CN110468071A - 含有甲基营养型芽孢杆菌的复合菌剂及在制备水产动物疾病的药物中的应用 - Google Patents

含有甲基营养型芽孢杆菌的复合菌剂及在制备水产动物疾病的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物的开发和应用领域，具体公开了含有甲基营养型芽孢杆菌的复合菌剂及在制备水产动物疾病的药物中的应用。所述的复合菌剂包括：甲基营养型芽孢杆菌YFI‑1、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。本发明提供的复合菌剂对水产动物无致病性，对水产病原菌：维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、爱德华氏菌、霉实假单胞菌、无乳链球菌具有良好的抑制作用。该复合菌剂对水产动物细菌性疾病起到较好的防治作用，因此具有良好的应用前景。

Description

含有甲基营养型芽孢杆菌的复合菌剂及在制备水产动物疾病 的药物中的应用
技术领域
本发明属于微生物的开发和应用领域，具体涉及含有甲基营养型芽孢杆菌的复合菌剂及在制备水产动物疾病的药物中的应用。
技术背景
中国是世界上最大的水产品生产国和消费国，随着养殖高度集约化，水生态环境恶化日益突出，病害濒发，据统计，每年我国因病害造成损失达150亿元。而在水产养殖过程中当前，维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌能够导致多种养殖动物爆发细菌性疾病，对养殖也造成巨大损失。目前，药物仍然是渔业生产中控制病害发生最重要的手段。其原料药主要是移植农药、畜禽兽药、医药和少量化工原料等，也成为影响水产品安全和环境安全最直接的因素之一。因长期、超剂量使用，致使病原产生耐药性，同时破坏和干扰了肠道正常菌群和养殖微生态环境，加大了水产养殖病害防治的难度。
微生态制剂是通过加强肠道微生物区系的屏障作用或通过增进非特异性免疫功能，维持宿主微生态平衡，减少疾病的发生，同时，兼有提高饲料利用率、改善产品品质、优化养殖生态环境作用，因绿色环保、无毒副作用、无残留污染、不产生抗体、无记忆性、作用范围广等优点成为抗生素最有潜力的替代品。
芽孢杆菌(Bacillus sp.)是一类能够产生芽孢的革兰氏阴性细菌，好氧或兼性好氧生活，广泛存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处，能够产生耐热、耐旱、抗紫外线和抗有机溶剂的内生孢子，所产生芽孢可制成粉剂、可湿性粉剂等多种剂型，另外还能利用分泌的多种酶类和抗生素来抑制其他细菌的生长，进而减少甚至消灭水产养殖动物的病原体，减少疾病的发生，提高养殖效益。能够改善水生动物肠道微生物区系，增强动物的消化吸收功能，促进动物对钙、磷、铁的利用，促进维生素D的吸收，增强机体抗病力，降低饵料系数，是理想的益生菌筛选对象。研究报道(谢学文等2016)发现甲基营养型芽孢杆菌对黄瓜炭疽病菌具有较强的抑制作用。夏艳等(2014)筛选到一株甲基营养型芽孢杆菌对烟草青枯病菌有明显的抑制作用。魏新燕等(2018)发现甲基营养型芽孢杆菌BH21对葡萄灰霉病菌(Botrytis cinerea)有较好拮抗作用。张皎皎(2018)从草鱼肠道中筛选出一株甲基营养型芽孢杆菌WM-1，该菌对嗜水气单胞菌具有较好的抑制作用。
目前，水产领域益生菌的种类较少，本发明从池塘水中筛选出一株甲基营养型芽孢杆菌YFI-1,具有较广的抑菌谱，对维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、爱德华氏菌、霉实假单胞菌、无乳链球菌都具有抑制作用，将该菌与枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌复配后，可加强其抑菌功能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含有甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)YFI-1的复合菌剂，所述的复合菌剂包括甲基营养型芽孢杆菌YFI-1，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。
本发明的另一个目的在于提供了一种含有甲基营养型芽孢杆菌YFI-1的复合菌剂的应用，该复合菌剂对水产病原菌，包括维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、爱德华氏菌、霉实假单胞菌、无乳链球菌有较好的抑制作用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种含有甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)的复合菌剂，所述的复合菌剂包括：甲基营养型芽孢杆菌YFI-1、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌；所述的甲基营养型芽孢杆菌YFI-1的保藏编号：CCTCC NO：M2019651。
市售的地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌菌能完成本发明。
以上所述的复合菌剂，优选的，所述的甲基营养型芽孢杆菌YFI-1、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的有效菌浓度比例为3-4:0.5-2:1-2。
一种含有甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)的复合菌剂的应用，包括利用该复合菌剂制备成水产细菌的抑菌剂，或是制备成预防或治疗水产动物疾病的药物；
以上所述的应用中，优选的，所述的水产细菌包括但不限于：维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、爱德华氏菌、温和气单胞菌、无乳链球菌、霉实假单胞菌。
以上所述的应用中，优选的，所述的水产动物疾病是由维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、爱德华氏菌、温和气单胞菌、无乳链球菌或霉实假单胞菌引起的。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.本发明的甲基营养型芽孢杆菌YFI-1对水产病原菌维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、爱德华氏菌、霉实假单胞菌、无乳链球菌都具有良好的抑制效果，可以作为抗生素替代品使用，具有良好的应用前景。
2.本发明的甲基营养型芽孢杆菌YFI-1对养殖动物和环境友好，且不会产生药物残留和耐药性问题。
3.本发明的甲基营养型芽孢杆菌YFI-1，枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌混配后的复合菌剂对水产病原菌维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、爱德华氏菌、霉实假单胞菌、无乳链球菌的抑制率高于单株甲基营养型芽孢杆菌YFI-1，因此适用于作为复合菌剂使用。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。本发明实施例中的抑菌指示菌具体为：维氏气单胞菌(Aeromonas veronii CCTCC AB 98045)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila ATCC13040)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria ATCC43979)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda ATCC 15947)、霉实假单胞菌(Pseudomonas fragi ATCC4973)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae ATCC 12386)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii ATCC43864)、脑膜败血伊丽莎白菌(Elizabethkingiameningoseptica ATCC13253)、类志贺邻单胞菌(Plesiomonsshigelloides ATCC 14029)
实施例1：
甲基营养型芽孢杆菌YFI-1的分离鉴定
1.菌种的分离
从养殖区域采集养殖池塘水样品。用0.85％的无菌生理盐水将养殖池塘水样品连续10倍倍比稀释6次，用移液枪分别在各个浓度梯度稀释液中吸取溶液100μL到BHI固体平板上，用涂布棒涂匀、编号，并做3个重复。涂布均匀后在超净工作台中放置5～10min，使培养基表面菌液被充分吸收。最后将平板倒置，于恒温培养箱中30℃培养24h。挑选不同形态的菌落接种于普通肉汤平板上分离纯化。
2.菌株筛选
采用牛津杯平板抑菌法对分离纯化获得的细菌进行抑菌性能测定，经过大量分选，获得1株对维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、霉实假单胞菌(Pseudomonas fragi)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)等致病菌表现出良好抑制作用的菌株，命名为YFI-1，具体操作如下：
将YFI-1和病原菌维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、爱德华氏菌、霉实假单胞菌、无乳链球菌分别接种到液体培养基中，30℃200rmp震荡培养24h，用0.85％无菌生理盐水重悬计数，使菌株YFI-1和病原菌菌液终浓度都为1×106CFU/mL。分别吸取100μl病原菌菌液涂布于不同的LB琼脂平板上，在无菌操作台中静置30min，使培养基表面菌液被充分吸收。在病原菌平板上分别放两个无菌牛津杯(内径6mm)，其中一个牛津杯中加入50μlYFI-1菌液，另一个加入50μl PBS作为对照，培养24h后测量抑菌圈直径。抑菌圈如表1所示。
表1菌株YFI-1的抑菌效果
3.YFI-1菌株的鉴定
1)、生理生化特征
取经LB固体培养基纯培养的菌株YFI-1，单菌落划线接种于BUG鉴定平板上，30℃培养16h-24h，待菌落大小适宜时取Biolog细菌鉴定试剂盒IF-A接种液，将管外壁擦拭干净，置入Biolog浊度仪中调整其读数为100％T；用无菌棉签蘸取适量的单菌落至接种液中，使浊度仪读数在92％T-98％T之间，用8孔移液枪将混合液以每孔100μL体积转移至GENⅢ鉴定板中，然后将鉴定板装载于Biolog系统中培养，系统自动读数并输出鉴定结果。
菌株YFI-1的生理生化特征见表2。
表2生理生化试验
注：“+”表示阳性反应，“―”表示阴性反应。
2)菌株YFI-1的分子生物学鉴定。
(1)菌株YFI-1的16SrRNA的基因片段序列测定
将菌株YFI-1纯培养物接种于LB液体培养基中，30℃200rpm震荡培养24h，离心收集菌体，采用离心柱型细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株YFI-1总DNA。采用通用引物扩增拮抗菌菌株16SrRNA的基因，菌株YFI-1经生理生化特征测定和16S rDNA序列同源性分析，鉴定为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。
该菌株已于2019年8月19日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)YFI-1，保藏编号：CCTCC NO：M2019651，地址：中国武汉武汉大学。
实施例2：
甲基营养型芽孢杆菌YFI-1抑菌试验
将甲基营养型芽孢杆菌YFI-1和维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、爱德华氏菌、霉实假单胞菌、无乳链球菌、弗氏柠檬酸杆菌、伊莉莎白菌、类志贺邻单胞菌分别接种到液体培养基中，30℃200rmp震荡培养24h，用0.85％无菌生理盐水重悬计数，使甲基营养型芽孢杆菌和病原菌菌液终浓度都为1×106CFU/mL。分别吸取100μl病原菌菌液涂布于不同的固体培养基平板上，在无菌操作台中静置30min，使培养基表面菌液被充分吸收。在病原菌平板上分别放两个无菌牛津杯(内径6mm)，其中一个牛津杯中加入50μl甲基营养型芽孢杆菌，另一个加入50μl PBS作为对照，培养24h后测量抑菌圈直径。抑菌圈直径见表3。
表3菌株YFI-1的抑菌谱
实施例3：
复合菌剂的制备：
本实施的复合菌剂是将甲基营养型芽孢杆菌YFI-1，枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌分别经过一级种子、二级种子培养，发酵培养，离心浓缩和干燥后复配制成，其中甲基营养型芽孢杆菌YFI-1，枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌的有效活菌数比例为3：1：1，制成的复合菌剂有效菌浓度为1010CFU/g。
所述的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌均购自北京索莱宝科技有限公司。
本实施所用培养基为LB肉汤，配方如下：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，将pH调至7.4±0.2。
本实施所用干燥方式为：将麸皮、沸石粉和玉米粉粉碎，然后按照1:1:1的重量比例混合均匀，所得的混合物作为辅料载体；将得到的浓缩菌液加入辅料载体，加入辅料的量为每100毫升浓缩菌液加入1000g辅料，混匀后55℃烘干后得到粉状制剂。
实施例4：
复合菌剂的抑菌试验：
将实施例3制得的复合菌剂和病原菌维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、爱德华氏菌、霉实假单胞菌、无乳链球菌分别接种到LB液体培养基中，30℃200rmp震荡培养24h，用0.85％无菌生理盐水重悬计数，复合菌剂和病原菌菌液终浓度都为1×106CFU/mL。分别吸取100μl病原菌菌液涂布于不同的LB琼脂平板上，在无菌操作台中静置30min，使培养基表面菌液被充分吸收。在病原菌平板上分别放两个无菌牛津杯，其中一个牛津杯中加入50μl复合菌剂菌液，另一个加入50μl PBS作为对照，培养24h后测量抑菌圈直径。抑菌圈直径见表4。
表4复合菌剂的抑菌效果
实施例5：
复合菌剂安全性评价
将复合菌剂用0.85％无菌生理盐水重悬计数，分别将模式动物斑马鱼和稀有鮈鲫于1×105CFU/mL、1×106CFU/mL、1×107CFU/mL、1×108CFU/mL的菌液浸泡2h，对照组用相同体积的PBS浸泡，观察10d内斑马鱼和稀有鮈鲫的发病及死亡情况。
结果发现10d内斑马鱼和稀有鮈鲫生长良好且无死亡情况，说明以甲基营养型芽孢杆菌YFI-1、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌为主成分的复合菌剂无致病性。
实施例6：
复合菌剂在养殖池塘中的应用：
试验地点选在湖北荆州、潜江的鲟鱼、鲫鱼、小龙虾养殖池塘。
试验设定3个养殖品种分别为A组(鲟鱼)、B组(鲫鱼)和C组(小龙虾)，每组选取6个养殖池塘进行试验，3个池塘作为对照组，3池塘泼洒复合菌剂作为处理组。复合菌剂使用方法：取1kg复合菌剂(活菌数1010CFU/g)溶于50L水中，均匀泼洒于池塘中，每1kg复合菌剂用于20亩池塘。
试验开始0h时，取每个池塘水样和养殖动物肠道进行维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌数量检测。
按照试验设计处理组泼洒复合菌剂，对照组什么也不添加，试验期间饲养条件不变。72h后，再测定所有试验池塘水样和养殖动物肠道中维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌的数量。见表5、表6。
抑制率＝(F-F’)/F×100％
F’：0h细菌数；F：72h细菌数。
表5复合菌剂在养殖池塘中对维氏气单胞菌的抑制效果
表6复合菌剂在养殖池塘中对嗜水气单胞菌的抑制效果

Claims (6)

1.一种含有甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）的复合菌剂，所述的复合菌剂包括：甲基营养型芽孢杆菌YFI-1、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌；所述的甲基营养型芽孢杆菌YFI-1的保藏编号：CCTCC NO：M2019651。
2.根据权利要求1所述的复合菌剂，所述的甲基营养型芽孢杆菌YFI-1、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的有效菌浓度比例为3-4:0.5-2:1-2。
3.权利要求1所述的复合菌剂在制备水产细菌的抑菌剂中的应用。
4.权利要求1所述的复合菌剂在制备预防或治疗水产动物疾病的药物。
5.根据权利要求3所述的应用，所述的水产细菌为：维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、爱德华氏菌、温和气单胞菌、无乳链球菌或霉实假单胞菌。
6.根据权利要求4所述的应用，所述的水产动物疾病是由维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、爱德华氏菌、温和气单胞菌、无乳链球菌或霉实假单胞菌引起的。
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