toxinómicas e morfológicas de X clavuligerus NCIB 12209 são essencialmente semelhantes às de Í3. clavuligerus ATCC 27064, uma descrição da qual pode ser encontrada na Patente U.S. 3.862.008 e também em Higgens, C.E. e Kastner, R.E., Int. J. Systematic Bacteriol., 1971, 21, 326-331.

Após despiste de um banco de clones preparado como descrito atrás com uma sonda de hibridação adequada, por exemplo pWORl, o DNA inserido correspondendo ou incluindo o DNA do invento pode então ser subclonado por métodos convencionais ou clivado como aqui descrito atrás.

No caso de se obter um pedaço de DNA inadequado ou muito curto no passo de despiste, o fragmen to de DNA isolado pode ele próprio ser usado como sonda dehi bridação (após marcação radioctiva por métodos convencionais, e.g. nick-translation) para identificar outras colónias positivas no banco de clones, o DNA inserido pode ser analisada por mapeamento de restrição e se necessário, modificar por clivagem com enzimas de restrição adequadas.

O processo acima pode ser repetido até se isolar o DNA pretendido de acordo com o invento.

Ainda um outro aspecto o invento proporciona um hospedeiro transformado por um vector recombinante do invento.

O hospedeiro pode ser transformad por técnicas convencionais.

-13Num aspecto o hospedeiro pode ser um não produtor de ácido clavulânico, por exemplo J3. coli ou Í3. lividans. Tais hospedeiros podem ser importantes em processos de manipulação genética e podem com vantagem ser usados para expressar grandes guantidades de enzimas envolvidas na biossíntese de ácido clavulânico, por exemplo uma enzima tendo actividade CAS.

No entanto são preferidos os hospedeiros produtores naturais de ácido clavulânico guando cultivados num meio adeguado ou seus mutantes não produtores blogueados na biossíntese de ácido clavulânico a gual o DNA de acordo com o invento pode então separar o defeito e ser restaurada a síntese de ácido clavulânico e preferencialmente aumentada. Os hospedeiros deste tipo preferidos são Streptomycetes incluindo clavuligerus ATCC 27064, Í3. jumonjinensis ATCC 29864 e S_. katsurahamanus T-272 ou seus derivados.

A vantagem de empregar tais hospedeiros é gue nas condições adeguadas pode-se obter um aumento do título de ácido clavulânico após transformação com um vector recombinante de acordo com o invento.

Assim, o presente invento proporciona ainda um método para a produção de ácido clavulânico num hospedeiro gue é naturalmente um produtor de ácido clavulânico ou a partir de um mutante blogueado não produtor do referido hospedeiro, método em gue compreende os passos de:

(à) transformação do referido hospedeiro ou do referido mutante não produtor com um vector recombinante de acordo com o invento; e (b) cultura dos transformantes assim formados em condições adeguadas de modo a ocorrer a produção de ácido clavulânico .

-14Na especificação da Patente U.K.

N2 1.5Θ8.977 são dados métodos gerais para a cultura de um organismo produtor de ácido clavulânico de modo a obter-se ácido clavulânico.

No método acima o hospedeiro é de preferência £. clavuligerus ATCC 27064 ou é derivado dele.

De preferência o vector recombinante usado no método acima é pWORlO conforme definido atrás.

Os exemplos que se seguem ilustram o invento.

EXEMPLO 1

Construção de uma biblioteca de DNA de S. clavuligerus ATCC

27064 no vector cosmídeo pTCF

DNA cromossómico de £. clavuligerus ATCC 27064 foi isolado como descrito na Publicação do Pedido de Patente Europeia NS 0.233.715. Três amostras de 20 pg de DNA cromossómico foram parcialmente digeridas com Mbo I (0,5 unidades por pg de DNA) durante 5 minutos, 10 minutos e 15 minutos em condições normalizados. As três amostras foram reunidas e fraccionadas num gradiente salino (1,25M-5M NaCl)/ /Tris EDTA e centrifugadas durante 3 horas a 39 K rpm num rotor Beckman SW40.1. Colheram-se doze fracções e os DNAs isolados das fracções 5-9 deram 10 ug do fragmento de DNA Mbo I com cerca de 35-45kb de tamanho.

A preparação dos braços do vector pTCF foi efectuada de acordo com Grosveld, F.G., Lund, T., Murray, E.J., Mellor, A.L., Dohl, H.H., Flavell, R.A., Nucleic Acids Research (1982), 10 , 6715-6732.

Os fragmentos de DNA de £. clavuligerus e braços de vector foram ligados numa proporção de 5:3:3, a mistura encapsidada e usada na transdução de £. coli ED8767 como descrito em Grosveld et al. (loc. cit.). Este processo deu 4 x 10θ colónias por ug de DNA encapsidado.

EXEMPLO 2

Preparação de DNA I

5000 colónias de EL coli ED8767 contendo pTCF com inserções de DNA de S. clavuligerus ATCC 27064 foram imobilizadas e lisadas em filtros de nitrocelulose. O plasmídeo pWORl (Bailey, C.R. et al., (loc. cit.) foi isolado, sujeito a nick-translation e usado como sonda para despiste dos filtros através de técnicas convencionais do hibridação de colónias.

Obtiveram-se duas colónias que hibridaram, as quais quando combinadas contêm o fragmento de DNA I de 60 kb ilustrado na Figura 1.

-16Construção de uma biblioteca de DNA de S. clavuligerus ATCC

27064 em pAT!53

EXEMPLO 3

DNA cromossómico de S. clavuligerius ATCC 27064 foi isolado como descrito na Publicação do Pedido de Patente Europeia 0233 715.

ug de DNA de S. clavuligerius ATCC 27064 foi parcialmente digerido com Mbo I e fraccionado num gel de agarase. Isolou-se DNA a partir de fracções con tendo fragmentos maiores do que lOkb de tamanho por eluição electroforética como descrito por Maniatis, T., Fritsch, E.F. Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning; A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory).

ug de pATl53 (Twigg e Sherratt (loc. cit.)) foi digerido com Bam HI e tratado com fosfatase alcalina de intestino de vitela para remover os grupos fosfato terminais e evitar a recircularização. O vector e fragmentos maiores do que 10 kb de DNA de S. clavuligerus ATCC 27064 foram ligados uns aos outros e usados para transformar E. coli DH1.

EXEMPLO 4

Preparação de DNA III

-176000çcolónias de E. coli DH1 contendo pAT 153 com inserações de S, clavuligerus ATCC 27064 foram imobilizadas e lisadas em filtros de introcelulose. O fragmento inserção SpH I - Bgl II de 2,2kb de pWORl /sítios

3-4 na Figura 3 de Bailey et al (loc. cit.)/ foi isolado, sujeito a nick-translation e usado como sonda no despiste dos filtros por técnicas convencionais de hibridação de colónias.

Obteve-se uma colónia positiva para hibridação que contem o fragmento de DNA III de 13,lkb ilustrado na Figura 3.

EXEMPLO 5

Aumento do titulo de ácido clavulânico em S. clavuligerus estirpe SC2 pelo plasmídeo pWORlO

O plasmídeo pWORlO foi construído por ligação do fragmento IX BglII - BglII (Figura 4) no sítio Bam HI de pIJ680 (Hopwood et al., 1985 Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual. The Jonh Innes Foundation ) .

O plasmídeo pXORlO foi usado para transformar £. clavuligerus SC2 (reisolada do tipo selvagem) por um método análogo ao descrito em C.R. Bailey et al. (loc. cit.). Os transformantes foram repicados e semeados em meio M5D (Dextrin, 1,0%; f<₂HPO₄ , 0,1%; MgSO₄ , 0,1%; NaCl, 2,1%; (NH₄)₂SO₄, 0,1%; CaCO^, 0,4%; Micronutrientes (FeSO₄ 0,0001%; MnCl₂ 0,0001%; ZnSO₄ , 0,0001%),; 2,0% Agar) contendo 5 jig/ml de tiostreptona. As células de cada um dos transformantes fo-18ram transferidas para M5D e crescidas durante 6 dias a 26QC.

As placas de bioensaio foram então cobertas com agar com sangue (Oxoid) contendo a estirpe de Klebsiella aerogenes como descrito em Reading, C. e Cole, M. (1977) Antimicrob. Agents Chemother., 11, 852-857, 4% de sais de tetrazólio e 5 ug/ml de penicilina G. Após incubação durante a noite a 26QC mediram-se zonas de inibição. Os transformantes que apresentaram zonas maiores do que a cultura testemunha foram transferidos para cultura em frascos de agitação para avaliação precisa do título. As células foram inoculados em 25 ml de um meio de sementeira adequado como descrito na Especificação de Patente U.K. NQ 1 508 977 e cultivadas durante 3 dias a 26QC com agitação, 1 ml de cultura foi usado para inocular um meio de fase final como descrito na Especificação de Patente U.K. NQ 1 508 977 e cultivado a 26QC durante quatro dias.

Após três e quatro dias de crescimento retiraram-se amostras do caldo de cultura e testaram-se quanto à produtividade de ácido clavulãnio como descrito em Bird, A.E. et al (1982) Analyst, 107, 1241-1245 e:Foulston

M., e Reading, C. (1982) Antimicrol Agents Chemother., 22, 753-762.

Resultados

Dos isolados testados um deu títulos aumentados comparado com S_. clavuligerus SC2 dando até 53% de vantagem em culturas crescidas na ausência de tiostreptona e 39% de vantagem em culturas cultivadas na presença de tiostreptona. Em todos os casos se registou a presença de pWORlO.

-19EXEMPLO 6

Transformação de S. lividans com pBROC44 pBROC 44 foi preparado através da ligação do fragmento IX Bgl II-Bgl II /Figura 4) no sítio Bgl II de pIJ 702 (sec Hopwood et al. loc. cit.).

Esporos de S_. lividans foram usados para inocular 25 ml de meio de sementeira para protoplastos (caldo de triptona de soja + 1% de maltose) num frasco de agitação de 250 ml e incubado durante três dias a 30SC com agitação. 1 ml da cultura de sementeiras foi transferido para 25 ml de meio de protoplasto fase final /compreendendo 15 ml YEME (Hopwood et al., loc cit) com 1% de maltose mais 10 ml de PBS mais 0,5% de glicina mais 1% de maltose/ em frascos de agitação de 250 ml contendo uma mola enrolada. Fez-se incubação durante a noite (16 h) a 302C. A cultura foi colhida para tubos de centrífuga esterilizados e o micélio lavado em 10,3% de sacarose. O sedimento de células foi ressuspenso em 1,5 ml de mistura de lisozina e incubado a 25SC durante 1 hora, misturando ocasionalmente. A formação de protoplastos foi controlada usando um microscópio. Adicionou-se tampão para protoplas_ tos (PB) (4 ml) (Hopwood et al., loc cit) e, mistura-se a suspensão de células foi então filtrada através de filtros de-Ã algodão esterilizado. A suspensão de protoplastos foi centrifugada, lavada rápidamente em PB e finalmente ressuspensa em 2 ml de PB. A concentração de protoplastos foi medida usando uma câmara de contagem Thoma.

x 10 protoplastos foram colocados num novo tubo de centrífuga, adicionou-se 5 ml de PB e sedimentados por centrifugação. Os protoplastos foram ressuspensos em aprox. 400 pl de PB. Adicionaram-se 5 jil de mistura de ligação à suspensão de protoplastos e dentro de 30 segundos

-20adicionou-se 0,5 ml de meio de transformação Chopwood et al., loc cit., pag. 246). Após 10 segundos adicionou-se 5 ml de PB e os protoplastos foram centrifugados.

Os protoplastos foram ressuspensos , 3 em 1 ml de PB e feitas diluições em PB ate 10 . Amostras de 0,1 ml de cada uma das diluições foram semeadas em meio de regeneração R2YE; ver thompson. C.J. Ward, J.M. e Hopwood,

D.A. (1980) Nature, 286, 525-527. As placas de agar foram incubadas a 30°C. Após 20 horas as placas foram cobertas com 2 ml de agar nutritivo contendo 500 jig/ml de tiostreptona. As placas de agar foram incubadas durante mais 3 dias. Os transformantes resistêntes à tiostreptona foram repicados das placas de regeneração e semeados em agar R2YE fresco. Após 3-4 dias de crescimento os transformantes foram inoculados em meio de cultura contendo 50 jig/ml de tiostreptona e cultivados com agitação durante 2 dias a 30QC. O plasmídeo foi isolado de acordo com o método de Hopwood et al. ,(loc cit) . A construção correcta designada pBROC44 foi confirmada por digestão com endonucleases de restrição como descrito por Maniatis et al (loc. cit) (1982).

EXEMPLO 7

Demonstração de actividade de ácido clavamínico-sintetase em S. lividans transformado com pBROC44

As experiências descritas abaixo demonstram a presença de ácido clavamínico-sintetase (CAS) em EL lividans que foi transformado por pBROC44 (Exemplo 6_) .

Foram examinadas três culturas:

-21(i) hospedeiro lividans;

(ii) S^. lividans contendo pIJ702 e (iii) S_. lividans contendo pBROC44 (Exemplo 6).

As culturas (i) e (ii) actuaram como testemunhas negativas para (iii).

Devido ao vector pIJ702 conter um locus parai resistência à Tiostreptona, as duas culturas conten do este vector foram cultivadas na presença de tiostreptona (50 pg/ml). O próprio hospedeiro foi cultivado sem tiostreptona.

meio usado foi o seguinte:

Extracto de levedura Difco

Peptona Bacto Difco

Extracto de malte oxóide

Glucose

Sucrose g )

g)

g) 1 litro de ^H2°

g)

340 g) e foi suplementado após concentrações finais de autoclavagem com MgC^ 5 mM, respectivamente.

e glicina para ca como de cultivadas ml a 31SC.

O meio foi inoculado com uma úniagar de uma placa de esporos e as culturas foram em frascos de agitação com molas de 250 ml ou 500

O micélio foi colhido por centrifugação após 48 h de crescimento e foi sonicado (3 pulsos de 5 segundos) para libertar as enzimas intracelulares no mesmo

-22volume de 50 mM Tris HCl/lOmM MgC^/lOmM KCl/10% glicerol/lmM PMSF (cloreto de fenilmetilsulfonilo)/pH 7,5.

Para testar a actividade CAS, o sonicado centrifugado (115 £l) foi incubado com Fe^⁺ (15 ul, mM) , p(-cetoglutarato (15 jil, lOmM) e o substrato para CAS /5-amino-3-hidroxi-2-( 2-oxoazetidin-l-il) valerato ; ácido proclavamínico; como descrito em ΕΡ-Α^Ο 213 914/::(5 ul, 5 mg/ml) durante 5 minutos à temperatura ambiente, seguido de incubação com imidazole (37,5 μΐ, 20%, pH 6,8) durante 10 minutos, seguido de detecção do produto derivatizado por HPLC usando uma coluna Waters C18 de 30 cm equilibrada em 0,1 M NaH^PO^/ /6% MeOH/pH 3,2 a 2 ml/min, detecção a 312 nm. Fez-se cromatografia de permeação em gel mole a 4°C usando uma coluna de

2,6 x 45 cm de Ultrogel ACA 54 equilibrado em tampão de sonicação (ver atrás) a 20 ml/hr. As fracções foram testadas quanto à actividade de CAS como atrás. Os ensaios de proteína foram efectuados de acordo com o método de Bradford (1976) Analytical Biochem. 72, 248-254.

Resultados

Culturas de lividans sozinha, tL· livióans contendo o vector pIJ722 e S.. lividans transformada com pBROC44 foram cultivadas durante 48 horas para dar um caldo opaco. O micélio de cada uma das culturas foi colhido e sonicado e o material sonicado centrifugado foi testado quanto à actividade CAS. Os dados de HPLC mostraram que lividans transformado com pBROC44 deu origem a um pico de HPLC com as seguintes características:

(i) co-elui (2,5 mins) com o padrão de ácido clavaminico, (ii) está ausente das duas culturas testemunhas (£. clividans sozinho e S. lividans contendo pIJ702 sem a inserção);

-23(iii) a sua ausência quando a cultura transformada com pBROC44 é testada na ausência de Fe^ ⁺, pk-cetoglutarato ou o substracto.

Esta evidência mostra que a cultura transformada com pBROC44 dá origem a actividade CAS.

A actividade específica da CAS purificada a partir de S^. lividans/pBROC44 verificou-se ser 0,0036 pmole/min/mg de proteína. Isto compara-se aos valores entre 0,008 e 0,06 umoles/min/mg de proteína para CAS derivado de Í3. clavuligerus ATCC 27064 (reisolado SC2 ) . Se bem que a actividade específica do CAS cionado seja ligeiramente inferior à do CAS nativo, os resultados indicam que a enzima é traduzida intacta e que pBROC44 contem o gene CAS completo.

Claims

lâ. - Processo para a transformação de uma célula hospedeira com um vector recombinante compreendendo uma sequência de DNA que codifica pelo menos uma enzima envolvida na biossíntese de ácido clavulânico, caracterizado por compreender a mistura do hospedeiro e do vector recombinante e do vector recombinante em condições de transformação convencional, e por o vector recombinante compreender DNA que tem aproximadamente 60 kb de comprimento e tem a configuração dos sítios de restrição apresentados no fragmento de DNA (I) na Figura 1:

5kb j—I 1/ y

3 & = S o* S § ι—ι-1-1

U)

IBOkb)
2â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o vector recombinante compreender um subfragmento do DNA (I) com a condição de se o subfragmento fôr um subfragmento de DNA (II) apresentado na Figura 2:

— — α——

Ikb ·/»

I

Fig.2

-25V» V» «/» βο ·» *

J_I_LLZy (leOkb) (III o subfragmento é idêntico do fragmen.to de DNA (III) apresentado na Figura 3:

-1,1 I

OD l

·*»

L vt

L cd α v,

1/ I I (III) (13.1 kb)

Fig.3 ou é um seu subfragmento.
3â. - Processo para a transformação de uma célula hospedeira com um vectòr recombinante conpreendendo uma sequência de DNA codificadora de uma proteína com actividade de síntese do ácido clavamínico caracterizado por se misturar o hospedeiro e o vector recombinante em condições convencionais de transformação.
4â. - Processo de acordo com a reivindicação 2 ou com a reivindicação 3, caracterizado por o DNA ter a configuração dos sítios de restrição mostrados no fragmento de DNA (IX) da Figura 3:

Fig.3
5â. - Processo para a transformação de uma célula hospedeira com um vector recombinante compreendendo DNA que foi obtido por delecção, substituição, inserção de nucleotídeos de uma sequência de DNA conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou que compreende DNA que híbrida com o fragmento de DNA (III) tendo a configuração dos sítios de restrição apresentados na Figura 3:

<D ·/» “ (D “ St vtattB *

I -I_1/ I -L(13.1 kb) (III)

Fig.3

-27ou um seu subfragmento, caracterizado por se misturar o hospedeiro e o vector recombinante em condições de transformação convencionais.

quer uma das reivindicações derivar de S. clavuligerus.
6i. - Processo de acordo 1 a 5, caracterizado por com qualo DNA reivindicação 6, pWORlO, pBROC44,
7â. - Processo de acordo com a caracterizado por o vector ser designado por pBROC31, pBROC4lA ou pBROC41B.
8ã. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o vector ser um vector de elevado nível de expressão.
9ã. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por o hospedeiro ser um Streptomycete ou E. coli.

lOã. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o Streptomycete ser um produto natural de ácido clavulânico.

llâ. - Processo de acordo com a reivindicação 9 ou com a reivindicação 10, caracterizado por o hospedeiro ser £. clavuligerus, ATCC27064, £. jumonjinensis ATCC 29864 ou S_. katsurahamanus T-272.
12^. _ Método para a produção de

-28ácido clavulânico num hospedeiro que é um produtor natural de ácido clavulânico ou num mutante não produtor bloqueado do referido hospedeiro, caracterizado por compreender:

a) a transformação do referido hospedeiro ou do referido mutante não produtor pelo processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11 e

b) cultura dos transformantes assim formados em condições adequadas de modo a ocorrer produção de ácido clavulânico.