CN109762760A - 一种贝莱斯芽孢杆菌dh82及其抗菌蛋白的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)DH82，该菌于2018年12月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16865；并公开利用该贝莱斯芽孢杆菌DH82制备其抗菌蛋白的方法，及该抗菌蛋白在水产养殖饲料添加剂中的应用；其抗菌蛋白能够有效防控水产病原菌引发的水产养殖动物的病害，从而保护水生动物健康生长，且能作为渔业养殖饲料添加剂显著提高水生动物机体免疫力，有着较好的应用前景。

Description

一种贝莱斯芽孢杆菌DH82及其抗菌蛋白的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种微生物菌株及其应用，尤其涉及一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacilusvelezensis)DH82及其抗菌蛋白的制备方法和应用。

背景技术

近年来，随着海洋渔业和水产养殖业的快速发展，我国养殖水体本身净化能力减弱、水环境污染、病原菌大量繁殖，极大地增加了水产动物之间病原体交叉感染的机会。迟缓爱德华氏菌(Edwardsiela tarda)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、坎氏弧菌(Vibrio campbelii)等水产细菌性致病菌，在海、淡水鱼的养殖过程中经常侵染鱼的皮肤及腮部，引发败血症，对水产养殖业构成较大的威胁并造成经济损失。因此，寻求安全、高效、生态的防治方法迫在眉睫。

对于水产养殖过程中的细菌性病害防治，传统处理方法是使用化学抗生素，这易使原本没有抗生素抗性的细菌获得耐药性，培养出超级细菌，使细菌性病害防治更加困难。同时化学抗生素的大量使用和滥用，导致水产品药物残留，最终通过食物链进入到人体内，威胁食用者安全，在国内外的水产养殖受到极大的限制。因此，积极寻找和开发出能够有效抑制病原菌的化学抗生素替代物至关重要。

深海是指水深大于1000米的海洋，广泛分布着海山、海盆和海沟等，有着热液口、冷泉、高压、高温、高污染等多种复杂独特生境。深海微生物在这极端生境中，往往能够产生结构和功能独特的生物活性物质，并与陆源活性物质结构和功能不同。其中，芽孢杆菌以其抗逆性强、稳定性好及能产生多种功能特异的活性物质而成为海洋极端生境微生物开发的重点，益生和抗菌功能是当前相关研究的热点。

目前，针对贝莱斯芽孢杆菌应用于水产养殖细菌性病害防控专利寥寥无几。本发明涉及贝莱斯芽孢杆菌DH82在针对迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、坎氏弧菌等水产细菌性致病菌等有拮抗作用，在水产疾病的防治上有着极大应用价值。同时该菌株还兼具促进水产动物生长和提高水生动物机体免疫力的特点，是一种新型的多功能微生物。目前尚无贝莱斯芽孢杆菌在此方面的专利报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis) DH82，该菌株已于2018年12月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16865。

本发明的贝莱斯芽孢杆菌(Bacilus velezensis)DH82是从蛟龙号第150潜次中西太平洋雅浦海沟6000米深的海水样品筛选到产抗菌蛋白的菌株，结合形态学和生理生化特性，并对16S rDNA和gyrB 基因进行生物信息学分析，最终鉴定其为贝莱斯芽孢杆菌Bacilus velezensis。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述的贝莱斯芽孢杆菌 DH82制备其抗菌蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)菌株活化：将贝莱斯芽孢杆菌DH82接种于改良LB培养基，25～40℃，150～220rpm，8～16h；

(2)发酵上清液的制备：将步骤(1)活化好的菌液按1～5％ (V/V)接种到改良LB培养基，25～40℃，150～220rpm，10～35h，所有发酵液在5000～12000rpm，4℃，离心10～30min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，得发酵上清液；

(3)抗菌蛋白的制备：于步骤(2)发酵上清液50～2000mL，加入固体硫酸铵使溶液硫酸铵饱和度达到40～100％，4℃过夜，于 6000～10000rpm离心20～30min得沉淀物，用超纯水溶解，3000Da 透析袋透析24～48h，冷冻干燥得贝莱斯芽孢杆菌DH82抗菌蛋白。

本发明的又一目的在于贝莱斯芽孢杆菌DH82抗菌蛋白在制备水产养殖饲料添加剂中的应用。

本发明的有益效果：

本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌DH82抗菌蛋白能够有效防控水产病原菌，如迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、坎氏弧菌、溶藻弧菌和哈维氏弧菌，能够有效防控由病原菌引发的水产养殖动物的病害，从而保护水生动物健康生长，且能作为渔业养殖饲料添加剂显著提高水生动物机体免疫力，有着较好的应用前景。

附图说明

图1为菌株16S rDNA序列系统进化树。

图2为菌株gyrB基因序列系统进化树。

图3为温度对抗菌蛋白活性的影响。

图4为蛋白酶对抗菌蛋白活性的影响。

具体实施方式

本发明中所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacilus velezensis)DH82于 2018年12月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为 CGMCC No.16865。

一、贝莱斯芽孢杆菌DH82分离与鉴定

本发明贝莱斯芽孢杆菌(Bacilus velezensis)DH82是从蛟龙号第150潜次中西太平洋雅浦海沟6000米深的海水样品筛选到产抗菌蛋白的菌株，结合形态学和生理生化特性，并对16S rDNA和gyrB 基因进行生物信息学分析，最终鉴定其为贝莱斯芽孢杆菌Bacilus velezensis。

1、菌株筛选

(1)初筛：取5～10mL蛟龙号第150潜次中西太平洋雅浦海沟6000米深海水样品，70～80℃恒温水浴20～30min，用无菌海水采用十倍稀释法进行梯度稀释，每个浓度各取100μL液体分别涂布在细菌分离培养基，28～37℃倒置培养24～48h。根据菌落大小、颜色、边缘光滑程度等对细菌进行分离、纯化。

上述细菌分离培养基为：NB(Nutrient Broth)培养基(0.5％蛋白胨，3％牛肉膏，0.5％氯化钠，pH7.3)、M1培养基(1％淀粉，0.4％酵母粉，0.2％蛋白胨，pH7.3)和Zobell2216E培养基(0.5％蛋白胨， 0.1％酵母提取物，天然过滤海水：纯水＝2:1(V/V)，pH7.6)；

天然过滤海水为把从不被陆上污物污染的或很少混有淡水的地方取来的海水装入玻璃瓶储放在暗处数星期后形成的海水。

(2)复筛：将上述筛得的贝莱斯芽孢杆菌DH82接种于改良LB 培养基，25～40℃，150～220rpm，8～16h活化，活化后接种至300 mL改良LB(Luria Broth)培养基(1L锥形瓶)，接种量1％(V/V)， 37℃，180rpm，24h后，发酵液离心(10000rpm，4℃，10min) 弃菌体，加入固体硫酸铵使溶液硫酸铵饱和度达到100％，4℃过夜， 10000rpm离心30min后得沉淀物，所得沉淀物用3000Da透析袋除盐，冷冻干燥得抗菌蛋白样品。按改良琼脂扩散方法检测发酵液处理后的抑菌活性，进而筛选出产抗菌蛋白活性强的菌株，将该菌株标记为DH82。

改良琼脂扩散法：取1.5mL新鲜的指示细菌液(迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、坎氏弧菌、溶藻弧菌和哈维氏弧菌)在18mm ×180mm试管培养37℃，180rpm，12h，于150mL的LB培养基 46℃中，迅速摇匀倒入9cm规格的培养皿中，凝固后用直径为8.58 mm无菌打孔器在抑菌板上打孔，并用灭过菌的牙签挑出培养基块。每孔加入50μL待检测液，在超净台中吹干后置于37℃，培养12h 后观察是否有抑菌圈，并测量抑菌圈的直径。

2、菌株鉴定

将筛选所得DH82菌株接种至LB固体培养基，于37℃下培养，观察菌落形态，并做部分生理生化特性的测定，结果如下：DH82菌株微泛黄大菌落，边缘不规则，表面平整、干燥，革兰氏阳性，镜检呈杆状。DH82菌株能分解D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖和七叶苷，能水解明胶、淀粉和酪蛋白，其氧化酶反应、接触酶反应、硝酸盐还原反应、V-P反应和吲哚试验均呈阳性。

利用OMEGA的细菌DNA试剂盒提取菌株基因组DNA，采用细菌通用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5 ’-GGTTACCTTGTTAGGACTT-3'进行16S rDNA的PCR扩增，并用引物UP-1：5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNA ARTTY-3'和UP-2r：5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNAC RTCNGCRTCNGTC-3'扩增gyrB基因，所得PCR产物经生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

16S rDNA和gyrB基因的测序序列分别在Gen Bank进行BLAST 分析，并采用MEGA7.0软件进行序列比对和聚类分析， Neighbour-joining(Maximum Composite Likelihood模型，bootstrap 1000)法构建系统发育树。

对DH82菌株16S rDNA序列PCR扩增，得到的基因序列片段长度为1452bp，基因序列如SEQ ID NO：1所示。将该基因序列进行 BLAST分析，构建系统进化树，从图1中可以看出，DH82菌株序列与Bacilus amyloliquefaciens、Bacilus velezensis亲缘关系最近。

对DH82菌株的gyrB基因序列PCR扩增，得到的基因序列片段长度为1181bp，基因序列如SEQ ID NO：2所示。以gyrB基因序列进行BLAST分析，构建系统进化树，从图2中可以看出，DH82菌株的gyrB序列与Bacilus velezensis BCRC 17467的gyrB序列位于系统发育树同一分支，表明DH82菌株与Bacilus velezensis BCRC 17467 的亲缘关系最近。

基于以上分子生物学鉴定结果，结合形态学和生理生化特性，鉴定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌Bacilus velezensis，命名为DH82。

3、贝莱斯芽孢杆菌DH82抗菌蛋白的制备，其具体步骤如下：

(1)贝莱斯芽孢杆菌DH82活化：贝莱斯芽孢杆菌DH82接种于改良LB培养基，25～40℃，150～220rpm，8～16h；

(2)发酵上清液的制备：将步骤(1)活化好的菌液按1～5％ (V/V)接种到改良LB培养基，25～40℃，150～220rpm，10～35h，所有发酵液在5000～12000rpm，4℃，离心10～30min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，得发酵上清液；

(3)抗菌蛋白的制备：于步骤(2)发酵上清液50～2000mL，加入固体硫酸铵使溶液硫酸铵饱和度达到40～100％，4℃过夜，于 6000～10000rpm离心20～30min得沉淀物，用超纯水溶解，3000Da 透析袋透析24～48h，冷冻干燥得抗菌蛋白。

本发明实施例使用的LB培养基组分为：1％蛋白胨，0.5％酵母粉，1％氯化钠，pH7.3；改良LB培养基组分为：1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉，0.5％氯化钠，pH7.3；LB固体培养基组分为：1％蛋白胨， 0.5％酵母粉，1％氯化钠，1.5％琼脂，pH7.3。

为了更好地对本发明中抗菌蛋白进一步阐述说明，申请人例举了如下实施例。

实施例1：抗菌蛋白的制备

(1)发酵上清液：取贝莱斯芽孢杆菌DH82并将其接种于改良 LB培养基，25℃，150rpm，16h，然后按5％(V/V)接种量接种到改良LB培养基，25℃，220rpm，35h后，所有发酵液在5000rpm， 4℃，离心30min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，得发酵上清液；

(2)抗菌蛋白：发酵上清液加入固体硫酸铵使溶液硫酸铵饱和度达到40％，4℃过夜，于6000rpm离心30min得沉淀物，用超纯水溶解，3000Da透析袋透析24h，冷冻干燥得抗菌蛋白。

实施例2：抗菌蛋白制备

(1)发酵上清液：取贝莱斯芽孢杆菌DH82并将其接种于改良 LB培养基，40℃，220rpm，8h，按1％(V/V)接种量接种到改良 LB培养基，40℃，150rpm，10h后，所有发酵液在12000rpm，4℃，离心10min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，得发酵上清液；

(2)抗菌蛋白：发酵上清液加入固体硫酸铵使溶液硫酸铵饱和度达到100％，4℃过夜，于10000rpm离心20min得沉淀物，用超纯水溶解，3000Da透析袋透析48h，冷冻干燥得抗菌蛋白。

实施例3：抗菌蛋白制备

(1)发酵上清液：取贝莱斯芽孢杆菌DH82并将其接种于改良 LB培养基，37℃，180rpm，12h，按2％(V/V)接种量接种到改良LB培养基，37℃，180rpm，22h后，所有发酵液在10000rpm， 4℃，离心15min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，得发酵上清液；

(2)抗菌蛋白：发酵上清液加入固体硫酸铵使溶液硫酸铵饱和度达到80％，4℃过夜，于8000rpm离心25min得沉淀物，用超纯水溶解，3000Da透析袋透析36h，冷冻干燥得抗菌蛋白。

实施例4：抗菌蛋白对水产病原细菌抑菌效果

制作抑菌板，打孔后，孔内添加实施例3所得的超纯水溶解抗菌蛋白，置于37℃培养过夜，且该抑菌板：46℃熔融LB固体培养基添加1％活化的病原菌(迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、坎氏弧菌、溶藻弧菌和哈维氏弧菌)观察记录抑菌板上抑菌圈直径。

实验结果表一：

实施例5：温度对抗菌蛋白活性影响

取实施例1所得的抗菌蛋白，在20℃、40℃、60℃、80℃及 100℃水浴30min，冷却至室温后用13000rpm离心5min，检测样品抑菌活性。

按实施例4的抗菌蛋白抑菌效果检验方法，在不同温度下处理抗菌蛋白，获得不同温度对其抑菌活性的影响结果如图3所示，从中可看出，抗菌蛋白的抑菌活性随温度升高呈现小幅度的下降趋势，其在温度100℃处理30min后，仍有85.5％抑菌活性(对照组：在20℃，100％抑菌活性)，说明该蛋白热稳定性较好。

实施例6：蛋白酶对抗菌蛋白活性影响

取实施例2所得的抗菌蛋白分别用1mg/mL的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶处理，以1mg/mL牛血清蛋白为空白对照，37℃水浴2h，检测样品抑菌活性。

按实施例4的抗菌蛋白抑菌效果检验方法，用不同蛋白酶处理抗菌蛋白后，获得不同蛋白酶对其抑菌活性影响结果如图4所示，从中可看出，不同蛋白酶处理后，抗菌蛋白仍有抑菌活性，与对照相比略有提高或降低，活性保持在91.6％～103.7％之间，说明该抗菌蛋白对这四种蛋白酶稳定性良好。

实施例7：水产养殖动物细菌性疾病防治实验

过夜培养的迟缓爱德华氏菌以体积比1％转接到LB培养基中，继续培养2h至OD₆₀₀＝0.8；8000rpm离心2min收集菌体，在PBS 中清洗三遍，用PBS稀释成10⁸CFU/mL、10⁷CFU/mL、10⁶CFU/mL、 10⁵CFU/mL、10⁴CFU/mL和10³CFU/mL，使用一次性灭菌注射器注射到罗非鱼(56.0±0.56)g体内，养殖20天观察鱼体死亡情况，确定最佳攻毒剂量。

对实验组和无添加抗菌蛋白的阳性对照组进行攻毒处理后，对实验组投喂不同剂量的实施例3所得的抗菌蛋白，继续养殖8天，观测每天每一条鱼的体色、身体状态、游泳情况、摄食状况等，并对死亡鱼数进行统计，计算死亡率。阴性对照组是未给药、未投喂抗菌蛋白的鱼。

攻毒实验结果表二：

注射迟缓爱德华氏菌4小时后，部分罗非鱼体色开始变黑，之后陆续有鱼死亡，死鱼有着类似典型淡、海水养殖鱼类出血性败血症症状：鳍基部、眼眶出血，肠红肿。第8天后，实验鱼停止死亡。实验鱼阳性对照组死亡率为45％，按给药量为3g/kg饲料的实验Ⅰ组死亡率为10％；按给药量为6g/kg饲料和9g/kg饲料的实验Ⅱ组和Ⅲ组的死亡率为15％；按给药量为12g/kg的实验Ⅳ组死亡率为5％，实验结果表明：实施例3的抗菌蛋白对细菌性疾病具有较强的治疗效果。

实施例8：水产养殖动物免疫力和生长性能等指标考察的实验

首先选取平均体重为(56.0±0.56)g的健康罗非鱼260条，驯养至实验动物稳定后，挑选健康鱼240条，随机分成4组：对照组(无添加抗菌蛋白)、实验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组，每组3个重复，每个重复20 条；实验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别添加3g/kg，6g/kg，9g/kg的实施例3 所得的抗菌蛋白在罗非鱼饲料中。实验鱼饲养在室内水池内，按体重 3％投喂饲料，每日投饲2次，投饲时间分别为每天08:00和16:00，投饲后2小时捞取剩余饲料，烘干，称重，周期为40天；实验期间每天记录鱼的摄食量和死亡鱼数量，实验结束后，测定鱼的重量；并采用尾椎静脉采血，4000rpm，离心15min，取血清，测定血清总蛋白(TP)、免疫球蛋白G(IgG)的含量。并计算成活率、饵料系数 (饵料系数＝总投饵量/鱼总增重量)和增重率。

通过计算得实验结果为表三：

由表三实验结果可知：随着抗菌蛋白使用量增加，能降低饵料系数，提高成活率和增长率；实验组总蛋白含量高于对照组，免疫球蛋白在实验组均高于对照组，但实验Ⅱ、Ⅲ组随添加抗菌蛋白含量增加而降低。由此可知，添加抗菌蛋白可以促进罗非鱼的生长，但过多的添加抗菌蛋白使机体免疫力增加不明显。

综上，本发明提供了一种贝莱斯芽孢杆菌DH82抗菌蛋白能够有效防控水产病原菌，如迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、坎氏弧菌、溶藻弧菌和哈维氏弧菌，能够有效防控由病原菌引发的水产养殖动物的病害，从而保护水生动物健康生长，且能作为渔业养殖饲料添加剂显著提高水生动物机体免疫力，有着较好的应用前景。

序列表

<110> 国家海洋局第三海洋研究所

<120> 一种贝莱斯芽孢杆菌DH82及其抗菌蛋白的制备方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1452

<212> DNA

<213> Bacillus velezensis

<400> 1

gcgggcgggt gctatacatg cagtcgagcg gacagatggg agctatgctt ccctgatgtt 60

agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg 120

aaaccggggc taataccgga tggttgtttg aaccgcatgg ttcagacata aaaggtggct 180

tcggctacca cttacagatg gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca 240

ccaaggcgac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac 300

ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac 360

ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag 420

aacaagtgcc gttcaaatag ggcggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta 480

actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc 540

gtaaagggct cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga 600

gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc 660

ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa 720

ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780

ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc 840

attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg 900

gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg 960

tcttgacatc ctctgacaat cctagagata ggacgtcccc ttcgggggca gagtgacagg 1020

tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg 1080

caacccttga tcttagttgc cagcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca 1140

aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca 1200

cgtgctacaa tggacagaac aaagggcagc gaaaccgcga ggttaagcca atcccacaaa 1260

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accacgagag tttgtaacac ccgaagtcgg tgaggtaacc tttatggagc cagccgccga 1440

agtgacagaa gg 1452

<210> 2

<211> 1181

<212> DNA

<213> Bacillus velezensis

<400> 2

ccagggtagc ggatatagta tccggcggtc ttcacggtgt aggggcgtct gtcgtaaacg 60

ctcttgtcga ctactcttga cgttacggtt catcgtgacg gaaaaatcca ctatcaggcg 120

tacgagcgcg gtgtacctgt ggccgatctt gaagtgatcg gtgatactga taagaccgga 180

acgattacgc acttcgttcc ggatccggaa atcttcaaag aaacaaccgt atacgactat 240

gatctgcttt caaaccgtgt ccgggaattg gccttcctga caaaaggcgt aaacatcacg 300

attgaagaca aacgtgaagg acaagaacgg aaaaacgagt accactacga aggcggaatc 360

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atttcaatta agcaccctga tccgcaattc gaagggcaga cgaaaacgaa gctcggcaac 720

tccgaagcga gaacgatcac tgatacgctg ttttcttctg cgctggaaac attccttctt 780

gaaaatccgg actcagcccg caaaatcgtt gaaaaaggtt taatggccgc aagagcgcgg 840

atggcagcga aaaaagcacg ggaattgacc cggcgcaaaa gtgcgcttga gatttccaat 900

ctgccgggca aactggcgga ctgttcttct aaagatccga gcatttccga gctgtatatc 960

gtagagggtg actctgcggg cggatcagcg aaacagggac gggaccgtca tttccaagct 1020

attctgccgc tgcgcggtaa gattctgaac gttgagaaag ccagacttga taagatcctc 1080

tcaaacaatg aggtcagatc aatgatcacg gctctcggaa caggaatcgg agaagatttt 1140

aatcttgaaa aagcgcgtta tcataaaagt gtcatcgtgt g 1181

Claims (3)

1.一种贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，所述菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)DH82，已于2018年12月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16865。

2.一种利用权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌DH82制备其抗菌蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)菌株活化：将贝莱斯芽孢杆菌DH82接种于改良LB培养基，25～40℃，150～220rpm，8～16h；

(2)发酵上清液的制备：将步骤(1)活化好的菌液按1～5％(V/V)接种到改良LB培养基，25～40℃，150～220rpm，10～35h，所有发酵液在5000～12000rpm，4℃，离心10～30min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，得发酵上清液；

(3)抗菌蛋白的制备：于步骤(2)发酵上清液50～2000mL，加入固体硫酸铵使溶液硫酸铵饱和度达到40～100％，4℃过夜，于6000～10000rpm离心20～30min得沉淀物，用超纯水溶解，3000Da透析袋透析24～48h，冷冻干燥得贝莱斯芽孢杆菌DH82抗菌蛋白。

3.如权利要求2所述的制备抗菌蛋白的方法所得抗菌蛋白在制备水产养殖饲料添加剂中的应用。