CN114214259A - 一种智能生防菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种智能生防菌剂及其制备方法和应用，属于微生物和生物防治技术领域。本发明的智能生防菌剂将生防菌置于智能载体材料中，所述智能载体材料能够为生防菌提供生存和繁殖所必须的营养物质，通过物理和化学作用吸附在植物叶片表面，并能够防御紫外线照射和雨水冲刷，保持生防菌长效性能，在植物体外形成一种保护膜，阻止外界病原菌侵染，使微生物制剂的田间防效更加稳定，因此具有良好实际应用之价值。

Description

一种智能生防菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物和生物防治技术领域，具体涉及一种智能生防菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
目前，大量具有生防作用的微生物菌株已被用于防控植物病害，生防微生物虽然具有易获得、易分离、活力强等特点，但受制剂加工、贮存条件和田间环境因素影响，存在菌株活性减弱、定殖能力差、防治效果不稳定等问题，严重制约了生防功能的充分发挥。目前生防菌剂型主要集中在可湿性粉剂和水剂，不能满足农业生产需求，由于剂型加工条件(加热、酸碱性等)以及外部环境(光照、金属离子等)的影响，加上生物体本身对环境因素较为敏感，导致使用中出现菌株活性减弱、定殖能力差、防效降低等问题，严重限制其长效应用。
然而，发明人发现，生防菌因脱离长期生存栖息地，不易与周围微生物种间互作形成多菌株生物被膜，同时受环境因素影响，生防菌定殖能力差，导致生防菌使用防效和实验室防效出现较大差异，阻碍微生物农药的发展。
发明内容
基于上述现有技术的不足，本发明提一种智能生防菌剂及其制备方法和应用，本发明的智能生防菌剂将生防菌置于智能载体材料中，所述智能载体材料能够为生防菌提供生存和繁殖所必须的营养物质，通过物理和化学作用吸附在植物叶片表面，并能够防御紫外线照射和雨水冲刷，保持生防菌长效性能，在植物体外形成一种保护膜，阻止外界病原菌侵染，使微生物制剂的田间防效更加稳定，因此具有良好实际应用之价值。
为实现上述技术目的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种智能生防菌剂，所述智能生防菌剂包括生防菌，以及智能载体材料。
其中，所述智能载体材料由纳米外壳和芯溶液通过同轴静电纺丝方法制得。在一定湿度条件下，芯材透过纳米外壳上的空隙缓慢释放，为生防菌提供营养物质。纳米外壳通过化学修饰和物理作用，能吸附在植物植株表面(如叶、茎杆、根等)，并能抵御紫外线照射和雨水冲刷对生防菌产生的不利影响
本发明的第二个方面，提供上述智能生防菌剂的制备方法，所述制备方法包括：
将生防菌菌液与智能载体材料混合后加入分散剂，培养后冷冻干燥即得。
本发明第三个方面，提供一种防治植物病害的方法，所述方法包括向植物喷施或灌根上述智能生防菌剂。
所述植物病害包括但不限于烟草黑胫病、赤星病、烟草病毒病、苹果腐烂病、蓝莓灰霉病、草莓灰霉病、草莓根腐病、桃灰霉病、稻瘟病和烟草青枯病。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
1.上述技术方案合成智能载体材料中的壳材运用化学键合作用，利用表面吸附和分子间作用力，对微观结构进行修饰，并结合烟叶表面物理及化学结构和环境等因素制备，芯材能提供生防菌生存和繁殖所需的营养物质，能够提高生防菌在叶片及植株上的定殖能力和生物活性。同时，载体材料能够调控温度、湿度及光照，而高温高湿的气候条件是影响植物(如烟草)病害发生的主要因素之一，温度、湿度越高、孢子繁殖量越大，造成病害发生严重。因此上述技术方案制备的智能生防菌剂可以有效降低或减缓病害的发生。
2、上述技术方案选用的粪产碱杆菌FC01对真菌病害和细菌病害具有广谱性，实验室已测定对烟草黑胫病、赤星病、烟草病毒病、苹果腐烂病、蓝莓灰霉病、草莓灰霉病、草莓根腐病、桃灰霉病、稻瘟病和烟草青枯病均具有较好的防治效果，且菌株稳定，
3、上述技术方案制备的智能生防菌剂可为生防菌定殖提供营养物质和定殖环境，同时可抵御田间环境中紫外线照射、雨水冲刷等恶劣环境，从而延长生防菌使用寿命，且用量少、对烟草安全性好。其在使用过程中环保、无污染，具有环境友好、施用简单、用量少、持效期长等优点，且易于工业化生产。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中菌株FC01对烟草青枯病的拮抗效果。
图2为本发明实施例中菌株FC01的16S rDNA构建的系统发育进化树。
图3为本发明实施例中菌株FC01生防菌剂对烟草青枯病的活体防治效果图；(a)粪产碱杆菌FC01智能生防菌剂，(b)10亿cfu/克解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂，(c)1×109cfu/mL粪产碱杆菌FC01发酵液，(d)清水空白。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种智能生防菌剂，所述智能生防菌剂包括生防菌，以及智能载体材料。
其中，所述智能载体材料由纳米外壳和芯溶液通过同轴静电纺丝方法制得。在一定湿度条件下，芯材透过纳米外壳上的空隙缓慢释放，为生防菌提供营养物质。纳米外壳通过化学修饰和物理作用，能吸附在植株表面(如叶、茎杆、根等)，并能抵御紫外线照射和雨水冲刷对生防菌产生的不利影响。
本发明的又一具体实施方式中，所述智能载体材料，其合成方法包括：
S1、合成纳米外壳：将壳材加入壳材溶剂中至完全溶解后，再加入保护剂进行高温搅拌；
S2、制备芯溶液：将芯材、芯材溶剂混合后，搅拌；
S3、将步骤S1制得纳米外壳溶液的和S2制得的芯溶液，进行同轴静电纺丝，得到稳定的微纳米纤维，干燥后即得。
所述步骤S1和S2并无先后顺序之分。
其中，所述步骤S1中，
所述壳材可以为聚乳酸、聚乙烯醇、聚偏氟乙烯、甲壳素、纤维素、聚己内酯、聚丁二酸丁二醇酯、聚芳酯中的任意一种或多种；在本发明的一个具体实施方式中，所述壳材为聚乙烯醇和聚己内酯的混合物，二者质量比为1～2:1，优选为3.5:3；
所述壳材溶剂为甲醇、丙酮、乙酸、N,N二甲基甲酰胺、N,N二甲基乙酰胺中的任意一种或多种；
所述保护剂为二氧化硅、吡咯烷、乙二胺、正丁胺中的一种或多种，优选为纳米二氧化硅；
在本发明的一个具体实施方式中，所述壳材、壳材溶剂和保护剂的质量比为1:0.2-5：0.075-1；
高温搅拌具体条件为：在50-90℃内，以1000-2000rmp的转速搅拌1-4小时。
所述步骤S2中，
所述芯材为葡萄糖、麦芽糖、果糖、甘露醇、糊精、玉米粉、麸皮、酵母粉、牛肉粉、豆饼粉、蛋白胨、MgSO4·7H2O、KH2PO4、KNO3、CaCO3、NaCl中的一种或多种，优选为麦芽糖和硝酸钾的混合物，二者质量比为1:1，从而有利于为生防菌补充碳、氮源等营养物质；
所述芯材溶剂可以为水；
所述芯材和芯材溶剂的质量比为1:3-10，搅拌具体条件为：在25-55℃以100-2000rmp的转速搅拌2-4小时。
所述同轴静电纺丝具体条件包括：纺丝电压范围在25-30kV，负电压为-3.0kV，接收距离为10-20cm；
纳米外壳的溶液推注速度为0.3-0.5mm/min，芯溶液推注速度为0.1-0.2mm/min。
所述生防菌可以为控制植物病害发生、发展的细菌、真菌或放线菌，优选为细菌，在本发明的一个具体实施方式中，所述生防菌为粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)FC01，该菌株已于2021年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.22511。该菌株对真菌病害和细菌病害具有广谱性，实验室已测定对烟草黑胫病、赤星病、烟草病毒病、苹果腐烂病、蓝莓灰霉病、草莓灰霉病、草莓根腐病、桃灰霉病、稻瘟病和烟草青枯病均具有较好的防治效果。
在本发明的又一具体实施方式中，所述生防菌在智能生防菌剂中的有效浓度不小于1х109cfu/mL。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述智能生防菌剂的制备方法，所述制备方法包括：
将生防菌菌液与智能载体材料混合后加入分散剂，培养后冷冻干燥即得。
其中，所述生防菌菌液可以为生防菌的发酵液或者含生防菌的菌悬液；
所述含生防菌的菌悬液为：发酵液离心后去上清加水获得。
所述分散剂可以为有机硅408、有机硅618、吐温-20、吐温-40和吐温-60中的任意一种或多种。
所述培养具体方法为：在25-37℃(优选为28℃)振荡培养24-48h。
所述智能生防菌剂中控制生防菌菌体数量不小于1х109cfu/mL，进一步优选为1×109-9×109cfu/mL。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种防治植物病害的方法，所述方法包括向植物喷施或灌根上述智能生防菌剂。
所述植物病害包括但不限于烟草黑胫病、赤星病、烟草病毒病、苹果腐烂病、蓝莓灰霉病、草莓灰霉病、草莓根腐病、桃灰霉病、稻瘟病和烟草青枯病。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中所用生防菌为粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)FC01，该菌株已于2021年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22511。
实施例
一种粪产碱杆菌FC01智能生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1.采用同轴静电纺丝系统，在室温条件下，纺丝电压范围在25-30kV，负电压为-3.0kV，同轴针喷嘴到滚筒接收器距离为13cm。同轴针的内径为0.60mm，外径为0.90mm。注射器的体积是10mL。壳溶液推注速度为0.3mm/min，芯溶液推注速度为0.2mm/min。
2.合成智能载体。称取3.5g聚乙烯醇(PVA)和3.0g聚己内酯(PCL)溶于20mLDMF溶液中，加入0.8g纳米SiO2粉末，搅拌至均匀分散即为壳溶液；将0.5g麦芽糖、0.5g硝酸钾溶解于5mL水中，常温下磁力搅拌直至完全溶解，即为碳、氮源芯溶液。将上述纺丝液连接在同轴针上并置于静电纺丝设备上，调节设备各项运行参数(步骤1)，得到稳定的微纳米纤维。将其置于烘箱中40℃烘干1h，冷却至室温。
3.生防菌FC01(培养基：葡萄糖10g/L、牛肉粉10g/L、氯化钠5g/L，pH调节为7.2±0.2，121℃高温高压灭菌20min。放入摇床150rpm，28℃振荡培养)，发酵液5000r离心8min，ddH2O清洗，弃去上清液，重复2次后，加入ddH2O既为菌体悬浮液。菌体数量为1×109cfu/mL。
将紫外灭菌的0.2mL有机硅408、0.3mL吐温-80和步骤2制备的2.0g载体添加到50mL菌体悬浮液中，搅拌待两者充分结合，冷冻干燥。既为制备的粪产碱杆菌FC01生防菌剂。
防治烟草青枯病效果举例：
烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum，简称R.S)引起的一种土传病害，该菌寄主范围广，喜高温，加之缺乏抗源，易爆发流行，防治较为困难。将按实施例1配制的粪产碱杆菌FC01智能生防菌剂(稀释3000倍)(处理1)，10亿cfu/克解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂(稀释3000倍)(处理2)，1×109cfu/mL粪产碱杆菌FC01发酵液(稀释300倍)(处理3)，分别对烟苗进行灌根处理，每株10mL。设清水空白(处理4)。药后2d接菌，接菌后10d、20d调查病情指数，计算防治效果。由图3可见，处理1的防治效果明显好于处理2和处理3。
结果见表1：
表1对烟草青枯病的防治效果
Figure BDA0003473965160000091
在防效实验中，该菌株对烟草青枯病的抑制效果高于生物农药10亿cfu/克解淀粉芽孢杆菌。且定殖时间长，该菌可部分替代化学农药或与化学农药交替使用，在不影响防效的情况下能明显减少化学农药的使用，减少农药残留和环境污染，同时也可延缓病原菌产生抗药性，提高烟草品质。因此粪产碱杆菌FC01新型生物农药可用于烟草青枯病的生物防治。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.一种智能生防菌剂，其特征在于，所述智能生防菌剂包括生防菌，以及智能载体材料；
所述智能载体材料由纳米外壳和芯溶液通过同轴静电纺丝方法制得。
2.如权利要求1所述的智能生防菌剂，其特征在于，所述智能载体材料，其合成方法包括：
S1、合成纳米外壳：将壳材加入壳材溶剂中至完全溶解后，再加入保护剂进行高温搅拌；
S2、制备芯溶液：将芯材、芯材溶剂混合后，搅拌；
S3、将步骤S1制得纳米外壳溶液的和S2制得的芯溶液，进行同轴静电纺丝，得到稳定的微纳米纤维，干燥后即得；
所述步骤S1和S2并无先后顺序之分。
3.如权利要求2所述的智能生防菌剂，其特征在于，所述步骤S1中，
所述壳材为聚乳酸、聚乙烯醇、聚偏氟乙烯、甲壳素、纤维素、聚己内酯、聚丁二酸丁二醇酯、聚芳酯中的任意一种或多种；
优选的，所述壳材为聚乙烯醇和聚己内酯的混合物，二者质量比为1～2:1，进一步优选为3.5:3；
优选的，所述壳材溶剂为甲醇、丙酮、乙酸、N,N二甲基甲酰胺、N,N二甲基乙酰胺中的任意一种或多种；
优选的，所述保护剂为二氧化硅、吡咯烷、乙二胺、正丁胺中的一种或多种，优选为纳米二氧化硅；
优选的，所述壳材、壳材溶剂和保护剂的质量比为1:0.2-5：0.075-1；
优选的，高温搅拌具体条件为：在50-90℃内，以1000-2000rmp的转速搅拌1-4小时。
4.如权利要求2所述的智能生防菌剂，其特征在于，所述步骤S2中，
所述芯材为葡萄糖、麦芽糖、果糖、甘露醇、糊精、玉米粉、麸皮、酵母粉、牛肉粉、豆饼粉、蛋白胨、MgSO4·7H2O、KH2PO4、KNO3、CaCO3、NaCl中的一种或多种，优选为麦芽糖和硝酸钾的混合物，二者质量比为1:1；
所述芯材溶剂为水；
所述芯材和芯材溶剂的质量比为1:3-10，搅拌具体条件为：在25-55℃以100-2000rmp的转速搅拌2-4小时；
所述同轴静电纺丝具体条件包括：纺丝电压范围在25-30kV，负电压为-3.0kV，接收距离为10-20cm；
纳米外壳的溶液推注速度为0.1-0.3mm/min，芯溶液推注速度为0.001-0.002mm/min。
5.如权利要求1所述的智能生防菌剂，其特征在于，所述生防菌为控制植物病害发生、发展的细菌、真菌或放线菌，优选为细菌；
优选的，所述生防菌为粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)FC01，该菌株已于2021年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.22511。
6.如权利要求1所述的智能生防菌剂，其特征在于，所述生防菌在智能生防菌剂中的有效浓度不小于1х109cfu/mL。
7.权利要求1-6任一项所述智能生防菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
将生防菌菌液与智能载体材料混合后加入分散剂，培养后冷冻干燥即得。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述生防菌菌液为生防菌的发酵液或者含生防菌的菌悬液；
所述含生防菌的菌悬液为：发酵液离心后去上清加水获得；
优选的，所述分散剂为有机硅408、有机硅618、吐温-20、吐温-40和吐温-60中的任意一种或多种；
优选的，所述培养具体方法为：在25-37℃(优选为28℃)振荡培养24-48h；
优选的，所述智能生防菌剂中控制生防菌菌体数量不小于1х109cfu/mL，进一步优选为1×109-9×109cfu/mL。
9.一种防治植物病害的方法，其特征在于，所述方法包括向植物喷施或灌根权利要求1-6任一项所述智能生防菌剂。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述植物病害包括烟草黑胫病、赤星病、烟草病毒病、苹果腐烂病、蓝莓灰霉病、草莓灰霉病、草莓根腐病、桃灰霉病、稻瘟病和烟草青枯病。
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