CN113215031A - 一种贝莱斯芽孢杆菌19573-3及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明一种贝莱斯芽孢杆菌19573‑3及其应用，属于生物工程技术领域。贝莱斯芽孢杆菌19573‑3，CGMCC No.21866。该菌发酵液中Fengycin产量分别为保留时间为4.676min时90.31μg/ml与保留时间为4.893min时45.07μg/ml；具备产纤维素酶、蛋白酶能力以及铁载体的能力；其发酵液中有SA、2iP、IAA和ACC脱氨酶产生。该菌在抑制尖孢镰刀菌BNCC120618、灰葡萄孢BNCC338228、小麦根腐病、大豆疫霉、终极腐霉菌和番茄灰霉病活性中的应用。本发明的优点：该菌具有合成和分泌多种抗生素和抗菌肽的潜能，使其在植物防病促生中具备广泛多样的功能和作用。

Description

一种贝莱斯芽孢杆菌19573-3及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种贝莱斯芽孢杆菌19573-3及其应用。

背景技术

由植物病原菌侵染引起的植物病害每年都会给全国乃至全世界范围内的粮食生产造成巨大的经济损失，是制约粮食高产稳产和食品安全的主要因素之一。在过去的几十年中，植物病害的防治过度依赖化学手段，然而化学杀菌剂的长期不合理施用对土壤、水体等环境造成了诸多负面影响，同时也在一定程度上直接导致植物病原菌抗药性的产生。因此，探索新型环境友好植物病害防治方法迫在眉睫。生物防治具有绿色环保，安全高效等特点，符合农业可持续发展要求，研发芽孢杆菌属为代表的生物防治制剂，被认为是农业实践可持续和生态安全的一个极具前景的研究方向。

芽孢杆菌属细菌具备易定殖、抗逆性强且能够产生大量的具有抑菌活性的次生代谢产物等特点，在植物防病促生制剂的研究和开发中占有重要地位。贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)是Ruiz-García等人于2005年首次分离得到，是土壤中常见的根际促生菌，具有广谱的拮抗病原真菌和细菌的能力。Xu等从黄瓜茎中分离得到内生菌B.velezensis ZF2，对黄瓜叶斑病番茄灰霉病、辣椒疫霉病以及镰刀菌等病原菌均具有良好的拮抗作用。Cao等通过分离鉴定发现在菌株B.velezensis Y6和F7能够产生surfactin，iturin和fengycin 3种脂肽，其中iturin和fengycin不仅在拮抗病原菌生长中起重要的作用，还能够在一定程度上影响细菌运动性和生物膜的形成。B.velezensis不仅具有良好的抗菌活性，还能够产生IAA，嗜铁素等多种植物激素类物质，同时还可以通过分泌多种活性酶分解土壤中难溶性的磷钾化合物供植物体吸收利用，促进植物生长。Wang等从苹果根际土壤中分离得到菌株B.velezensis FKM10，发现其能够产生铁载体、可以降解蛋白质，且能够抑制镰刀菌。Khan等从百合鳞茎中分离的B.velezensis Lle-9对包括镰刀菌和灰葡萄孢等多种植物病原真菌均有拮抗活性，还能够产有机酸、ACC脱氨酶、IAA、铁载体等物质，同样还具备固氮和增溶磷酸盐等多种促进植物生长的特性。此外，随着二代测序和三代测序技术的进步和生物信息学技术的发展，为从基因组层面深入挖掘和分析B.velezensis抗病促生机理提供了技术手段。Balderas-Ruíz等从芒果中分离得到B. velezensis 83可有效控制炭疽病，通过全基因组分析发现了10个与生物防治有关的次生代谢产物生物合成基因簇，且其产生的surfactin和bacillomycin D(生物防治活性)和γ-PGA(生物膜成分)与生防功能密切相关。Berezhnaya等在B.velezensis BIM B-439D 基因组序列中也注释到具有抗病功能的脂肽类物质(surfactin,bacillomycin,fengycin)，聚酮类物质(bacillaene,difficidin,macrolactin)，以及bacillibactin，dipeptide bacilysin合成序列，为进一步揭示其抗病机理提供了依据。

发明内容

本发明筛选获得了一株高效优良菌株B.velezensis 19573-3，该菌株对于灰霉，腐霉，疫霉，镰刀菌等多种病原真菌具有良好的拮抗能力，具有广谱抑菌活性，且能够产生铁载体以及多种水解酶类和水杨酸、吲哚乙酸等植物激素，兼具根际促生和生物防治功能，丰富了微生物菌种资源库。同时，该菌株具有丰富的抗菌物质合成基因簇，为抑制植物真菌病原菌提供了理论依据。

本发明的目的在于公开了一种贝莱斯芽孢杆菌19573-3。

本发明第二个目的在于公开了上述贝莱斯芽孢杆菌19573-3的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种贝莱斯芽孢杆菌19573-3，CGMCC No.21866。

上述技术方案所述的贝莱斯芽孢杆菌19573-3，其中，所述贝莱斯芽孢杆菌19573-3 是通过下述步骤筛选得到：

(1)、采集山东泰安岱岳区马庄镇马庄村花生根际土，采用5点取样法，将土样混合；

(2)、称取10g土壤于盛有90ml无菌水的三角瓶中，150r/min摇床振荡30min，按照10倍稀释法配制成10^-1～10^-6系列土壤悬液，取其中10^-1、10^-2悬液于80℃水浴中保持10min以杀死非芽孢杆菌，而10^-3、10^-4、10^-5、10^-6悬液不进行加热处理；

(3)、吸取系列土壤悬液0.1ml，分别加入牛肉膏蛋白胨和麦芽汁牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板上，涂布均匀，每个稀释度3次重复，28℃下培养3～4d；

(4)、根据菌体形态特征(形状、大小、排列、芽孢生成与否等)和菌落形态特征 (形状、大小、颜色、质地、气味等)进行初步归类，随机挑取产生芽孢的单个菌落，于无菌玻璃珠水中，制备菌悬液，用接种环于牛肉膏蛋白胨培养基平板上进行交叉划线或连续划线后，28℃下培养3～4d；

(5)选择单个菌落接种斜面，同时做涂片镜检；菌体、菌落形态特征一致的即为单菌落纯培养物，若发现不纯，应做进一步划线分离，直至获得纯培养物，于4℃冰箱中备用。

上述技术方案所述的贝莱斯芽孢杆菌19573-3，其特征在于：所述贝莱斯芽孢杆菌19573-3发酵液中Fengycin产量分别为保留时间为4.676min时90.31μg/ml与保留时间为4.893min时45.07μg/ml。

上述技术方案所述的贝莱斯芽孢杆菌19573-3，其特征在于：所述贝莱斯芽孢杆菌19573-3具备产纤维素酶、蛋白酶能力以及铁载体的能力。

上述技术方案所述的贝莱斯芽孢杆菌19573-3，其特征在于：所述贝莱斯芽孢杆菌19573-3发酵液中有SA、2iP、IAA和ACC脱氨酶产生。

上述技术方案所述的贝莱斯芽孢杆菌19573-3，其特征在于：所述贝莱斯芽孢杆菌19573-3发酵液中产生的SA18.44 ng/ml、2iP 35.53ng/ml、IAA 47.43ng/ml和ACC脱氨酶87.43ng/ml。

上述技术方案所述贝莱斯芽孢杆菌19573-3在抑制尖孢镰刀菌BNCC 120618、灰葡萄孢BNCC 338228、小麦根腐病、大豆疫霉、终极腐霉菌和番茄灰霉病活性中的应用。

本发明具有以下有益效果：

1、贝莱斯芽孢杆菌19573-3具有抑制尖孢镰刀菌BNCC 120618、灰葡萄孢BNCC338228、小麦根腐病、大豆疫霉、终极腐霉菌和番茄灰霉病活性的作用。

2、贝莱斯芽孢杆菌19573-3具有合成和分泌多种抗生素和抗菌肽的潜能，使其在植物防病促生中具备更为广泛多样化的功能和作用，该菌株的多生物活性保障了其在植物促生防病方面有着更为优越的研究潜力和应用价值。

附图说明：

图1为菌株19573-3 10％的无菌滤液对不同病原真菌的抑菌活性。

图2为菌株19573-3对番茄灰霉病的离体防效。

图3为HPLC检测菌株19573-3分泌Fengycin。

图4为菌株19573-3植物促生特性相关指标检测。

图5为菌株19573-3与其近缘芽孢杆菌的系统进化分析。

图6为芽孢杆菌属不同菌株的平均核苷酸一致性分析。

菌株保藏信息：本发明贝莱斯芽孢杆菌19573-3，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.21866，保藏日期为2021年3月4日。

具体实施方式：

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对一种贝莱斯芽孢杆菌19573-3及其应用作进一步的说明。

实施例1：贝莱斯芽孢杆菌19573-3的筛选：

采集山东泰安岱岳区马庄镇马庄村花生根际土，采用5点取样法，将土样混合，装入无菌牛皮纸袋密封运至实验室。称取10g土壤于盛有90ml无菌水的三角瓶中，150 r/min摇床振荡30min，按照10倍稀释法配制成10^-1～10^-6系列土壤悬液，取其中10^-1、 10^-2悬液于80℃水浴中保持10min以杀死非芽孢杆菌，而10^-3、10^-4、10^-5、10^-6悬液不进行加热处理。吸取系列土壤悬液0.1ml，分别加入牛肉膏蛋白胨和麦芽汁牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板上，涂布均匀，每个稀释度3次重复，28℃下培养3～4d。根据菌体形态特征(形状、大小、排列、芽孢生成与否等)和菌落形态特征(形状、大小、颜色、质地、气味等)进行初步归类，随机挑取产生芽孢的单个菌落，于无菌玻璃珠水中，制备菌悬液，用接种环于牛肉膏蛋白胨培养基平板上进行交叉划线或连续划线后，28℃下培养3～4d，选择单个菌落接种斜面，同时做涂片镜检，菌体、菌落形态特征一致的即为单菌落纯培养物，若发现不纯，应做进一步划线分离，直至获得纯培养物。最终获得贝莱斯芽孢杆菌19573-3、19-5036等纯培养物，保存于4℃冰箱中备用。

实施例2：贝莱斯芽孢杆菌19573-3的应用：

一、材料和方法：

1、供试菌株：

中国农业科学院农业资源与农业区划研究所菌肥测试中心实验室分离保存的贝莱斯芽孢杆菌19573-3、19-5036，解淀粉芽孢杆菌19544-1、19544-R、19698-2，地衣芽孢杆菌19423-1、19593-2、19490-1，枯草芽孢杆菌19479、19482、19485-1、19487、19543-1、19590、19605、19644、19699、2、12，纺锥形芽孢杆菌1、3、4、5、6、7、7R、8、11、 13等29株植物根际促生菌株，使用前利用LB培养基在28℃活化培养。

病原菌：尖孢镰刀菌BNCC 120618、灰葡萄孢BNCC 338228购自北纳创联生物技术有限公司；小麦根腐病、大豆疫霉、终极腐霉菌及番茄灰霉病由本实验室保存。六株真菌均在25℃条件下利用PDA培养基培养。

2、具抑菌能力芽孢杆菌初筛及优良菌株抑菌谱的测定：

采用平板对峙法，以六株植物病原菌为指示菌筛选对上述供试菌株具有良好的拮抗效果的菌株。用直径为5mm的打孔器打取病原菌菌饼，将病原菌接种至PDA培养基中央，在距离病原菌3cm处点接待测菌株单菌落，28℃下培养，观察并记录结果。选择具有广谱抗性且抑菌效果显著的优良菌株进行后续试验。

无菌发酵液的制备：挑取优良菌株新鲜培养单菌落接种于5ml LB液体培养基在28℃， 200rpm条件下过夜摇培制备母液，将母液按照1:1000转接于50ml LB液体培养基在相同条件下发酵48h，获得菌株发酵液。在4℃，6000rpm条件下离心15min，收集发酵上清，经0.22μm滤膜过滤除菌，得到无菌发酵液。参照梁聪等(2020)【梁聪,李文雅,王雅娜, 等.马铃薯干腐病拮抗菌的鉴定及生物学特性[J].中国蔬菜,2020,(08):71-76.】采用菌丝生长速率法测定上述优良菌株对供试植物病原真菌的抑菌活性。

3、菌株19573-3生防效果检测：

采用离体叶片法【赵娟,刘霆,刘伟成,等.番茄灰霉病生防链霉菌筛选及鉴定[J].微生物学报,2019,46(10):2548-2558.】检测菌株19573-3对番茄灰霉病的防效。选取生长8周且大小一致的健康叶片，75％酒精表面消毒30s后，用无菌水冲洗干净。将叶片浸入19573-3发酵液(浓度OD₆₀₀ 0.5)和LB液体培养基中处理30s，使其叶面均匀润湿。置于铺有灭菌滤纸且经无菌水润湿的培养皿中，12h后将直径5mm的新鲜番茄灰霉病菌饼分别接种于不同处理叶片表面，置于28℃，光暗时长16/8的光照培养箱培养，48h后观察结果。

4、菌株19573-3抑菌活性物质Fengycin的定量检测：

菌株19573-3抑菌活性物质的提取采用乙酸乙酯萃取法。利用LB培养基过夜摇培菌株19573-3母液，按照1:1000接种于含200ml LB液体培养基的500ml三角瓶中，在200rpm，28℃条件下摇培24h。通过等量的乙酸乙酯震荡萃取，经分液漏斗分离收集有机相，重复萃取3次，获得发酵产物提取液。利用旋转蒸发仪浓缩蒸干样品，然后用HPLC甲醇溶解提取物，并用0.22μm滤膜过滤，得到发酵产物粗提取物备用。Fengycin检测参考郝象瑢【郝象瑢.生防菌TJ中生防代谢因子的分析[D].天津农学院,2016.】HPLC方法。仪器型号：Agilent1100；柱规格：Agilent ZORBAX SB-C18柱(5μm,4.6×250mm)；进样量及进样方式：20μl自动进样；柱温：30℃；流速0.6ml/min；检测波长：214nm。流动相：10％含0.1％三氟乙酸的水溶液：90％含0.1％三氟乙酸的乙腈。

标准曲线的建立：配制浓度为800μg/ml的丰原素标准样品母液，经梯度稀释获得浓度分别为400，200，100，50，25，12.5μg/ml的标样，利用HPLC检测，计算峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标建立标准曲线。

5、菌株产蛋白酶、纤维素酶、铁载体及产植物激素能力测定：

纤维素钠培养基参考刘婉等【刘婉,赵珊珊,焦浈,等.产纤维素酶菌株的筛选及离子束诱变[J].生物技术通报,2018,34(06):149-154.】的方法进行配置、CAS固体检测培养基参考吴菊艳【吴菊艳.沙棘根瘤内生细菌中促生菌的筛选及促生性能研究[D].西北师范大学,2019.】的方法进行配置、脱脂奶粉培养基参考孙倩等【孙倩,张文姣,闫巧娟, 江正强.铜绿假单胞菌产蛋白酶的发酵条件优化[J].微生物学通报,2017,44(01):86-95.】的方法进行配置。挑取新鲜培养单菌落接种于5ml LB液体培养基在28℃，200rpm条件下摇培24h。取10μl发酵液点接于脱脂奶粉培养基、纤维素钠培养基及CAS培养基上， 28℃培养2d，观察并记录结果。

菌株产植物激素能力测定参考卢玉秋【卢玉秋,宋阿琳,唐治玉,等.UPLC-MS/MS同时测定土壤中19种植物激素方法的建立和验证[J].植物营养与肥料学报,2019,25(06):953-962.】等采用超高效液相色谱串联质谱法测定发酵液中的植物激素含量。

6、菌株分类鉴定：

6.1Biolog GenⅢ微生物鉴定系统表型测定：

将纯化后的待测菌株在LB固体培养基上传代两次，挑取单菌落利用无菌水洗涤菌体2-3次，保留菌体。利用长纤维素棉签蘸取沉淀菌体接种于IF-B接种液中，调整悬液浊度至90％-98％，然后按照每孔100μl接种于GenⅢ鉴定板中，30℃培养18h后Biolog GenⅢMicrostation检测器读取显色结果。

6.2分子生物学鉴定：

基因组DNA的提取按照细菌DNA提取试剂盒(天根，北京)中的操作说明提取，获得足量纯净的基因组DNA。16S rRNA基因的扩增利用通用引物27F (5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-ACGGTTACCTTGTTACGACTT -3')，以及gyrA基因通用引物gyrA-F(5'-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3')和 gyrA-R(5'-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3')进行PCR扩增，其体系为Premix Taq^TM 12.5μl，上下游引物各1.0μl，模板DNA 1.0μl，加ddH₂O补足至25.0μl；反应条件为95℃预变性5min；95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，送至宝锐通生物科技(北京)有限公司进行测序分析。序列结果在EzBioCloud网站上进行比对，并利用MEGA 7.0 软件中的邻接法(Neighbor-Joining method)构建系统发育树。

7、全基因组序列的测定及生物信息学分析：

菌株活化后接种于LB液体培养基中，28℃200rpm培养24h，离心后收集的菌体参照细菌DNA提取试剂盒提取获得足量基因组DNA，检测合格后，送至北京奥维森基因科技有限公司利用PacBio平台进行测序。使用GeneMarkS(Version 4.17)【Besemer J, Lomsadze A,Borodovsky M.GeneMarkS:a self-training method for prediction of gene startsin microbial genomes.Implications for finding sequence motifs in regulatoryregions[J]. Nucleic Acids Research,2001,29(12):2607-2618.】软件对新测序的基因组进行编码基因预测。利用antiSMARSH软件(https://antismash.secondarymetabolites.org/#！/start)对菌株 19573-3的主要次生代谢产物合成基因簇进行预测【Medema M H,Blin K,Cimermancic P, et al.antiSMASH:rapid identification,annotation andanalysis of secondary metabolite biosynthesis gene clusters in bacterial andfungal genome sequences[J].Nucleic acids research, 2011,39(2):339-346.】。使用ANI Calculator软件(https://www.ezbiocloud.net/tools)用于计算菌株19573-3全基因组的平均核苷酸一致性(Average nucleotide identity,ANI)【Yoon S H,Ha S M,Lim J,et al.A large-scale evaluation of algorithms to calculate average nucleotideidentity[J].Antonie Van Leeuwenhoek,2017,110:1281-1286.】。

二、结果与分析：

1、拮抗植物病原菌初筛与菌株19573-3抑菌活性：

以实验室保存的29株植物根际促生菌株为供试对象，以多种植物病原菌为指示菌进行平板对峙试验并进行统计。结果表明，菌株19573-3、19485-1、19-5036、19544-R、19544-1、19543-1、14、19698-2对番茄灰霉病有拮抗作用，菌株19573-3及19-5036对大豆疫霉、小麦根腐病、终极腐霉、尖孢镰刀菌等病原菌均有抑制作用，其中菌株19573-3 抑菌特性和抑菌效果最为显著。

菌株19573-3代谢产物抑菌特性结果见图1(图1为菌株19573-3 10％的无菌滤液对不同病原真菌的抑菌活性，其中图1A为PDA中添加了10％的19573-3无菌发酵液培养 5d后菌落生长情况；图1B为PDA中未添加10％19573-3无菌发酵液的病原菌菌落直径；图1C为图1A与图1B数据条形图，其中**表示在p<0.01水平下差异显著)。在PDA 中添加了10％的19573-3无菌发酵液与未添加的对照相比，供试病原真菌的生长均受到了明显的抑制，处理的病原菌的菌落直径显著小于对照直径(图1)。说明菌株19573-3 产生的代谢产物对灰霉菌，腐霉菌，镰刀菌和疫霉等病原菌均具有良好的拮抗作用，其中对灰霉和腐霉的抑制效果更显著。

2、菌株19573-3对番茄灰霉病的离体防效：

不同处理的番茄叶片接种灰霉病48h后。结果如图2(图2为菌株19573-3对番茄灰霉病的离体防效。图2A为番茄叶片对比图；图2B为图2A数据条形图，图2B中a、 b表示处理间差异显著(P<0.05))所示，经菌株19573-3发酵液润湿后的离体番茄叶片接种病原菌块与用LB培养基处理后接种病原菌相比，能够明显降低叶片的发病情况，灰霉病病斑直径也显著小于对照组，且叶片颜色呈现新鲜绿色，而空白组叶片呈暗黑色且发病更为严重。

3、菌株19573-3抑菌活性物质Fengycin的检测：

利用HPLC技术对菌株19573-3的提取物质进行检测，以Fengycin标准品为对照(图3 A)。结果如图3(图3为HPLC检测菌株19573-3分泌Fengycin，其中图3A为Fengycin标准品的HPLC检测图，图3B为菌株19573-3的检测图)所示，发现标准品Fengycin分别在保留时间为4.650min、4.823min有明显的峰形。而菌株19573-3提取物(图3B)在保留时间为4.676min、4.893min也能观察到明显的峰形。根据标准样品梯度检测，建立两个出峰时间的标准曲线：y_4.650min＝3.8326x+657.63(R²＝0.9986)；y_4.823min＝1.2081x+ 266.04(R²＝0.9995)，其中y代表峰面积，x为样品浓度。根据菌株19573-3发酵液粗提取对应保留时间峰面积，计算获得菌株19573-3发酵液中Fengycin产量分别为90.31μg/ml(保留时间4.676min)与45.07μg/ml(保留时间4.893min)。

4、菌株19573-3的植物促生特性：

参考不同活性酶的选择鉴定培养基，对菌株19573-3产酶活性进行检测。培养2d后可以观察到在3种培养基上菌株可正常生长且在菌落周围产生明显的水解晕圈(图4为菌株19573-3植物促生特性相关指标检测，其中图4A分泌蛋白酶，图4B产生纤维素酶，图4C产生纤维素酶)，表明菌株19573-3具备产纤维素酶、蛋白酶能力以及铁载体的能力，并通过水解酶类以及铁载体等物质，加速土壤中植物不可利用物质的水解而成为植物可吸收的物质，并竞争环境中微量的铁离子，为植物生长提供有利条件。

利用UPLC-MS技术对发酵24h的无菌滤液进行检测，并以水杨酸(SA)、细胞分裂素(2iP)、生长激素(IAA)的标准样品为对照，结果表明，菌株19573-3无菌发酵液中检测到以上植物激素均有产生，其中SA18.44 ng/ml，2iP 35.53ng/ml，IAA 47.43ng/ml。此外，菌株19573-3还能产生ACC脱氨酶，为87.43ng/ml。

5、菌种鉴定：

经GENⅢ自动微生物鉴定系统分析发现，菌株19573-3可以利用糊精、D-海藻糖、龙胆二糖、β-甲酰-D-葡糖苷、D-果糖、乳酸钠、D-山梨醇、肌醇、甘油、L-丙氨酸、L- 天冬氨酸、L-谷氨酸、D-葡糖醛酸、L-乳酸、L-苹果酸、氯化锂、亚碲酸钾、丁酸钠等 (表1)，属于芽孢杆菌属。

表1菌株19573-3的生理生化指标

“+”表示可以利用；“-”表示不可以；“W”表示弱反应。

分别根据16S rRNA和gyrA基因序列，与芽孢杆菌属其它种模式菌株构建系统进化树。结果如图5(图5为菌株19573-3与其近缘芽孢杆菌的系统进化分析，其中图5A为基于16SrDNA序列构建的系统发育树；图5B为基于16S rRNA与gyrA基因构建的系统发育树)显示，菌株19573-3与Bacillus velezensis FZB42^T亲缘关系最为接近(图5A)，具有较高的同源性，菌株19573-3初步鉴定为Bacillus velezensis。

芽孢杆菌属不同种之间看家基因的保守性较高，因此利用菌株19573-3的全基因组序列信息进行平均核苷酸一致性分析(Average Nucleotide Identity,ANI)。结果显示菌株19573-3与B.velezensis的ANI值均大于97％(图6，图6为芽孢杆菌属不同菌株的平均核苷酸一致性分析)，而与B.amyloliquefaciens以及其它几个种的ANI值小于95％。综合生理生化指标检测，系统发育分析以及ANI分析，可以确定菌株19573-3属于Bacillusvelezensis。

6、基因组水平的次生代谢产物分析：

利用PacBio平台对B.velezensis19573-3进行全基因组序列测定，该菌株由一个环状的染色体构成，不含质粒，基因组全长3 990 203bp；G+C含量为46.56％；编码基因4164个；编码区总长度占全基因组的比例90.03％。预计染色体上共有86个tRNA，27个rRNA 和8个sRNA，详见表2。

表2菌株19573-3全基因组统计结果

通过antiSMASH分析发现，在B.velezensis 19573-3基因组中共检测到13个与次级代谢产物合成相关的基因簇(表3)，其中Surfactin、fengycin、bacillibactin等是通过非核糖体途径(nonribosomal peptide synthesis,NRPS)合成，而macrolactin H、butirosin A/ butirosin B及difficidin是通过PKS途径(polyketide biosynthase,PKS)合成。这些基因簇与抗菌和螯合铁离子等功能密切相关，且发现合成Fengycin、bacillomycin D等合成基因簇与B.velezensis FZB42^T具有极高的同源性。

表3 B.velezensis 19573-3中次级代谢产物合成基因簇

植物有益微生物资源的挖掘以及开发应用对于目前绿色生态农业的发展具有重要价值，而明确植物有益微生物的分类地位对于深入研究具有举足轻重的作用。一直以来微生物的分类鉴定在研究中既是基础也是核心，但微生物分类的也是极为繁琐且易混淆的问题。在芽孢杆菌以及其它多种细菌的分类中，由于其多种之间形态相似，进化亲缘关系接近给菌株分类地位的明确造成了诸多麻烦。前人研究报道在Bacillus spp.中B.velezensis，B.amyloliquefaciens，及B.siamensis亲缘关系便极为相近^[21]。因此在菌株的鉴定工作中采用多相手段是极为必要的。本研究通过生理生化指标，16S rRNA与gyrA 基因序列系统进化分析以及基于基因组水平的ANI分析鉴定菌株19573-3为贝莱斯芽孢杆菌。

本发明发现B.velezensis 19573-3对包括番茄灰霉病、大豆疫霉、尖孢镰刀菌在内的 6种植物病原真菌均有显著的拮抗活性。此外，B.velezensis 19573-3还可以产生纤维素酶、蛋白酶和铁载体等物质，已有研究表明，上述物质兼具抑制植物病原菌生长的功能。胞外酶已被证实在拮抗真菌病原方面起到了重要作用【辛雅芬,刘晓光,朱俊华,高克祥. 微生物酶及其在植物病害生物防治中的作用[J].安徽农业科学,2009,37(07): 3059-3062.】，能够有效降解病原真菌细胞壁组分进而影响病原菌的正常生长；而铁载体不仅能够促进植物的生长，也可与植物病原菌竞争摄取环境中微量的铁离子来达到抑制病原菌的效果【Hotta K,Kim C Y,Fox D T,Koppisch AT.Siderophore-mediated ironacquisition in Bacillus anthracis and related strains[J].Microbiology,2010,156(7): 1918-1925.】。Cheffi等在橄榄树根系分离筛选得到B.velezensis OEE1具有溶解磷酸盐作用，可以生成IAA及铁载体，且对主要卵菌属和真菌病原菌有较强的抑制活性。张琼等发现B.velezensis SZAD1分泌的纤维素酶和几丁质酶在防控由大丽轮枝菌引起的棉花黄萎病中起到至关重要的作用。Mon Myo等发现具有广谱抑菌活性的B.velezensis NKG-2 也可产生几丁质酶、葡聚糖酶、纤维素酶，以及生长激素与铁载体，兼具抑制病原菌和促进植物生长功能。

植物激素是植物生长过程中重要的信号分子，参与植物多种生物学途径。在对19573-3的代谢产物分析中发现，菌株19573-3能够分泌生长激素IAA、SA等植物激素。随着对激素信号网络作用研究的深入，发现植物激素在调节植物生长和环境适应性方面具有重要意义。合成和分泌植物激素是芽孢杆菌发挥促生功能的重要因素。Meng等发现B.velezensis BAC03、B.velezensis FZB42^T以及QST713均可以产生吲哚乙酸和NH₃，并显示出ACC脱氨酶活性，但是未检测到铁载体的产生。Kim等与Chen等通过全基因组分析分别在B.velezensis GH1-13与B.velezensis LM2303的基因组中注释到了与生长激素相关的ysnS和yhcX基因。而我们的基因组结果也注释到了与生长激素合成相关的基因 ysnS和yhcX，且通过试验也证实菌株19573-3具有产生生长素的能力。除此之外，研究发现水杨酸(Salicylia acid,SA)、茉莉酸(Jasmonic acid,JA)与乙烯(ethylene,ET)介导的信号通路在植物诱导抗病途径中起重要作用。在1992年Edward茉莉酸和茉莉酸甲酯能够有效诱导番茄、烟草和苜蓿植株内蛋白酶抑制剂的合成，从而应对昆虫和病原体的危害。因此，可以推测菌株19573-3除了已知的拮抗活性以外，可能还具备潜在诱导植物抗病性的能力。芽孢杆菌能够产生多种NRPS和PKS等次生代谢产物，是其发挥防病促生功能的关键因素，尤其是NRPS是当前在生物、医药和农业等方面研究的重要天然产物之一。孙平平等发现B.velezensis L-1对梨灰霉和青霉菌具有抑制作用，且L-1全基因组结果显示其具有产生多种聚酮糖、肽聚糖和多肽类等抗性化合物相关的基因簇，并发现了与胞外酶合成相关的基因。CAO等人发现B.velezensis Y6和F7对番茄青枯和尖孢镰刀菌均具有较强的拮抗活性，且发现产生的脂肽类化合物显著的刺激了Y6和F7 与番茄青枯的相互作用。利用antiSMASH对菌株19573-3全基因组分析预测，结果发现该菌株能够合成多种NRPSs，细菌素以及嗜铁素等物质。在B.velezensis 19573-3中可预测到与已报到的bacilysin，bacillibactin，difficidin，fengycin，bacillaene，macrolactin H 等物质完全一致的合成基因簇以及同源性较高的plantazolicin和surfactin等物质，意味着该菌株潜在的合成活性物质至少有以上几种，其中聚酮类化合物Macrolactin、Bacillaene、 Difficidin和脂肽类化合物Surfactin、Fengycin均是芽孢杆菌中研究较多且较为常见的抑菌活性物质。其中Difficidin和bacilysin是B.velezensis FZB42^T最有效的抗菌物质，其对水稻黄单胞菌、细菌性枯萎病和细菌性条斑病均有较好的防效。Bacillibactin是由 dhbACEBF基因簇合成功能基因，当芽孢杆菌处于缺铁状态时，Bacillibactin会参与铁离子的积累和吸收。而脂肽类物质是重要的次级代谢产物，由于其结构特征使其对氧化和相对高温的作用不敏感，因此，在解决作物生产和改善生态环境方面有着较好的应用前景。Plantazolicin的生物合成主要是由12个基因合成，长度覆盖10kb，而19573-3的基因序列中plantazolicin基因簇注释到了11个基因，对比发现是ptnA基因未注释到，而该基因的缺失对于plantazolicin合成的影响仍有待进一步分析。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶编码基因在调控surfactin的合成过程中极为重要，枯草芽孢杆菌168菌株的sfp基因发生突变，则导致该菌株不能产生表面活性素。而在B.velezensis 19573-3与B.velezensis FZB42^T中均注释有sfp基因。由此可以推测菌株19573-3对病原真菌的拮抗作用可能主要来源于这些已知的具有良好防病活性的物质。而其它一些不明确的代谢物同样可能具有潜在的抑菌活性或其他生物学功能。

综上所述，菌株19573-3具有合成和分泌多种抗生素和抗菌肽的潜能，使其在植物防病促生中具备更为广泛多样化的功能和作用，该菌株的多生物活性保障了其在植物促生防病方面有着更为优越的研究潜力和应用价值。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (7)

1.一种贝莱斯芽孢杆菌19573-3，CGMCC No.21866。

2.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌19573-3，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌19573-3是通过下述步骤筛选得到：

(1)、采集山东泰安岱岳区马庄镇马庄村花生根际土，采用5点取样法，将土样混合；

(2)、称取10g土壤于盛有90ml无菌水的三角瓶中，150r/min摇床振荡30min，按照10倍稀释法配制成10^-1～10^-6系列土壤悬液，取其中10^-1、10^-2悬液于80℃水浴中保持10min以杀死非芽孢杆菌，而10^-3、10^-4、10^-5、10^-6悬液不进行加热处理；

(3)、吸取系列土壤悬液0.1ml，分别加入牛肉膏蛋白胨和麦芽汁牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板上，涂布均匀，每个稀释度3次重复，28℃下培养3～4d；

(4)、根据菌体形态特征和菌落形态特征进行初步归类，随机挑取产生芽孢的单个菌落，于无菌玻璃珠水中，制备菌悬液，用接种环于牛肉膏蛋白胨培养基平板上进行交叉划线或连续划线后，28℃下培养3～4d；

(5)选择单个菌落接种斜面，同时做涂片镜检；菌体、菌落形态特征一致的即为单菌落纯培养物，若发现不纯，应做进一步划线分离，直至获得纯培养物，于4℃冰箱中备用。

3.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌19573-3，其特征在于：所述贝莱斯芽孢杆菌19573-3发酵液中Fengycin产量分别为保留时间为4.676min时90.31μg/ml与保留时间为4.893min时45.07μg/ml。

4.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌19573-3，其特征在于：所述贝莱斯芽孢杆菌19573-3具备产纤维素酶、蛋白酶能力以及铁载体的能力。

5.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌19573-3，其特征在于：所述贝莱斯芽孢杆菌19573-3发酵液中有SA、2iP、IAA和ACC脱氨酶产生。

6.根据权利要求5所述的贝莱斯芽孢杆菌19573-3，其特征在于：所述贝莱斯芽孢杆菌19573-3发酵液中产生的SA18.44 ng/ml、2iP 35.53ng/ml、IAA 47.43ng/ml和ACC脱氨酶87.43ng/ml。

7.权利要求1～6所述贝莱斯芽孢杆菌19573-3在抑制尖孢镰刀菌BNCC 120618、灰葡萄孢BNCC 338228、小麦根腐病、大豆疫霉、终极腐霉菌和番茄灰霉病活性中的应用。

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