CN111621434B - 棒状链霉菌、应用、发酵培养基及克拉维酸的制备方法 - Google Patents

棒状链霉菌、应用、发酵培养基及克拉维酸的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开棒状链霉菌、应用、发酵培养基及克拉维酸的制备方法；所述棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19076；公开了棒状链霉菌在生产克拉维酸中的应用；公开了克拉维酸的制备方法包括：发酵所述棒状链霉菌，得到克拉维酸；该棒状链霉菌遗传稳定性好，克拉维酸产量大，效价高。

Description

棒状链霉菌、应用、发酵培养基及克拉维酸的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种棒状链霉菌、应用、发酵培养基及克拉维酸的制备方法。
背景技术
青霉素、头孢菌素等β-内酰胺类抗生素的滥用导致部分病原菌产生β-内酰胺酶，从而降解该类抗生素产生耐药性。克拉维酸(clavulanic acid)是由棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)产生的天然β-内酰胺酶抑制剂，可协同增强青霉素和头孢菌素对产生β-内酰胺酶耐药菌的抗菌活性，极大提高病原菌对β-内酰胺类抗生素的敏感性。临床用的奥格门汀为克拉维酸与阿莫西林的配伍制剂，替门汀为替卡西林钠及克拉维酸钾配伍制剂，克拉维酸临床应用广泛。
目前，克拉维酸的工业化生产主要是通过微生物发酵方法生产，其发酵水平是决定克拉维酸生产成本的重要因素。而野生型棒状链霉菌的克拉维酸产量很低，远远不能满足工业发酵的需要。
发明内容
有鉴于此，本申请提供棒状链霉菌、应用、发酵培养基及克拉维酸的制备方法，该棒状链霉菌遗传稳定性好，克拉维酸产量大，效价高。
为解决以上技术问题，本申请提供的技术方案是一种棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.19076，保藏日期为2019年12月04日。
本发明还提供了上述棒状链霉菌在生产克拉维酸中的应用。
本发明还提供了用于培养上述棒状链霉菌的发酵培养基，以质量百分数计，所述发酵培养基由淀粉2％～3％、黄豆粉2％～3.5％、酵母粉1％～1.5％、蛋白胨0.1％～0.2％、谷氨酸钠0.02％～0.1％、苏氨酸0.05％～0.2％、甘油0.5％～1.5％、硝酸钾0.05％～0.2％、磷酸二氢钾0.05％～0.12％和余量的水组成。
本发明提供了一种克拉维酸的制备方法，包括：上述棒状链霉菌经发酵，得到克拉维酸。
优选的，所述方法具体包括：以10％～15％(V/V)的接种量将所述棒状链霉菌的种子液接种至发酵培养基中培养，得到发酵液。
优选的，所述方法具体包括：将所述棒状链霉菌的种子液接种至发酵培养基中培养，收集发酵产物，得到克拉维酸。
优选的，所述方法还包括：
所述棒状链霉菌接种于斜面培养基进行培养，得到斜面菌种；
所述斜面菌种接种至种子培养基中培养，得到种子液。
优选的，以质量百分数计，所述斜面培养基由可溶性淀粉1％～4％、无水硫酸镁0.0122％～0.0512％、硝酸钾0.05％～0.5％、硫酸亚铁0.0002％～0.0025％、氯化钠0.02％～0.15％、磷酸氢二钾0.02％～0.15％、琼脂1.0～2.5％和余量的水组成；
以质量百分数计，所述种子培养基由淀粉1％～3％、黄豆粉2％～4％、甘油0.2％～1％、酵母粉0.05％～0.2％、蛋白胨0.05％～0.2％、磷酸二氢钾0.05％～0.2％、硝酸钾0.05％～0.2％和余量的水组成；
以质量百分数计，所述发酵培养基由淀粉2～4％、黄豆粉2％～4％、酵母粉0.5％～1.5％、蛋白胨0.05％～0.2％、谷氨酸钠0.02％～0.1％、苏氨酸0.05％～0.2％、甘油0.5％～1.5％、硝酸钾0.05％～0.2％、磷酸二氢钾0.05％～0.12％和余量的水组成。
优选的，以质量百分数计，所述斜面培养基由可溶性淀粉2％、无水硫酸镁0.0244％、硝酸钾0.1％、硫酸亚铁0.001％、氯化钠0.05％、磷酸氢二钾0.05％、琼脂1.5％和余量的水组成。
优选的，以质量百分数计，所述种子培养基由淀粉1.2％、黄豆粉3％、甘油0.5％、酵母粉0.1％、蛋白胨0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硝酸钾0.1％和余量的水组成。
优选的，以质量百分数计，所述发酵培养基由淀粉3％、黄豆粉3.5％、酵母粉1％、，蛋白胨0.1％、谷氨酸钠0.05％、苏氨酸0.2％、甘油1％、硝酸钾0.1％、磷酸二氢钾0.08％和余量的水组成。
优选的，所述斜面培养基pH为7.0。
优选的，所述种子培养基pH为7.2。
优选的，所述发酵培养基pH为7.6。
优选的，以质量百分数计，所述发酵培养基中苏氨酸含量0.1％～0.2％。
优选的，所述方法具体包括：
所述棒状链霉菌接种于斜面培养基，28℃，培养6～8d，得到斜面菌种；
所述斜面菌种接种至种子培养基中28℃,转速220r/min，培养32～36h，得到种子液；
将所述种子液接种至发酵培养基中28℃，转速220r/min，培养90～96h，收集发酵产物，得到克拉维酸。
本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂的活性成分为上述的棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)。
本申请与现有技术相比，其详细说明如下：
本发明利用等离子体诱变方法并结合苏氨酸耐受性筛选模型，在分离培养基中添加可能作为前体的物质或前体的结构类似物(苏氨酸)，筛选出高产克拉维酸的棒状链霉菌菌株SIIA19-77#。现有的棒状链霉菌工业菌株是通过多轮诱变筛选得到的突变株，但是常规诱变育种技术具有随机性和盲目性，导致育种工作效率较低，周期很长，本发明的棒状链霉菌菌株SIIA19-77#可通过高效、简便的育种方法得到，可应用于工业化发酵生产，具有非常重要的实际应用价值。
本发明菌株遗传稳定性好，经发酵培养基优化后，该菌株产克拉维酸的能力显著提升，克拉维酸产量大、效价高，摇瓶发酵单位最高达到5468μg/mL，有效降低了克拉维酸生产成本。且本发明发酵周期短，能耗低。
本技术发明
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)SIIA19-77#的筛选和克拉维酸的制备
1、棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)SIIA0855#，是以棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)SIIA0198#(四川抗菌素工业研究微生物资源中心提供)为出发菌株，经多轮诱变筛选得到的，其克拉维酸发酵单位为4100μg/mL～4200μg/mL。
2、(1)选择生长良好的产克拉维酸的棒状链霉菌SIIA0855#斜面菌株，用生理盐水洗下孢子，经棉花过滤，制成106个/mL的孢子悬浮液；
(2)将(1)中的孢子悬浮液用移液枪吸取10μL于直径为1cm的载玻片上，置于以氦气为工作气体，功率120W，通气量为10SLM的常压室温等离子体诱变系统中，等离子体发射源与样品间距离为2mm，分别处理0s、3s、6s、9s、12s、15s、18s、21s，将诱变处理的孢子悬液进行梯度稀释后涂平板，制作致死曲线；
(3)根据(2)的致死曲线，选择3s、9s、12s三个不同致死剂量的照射时间，对菌株SIIA0855#的孢子液进行等离子体诱变；
(4)将(3)中三个不同处理时间的孢子悬液混合于装有生理盐水的试管中，混合均匀；
(5)将(4)中的诱变孢子悬液，进行梯度稀释10-1～10-6，取10-4、10-5、10-6三个稀释度的孢子悬液，分别涂布于含有质量百分含量为10％苏氨酸的分离培养基上；
以质量百分比计，所述分离培养基组成为：可溶性淀粉4％、无水硫酸镁0.0122％、硝酸钾0.5％、硫酸亚铁0.0002％、氯化钠0.02％、磷酸氢二钾0.15％、苏氨酸10％、琼脂2.5％和余量的水，pH7.0；
(6)将(5)中各个分离培养基上长出的单菌落接种于斜面培养基，28℃，培养6～8d，得到斜面菌种；
将所述斜面菌种接种至种子培养基中，28℃,转速220r/min，培养32h，得到种子液；
以15％(V/V)的接种量将所述种子液接种至发酵培养基中28℃，转速220r/min，培养90h，收集发酵液，得到克拉维酸；
以质量百分比计，所述斜面培养基组成为：可溶性淀粉2％、无水硫酸镁0.0244％、硝酸钾0.1％、硫酸亚铁0.001％、氯化钠0.05％、磷酸氢二钾0.05％、琼脂1.5％和余量的水，pH7.0；
以质量百分比计，所述种子培养基组成为：淀粉3％、黄豆粉4％、甘油1％、酵母粉0.05％、蛋白胨0.05％、磷酸二氢钾0.2％、硝酸钾0.2％和余量的水，pH7.2；
以质量百分比计，所述发酵培养基组成为：淀粉4％、黄豆粉4％、酵母粉0.5％、蛋白胨0.05％、谷氨酸钠0.1％、苏氨酸0.05％、甘油0.5％、硝酸钾0.05％、磷酸二氢钾0.12％和余量的水，pH7.6；
(7)采用高效液相色谱法测定(6)中发酵液中的克拉维酸的产量，筛选得到诱变菌株棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)SIIA19-77#，其克拉维酸产量达到4557μg/mL。
HPLC方法流动相体积比为甲醇：水：10％TBA＝150:375:10，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，检测波长为220nm。
上述棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)SIIA19-77#，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.19076，保藏日期为2019年12月04日。
实施例2
和实施例1的区别仅在于：
以质量百分比计，分离培养基组成为：可溶性淀粉1％、无水硫酸镁0.0512％、硝酸钾0.05％、硫酸亚铁0.025％、氯化钠0.15％、磷酸氢二钾0.02％、苏氨酸10％、琼脂1.5％、pH7.0。
将步骤(6)中分离得到的棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)SIIA19-77#接种于斜面培养基，28℃，培养6～8d，得到斜面菌种；
将所述斜面菌种接种至种子培养基中28℃,转速220r/min，培养32h，得到种子液；
以10％(V/V)的接种量将所述种子液接种至发酵培养基中28℃，转速220r/min，培养96h，收集发酵液，得到克拉维酸；
以质量百分比计，所述斜面培养基组成为：可溶性淀粉2％、无水硫酸镁0.0244％、硝酸钾0.1％、硫酸亚铁0.001％、氯化钠0.05％、磷酸氢二钾0.05％、琼脂1.5％和余量的水，pH7.0；
以质量百分比计，所述种子培养基组成为：淀粉1％、黄豆粉2％、甘油0.2％、酵母粉0.2％、蛋白胨0.1％、磷酸二氢钾0.05％、硝酸钾0.05％和余量的水，pH7.2；
以质量百分比计，所述发酵培养基组成为：淀粉2％、黄豆粉2％、酵母粉1.5％、蛋白胨0.2％、谷氨酸钠0.02％、苏氨酸0.2％、甘油1.5％、硝酸钾0.2％、磷酸二氢钾0.05％和余量的水，pH7.6；
克拉维酸产量达到4798μg/mL。
实施例3
和实施例1的区别仅在于：
以质量百分比计，分离培养基组成为：可溶性淀粉2％、无水硫酸镁0.0244％、硝酸钾0.1％、硫酸亚铁0.001％、氯化钠0.05％、磷酸氢二钾0.05％、苏氨酸5％、琼脂1.5％、pH7.0。
将步骤(6)中分离得到的棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)SIIA19-77#接种于斜面培养基，28℃，培养6～8d，得到斜面菌种；
将所述斜面菌种接种至种子培养基中28℃,转速220r/min，培养32h，得到种子液；
以15％(V/V)的接种量将所述种子液接种至发酵培养基中28℃，转速220r/min，培养96h，收集发酵液，得到克拉维酸；
以质量百分比计，所述斜面培养基组成为：可溶性淀粉2％、无水硫酸镁0.0244％、硝酸钾0.1％、硫酸亚铁0.001％、氯化钠0.05％、磷酸氢二钾0.05％、琼脂1.5％和余量的水，pH7.0；
以质量百分比计，所述种子培养基组成为：淀粉1.2％、黄豆粉3％、甘油0.5％、酵母粉0.1％、蛋白胨0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硝酸钾0.1％和余量的水，pH7.2；
以质量百分比计，所述发酵培养基组成为：淀粉3％、黄豆粉3.5％、酵母粉1％、，蛋白胨0.1％、谷氨酸钠0.05％、苏氨酸0.2％、甘油1％、硝酸钾0.1％、磷酸二氢钾0.08％和余量的水，pH7.6；
克拉维酸产量达到5370μg/mL。
实施例4
克拉维酸的制备
将棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)SIIA19-77#接种于斜面培养基，28℃，培养6～8d，得到斜面菌种；
将所述斜面菌种接种至种子培养基中28℃,转速220r/min，培养32h，得到种子液；
以15％(V/V)的接种量将所述种子液接种至发酵培养基中28℃，转速220r/min，培养90h，收集发酵液，得到克拉维酸；
以质量百分比计，所述斜面培养基组成为：可溶性淀粉1％、无水硫酸镁0.0122％、硝酸钾0.05％、硫酸亚铁0.0025％、氯化钠0.15％、磷酸氢二钾0.15％、琼脂2.5％和余量的水，pH7.0；
以质量百分比计，所述种子培养基组成为：淀粉1％、黄豆粉2％、甘油0.2％、酵母粉0.2％、蛋白胨0.2％、磷酸二氢钾0.2％、硝酸钾0.2％和余量的水，pH7.2；
以质量百分比计，所述发酵培养基组成为：淀粉2％、黄豆粉2％、酵母粉0.5％、蛋白胨0.2％、谷氨酸钠0.1％、苏氨酸0.2％、甘油1.5％、硝酸钾0.2％、磷酸二氢钾0.12％和余量的水，pH7.6；
克拉维酸产量达到5290μg/mL。
实施例5
克拉维酸的制备
将棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)SIIA19-77#接种于斜面培养基，28℃，培养6～8d，得到斜面菌种；
将所述斜面菌种接种至种子培养基中28℃,转速220r/min，培养36h，得到种子液；
以10％(V/V)的接种量将所述种子液接种至发酵培养基中28℃，转速220r/min，培养96h，收集发酵液，得到克拉维酸；
以质量百分比计，所述斜面培养基组成为：可溶性淀粉4％、无水硫酸镁0.0512％、硝酸钾0.5％、硫酸亚铁0.0002％、氯化钠0.02％、磷酸氢二钾0.02％、琼脂1.0％和余量的水，pH7.0；
以质量百分比计，所述种子培养基组成为：淀粉3％、黄豆粉4％、甘油1％、酵母粉0.05％、蛋白胨0.05％、磷酸二氢钾0.05％、硝酸钾0.05％和余量的水，pH7.2；
以质量百分比计，所述发酵培养基组成为：淀粉4％、黄豆粉4％、酵母粉1.5％、蛋白胨0.05％、谷氨酸钠0.02％、苏氨酸0.05％、甘油0.5％、硝酸钾0.05％、磷酸二氢钾0.05％和余量的水，pH7.6；
克拉维酸产量达到4907μg/mL。
实施例6
克拉维酸的制备
将棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)SIIA19-77#接种于斜面培养基，28℃，培养6～8d，得到斜面菌种；
将所述斜面菌种接种至种子培养基中28℃,转速220r/min，培养34h，得到种子液；
以15％(V/V)的接种量将所述种子液接种至发酵培养基中28℃，转速220r/min，培养96h，收集发酵液，得到克拉维酸；
以质量百分比计，所述斜面培养基组成为：可溶性淀粉2％、无水硫酸镁0.0244％、硝酸钾0.1％、硫酸亚铁0.001％、氯化钠0.05％、磷酸氢二钾0.05％、琼脂1.5％和余量的水，pH7.0；
以质量百分比计，所述种子培养基组成为：淀粉1.2％、黄豆粉3％、甘油0.5％、酵母粉0.1％、蛋白胨0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硝酸钾0.1％和余量的水，pH7.2；
以质量百分比计，所述发酵培养基组成为：淀粉3％、黄豆粉3.5％、酵母粉1％、，蛋白胨0.1％、谷氨酸钠0.05％、苏氨酸0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、甘油1％、硝酸钾0.1％、磷酸二氢钾0.08％和余量的水，pH7.6；
对含有不同苏氨酸浓度的发酵培养基进行综合比较，测定效价，所对应的测定结果见表1。
表1 实验测定结果
发酵培养基中苏氨酸浓度％ 克拉维酸效价μg/mL
0.05 4702
0.1 5026
0.15 5468
0.2 5291
从表1中可以知道配方中苏氨酸的浓度在0.1～0.2％时，克拉维酸效价较高，0.15％时克拉维酸效价最高，达到5468μg/mL。
实施例7
棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)SIIA19-77#的稳定性试验
(1)将棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)SIIA19-77#接种于斜面培养基，28℃，进行传代培养，连续传6代，得到斜面菌种，培养好的菌株放4℃冰箱保存；
(2)将培养好的(1)中的斜面接种到三角瓶发酵培养基中，28℃，220rpm摇床培养96h，收集发酵液，得到克拉维酸；
以质量百分比计，所述斜面培养基组成为：可溶性淀粉2％、无水硫酸镁0.0244％、硝酸钾0.1％、硫酸亚铁0.001％、氯化钠0.05％、磷酸氢二钾0.05％、琼脂1.5％和余量的水，pH7.0；
以质量百分比计，所述发酵培养基组成为：淀粉3％、黄豆粉3.5％、酵母粉1％、，蛋白胨0.1％、谷氨酸钠0.05％、苏氨酸0.15％、甘油1％、硝酸钾0.1％、磷酸二氢钾0.08％和余量的水，pH7.6；
测定发酵液中克拉维酸的效价，结果如表2所示。
表2 棒状链霉菌SIIA19-77#遗传稳定性试验结果
传代次数 克拉维酸效价μg/mL 产棒酸的稳定性％
对照 5432 100
1 5389 99.2
2 5454 100.4
3 5378 99.0
4 5351 98.5
5 5334 98.2
6 5285 97.3
由上表可知，本发明的棒状链霉菌SIIA19-77#五代以内产克拉维酸的能力均保持在98％以上。证明该菌株遗传特性稳定，不回复突变。由此说明本发明采用常压室温等离子体诱变技术并结合苏氨酸耐受性筛选模型得到的棒状链霉菌SIIA19-77#能提高克拉维酸产量。
本发明利用等离子体诱变方法并结合苏氨酸耐受性筛选模型，筛选出高产克拉维酸产生菌。常压室温等离子体(ARTP)诱变系统具有温度低、活性粒子浓度高、设备简单、操作简易、运行成本低廉、且对环境无污染和危害等特点，其富含的活性能量粒子对菌株的遗传物质造成损伤，并诱发生物细胞启动SOS修复机制，在修复过程中产生种类丰富的错配位点，并最终稳定遗传进而形成突变株。因此ARTP可以作为一种快速简便的方法应用到棒状链霉菌育种中。并且利用克拉维酸产生菌可能作为前体的物质或前体的结构类似物(苏氨酸)加入到分离培养基中，观察菌株对苏氨酸的耐受情况，以此建立苏氨酸耐受性筛选模型来进行高产菌株的筛选。
上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)，其特征在于，所述棒状链霉菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19076。
2.权利要求1所述棒状链霉菌在生产克拉维酸中的应用。
3.一种克拉维酸的制备方法，其特征在于，包括：发酵权利要求1所述棒状链霉菌，得到克拉维酸。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述方法具体包括：以10％～15％(V/V)的接种量将所述棒状链霉菌的种子液接种至发酵培养基中培养，得到发酵液。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述方法具体包括：将所述棒状链霉菌的种子液接种至发酵培养基中培养，收集发酵产物，得到克拉维酸。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括：
所述棒状链霉菌接种于斜面培养基进行培养，得到斜面菌种；
所述斜面菌种接种至种子培养基中培养，得到种子液。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，以质量百分数计，所述斜面培养基由可溶性淀粉1％～4％、无水硫酸镁0.0122％～0.0512％、硝酸钾0.05％～0.5％、硫酸亚铁0.0002％～0.0025％、氯化钠0.02％～0.15％、磷酸氢二钾0.02％～0.15％、琼脂1.0～2.5％和余量的水组成；
以质量百分数计，所述种子培养基由淀粉1％～3％、黄豆粉2％～4％、甘油0.2％～1％、酵母粉0.05％～0.2％、蛋白胨0.05％～0.2％、磷酸二氢钾0.05％～0.2％、硝酸钾0.05％～0.2％和余量的水组成；
以质量百分数计，所述发酵培养基由淀粉2％～4％、黄豆粉2％～4％、酵母粉0.5％～1.5％、蛋白胨0.05％～0.2％、谷氨酸钠0.02％～0.1％、苏氨酸0.05％～0.2％、甘油0.5％～1.5％、硝酸钾0.05％～0.2％、磷酸二氢钾0.05％～0.12％和余量的水组成。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述方法具体包括：
所述棒状链霉菌接种于斜面培养基，28℃，培养6～8d，得到斜面菌种；
所述斜面菌种接种至种子培养基中28℃,转速220r/min，培养32～36h，得到种子液；
将所述种子液接种至发酵培养基中28℃，转速220r/min，培养90～96h，收集发酵产物，得到克拉维酸。
9.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成分为权利要求1所述的棒状链霉菌。
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