CN109913392A - 高产克拉维酸的棒状链霉菌菌株、其胁迫选育方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高产克拉维酸的棒状链霉菌菌株、其胁迫选育方法及其用途，属于生物技术领域。本发明公开了一株高产克拉维酸的棒状链霉菌菌株，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC No.：2019110，其保藏时间为：2019年2月25日。本发明通过在培养基中添加胁迫物（青霉素和克雷伯氏菌），并通过合适的胁迫物加入方式、加入时机、培养条件、菌株的分离培养过程等，培育出高产克拉维酸的棒状链霉菌菌株B‑77。由本发明方法得到的菌株遗传稳定性好，该菌株产克拉维酸的能力显著提升，克拉维酸产量大、效价高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种高产克拉维酸的棒状链霉菌菌株、其胁迫选育方法及其用途。
背景技术
克拉维酸(Clavulanic Acid，CA)从棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)发酵液中分离纯化得到的β-内酰胺酶抑制剂，其分子为一个稠合双环β-内酰胺结构，它以氧原子取代了青霉素及头孢菌素噻唑环中的硫原子，具有作为β-内酰胺酶抑制剂所必须的3R，5R立体化学结构。克拉维酸本身的抗菌活性很弱，但它是强力、广谱且不可逆的β-内酰胺酶抑制剂。不论在体外或体内都能同耐药的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，特别是同肺炎克雷伯氏菌、奇异变形菌和金黄色葡萄球菌所产生的β-内酰胺酶生成牢固不可逆的结合物，从而抑制耐药性细菌对β-内酰胺类抗生素的分解作用，恢复青霉素类及头孢菌素类抗生素对许多产生β-内酰胺酶的耐药菌的抗菌活性。
关于菌种选育方法很多，诸如化学诱变、物理诱变和原生质体融合等，以及代谢控制选育、基因工程改造方法等。中国专利申请CN201710411496.5公开了一种高产曲酸米曲霉的选育方法，以微波和紫外复合诱变选育，筛选出曲酸高产菌株；左志晗等采用原生质体融合技术，将克拉维酸生产菌——棒状链霉菌甘油耐受性突变株和舒巴坦钠耐受性突变株进行了原生质体融合得到一株克拉维酸高产菌株；王艳萍等通过紫外线诱变育种，选育出2株克拉维酸高产菌株，并具有良好的遗传稳定性；中国专利申请CN201610739207.X公开了一株链霉菌及用它制备硫化物氧化酶制剂的方法，利用紫外线与硫酸二乙酯复合诱变的方法进行菌种诱变而获得的硫化物氧化酶高产突变菌株。中国专利申请CN201410782691.5公开了一种胁迫条件下低蛋白酶A外泌酵母菌株及其构建方法，该方法通过敲除蛋白酶A编码基因即PEP4基因的一个等位基因的同时过表达编码液泡分选受体的MRL1基因来实现调节蛋白酶A胞内外分泌。
目前菌种诱变存在以下问题：
化学诱变、物理诱变和原生质体融合等高产菌株选育方法存在正负突变选育方向性不确定、选育周期长、选育效率低等问题。
代谢控制选育、菌种基因工程改造方法具有所需设备多、方法复杂、需知晓目标产物合成途径或阐明产物合成基因功能序列等问题。
发明内容
为了解决现有技术正负突变选育方向性不明确、选育周期长、选育效率低、设备投入高等问题，弥补现有技术的不足，本发明提供了一种棒状链霉菌高产菌株、其用途及其胁迫选育方法。
本发明的技术方案为：
一种高产克拉维酸的棒状链霉菌菌株，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC No.：2019110，其保藏时间为：2019年2月25日。
所述棒状链霉菌菌株的胁迫选育方法，在棒状链霉菌分离培养基中加入青霉素和克雷伯氏菌进行胁迫选育。
作为优选方案，所述棒状链霉菌菌株的胁迫选育方法，包括步骤：
1）菌种活化
冷冻的棒状链霉菌菌液解冻后，滴入棒状链霉菌分离培养基斜面，划线培养；25~30℃培养4~10天；
2）菌种冷冻保存
步骤1）活化培养后，在斜面中加入甘油保存液，然后转移到冻存管中，-20℃下冷冻保存；
3）菌液稀释
取出冻存管，解冻后取菌液，将菌液用生理盐水稀释10-4~10-7倍，菌液稀释后涂棒状链霉菌分离培养基平板，22~28℃培养6~10天；
4）胁迫培养
配制棒状链霉菌分离培养基，加入青霉素和克雷伯氏菌并混合均匀，将其均匀平铺到步骤3）的平板上，并确保单菌落被覆盖，22~28℃培养10~15天；
5）挑取抑菌圈直径大的菌种，接种到棒状链霉菌分离培养基斜面上，22~28℃培养9~14天，取菌体加甘油保存液，转移到冻存管中，-80℃下冷冻保存。
作为优选方案，步骤1）、步骤3）、步骤4）、步骤5）中所述的棒状链霉菌分离培养基为：酵母粉0.4%、葡萄糖0.4%、麦芽粉1%、琼脂粉2.0%、PH调制8.2。
作为优选方案，步骤4）中，青霉素的添加量为10mg~20mg/mL棒状链霉菌分离培养基；克雷伯氏菌的添加量为0.5~2mL/mL棒状链霉菌分离培养基。
进一步地，克雷伯氏菌菌液的OD600为0.05~0.15。
所述棒状链霉菌菌株在提高克拉维酸产量的上用途。
作为优选方案，所述棒状链霉菌菌株在提高克拉维酸产量的上用途，将所述棒状链霉菌菌株接种至发酵培养基，22~28℃下摇床培养80~120小时。
进一步地，所述发酵培养基为：大豆蛋白 5.2%、糊精 0.96%、MOPS 1.05%、甘油1.5%、KH2PO4 0.12%、CaCl2 0.01%、FeCl3 0.003%、ZnSO4·7H2O 0.0005%、MgSO4 0.0005%、CuCl2 0.0005%、豆油 2.2%、PH调制7.0。
本发明的有益效果为：
本发明通过在培养基中添加胁迫物（青霉素和克雷伯氏菌），并通过合适的胁迫物加入方式、加入时机、培养条件、菌株的分离培养过程等，培育出高产克拉维酸的棒状链霉菌菌株B-77。该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC No.：2019110，其保藏时间为：2019年2月25日。
本发明菌株遗传稳定性好，该菌株产克拉维酸的能力显著提升，克拉维酸产量大、效价高。
附图说明
图1为胁迫选育的抑菌圈图。
具体实施方式
一种高产克拉维酸的棒状链霉菌菌株B-77（Streptomyces clavuligerus B-77），该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC No.：2019110，其保藏时间为：2019年2月25日；保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。
所述棒状链霉菌菌株的胁迫选育方法，在棒状链霉菌分离培养基中加入青霉素和克雷伯氏菌进行胁迫选育。
作为优选方案，所述棒状链霉菌菌株的胁迫选育方法，包括步骤：
1）菌种活化
冷冻的棒状链霉菌菌液解冻后，滴入棒状链霉菌分离培养基斜面，划线培养；25~30℃培养4~10天；
2）菌种冷冻保存
步骤1）活化培养后，在斜面中加入甘油保存液，然后转移到冻存管中，-20℃下冷冻保存；
3）菌液稀释
取出冻存管，解冻后取菌液，将菌液用生理盐水稀释10-4~10-7倍，菌液稀释后涂棒状链霉菌分离培养基平板，22~28℃培养6~10天；
4）胁迫培养
配制棒状链霉菌分离培养基，加入青霉素和克雷伯氏菌并混合均匀，将其均匀平铺到步骤3）的平板上，并确保单菌落被覆盖，22~28℃培养10~15天；
5）挑取抑菌圈直径大的菌种，接种到棒状链霉菌分离培养基斜面上，22~28℃培养9~14天，取菌体加甘油保存液，转移到冻存管中，-80℃下冷冻保存。
作为优选方案，步骤1）、步骤3）、步骤4）、步骤5）中所述的棒状链霉菌分离培养基为：酵母粉0.4%、葡萄糖0.4%、麦芽粉1%、琼脂粉2.0%、PH调制8.2。
作为优选方案，步骤4）中，青霉素的添加量为10mg~20mg/mL棒状链霉菌分离培养基；克雷伯氏菌的添加量为0.5~2mL/mL棒状链霉菌分离培养基。
进一步地，克雷伯氏菌菌液的OD600为0.05~0.15。
所述棒状链霉菌菌株在提高克拉维酸产量的上用途。
作为优选方案，所述棒状链霉菌菌株在提高克拉维酸产量的上用途，将所述棒状链霉菌菌株接种至发酵培养基，22~28℃下摇床培养80~120小时。
进一步地，所述发酵培养基为：大豆蛋白 5.2%、糊精 0.96%、MOPS 1.05%、甘油1.5%、KH2PO4 0.12%、CaCl2 0.01%、FeCl3 0.003%、ZnSO4·7H2O 0.0005%、MgSO4 0.0005%、CuCl2 0.0005%、豆油 2.2%、PH调制7.0。
实施例1
1.1实验材料：
棒状链霉菌B-7；ATCC 27064；
克雷伯氏菌：克雷伯氏菌ATCC 31488；
棒状链霉菌分离培养基：酵母粉0.4%、葡萄糖0.4%、麦芽粉1%、琼脂粉2.0%、PH调制8.2；
发酵培养基为：大豆蛋白 5.2%、糊精 0.96%、MOPS 1.05%、甘油 1.5%、KH2PO4 0.12%、CaCl2 0.01%、FeCl3 0.003%、ZnSO4·7H2O 0.0005%、MgSO4 0.0005%、CuCl2 0.0005%、豆油2.2%、PH调制7.0。
1.2实验过程：
高产克拉维酸的棒状链霉菌菌株B-77的胁迫选育方法，包括步骤：
1）菌种活化：-80℃冰箱中取出冷冻的棒状链霉菌B-7，放置室温解冻后，用移液枪取10uL 滴入棒状链霉菌分离培养基斜面上，采用“Z”字划线法划线。28℃培养 7天，操作应在超净台内无菌操作；
2）菌种保存：在培养7天后的斜面里加入30%甘油保存液，然后用移液枪转移到冻存管中，贴上标签，置-20℃冰箱保存；
3）取冻存管，放置室温解冻后，取1ml菌液，放入9ml生理盐水中摇匀，记为10-1倍，再吸取10-1 倍稀释液1ml于另一9ml生理盐水中摇匀，记为10-2 倍。以此类推稀释至10-6倍，取10微升涂棒状链霉菌分离培养基平板，25℃恒温室培养8天；
4）配制棒状链霉菌分离培养基150ml，加青霉素0.0874ml(12.012mg/ml)和克雷伯氏菌ATCC31488菌液（OD600为0.1）1.5ml，混合均匀，加至步骤3）的平板中进行胁迫选育，加量5ml/平板，加入后迅速摇晃，使其均匀平铺到平板上，并确保单菌落被覆盖，继续25℃恒温室培养12天；胁迫选育的抑菌圈如图1所示；
5）挑取抑菌圈直径大的几个菌株，菌株分别编号：B-71、B-72、B-73、B-74、B-75、B-76、B-77，接种到棒状链霉菌分离培养基斜面上，25℃恒温室培养11天，取菌体加30%甘油保存液，转冻存管并放到-80℃冰箱保存；
6）取5）冻存管，放置室温解冻后，用接种环蘸取冷冻液，采用“Z”字划线法分别接种到棒状链霉菌分离培养基斜面上；
7）将步骤6）中的斜面接种到三角瓶发酵培养基中，25℃，250rpm摇床培养至96h后，测发酵液中克拉维酸的效价；棒状链霉菌B-7的克雷伯氏菌胁迫选育药瓶结果如表1所示。
克拉维酸检测方法为：
样品处理：发酵液采用6mol/L的盐酸调pH至3.5~4.0，3500rpm离心10min，去除菌丝体和固体残渣，吸取5ml上清液，12000rpm离心10min后，用重蒸水适当稀释，供HPLC检测。
HPLC测定的色谱条件：色谱柱C18ODS（4.6mm×150mm），柱温25℃。检测器：VWD(SPD-10A)，检测波长220nm，流动相：0.02MKH2PO4:乙睛=400:12（体积比）流速0.7ml/min，进样量10μL。
表1 棒状链霉菌B-7的克雷伯氏菌胁迫选育药瓶结果。
由上表可知，突变菌株B-77的克拉维酸效价最高，通过摇瓶筛选出的该菌株B-77比初始菌株产量提高7.8%。
实施例2 棒状链霉菌菌株B-77的遗传稳定性研究
1.1实验材料：
突变菌株：棒状链霉菌菌株B-77；
斜面培养基：酵母粉2%、葡萄糖0.4%、麦芽粉1%、琼脂粉2.0%、PH调制8.2；
发酵培养基：大豆蛋白 5.2%、糊精 0.96%、MOPS 1.05%、甘油 1.5%、KH2PO4 0.12%、CaCl2 0.01%、FeCl3 0.003%、ZnSO4·7H2O 0.0005%、MgSO4 0.0005%、CuCl2 0.0005%、豆油2.2%、PH调制7.0。
1.2实验过程
1、将突变菌株棒状链霉菌菌株B-77接种至灭菌的斜面培养基，进行传代培养，连续传6代，培养好的菌株放4℃冰箱保存；
2、把培养好的斜面接种到三角瓶发酵培养基中，25℃，250rpm摇床培养96小时候，测发酵液中克拉维酸的效价，结果如表2所示。
表2 突变菌株B-77遗传稳定性实验结果
由上表可知诱变菌株B-77五代以内产棒酸能力均保持98%以上。证明该菌株性状比较稳定，不回复突变，可稳定遗传。说明肺炎克雷伯氏胁迫棒状链霉菌菌种诱变提高棒酸产量的一种育种方法有效可行。
Claims (9)
1.一种高产克拉维酸的棒状链霉菌菌株，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC No.：2019110，其保藏时间为：2019年2月25日。
2.如权利要求1所述棒状链霉菌菌株的胁迫选育方法，其特征在于：在棒状链霉菌分离培养基中加入青霉素和克雷伯氏菌进行胁迫选育。
3.如权利要求2所述棒状链霉菌菌株的胁迫选育方法，其特征在于，包括步骤：
1）菌种活化
冷冻的棒状链霉菌菌液解冻后，滴入棒状链霉菌分离培养基斜面，划线培养；25~30℃培养4~10天；
2）菌种冷冻保存
步骤1）活化培养后，在斜面中加入甘油保存液，然后转移到冻存管中，-20℃下冷冻保存；
3）菌液稀释
取出冻存管，解冻后取菌液，将菌液用生理盐水稀释10-4~10-7倍，菌液稀释后涂棒状链霉菌分离培养基平板，22~28℃培养6~10天；
4）胁迫培养
配制棒状链霉菌分离培养基，加入青霉素和克雷伯氏菌并混合均匀，将其均匀平铺到步骤3）的平板上，并确保单菌落被覆盖，22~28℃培养10~15天；
5）挑取抑菌圈直径大的菌种，接种到棒状链霉菌分离培养基斜面上，22~28℃培养9~14天，取菌体加甘油保存液，转移到冻存管中，-80℃下冷冻保存。
4.如权利要求3所述棒状链霉菌菌株的胁迫选育方法，其特征在于，步骤1）、步骤3）、步骤4）、步骤5）中所述的棒状链霉菌分离培养基为：酵母粉0.4%、葡萄糖0.4%、麦芽粉1%、琼脂粉2.0%、PH调制8.2。
5.如权利要求3所述棒状链霉菌菌株的胁迫选育方法，其特征在于：步骤4）中，青霉素的添加量为10mg~20mg/mL棒状链霉菌分离培养基；克雷伯氏菌的添加量为0.5~2mL/mL棒状链霉菌分离培养基。
6.如权利要求5所述棒状链霉菌菌株的胁迫选育方法，其特征在于：克雷伯氏菌菌液的OD600为0.05~0.15。
7.权利要求1所述棒状链霉菌菌株在提高克拉维酸产量的上用途。
8.权利要求7所述棒状链霉菌菌株在提高克拉维酸产量的上用途，其特征在于：将所述棒状链霉菌菌株接种至发酵培养基，22~28℃下摇床培养80~120小时。
9.权利要求8所述棒状链霉菌菌株在提高克拉维酸产量的上用途，其特征在于，所述发酵培养基为：大豆蛋白 5.2%、糊精 0.96%、MOPS 1.05%、甘油 1.5%、KH2PO4 0.12%、CaCl2 0.01%、FeCl3 0.003%、ZnSO4·7H2O 0.0005%、MgSO4 0.0005%、CuCl2 0.0005%、豆油 2.2%、PH调制7.0。
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2019
- 2019-03-30 CN CN201910253775.2A patent/CN109913392A/zh active Pending
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