CN108676756A - 贝莱斯芽孢杆菌及其作为水产病原菌抑制剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种贝莱斯芽孢杆菌及其作为水产病原菌抑制剂的应用，该菌分离自健康罗非鱼的肠道，该菌株保藏编号为：GDMCC No.60344。该菌具有广谱拮抗水产常见病原菌功能，能有效抑制无乳链球菌、海豚链球菌、鰤鱼诺卡氏菌、嗜水气单胞菌、舒氏气单胞菌和迟缓爱德华氏菌等病原菌的生长，而且使用安全无残留，有助于减少化学药物在水产养殖中的使用量和残留量，降低生产成本，实用性强等优点。

Description

贝莱斯芽孢杆菌及其作为水产病原菌抑制剂的应用

技术领域

本发明涉及水产微生物应用技术领域，具体涉及一种贝莱斯芽孢杆菌及其作为水产病原菌抑制剂的应用。

背景技术

我国水产养殖产量连续多年位居世界首位，水产养殖不仅给人们提供了丰富的蛋白质来源，而且有效增加了渔民的收入，在我国农业发展过程中扮演着重要角色。由于多年来，我国水产养殖过程中不断追求集约化、高密度养殖以及药物的频繁使用等原因，导致水产养殖动物疾病频繁暴发，制约着我国水产养殖业健康可持续发展。其中，水产养殖过程中常见的细菌性病原主要有嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、舒氏气单胞菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、迟缓爱德华氏菌、鮰爱德华氏菌、鰤鱼诺卡氏菌、无乳链球菌、和海豚链球菌等，这些病原菌在我国水产养殖动物中广泛流行，常常造成水产经济动物相关病害的大规模暴发。

当前，我国水产养殖中常见细菌性病害主要是通过使用抗生素、消毒剂等传统的化学药物进行防治防控，虽然在短时间内可以取得较好的效果，但是长期使用会造成耐药因子的传递从而导致病原菌耐药性的产生，并且破坏和干扰养殖环境的微生生态平衡，增加水生动物疾病防控的难度。此外，抗生素、消毒剂等药物易在养殖动物体内及环境中残留，不仅污染环境，而且威胁着人类身体健康。因此，寻求高效无公害的抗生素替代物是十分迫切的，而且具有重要的现实意义。由于拮抗益生菌不仅能够抑制病原菌的生长，同时可改善养殖生态环境，增强养殖动物的机体免疫力，提高鱼、虾的成活率和生长速度，而且具有不产生耐药性、无残留、无污染、无毒副作用等优点，是抗生素药物的理想替代品，因此有效使用拮抗益生菌是水生经济动物疾病防控的一个重要途径。

微生态防治的措施之一是利用拮抗益生菌抑制病原菌的生长，使病原菌的浓度低于其致病浓度，从而达到防治疾病的目的。潜在拮抗益生菌的筛选通常是进行体外拮抗实验，寻找具有抑菌活性的目标菌株，其筛选原理主要是基于抑菌物质在固体或半固体培养基上扩散，抑制指示菌的生长，从而形成透明的抑菌圈。常用的筛选方法主要有点种法、纸片法和牛津杯法等。在拮抗益生菌的应用中，不仅要考虑拮抗菌对相关病原的拮抗效果，还需要考虑拮抗菌对养殖生物的安全性，拮抗益生菌的筛选是其应用的关键，直接决定其应用效果。因此，筛选的益生菌应具备不含有毒力基因和抗性基因，对宿主和生存环境起到积极作用，能够被宿主通过摄食等方法接受并能够在肠道定植等要求。

拮抗益生菌防控水产动物疾病己成为当今研究的热点，但是其相关研究仍然十分有限，尤其是我国水生动物疾病的拮抗益生菌筛选工作进展缓慢，至今，只有少数相关报道。如刘观斌等筛选了1株罗非鱼无乳链球菌的拮抗菌—蜡样芽胞杆菌(NY-5)，其能有效抑制罗非鱼源无乳链球菌的生长(刘观斌,王淼,卢迈新,等.一株能抑制罗非鱼源无乳链球菌的反硝化芽孢杆菌的筛选鉴定[J].2016,23(1):207-217.)；赵光军筛选了2株罗非鱼无乳链球菌的拮抗菌—枯草芽抱杆菌(HAINUP40)和苏云金芽抱杆菌(HAINUP96)，抑菌效果良好，且对罗非鱼鱼体安全无毒(赵光军.拮抗菌的筛选及其对无乳链球菌粘附罗非鱼粘液的拮抗作用研究[D].海南大学,2014.)；陈辉报道了1株罗非鱼海豚链球菌的拮抗菌—诺卡氏菌N0906，其能显著提高罗非鱼非特异性免疫力，降低罗非鱼养殖水体中海豚链球菌的数量，提高罗非鱼的成活率(陈辉.海豚链球菌高效拮抗菌的筛选、特性分析及其生态效应研究[D].南京农业大学,2008.)。因此，有关水生动物疾病防控的益生菌筛选及应用相关研究基础薄弱，能够用于病害防控的拮抗益生菌十分匮乏，远远不能满足当前水生动物疾病防控的迫切需求。

因此，本发明从罗非鱼肠道中筛选出对水产常见病原菌如无乳链球菌、海豚链球菌、鰤鱼诺卡氏菌、嗜水气单胞菌、舒氏气单胞菌和迟缓爱德华氏菌等均具有较强拮抗作用的益生菌，而且该菌株对罗非鱼、乌鳢、斑马鱼等均不致病，其生物安全性良好，具有防控多种水产动物疾病的能力，该菌种在水产养殖上的应用前景十分广阔。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种贝莱斯芽孢杆菌及其作为水产病原菌抑制剂的应用，该菌具有广谱拮抗水产常见病原菌功能，能有效抑制无乳链球菌、海豚链球菌、鰤鱼诺卡氏菌、嗜水气单胞菌、舒氏气单胞菌和迟缓爱德华氏菌等病原菌的生长，而且使用安全无残留，有助于减少化学药物在水产养殖中的使用量和残留量，降低生产成本，实用性强等优点。

为解决上述问题，本发明在于提供一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LF01，该菌分离自健康罗非鱼的肠道，该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：中国广州市先烈中路100号省微生物所实验楼五楼，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No.60344。

一方面，本发明在于提供上述贝莱斯芽孢杆菌作为水产病原菌抑制剂的用途。

进一步地，所述水产病原菌包括无乳链球菌、海豚链球菌、鰤鱼诺卡氏菌、嗜水气单胞菌、舒氏气单胞菌和迟缓爱德华氏菌等水产常见病原菌。

进一步地，所述水产病原菌抑制剂为微生物制剂，可用于抑制鱼类病原菌、增强鱼类免疫功能。所述微生物制剂有望替代抗菌化学药物，所述替代的抗菌化学药物为抗革兰氏阳性菌药物或/和抗革兰氏阴性菌药物。所述抗菌化学药物包括抗无乳链球菌药物、抗海豚链球菌药物、抗鰤鱼诺卡氏菌药物、抗迟缓爱德华氏菌药物、抗鲫源嗜水气单胞菌药物、抗鳢源舒氏气单胞菌药物中的一种或几种。

进一步地，所述水产病原菌抑制剂作为饲料添加剂，可用于抑制鱼类病原菌、增强鱼类免疫功能。所述饲料添加剂的应用有望替代包括抗无乳链球菌药物、抗海豚链球菌药物、抗鰤鱼诺卡氏菌药物、抗迟缓爱德华氏菌药物、抗鲫源嗜水气单胞菌药物、抗鳢源舒氏气单胞菌药物中的一种或几种。

进一步地，所述水产病原菌抑制剂为干菌粉、发酵液或代谢产物等。

另一方面，本发明还提供了一种病原菌抑制剂，该病原菌抑制剂的活性成分为贝莱斯芽孢杆菌的菌株粉剂、代谢产物、发酵液等。该病原菌抑制剂对以下病原具有明显的抑制作用：无乳链球菌、海豚链球菌、鰤鱼诺卡氏菌、嗜水气单胞菌、舒氏气单胞菌和迟缓爱德华氏菌等。

另一方面，本发明提供一种筛选本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌的方法，具体步骤如下：

1)取健康罗非鱼的前、中、后肠，分别清理、剪碎并用灭菌去离子水冲洗后，加入无菌去离子水于振荡仪充分振荡匀浆，离心去上清液稀释得到菌悬液，将其涂布在BHI固体培养基进行培养，再将单菌落纯化培养得到分离菌株；

2)将分离菌株进行拮抗菌的筛选，获得具有较强抑菌活性的菌株，进一步筛选、鉴定，获得一株编号为LF01的菌株(Bacillus velezensis LF01)。

针对水产动物病原菌的拮抗效果而言，从水生动物及其生存环境中获得的拮抗菌相对于陆源的效果更佳，从水生动物肠道中分离的拮抗益生菌能够更加适应鱼类肠道环境以及能够在肠道中黏附定植。因此，本发明选择从罗非鱼肠道中筛选病原菌的拮抗菌。

本发明将LF01菌株无菌滤液用浓盐酸调至pH为2时，发酵液中产生乳白色絮状沉淀，浓缩的沉淀(乳白色絮状物质)经NaOH复溶后(pH＝6.5～7.5)具有抑菌活性，且抑菌效果显著，表明该抗菌物质可以在酸性条件下沉淀析出。该拮抗物质经121℃处理仍保持活性，具有良好的热稳定性；将活性粗提物储存于-20℃或-80℃不会失活，表明其耐低温储存；在pH＝2或pH＝12的极酸或极碱条件下仍具有抑菌活性，且经蛋白酶K，胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后，抑菌活性无显著性变化，表明该活性物质对酸碱和蛋白酶等具有良好的耐受性。

LF01菌株液体发酵的无菌滤液和菌体中均存在抗菌物质，表明有抑菌物质存在于沉淀粗提液中，且菌株LF01产生抗菌物质是其具有生防作用的原因之一。

在拮抗菌筛选过程中，不仅要考虑拮抗菌对相关病原菌的拮抗效果，还需要考虑拮抗菌对养殖生物的安全性。本发明实施例中罗非鱼鱼体安全性试验表明，菌株LF01及其所产生的抗菌物质安全性良好，且以活菌体拌料投喂罗非鱼后，罗非鱼累积死亡率降低50％以上，显著提高罗非鱼对无乳链球菌的抗病能力，起到较好的免疫保护作用。因此，本发明实施例筛选获得的拮抗菌株LF01在拮抗病原菌、抗菌谱和安全性等方面都满足益生菌的筛选条件，有较大的应用空间。

本发明从养殖的健康尼罗罗非鱼肠道中分离筛选到64株不同形态特征的菌株，以无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)为指示菌，对其进行体外拮抗试验。初筛获得6株具有抗菌活性的菌株，并通过其对无乳链球菌等3株革兰氏阳性菌和嗜水气单胞菌等3株革兰氏阴性菌的拮抗作用，复筛获得具有稳定抗菌活性且最符合拮抗益生菌特性的菌株LF01。以菌株LF01基因组DNA为模板，进行gyrA基因序列分析，并通过系统发育树进化分析确定其分类学地位。通过腹腔注射法测定LF01菌株对尼罗罗非鱼的安全性以及评价投喂该菌后罗非鱼对无乳链球菌的抗病力，同时对该菌种产拮抗物质的稳定性进行分析。结果显示：菌株LF01属于芽孢杆菌属的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，活菌体及其所产拮抗物质对鱼体安全性较好，且投喂该菌后明显提高了罗非鱼的抗病力。此外，该菌产生的拮抗物质在低于80℃时保持较高抑菌活性，经121℃高压灭菌后仍保有活性；经蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后，抑菌活性无显著变化；在pH 2或pH12仍具有抑菌活性，且在pH偏中性时抑菌活性最强。结果表明，LF01菌株抑菌作用强，抗菌谱广，安全性良好，具有作为水产拮抗益生菌应用的潜力，而且使用安全无残留，有助于减少化学药物在水产养殖中的使用量和残留量，降低生产成本，实用性强等优点。

有益效果

本发明提供一种贝莱斯芽孢杆菌及其作为水产病原菌抑制剂的应用，从健康罗非鱼肠道中筛选出对无乳链球菌且对鱼类常见致病菌具有较强拮抗作用的益生菌，并对其抑菌效果和该菌所产生的拮抗物质稳定性进行研究，以期为罗非鱼的健康养殖提供新思路，为拮抗益生菌在罗非鱼配合饲料中的应用提供理论依据。该贝莱斯芽孢杆菌具有广谱拮抗水产常见病原菌的功能；该贝莱斯芽孢杆菌的发酵液经过处理后，具有较强的抑菌功能，可作为饲料添加剂使用，具有广阔的应用前景；该贝莱斯芽孢杆菌对水生动物罗非鱼、斑马鱼和乌鳢等不致病，是一种优良的益生菌；该贝莱斯芽孢杆菌能增强罗非鱼等水生动物的免疫功能，减少疾病发生，有利于水产健康养殖；该贝莱斯芽孢杆菌主要功能是拮抗作用，适用于改善鱼类肠道微生物菌群。

附图说明

图1LF01菌株的gyrA基因PCR产物电泳图，M，Marker 5000(TAKARA)；C，空白对照；LF01，LF01菌株。

图2基于gyrA基因构建的系统进化树图。

图3LF01菌株在30℃下的生长曲线。

图4菌株LF01产拮抗物质对指示菌的抑菌效果。

图5不同温度、pH值和蛋白酶对拮抗物质抑菌活性的影响。

图6不同储存条件对拮抗物质抑菌活性的影响；罗非鱼源无乳链球菌(WC1535,Streptococcus agalactiae)、鲫源嗜水气单胞菌(Ca1701,Aeromonas hydrophila)。

图7投喂菌株LF01后罗非鱼对无乳链球菌抗病力的影响。

具体实施方式

材料

供试菌株：从池塘养殖的健康尼罗罗非鱼肠道内分离到64株菌株作为体外拮抗实验菌株。

实验用鱼：由中国水产科学研究院珠江水产研究所高要水产种质中心提供的尼罗罗非鱼幼鱼，体重5g。实验前暂养两周，按实验需求分组，日投喂量约为鱼体重的3％。

培养基：脑心浸液(BHI)液体培养基，直接称取37g加1L的去离子水，BHI固体培养基需在加入15g的琼脂粉。

指示菌株：罗非鱼源无乳链球菌(WC1535,Streptococcus agalactiae)、罗非鱼源海豚链球菌(Sn03,Streptococcus iniae)、宝石鲈源鰤鱼诺卡氏菌(BSL1701,Nocardiaseriolae)、罗非鱼源迟缓爱德华氏菌(GD1701,Edwardsiella tarda)、鲫源嗜水气单胞菌(Ca1701,Aeromonas hydrophila)和鳢源舒氏气单胞菌(WL1707,Aeromonasschubertii)。

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1菌株的筛选

1罗非鱼肠道细菌的分离与纯化

参照Olsson等的方法(具体过程请参见Olsson C,Westerdahl A,Conwa Y P L,etal.Intestinal colonization potential of turbot(Scophthalmus maximus L.)anddab(Lim anda limanda)2associated bacteria with inhibition effects againstVibrio anguillarum[J].Appl Environ Micro,1992,58(2):551-556.)，分别剪取罗非鱼前、中、后肠约2cm，挤出肠道内容物，无菌手术剪剪碎，再用灭菌去离子水冲洗2～3次，各加入1mL无菌去离子水于振荡仪上充分振荡匀浆。1000r/min离心1min，取上层液采用10倍稀释法分别稀释得到1倍、10倍和100倍稀释的菌悬液，各取300μL均匀涂布到BHI固体培养基上，置于28℃恒温培养箱培养1～2d。挑取形态各异的单菌落进行反复划线纯化培养，然后加入终体积分数为15％的甘油于-80℃冰箱保存备用。从罗非鱼肠道中共获得64株细菌，菌株依次编号为LF01～LF64。

2拮抗菌的筛选

采用打孔平板对峙法(张少博.抗水稻黄单胞菌深海独岛枝芽胞杆菌A493及其活性物质研究[D].华中农业大学,2011.)，将分离菌株(上一步制备的菌液，64株细菌，菌株依次编号为LF01～LF64。)和指示菌(无乳链球菌、海豚链球菌、嗜水气单胞菌、舒氏气单胞菌、鰤鱼诺卡氏菌和迟缓爱德华氏菌)分别活化12h，调整分离菌株浓度约为10⁹CFU/mL，指示菌菌液浓度为10⁶CFU/mL。吸取200μL指示菌菌液均匀涂布到BHI固体培养基上，再用无菌打孔器(外径7mm)均匀打孔6个，挑出琼脂块备用。每个小孔中加入60μL分离菌株的培养液，然后置于28℃恒温培养箱培养24h，观察并测定抑菌圈直径(包括孔径)，选择具有抑菌效果的菌株。按此方法，分别以无乳链球菌、海豚链球菌、鰤鱼诺卡氏菌、迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌和舒氏气单胞菌作为指示菌进行复筛，选择抑菌效果较强、抑菌谱广的分离菌进行深入研究。对无乳链球菌具有明显拮抗作用的共6株，其中LF01抑菌谱广泛，且对6株指示菌均具有较强的抑菌活性，以其作为代表性菌株进行深入研究。

实施例2

1菌种活化及发酵液的制备

将实施例1筛选的保存的LF01菌株划线于BHI固体培养基上，28℃培养24h，然后用接种环刮取单菌落于BHI液体培养基中，30℃、200r/min振荡培养12h作为种子液。以1：50(V/V)的比例转接至BHI液体培养基中，30℃、200r/min振荡培养48h即得发酵液。

2gyrA基因序列克隆及序列分析

根据细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书提取LF01菌株的基因组DNA，并将提取基因组DNA置于-20℃冰箱中保存备用。以LF01基因组DNA作为模板，通过引物

BgyrA-F：5′–ATTCACGCTATCACTGACTTATTC–3′

和

BgyrA-R：5′–ATGGGAGACAAAGTAGAACCGAG–3′

扩增LF01菌株的gyrA基因片段。

PCR扩增的反应条件为：95℃ 4min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 90s，30个循环；72℃10min。扩出长约2600bp的目的DNA片段，且亮度明显(见图1)。扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳进行检测，挑选阳性克隆送至广州艾基生物技术有限公司进行测序。将得到的基因序列(核苷酸序列SEQ1所示，gyrA基因编码区全长2424bp)通过BLAST在GenBank中进行同源性比较分析，取同源性较高菌株的gyrA基因序列，通过Mega7.0构建系统发育树。图2表明与菌株LF01与贝莱斯芽孢杆菌聚为一枝，表明与其亲缘关系最近；与枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的亲缘关系较远。综上，确定菌株LF10为贝莱斯芽孢杆菌。

3生长曲线测定

采用刘志刚等的方法(刘志刚,可小丽,卢迈新,等.温度对尼罗罗非鱼无乳链球菌毒力的影响[J].水产学报,2013,37(11):1733-1741.)，取培养12h的LF01菌株种子液以1：100(V/V)的比例转接至100mLBHI液体培养基中，30℃、200r/min振荡培养，实验设置3个重复。每隔1h测定其OD值，直至菌液的吸光值稳定，绘制生长曲线(图3)。图3表明，菌株LF01生长呈“S”型。当培养约5h时，菌株LF01进入对数生长期，快速繁殖，OD₆₀₀为0.582；当培养11h后，OD₆₀₀为2.749，其生长开始趋于稳定，达到稳定生长期。

实施例3拮抗物质的提取及抑菌效果测定

采用浓盐酸沉淀法(以下三个文献均有记载：1)张少博.抗水稻黄单胞菌深海独岛枝芽胞杆菌A493及其活性物质研究[D].华中农业大学,2011.2)侯宝宏.贝莱斯芽孢杆菌TS-1203抑菌活性物质分析及制剂研制[D].甘肃农业大学,2016.3)张晓云.枯草芽孢杆菌菌株CAB-1抑菌物质的分离鉴定及活性分析[D].河北农业大学,2011.)提取：

取LF01菌株的发酵培养液1L，经7500r/min离心10min，取上清缓慢加入1mol/L盐酸(HCl)至上清液的pH约为2，此时有白色絮状物析出，4℃过夜后7500r/min离心10min，分别收集上清与沉淀，无菌上清液用1mol/LNaOH复调回初始pH(约7.5)，沉淀用磷酸缓冲液溶解后，经0.2μm微孔滤膜过滤即得粗提液，打孔法分别测定其抑菌效果，以未接种的BHI液体培养基与无拮抗作用的分离菌菌液作为对照，每个处理3个重复。结果如图4所示。

结果显示：沉淀物具有抑菌活性，沉淀所得粗提液作用于无乳链球菌、海豚链球菌、鰤鱼诺卡氏菌、嗜水气单胞菌、舒氏气单胞菌和迟缓爱德华氏菌后均有明显的抑菌圈，表明LF01菌株产生的拮抗物质对无乳链球菌和嗜水气单胞菌具有较好的拮抗作用，同时表明菌株LF01所产拮抗物质存在于沉淀析出物中。

实施例4拮抗菌及粗提液安全性实验

将暂养的罗非鱼、斑马鱼和乌鳢随机分组，每组20尾；将菌株LF01于30℃振荡培养12h，调整浓度约4.5×10⁸CFU/mL，将该菌液与实施例3提取的粗提液腹腔注射感染罗非鱼、斑马鱼和乌鳢，每尾注射0.1mL，对照组注射等量磷酸缓冲液。实验期间按常规方法养殖，水温控制为29±1℃，连续观察10d，每天记录各组试验鱼的死亡情况。结果表明，实验至结束(10d)，在该浓度(4.5×10⁸CFU/mL)下，菌液、粗提液及对照组的试验鱼均未发生死亡，这表明该菌株对罗非鱼、斑马鱼和乌鳢的生物安全性良好。

实施例5实施例3提取的粗体液稳定性分析即拮抗物质稳定性分析

1)对温度的热稳定性

将经浓盐酸沉淀的粗提液分别在30、40、50、60、70、80、90和100℃不同温度条件下水浴处理30min，以及经121℃高压蒸汽灭菌30min，以未经温度处理的粗提液作为对照，打孔法测定经不同温度处理的粗提液的抑菌效果，每个处理重复3次。试验结果显示，菌株LF01粗提液经不同温度处理后，其对无乳链球菌和嗜水气单胞菌的抑菌活性随温度升高而降低，当温度低于80℃时，虽然该拮抗物质的抗菌活性有所下降，但下降幅度不大，总体上比较稳定，且该拮抗物质经高压蒸汽灭菌后，仍保有活性(图5)，表明该拮抗物质具有较好的热稳定性。

2)对蛋白酶的稳定性

取4份经浓盐酸沉淀的1mL粗提液，分别加入蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶溶液20μL，对照组加入20μL磷酸缓冲液，实验组和对照组分别于37℃水浴处理1h。通过打孔法测定处理后粗提液的抑菌效果，每个处理重复3次。与对照组相比，经蛋白酶处理的粗提液抑菌活性无显著变化(p>0.05)，表明该拮抗物质对蛋白酶不敏感，由此判断该拮抗物质为非蛋白类物质。

3)对pH的稳定性

将经浓盐酸沉淀的粗提液分别调pH值为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0，于4℃冰箱静置过夜后调至初始pH值，以未经pH处理的粗提液作为对照，打孔法测定经不同pH处理的粗提液的抑菌效果，每个处理重复3次。结果显示，在pH6～9范围内，粗提液对无乳链球菌和嗜水气单胞菌的抑菌活性有不同程度的下降，但与对照差异不显著(p>0.05)，其中pH为7时抑菌活性最高，仅在pH<4或pH>10时，其抑菌活性显著下降(p<0.05)，表明该拮抗物质在酸性和碱性条件下仍能够保持一定的活性，这也表明该拮抗物质对酸碱耐受性较好。

4)储存稳定性

将经浓盐酸沉淀的粗提液分别储存于室温、4℃、-20℃及-80℃条件下，在1W、2W、3W、4W、5W，打孔法测定不同储存条件下粗提液的抑菌效果，以未经处理的粗提液作为对照组，以无乳链球菌和嗜水气单胞菌作为指示菌，分别测定菌株LF01产拮抗物质的稳定性，每个处理重复3次。结果如图6所示，室温和4℃储存条件下，该拮抗物质的抗菌活性从第二周开始降低，至第八周，室温条件储存的抗菌活性基本消失，而-20℃与-80℃条件下该拮抗物质的抗菌活性维持不变。这表明该拮抗物质耐低温储存。

实施例6投喂拮抗菌后罗非鱼对无乳链球菌抗病力评价

用拮抗菌LF01连续1W、2W、3W、4W、5W、6W拌料投喂罗非鱼幼苗，立即进行无乳链球菌(WC1535)攻毒试验，对投喂益生菌后罗非鱼对无乳链球菌的抗病力进行评价。结果如图7所示。

由图7可知，与对照组相比，投喂拮抗菌LF01的罗非鱼组经攻毒后其累计死亡率显著降低，且连续投喂一周时，其累计死亡率已明显降低，表明投喂该拮抗菌后提高了罗非鱼的抗病力，使其产生一定的免疫保护作用。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120> 贝莱斯芽孢杆菌及其作为水产病原菌抑制剂的应用

<130> 2018

<141> 2018-06-01

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2424

<212> DNA

<213> Bacillus velezensis

<400> 1

gtggcacagc cagaattatt tcatgattta ccgttagaag aagtaatcgg cgaccgtttc 60

ggacgctaca gtaaatatat tattcaagac agggcgctgc ccgacgctcg tgacggttta 120

aagccggtgc agcggagaat tttatacgcc atgcacgcag acggaaatac attcgataaa 180

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cgtatccctg catacgatgt ttaa 2424

Claims (8)

1.一种贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，该菌分离自健康罗非鱼的肠道，保藏编号为：GDMCC No.60344。

2.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌作为水产病原菌抑制剂的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述水产病原菌包括无乳链球菌、海豚链球菌、鰤鱼诺卡氏菌、嗜水气单胞菌、舒氏气单胞菌或迟缓爱德华氏菌。

4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述水产病原菌抑制剂为微生物制剂，用于抑制鱼类病原菌、增强鱼类免疫功能。

5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述水产病原菌抑制剂作为饲料添加剂，可用于抑制鱼类病原菌、增强鱼类免疫功能。

6.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述水产病原菌抑制剂包括干菌粉、发酵液或代谢产物。

7.一种病原菌抑制剂，其特征在于，所述病原菌抑制剂的活性成分包括权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌的菌株粉剂、代谢产物或发酵液。

8.一种筛选权利要求1所述的所述的贝莱斯芽孢杆菌的方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)取健康罗非鱼的前、中、后肠，分别清理、剪碎并用灭菌去离子水冲洗后，加入无菌去离子水于振荡仪充分振荡匀浆，离心去上清液稀释得到菌悬液，将其涂布在BHI固体培养基进行培养，再将单菌落纯化培养得到分离菌株；

2)将分离菌株进行拮抗菌的筛选，获得具有较强抑菌活性的菌株，进一步筛选、鉴定，获得一株编号为LF01的菌株。