CN114634891A - 一株贝莱斯芽孢杆菌zh3及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种贝莱斯芽孢杆菌ZH3及其应用。本发明所提供的贝莱斯芽孢杆菌具体为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZH3，它在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.24404。本发明贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZH3可以提高凡纳滨对虾ACP、AKP、SOD酶活性，提高LZM酶含量，促进凡纳滨对虾的非特异性免疫，对感染副溶血性弧菌的凡纳滨对虾受损肠道和肌肉组织具有修复作用。本发明贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZH3在控制大部分革兰氏阴性致病菌(如副溶血性弧菌、单胞菌等)感染和增强益生菌的免疫调节具有有效的QQ和抗菌活性，表明ZH3作为生物防治剂在水产养殖可持续绿色生产中的潜在应用。

Description

一株贝莱斯芽孢杆菌ZH3及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一株贝莱斯芽孢杆菌ZH3及其应用。

背景技术

目前，高密度水产养殖凭借着可以最大限度地提高商业利润的优势脱颖而出，但这种养殖方式会导致水产疾病频发。其中，副溶血性弧菌等弧菌是一种常见的致病菌，其不仅可导致鱼、虾和其他水生动物患病，其还是引起人类感染的主要食源性病菌。副溶血性弧菌可通过伤口感染水生动物，在宿主体内形成生物膜，通过释放群体感应(quorumsensing)产生的毒力因子引起细菌感染，或调节外膜蛋白和外排泵蛋白而产生细菌耐药性。

由于水产养殖中抗生素的滥用，具有耐药性的副溶血性弧菌传播更加广泛，这使副溶血性弧菌病害的防治更加困难，而且增加了新型抗生素开发的难度。随着益生菌免疫增强剂作为饲料添加剂的广泛应用，基于群体感应抑制的微生物拮抗被认为是替代抗生素的有效方法。

因此，开发一种能有效替代抗生素，又能有效抑制有害病菌感染/繁殖的益生菌免疫增强剂是本领域亟待解决的技术难题。

发明内容

本发明的目的是提供一种贝莱斯芽孢杆菌及其生物学纯培养物、及其在制备菌剂、饲料或环境底改制剂中的应用。

为了实现本发明的上述目的，采用了以下技术方案：

一种贝莱斯芽孢杆菌ZH3，该贝莱斯芽孢杆菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称：CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，其保藏编号为CGMCC No.24404。

上述的贝莱斯芽孢杆菌的生物学纯培养物。

上述的贝莱斯芽孢杆菌或贝莱斯芽孢杆菌的生物学纯培养物在制备菌剂或饲料中的应用。

一种饲料添加剂，其包括上述的贝莱斯芽孢杆菌或其生物学纯培养物。

一种饲料，其包括上述的贝莱斯芽孢杆菌或其生物学纯培养物。

一种环境底改制剂，其包括上述的贝莱斯芽孢杆菌或其生物学纯培养物。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)ZH3能提高凡纳滨对虾ACP、AKP、SOD酶活性，提高LZM酶含量，促进凡纳滨对虾的非特异性免疫，对感染副溶血性弧菌的凡纳滨对虾受损肠道和肌肉组织具有修复作用。本发明贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZH3在控制大部分革兰氏阴性致病菌(如副溶血性弧菌、单胞菌等)感染和增强益生菌的免疫调节具有有效的QQ和抗菌活性，表明ZH3作为生物防治剂在水产养殖可持续绿色生产中的潜在应用。

本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌ZH3中还能产生多种酰基高丝氨酸内酯酶，包括AiiA、YtnP，以及未命名的潜在内脂酶0114,1459,1509和1880等群体淬灭酶，可识别和降解革兰氏阴性细菌产生的AHLs信号分子，并通过干预AHLs/Lux病原体的生物膜形成和毒素释放来实现群体感应抑制。基因序列比对结果显示，这些次级代谢产物及淬灭酶在基因序列上与现有报道的基因相似度较低，具有较高的结构新颖性；随后开展的实施例验证中，也发现这些抑菌功能产物在施用效果上能够显著抑制弧菌等革兰氏阴性菌对水产动物的影响。对虾肠道样品的高通量测序结果也显示，ZH3能够在对虾肠道中定殖，显著抑制肠道中的弧菌。

保藏说明

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2022年02月17日

菌种名称：贝莱斯芽孢杆菌

拉丁名：Bacillus velezensis

菌株编号：ZH3

保藏机构：中国普通微生物菌种保藏管理中心

保藏机构简称：CGMCC

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.24404

附图说明

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。

图1为贝莱斯芽孢杆菌ZH3的遗传进化树图。

图2为贝莱斯芽孢杆菌ZH3同源序列预测群体淬灭淬灭酶情况图。

图3为重组载体pET28a-ZH3aiiA结构示意图。

图4为贝莱斯芽孢杆菌ZH3潜在群体淬灭酶蛋白表达情况图。

图5为贝莱斯芽孢杆菌ZH3潜在群体淬灭酶蛋白对AHL降解情况图。

图6为AiiAZH3对不同的AHLs具有不同的降解活性图。

图7为AiiAZH3和蛋白0540的三维结构模拟示意图。

图8为贝莱斯芽孢杆菌ZH3的AiiA和YtnP蛋白表达情况图。

图9为贝莱斯芽孢杆菌ZH3及其组分对病原菌抑制作用的体外影响图。

生物膜由柱子表示，17SZ的游离态细菌数量由█表示，ZH3由▲表示。误差棒以标准差表示。统计学分析结果以显著性差异表示，分别为**p<0.01和p<0.05

图10为贝莱斯芽孢杆菌ZH3的非特异性免疫力分析情况图。

将每100mL细菌培养液(OD600nm 0.1)分别倒入水族箱中浸泡攻毒凡纳滨对虾，最终浓度为10⁵CFU/mL。空白(阴性对照)、第一周添加ZH3、每周连续添加ZH3、添加17SZ再连续添加ZH3，仅添加17SZ形成对照，(a)ACP，(b)AKP，(c)SOD，(d)LZM。误差棒以标准差表示。统计学分析结果以显著性差异表示，分别为**，p<0.01，*，p<0.05

图11为添加贝莱斯芽孢杆菌ZH3的苏木精-伊红(H&E)染色法下感染组织分析图。

将每100mL细菌培养液(OD600nm 0.1)分别倒入水族箱浸泡攻毒凡纳滨对虾，最终浓度为10⁵CFU/mL。肠道标本行H&E染色，镜检成像。

(a)空白对虾肠道；

(b)ZH3攻毒对虾肠道；

(c)17SZ攻毒对虾肠道；

(d)17SZ攻毒在持续添加ZH3攻毒的对虾肠道。

箭头分别指示肠道上皮细胞从基膜脱落的位置，嗜碱性细胞核体积增大，嗜酸性细胞质体积减少，肠道上皮细胞解体。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，但本领域技术人员了解，下述实施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改变和变化，都在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例提供贝莱斯芽孢杆菌ZH3的分离与鉴定

一、贝莱斯芽孢杆菌ZH3的分离

S1.菌株来源

福建东山珊瑚生态系统的鱼类肠道中。

S2.菌株的分离

取5～10mL上述样品，在液氮中研磨后，用无菌海水采用十倍稀释法进行梯度稀释，每个浓度各取100μL液体分别涂布在细菌分离培养基，28～37℃倒置培养24～48h。根据菌落大小、颜色、边缘光滑程度等对细菌进行分离、纯化。

上述细菌分离培养基为：NB(Nutrient Broth)培养基(0.5％蛋白胨，3％牛肉膏，0.5％氯化钠，pH7.3)、M1培养基(1％淀粉，0.4％酵母粉，0.2％蛋白胨，pH7.3)和Zobell2216E培养基(0.5％蛋白胨，0.1％酵母提取物，天然过滤海水：纯水＝2:1(V/V)，pH7.6)。

S3.菌株的培养

将上述筛得的贝莱斯芽孢杆菌接种于改良LB培养基，25～40℃，150～220rpm，8～16h活化，活化后接种至300mL改良LB(Luria Broth)培养基(1L锥形瓶)，接种量1％(V/V)，37℃，180rpm，24h后，发酵液离心(10000rpm，4℃，10min)弃菌体，加入固体硫酸铵使溶液硫酸铵饱和度达到100％，4℃过夜，10000rpm离心30min后得沉淀物，所得沉淀物用3000Da透析袋除盐，冷冻干燥得抗菌蛋白样品。按改良琼脂扩散方法检测发酵液处理后的抑菌活性，进而筛选出产抗菌蛋白活性强的菌株，将该菌株标记为ZH3。

二、贝莱斯芽孢杆菌ZH3的鉴定

S1.形态学鉴定

将筛选所得ZH3菌株接种至LB固体培养基，于37℃下培养，观察菌落形态，结果如下：ZH3菌株微泛黄大菌落，边缘不规则，表面平整、干燥，革兰氏阳性，镜检呈杆状。

S2.生理生化特征测定

将筛选所得ZH3菌株接种至LB固体培养基，于37℃下培养，观察菌落形态，并做部分生理生化特性的测定，结果如下：ZH3菌株能分解D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖和七叶苷，能水解明胶、淀粉和酪蛋白，其氧化酶反应、接触酶反应、硝酸盐还原反应、V-P反应和吲哚试验均呈阳性。

S3.16S rDNA序列同源性分析

1)DNA提取

利用OMEGA的细菌DNA试剂盒提取菌株基因组DNA，采用细菌通用引物(引物由南京金斯瑞生物科技有限公司公司合成)。

引物序列为：

正向引物为27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)(SEQ ID NO:2)；

反向引物为1492R(5’-TACGACTTAACCCCAATCGC-3’)(SEQ ID NO:3)。

反应体系：

PCR扩增程序：2×TaqPCR MasterMix 12.5μL、上下游引物各1μL、DNA模板0.5μL、ddH₂O 10μL；反应程序：95℃5min；94℃1min，55-58℃1min，72℃90s，30个循环；72℃10min

2)序列测定

PCR产物纯化后，送厦门铂瑞生物科技有限公司进行序列测定，其序列如下(如SEQID NO:1所示)：

CCTTTCCGGCCTGCCCTAAACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAAGTGAACAAAAGT

该序列与NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)已知标准菌株比对表明，该菌株与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)JS39D的同源性最高，达99.72％(遗传进化树参见图1)。

上述形态特征、生理生化特征分析和16srDNA序列同源性分析结果表明该菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。该菌株已于2022年02月17日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCCNo.24404，其分类命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZH3。

实施例2

本实施例提供贝莱斯芽孢杆菌ZH3的全基因组测序与功能分析

一、基因组DNA的提取和序列的性能

细菌培养物在37℃下孵育，180rpm摇动12小时，8000rpm离心10min，得到细菌颗粒。用CTAB法从颗粒中提取ZH3菌株基因组DNA 100ng，用Covaris S220超声随机消化成小于500bp的片段，建立cDNA文库。使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA)评估cDNA的质量，而使用Qubit 3.0荧光计(Thermo Fisher Science，Waltham，MA，USA)评估cDNA的数量)。基因组完成图采用IlluminaHiseq×10和PacBioRSII由Majorbio进行(中国上海)。

测序结果：根据使用软件SOAPdenovo v2.04和GapCloserv1.12进行从头组装的测序结果，如表1所示，ZH3株基因组全长为3929792bp，其中GC含量为46.50％。其中，通过软件Glimmer和GeneMarkS分析，预测的蛋白质编码序列(CDS)的数量为4016个基因序列，长度为3501957bp，GC含量为47.29％，占基因组序列的89.11％。用软件tRNAscan-SE v2.0(http://trna.ucsc.edu/software/)预测86个tRNA。

基因预测：基因组岛的数量由分析软件IslandPath-DIMOB预测其中有4个基因组岛由61个编码基因组成，参与致病性、药物耐受性、代谢和共生，这可能有助于ZH3在环境中的适应和益生菌功能。

潜在益生菌特性的基因注释：根据基因注释，由568个基因组成的12个簇被预测参与次级代谢产物，包括Baciysin的生物合成(100％相似)、Macrolactin(100％相似)、Bacillaene(100％相似)、Difficidin(100％相似)、Butirosin(7％相似)、Surfactin(82％相似)、Fengycin(100％相似)、Bacillibactin(100％相似)。

碳水化合物-活性酶数据库(CAZy)的注释结果还表明，预测基因中有125个CAZymes，包括40个糖苷水解酶(32.0％)、40个糖基转移酶(32.0％)、31个碳水化合物酯酶(24.8％)、9个辅助活性基因(7.2％)、3个多糖裂解酶基因(2.4％)和2个碳水化合物结合模块基因(1.6％)。

通过比较综合抗生素耐药数据库(CARD)的注释结果表明，ZH3菌株中存在246个抗生素耐药基因，表明该菌株对大环内酯类抗生素(34个基因)、氟喹诺酮(33个基因)、青霉素(22个基因)、肽类抗生素(19个基因)、四环素(17个基因)、头孢菌素(13个基因)、氨基糖苷类抗生素(11个基因)、吖啶染料(10个基因)、碳青霉烯(9个基因)和其他抗生素(90个基因)具有耐受性。

与VFDB数据库比较，观察到380个可能作为毒力因子的基因预测基因：分别为攻击毒力因子，包括36个粘附基因、25个侵袭基因、12个分泌系统基因和1个毒素基因；防御毒力因子，包括49个抗吞噬基因和11个应激蛋白基因；非特异性毒力因子，包括54个铁摄取系统基因和1个胞外酶基因；13个基因参与毒力相关基因的调控。

同源序列预测群体淬灭淬灭酶：根据COG注释，如图2所示，含有保守的β-内酰胺酶结构域的一组蛋白质与报道的群体淬灭内酯酶家族一致，由于其具有潜在AHL结合能力的丝氨酸活性位点的同源序列和被归类为金属依赖性水解酶超家族的金属结合位点，被预测为群体淬灭相关蛋白。其中，如图X所示，蛋白质4079对苏云芽孢杆菌群体淬灭内酯酶(AiiA)的一致性为91.6％(PDBID：3DHB)，与蜡状芽孢杆菌Y2的Y2-AiiA-AHL-内酯酶(Swiss-Prot：Q08GP4.1)98.40％同源，有不同残基Ile9(I)、Gln18(Q)、Gla27(A)和Gly201(G)，因此被命名为AiiAZH3。而如图XX所示，蛋白0540与枯草芽孢杆菌168的YtnP 79％同源(Swiss-Prot：O34760.2)，与蜡状芽胞杆菌Y2-AiiA 26.14％同源(Swiss-Prot：Q08GP4.1)，与Agrobacterium fabrum str.C58 AiiB 27.84％同源(Swiss-Prot：A9CKY2.1)。

对于其他预测的蛋白质，这些还没有被报道为QQ酶，如图2所示，蛋白质0114与来自贝莱斯芽孢杆菌G341的未表征蛋白YqgX有99.53％的同源；蛋白质1459被鉴定为推测的Bacillaene生物合成锌依赖水解酶，与来自贝莱斯芽孢杆菌UCMB5033(GenBank：AIU81842.1；UniPro：S6FKG4)的BaeB 100％同源；蛋白质1509与来自枯草芽孢杆菌菌株168(UniPro：P54553)的可能的金属水解酶YqjP 59.1％同源；蛋白质1800与来自从鞭毛虫中折叠金属水解酶YflN 28.64％同源(UniPro：A0A2V5K1S6)；蛋白1829与枯草芽孢杆菌168株(UniPro：O34910)未表征蛋白YobT 69.4％同源；蛋白3013与可能的金属水解酶YflN(UniPro：O34409)76.1％同源。

表1贝莱斯芽孢杆菌ZH3基因组DNA测序分析

二、潜在的群体淬灭酶的表达

(一)细菌、质粒和试剂

大肠杆菌DH5α和大肠杆菌BL21菌株、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和卡那霉素的活性细胞购自Transgen(中国北京)。用PCR方法从基因组DNA中扩增出预测群体淬灭酶的序列，并在限制性内切位点之间的表达载体上构建。用于PCR的引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)(SEQ ID NO:4)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTAGGACTT-3’)(SEQID NO:5)由Sangon生物技术(上海)有限公司合成。Takara PrimeStarMAX DNA聚合酶(cat.R045A)，Takara快速切割限制酶NdeI(cat.1621)和XhoI(cat.1635)和Takara结扎试剂盒(cat.6022)均用于构建表达克隆。质粒pET28a表达载体来自Novagen(Cat.69864-3)。质粒微型准备试剂(cat.CMK5999)和凝胶提取试剂盒(cat.D2500-02)均从Promega购买。AHLs，C6-HSL(Cat.56395)，3-O-C6-HSL(Cat.K3255),C4-HSL(Cat.09945)，3-OH-C4-HSL(Cat.74359),3-O-C10-HSL(Cat.O9014)，3-O-C12-HSL(Cat.O9139),均购自Sigma-Aldrich。

(二)融合酶复合物的构建

利用附录中列出的模板和引物构建了一系列融合蛋白。分别用限制性内切酶NdeI和XhoI消化PCR产物，然后用Takara连接试剂盒在pET28a载体上的多个克隆位点之间连接。表达克隆分别由T7启动子驱动，质粒上的His标记编码序列将组氨酸编码到靶蛋白的N端。将工程质粒转移到大肠杆菌BL21中进行蛋白表达。

(三)细菌培养和蛋白质表达

用LB培养基(含10g/L曲普酮、5g/L酵母提取物和10g/L NaCl至pH7.0，25℃)在37℃下摇动180rpm，注入0.2mM IPTG，诱导细菌培养2小时孵育后蛋白表达。将过夜培养的细菌用PBS(pH7.0)洗涤浓缩成5：1，在冰上进行超声破碎(3s×6s在300W下60次)，在4℃下10000rpm离心15min，收获上清液中的粗提取物。

如图3所示，在pET28a质粒上构建预测群体淬灭酶的操作子，并在大肠杆菌BL21中诱导表达，分别编码AiiA、蛋白0540、蛋白1829、蛋白3013、蛋白0114、蛋白1459、蛋白1509和蛋白1800。通过Sangon Biotech(上海)有限公司的测序证实了表达克隆的序列结构。用SDS-PAGE对表达蛋白进行了分析，如图4所示，AiiAZH3在28.10kDa，蛋白质0540在31.93kDa，蛋白质0114在23.61kDa，蛋白质1829在25.87kDa，蛋白质3013在29.34kDa，蛋白质1459在26.47kDa，蛋白质1509在35.46kDa，蛋白质1800在27.77kDa分别在跑道3，4，5，6，7，8，9和10。

(四)荧光成像对AHLs降解活性的体外评价

通过共培养LuxR-PluxI-RFP操纵子在大肠杆菌BL21菌株(简称LuxR-RFP)中产生的相对荧光强度来确定AHL水平，该菌株来自厦门大学(厦门，中国)，并在NdeI和HpaI的限制性位点之间进行。

用100μL粗酶提取法分别加入800m AHLs进行提取用于治疗。用同一载体上表达的AiiA3DHB作为阳性对照，无菌水作为阴性对照。将混合物(酶AHLs)混合均匀，在28℃反应45min，立即加入10％的SDS停止反应。报告菌株在37℃下孵育一夜，在200转/分下摇动，然后接种上述酶-AHL混合物，在25℃下在180转/分下摇动8h，在4℃下在8000g下离心，再用等量的PBS悬浮。用荧光分光光度计在620nm处(激发波长584nm)测定悬浮液的荧光强度，并测定600nm处的光密度OD。通过将上述荧光强度除以OD600值计算相对荧光强度。每次实验重复三次。

预测蛋白对AHL降解的鉴定：重组酶首先通过对革兰氏阴性菌C6-HSL中流行的自动诱导信号的AHL降解能力来鉴定。用报告操纵子LuxR-RFP产生的荧光强度测定共培养处理后残留的AHL水平。如图5所示，观察到可能的金属水解酶蛋白4079、0540、0114、1459、1509和1800对C6-HSL具有正降解能力，它们与AiiA3DHB的处理表现出相似的降解活性，两者与非负载pET28a载体提取的阴性对照有显著差异。其中，蛋白4079和0540的结果与关于酰基-L-高丝氨酸-内酯乳糖水解酶活性的基因注释一致，因为它们与AiiA和YtnP具有同源性。

群体淬灭酶对AHLs降解的活性：可能的群体淬灭酶，AiiA样蛋白4079和YtnP样蛋白0540，通过对更多种类AHLs的降解活性进一步证实。如图6所示，AiiAZH3和0540都对不同的AHLs具有不同的降解活性，这大大降低了所有被测试的AHLs、3-O-C6-HSL、C6-HSL、3-OH-C4-HSL、C4-HSL、3-O-C12-HSL和3-O-C10-HSL的水平，但是活性不如AiiA3DHB对照组，这表明AHLs上酰基链的长度和取代基均不影响AiiAZH3和蛋白质0540的降解活性。

(五)三维结构模拟

利用I-TASSE Rserver对酶复合物的三维结构模型进行模拟和预测，利用软件VMD1.8.3对置信度高的模拟模型进行分析，重点是配体结合区和活性位点的功能预测。

用I-TASSER模拟AiiAZH3和蛋白0540的典型结构，利用结构排列匹配PDB文库中的结构，预测结果的最佳命中均导致群体淬灭内酯酶的功能酶，与实验数据一致。

如图7A所示，根据所有残基在2.6±1.9A的两种结构(RMSD)中的平均距离，AiiAZH3模型被预测为N-酰基高丝氨酸乳酮水解酶(最高TM数为0.988)，在H104、H106、H169和D191残基处含有Zn²⁺结合位点；在H104、H106、F107、D108、H109、H169、D191、Y194、H235残基处含有PO43-结合位点；在R13、M15、L30、L33、V35、M53、H106、D108、H169、D191、T195、P204、F205、A206、H235、1K4(N64、T67、F68、I73、H106、F107、D108、H109、E136、H169、D191、Y194、H235残基处含有MCL(巯基羧酸盐抑制剂和(2-巯基甲基-4-苯基-丁酰基)-(5-四唑-1-YL甲基-噻吩-2-YL)-乙酸)结合位点；在C14、F64、T67、F68、I73、H106、F107、D108、H108、H109、H109、E136、H169、D191、Y194、H235残基处含有1K4(N-癸酰-L-高丝氨酸)结合位点；在E197和N198残基处有活性位点。

如图7B所示，RMSD在4.1±2.7A处的蛋白质0540模型被预测为AidC样内酯酶(最高TM数为0.933)，在H111、H113、D115、H116、H191、D212、H257残基处含有FeO(μ-氧铁)结合位点；在H111、H113、H191、D212残基处含有Zn²⁺结合位点；在M21、L49、I69、H113、D115、H191、D212、L226、A227、H257残基处含有MCO(D-卡托普利和1-(3-巯基-2-甲基-丙酰基)-吡咯烷-2-羧酸)结合位点；在T19、M21、Q46、L49、R50、T51、I69、H113、D115、H191、L226、A227、H257残基处含有MCL(巯基-羧酸盐抑制剂和(2-巯基甲基-4-苯基-丁酰基)-(5-四唑-1-YL甲基-噻吩-2-YL)-乙酸)结合位点；在D115残基处含有活性位点。

实施例3

本实施例提供贝莱斯芽孢杆菌ZH3的应用

在前期工作中，携带ZH3中的AiiA和YtnP表达克隆的大肠杆菌工程菌BL21菌株，E.coli::pET28a/AiiA和E.coli::pET28a/YtnP，由实验室构建。副溶血性弧菌17Sz菌株由中国厦门思明区疾病控制中心提供。

(一)细菌的培养及功能产物的制备

在500mL新鲜的LB培养基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物和10g/LNaCl，pH7.0)中接种1％(v/v)ZH3，并在37℃，180r/min培养24h。然后将培养液在4℃，10000r/min下离心10分钟，收集上清液，然后用0.22μm膜进行过滤。向(NH₄)₂SO₄加入已过滤的上清液至70％的饱和度，4℃下静置过夜，并在4℃，10000r/min下离心20分钟，以收集盐析蛋白质。接着将蛋白质粗产物在3000Da透析袋内透析18小时，并储存进一步研究。

在37℃，180r/min培养箱中培养接种在LB培养基中的淬灭酶表达菌株，2小时后加入0.2mMIPTG，以诱导蛋白质表达。将过夜培养的细菌用PBS缓冲溶液(pH7.0)洗涤并且按5：1的比例加入PBS缓冲溶液(pH7.0)混合，然后在冰上进行超声破碎(300W，3s×6s，60次)，并在4℃，9500r/min，离心15min，最后从上清液中提取粗提取物。使用裂解液(300mMNaCl和50mM NaH₂PO₄(pH7.4))重悬，萃取粗酶，然后用咪唑洗脱液(300mMNaCl、200mM咪唑和50mMNaH₂PO₄(pH7.4))洗涤。采用高亲和力的NI-NTA色谱法纯化组氨酸标记酶。然后将纯化的酶过滤灭菌，并用SDS-PAGE进行分析。最后使用Bradford测定法鉴定蛋白质的浓度(结果如图8所示)。

(二)琼脂扩散法测定上述粗蛋白对副溶血性弧菌的抑菌活性

将过夜培养的1.5mL 17SZ菌液与150mL新鲜LB培养基(含1.5％琼脂)在50℃左右混合。然后将混合后的培养液立即倒入培养皿中，每个培养皿中约倒20mL。在固体培养基中打孔，向孔中加入50μL ZH3培养液中的上述粗蛋白溶液。将平板在30℃培养箱中培养24小时以检查抑菌圈。

(三)RT-QPCR测定群体感应淬灭酶对副溶血性弧菌的影响

RT-qPCR对群体感应的分析：使用Trizol RNA纯化试剂盒(Takara)分别在2、4、6和12h时从1mL17SZ培养液上清液中提取RNA样本，然后以可以除去基因组DNA的PrimeScriptRT试剂盒(Takara)作为逆转录的模板，以合成cDNA用于进一步的qPCR程序。

结晶紫微板生物膜测定法：每100μL ZH3上清液和裂解液，0.1μL、1μL和10μL的ZH3菌液(107CFU/mL)，0.1μL、1μL和10μL的群体感应淬灭酶(AiiA与YtnP混合)分别与1μL 17SZ菌液(OD600nm 0.1,108CFU/mL)在200BM培养基上混合，17SZ与PBS缓冲液混合物作为空白对照，30℃温育3天。结晶紫检测法分析生物膜的形成，生物膜上清液涂布到LB培养基上计算细菌数量。

结果如图9所示，ZH3裂解物能够显著降低17SZ生物膜的形成(P值为0.0045)，且与游离态细菌菌液没有差异；含有抗菌肽的ZH3上清液也能够限制生物膜形成(P值为0.0026)，并且减少了约一半的游离17SZ；与注射17SZ和不同剂量ZH3混合物相比，ZH3沉淀对17SZ的数量和生物膜形成表现出与用量有关的抑制作用，其中，ZH3也能形成少数生物膜。加入AiiA和YtnP混合物对生物膜形成的作用与细胞沉淀和裂解物趋势一致，但对游离态的17SZ没有显著作用。

(四)ZH3及其组分对病原菌抑制作用的体外影响

将过夜培养100μLZH3的LB培养基离心，分别收集上清液和沉淀物，然后用1μg/mL溶菌酶处理沉淀物，获得细菌裂解液。将100μL ZH3上清液和裂解液、0.1μL、1μL和10μL过夜培养的ZH3菌液、0.1μL、1μL和10μL淬灭酶粗酶分别与过夜培养的1μL 17SZ菌液在200BM培养基中混合，以PBS缓冲溶液为空白对照，比较不同浓度ZH3对17SZ生物膜形成(结果如图9所示)和浮游细菌数量的抑制作用(结果如表2所示)。

如表2所示，微生物拮抗活性的结果表明，上清液(抑菌圈直径为19.4±0.2mm)和ZH3沉淀(抑菌圈直径为16.5±0.3mm)有抑菌活性，裂解物无抑菌活性；而从上清液中提取的粗蛋白(浓缩约100倍)出现直径为24.3±0.2mm的抑菌圈。结果表明，ZH3的抗菌能力主要与分泌的胞外肽有关，而与细胞裂解液中含有群体感应淬灭酶的胞内产物无关。

将BM培养基中的上述混合物在30℃下培养3天，形成生物膜。通过结晶紫分析法分析生物膜，将生物膜培养物的上清液涂布在LB琼脂平板上，并在37℃下培养24小时，以计算浮游细菌数量。

表2ZH3各组分对副溶血性弧菌的抑菌效果

ZH3各组分	抑菌圈(直径/mm)
		发酵上清液	19.4±0.2
菌体细胞	16.5±0.3
		细胞裂解液	/
发酵上清液中的粗蛋白	24.3±0.2

(五)益生菌对凡纳滨对虾非特异性免疫的影响

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)体长10±1cm，体重13.3±0.8g，生长在长×宽×深＝96mm×74mm×66mm的水族箱中，含300L新鲜海水，在高饲养密度下连续曝气。在中国漳州诏安(经度117.17501，纬度23.71148)进行了对虾养殖试验。每个水族箱中的水都进行泵循环，以清除虾的排泄物，并在潮位变化后每天更换一次新鲜海水。水族箱放置在室内，空气流通良好。每天喂养三次(上午6点、上午12点和下午6点)，为期一周，以适应试验前的饮食习惯。

浸泡攻毒的影响：每个水族箱150只虾被随机分配到4组，分别用100mL17SZ、ZH3、17SZ和ZH3的混合物处理，其中每组菌液在OD600nm为0.1下开始培养，至最终浓度为10⁵CFU/mL，与相同体积的新鲜LB液体培养基(空白)对照。

注射攻毒的影响：将30只虾随机分为6组，分别用注射器注射高剂量(OD600nm0.06,10⁷CFU/mL)和低剂量(OD600nm 0.006,10⁶CFU/mL)的17SZ和ZH3混合物(1:1)1ml，与注射相同体积的17SZ和ZH3(1:1pH 7.0的PBS缓冲溶液作为控制变量)的对照组进行比较。在对虾身体第5和第6个节之间肌肉注射。

非特异性免疫力分析：在浸泡攻毒和注射攻毒后第28天，从对虾的腹窦取约1mL血淋巴，在4℃下过夜静置，分离血清。血清在4℃，3000r/min离心15分钟，收集上清液。使用商业检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)和光吸收全波长酶标仪(SpectraMax M5)测定上清液中AKP、ACP、SOD、CAT和LZM的酶活性。结果如图10所示。

如图10所示，在副溶血性弧菌(P值为0.013)的浸泡攻毒下，即使加入了ZH3(P值为0.030)，ACP活性(图10-a)也显著下降，说明致病菌对对虾的ACP生长因子产生了不可逆的不良影响。此外，在试验第1周添加ZH3能够提高ACP活性，但与空白组没有显著差别，此后持续添加ZH3将会抑制ACP酶活性。

AKP酶活性(图10-b)与ACP酶活性的变化趋势相似，即初始时，加入ZH3的初始对宿主没有明显差异，连续添加ZH3会导致AKP酶活性显著降低。但连续饲喂添加ZH3的饲料大大缓解了副溶血性弧菌(P值为3.2E-06)对对虾的毒害，与空白组(P值为0.018)的对虾情况相似。

SOD活性(图10-c)与ACP、AKP酶活性也表现出一致的变化趋势，即初始时加入ZH3和连续添加ZH3对SOD活性的影响与对照组无显著差异。此外，虽然17SZ的感染导致SOD活性的降低，但加入ZH3显著缓解了17SZ的影响(P值为0.00011)，表明在副溶血弧菌存在的情况下，加入ZH3确实有助于清除自由基的非特异性免疫反应。

根据LZM酶活性的数据(图10-d)，加入ZH3能够降低对虾溶菌酶的表达这种非特异性免疫反应，持续添加ZH3能够明显改变LZM活性(P值为0.0016)，而在副溶血性弧菌浸泡攻毒下，添加ZH3(与空白组相比P值为0.00020)能够显著提高宿主的LZM活性(P值为0.0076)。考虑到ZH3中群体感应淬灭酶和抗菌肽等功能产物的影响，本实验结果验证了ZH3对副溶血性弧菌的控制采用“抑制但不致死”的策略，同时也说明ZH3对对虾是无毒的。

苏木精-伊红(H&E)染色法下感染组织的分析：先将感染的凡纳滨对虾组织浸泡在Bouin固定液中浸泡4h，然后转移到70％酒精中。接着将对虾组织放入组织包埋盒中，通过一系列酒精梯度脱水，并嵌入石蜡块中。将组织切片在二甲苯中脱蜡20分钟，2次，通过100％至75％乙醇溶液覆水5分钟，覆水后用无菌水冲洗。然后用苏木精染色，5分钟，用无菌水冲洗，接着再将乙醇浓度从85％递增至95％，每个梯度5分钟，并用伊红染色，5分钟。染色后，组织切片用100％乙醇脱水三次，二甲苯脱水两次，每次5分钟，并用中性树胶密封。最后使用brightfield显微镜(尼康Eclipse E100)和成像系统(尼康DS-U3)成像。结果如图11所示。

如图11所示，对照组(图11-a)健康虾的肠道上皮细胞排列紧密，肠道上皮细胞边缘较厚，无肿胀现象；ZH3攻毒对虾(图11-b)肠道边缘稍薄，肠上皮细胞受损。而副溶血性弧菌感染组(图11-c)，对虾肠腔内的肠道上皮组织几乎脱落，肠壁肿胀。ZH3混合17SZ组(图11-d)肠道损伤症状明显减轻，虽有少量上皮细胞脱离肠道，但仍有完整的肠上皮细胞存在，肠壁肿胀。4组对虾浸泡攻毒后的症状明显，说明ZH3对感染副溶血性弧菌的对虾有抗炎和减轻损伤作用。

综上，本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZH3能提高凡纳滨对虾ACP、AKP、SOD酶活性，提高LZM酶含量，促进凡纳滨对虾的非特异性免疫，对感染副溶血性弧菌的凡纳滨对虾受损肠道和肌肉组织具有修复作用。本发明贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)ZH3在控制大部分革兰氏阴性致病菌(如副溶血性弧菌、单胞菌等)感染和增强益生菌的免疫调节具有有效的QQ和抗菌活性，表明ZH3作为生物防治剂在水产养殖可持续绿色生产中的潜在应用。

本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌ZH3中还能产生多种酰基高丝氨酸内酯酶，包括AiiA、YtnP，以及未命名的潜在内脂酶0114,1459,1509和1880等群体淬灭酶，可识别和降解革兰氏阴性细菌产生的AHLs信号分子，并通过干预AHLs/Lux病原体的生物膜形成和毒素释放来实现群体感应抑制。基因序列比对结果显示，这些次级代谢产物及淬灭酶在基因序列上与现有报道的基因相似度较低，具有较高的结构新颖性；随后开展的实施例验证中，也发现这些抑菌功能产物在施用效果上能够显著抑制弧菌等革兰氏阴性菌对水产动物的影响。对虾肠道样品的高通量测序结果也显示，ZH3能够在对虾肠道中定殖，显著抑制肠道中的弧菌。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

序列表

<110> 厦门萤星海科技有限公司

华侨大学

福建汇盛生物科技有限公司

<120> 一株贝莱斯芽孢杆菌ZH3及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1456

<212> DNA

<213> Bacillus velezensis

<400> 1

cctttccggc ctgccctaaa catgcaagtc gagcggacag atgggagctt gctccctgat 60

gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc tgtaagactg ggataactcc 120

gggaaaccgg ggctaatacc ggatggttgt ttgaaccgca tggttcagac ataaaaggtg 180

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gaaagtgaac aaaagt 1456

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<210> 3

<211> 20

<212> DNA

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<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggttaccttg ttaggactt 19

Claims (7)

1.一种贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌ZH3(Bacillus velezensis ZH3)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.24404。

2.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌的生物学纯培养物。

3.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌或权利要求2所述的贝莱斯芽孢杆菌的生物学纯培养物在制备菌剂、饲料或环境底改制剂中的应用。

4.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包括权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌或权利要求2所述的贝莱斯芽孢杆菌的生物学纯培养物。

5.一种饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂包括权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌或权利要求2所述的贝莱斯芽孢杆菌的生物学纯培养物。

6.一种饲料，其特征在于，所述饲料包括权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌或权利要求2所述的贝莱斯芽孢杆菌的生物学纯培养物。

7.一种环境底改制剂，其特征在于，所述环境底改制剂包括权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌或权利要求2所述的贝莱斯芽孢杆菌的生物学纯培养物。

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