CN110028560A

CN110028560A - 一种凝结芽孢杆菌产的细菌素及其应用

Info

Publication number: CN110028560A
Application number: CN201910196000.6A
Authority: CN
Inventors: 吴影; 周子吕; 古绍彬; 李市场; 田晶晶; 李长福
Original assignee: Henan University of Science and Technology
Current assignee: Henan University of Science and Technology
Priority date: 2019-03-15
Filing date: 2019-03-15
Publication date: 2019-07-19
Anticipated expiration: 2039-03-15
Also published as: CN110028560B

Abstract

本发明提供了一种凝结芽孢杆菌产的细菌素及其应用，属于微生物领域，所述细菌素从保藏编号为CGMCC NO.9951的凝结芽孢杆菌中提取获得，可以耐受模拟胃酸、模拟胆盐环境；具有显著的益生性，可有效抑制大肠杆菌、禽巴氏杆菌、伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏杆菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌的生长繁殖；细菌素稳定性好，抑菌效果好，该细菌素及产细菌素的凝结芽孢杆菌可以应用于禽畜和水产疾病防治领域。

Description

一种凝结芽孢杆菌产的细菌素及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体地，涉及一种凝结芽孢杆菌产的细菌素及其应用。

背景技术

由于芽孢杆菌能够将营养细胞转化为具有良好抗逆性的芽孢体，使其对高温、酸碱等不良环境抵抗力增强，这种耐受性增加了它作为益生菌的潜力。由于凝结芽孢杆菌既具有芽孢杆菌的特点，同时还具有乳酸菌的优势，因此，获得新型具有良好益生特性的凝结芽孢杆菌的研究具有重大意义。

细菌素是由基因编码的一类具有抑菌活性的多肽或蛋白质，具有高效、无毒、耐高温、无残留、无抗药性等优点，使其作为绿色生物防腐剂在农产品和其它食品的保藏和农作物安全生产中倍受关注。乳酸菌在其代谢过程中能产生蛋白质或肽类抑菌物质细菌素。目前只有已经发现的乳酸链球菌素(Nisin)被批准应用于食品中，并实现了工业化生产。但由于乳酸链球菌素仅对部分革兰氏阳性菌有抑制作用，且热稳定性差，这限制了乳酸链球菌素的应用。因此开发具有良好稳定性、广抑菌谱的细菌素产品具有重大意义。

发明内容

为了解决现有技术中可作为绿色生物防腐剂的乳酸链球菌细菌素仅对部分革兰氏阳性菌有抑制作用，且稳定性差的问题，本发明的目的一在于提供一种细菌素，目的二提供一种广谱抗菌剂，目的三在于提供所述细菌素的生物学应用，包括其在制备生物防腐剂及在畜禽疾病或水产疾病防治中的应用。所述细菌素抑菌效果好，抑菌谱广，稳定性良好，对抑菌剂的进一步开发利用奠定基础。

为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：

一种细菌素，其特征在于：所述细菌素从凝结芽孢杆菌中提取所得；所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京市，保藏编号为CGMCC NO.9951，保藏日期为2014年11月13日。

作为对上述方案的优化，所述提取的方法为：将凝结芽孢杆菌培养发酵，取上清发酵液，向上清发酵液中加入饱和度为10%-80%的硫酸铵，搅拌均匀，4℃下静置2h使充分盐析，得盐析产物；将盐析产物离心，去除上清保留沉淀，所得沉淀即为细菌素粗品。更进一步地，向上清发酵液中加入饱和度为50%的硫酸铵，所得到的细菌素粗品物质抑菌效果较好。

本发明还提供一种广谱抗菌剂，包括上述细菌素。

本发明还请求保护上述细菌素在制备生物防腐剂上的应用。

本发明另外请求保护上述细菌素在畜禽或水产疾病防治中的应用。进一步地，所述细菌素通过抑制致病菌的生长代谢达到疾病防治的效果，所述致病菌包括畜禽致病菌和水产致病菌；所述畜禽致病菌包括但不限于大肠杆菌、禽巴氏杆菌、伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏杆菌；所述水产致病菌包括但不限于溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌。

有益效果：

本发明所述的细菌素具有良好的热稳定性，在酸性环境下也具有良好的抑菌性能。对革兰氏阳性致病菌和革兰氏阴性致病菌均具有良好抑制作用，益生效果好，能显著抑制肠道致病大肠杆菌、禽巴氏杆菌、伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏杆菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌等病原菌的生长繁殖，具有广谱抑菌性。致病菌涵盖常见禽畜类致病菌及水产类致病菌，这使得该细菌素及产细菌素的凝结芽孢杆菌可以应用于禽畜类疾病及水产类疾病的防治。

附图说明

图1是本发明所述细菌素以禽巴氏杆菌作为指示菌的抑菌结果图；

图2是本发明所述细菌素以志贺氏菌作为指示菌的抑菌结果图；

图3是本发明所述细菌素以猪霍乱沙门氏菌CVCC2146作为指示菌的抑菌结果图；

图4是本发明所述细菌素以鼠伤寒沙门氏菌CVCC2228作为指示菌的抑菌效果图；

图5是本发明所述细菌素以大肠埃希氏菌CVCC1527作为指示菌的抑菌效果图；

图6是本发明所述产细菌素的凝结芽孢杆菌培养时间与抑菌效果关系图；

图7是本发明所述细菌素在不同温度条件下抑菌活性对比图；

图8是本发明所述细菌素在不同pH条件下抑菌活性对比图；

图9是本发明所述细菌素在不同酶处理下抑菌活性对比图；

图10是本发明所述细菌素以50%饱和度硫酸铵盐析发酵上清液产品的抑菌效果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1凝结芽孢杆菌CGMCC9951的分离和鉴定

1、芽孢杆菌的分离纯化：在无菌条件下采集生态养殖场健康仔猪盲肠及粪便30份，分别称取1g样品添加到9mL无菌生理盐水中，充分震荡混匀，于80℃水浴锅中水浴10min除去非芽孢细菌体，按照1％的接种量接种于改良LB培养基中，37℃培养20h后于改良碳酸钙鉴定平板上进行稀释涂布；挑选有溶钙圈且生长良好的单菌落，用接种环转接于营养琼脂斜面上作纯培养，重复传代纯培养3次，置于4℃冰箱保存备用。

2、菌落形态的观察：将步骤1保存的斜面菌种，经2-3次活化，取干净的载玻片进行革兰氏染色，镜检，观察菌株显微形态，选取革兰氏染色为阳性的产芽孢杆菌作为备用，。

3、表1菌株生理生化鉴定结果

注：“+”表示反应阳性；“-”表示反应阴性。

4、通过细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株基因组DNA，以P0和PC3为上下游引物进行PCR扩增，扩增出约750bp的特异条带并进行测序。测序结果提交到EzTaxon 数据库进行比对，结果显示，该菌株与凝结芽孢杆菌的16S rDNA 序列的同源性高达97％。采用MEGA5.0软件构建出菌株的系统发育树见图1，从进化距离分析发现该菌株与B. coagulans IAM12463标准模式菌株接近。通过对菌株的形态特征、生理生化特征、16SrDNA特征分析，确定分离的该菌株为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)。

5、菌株保藏：上述经分离、纯化、筛选得到的凝结芽孢杆菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏日期为2014年11月13日，保藏编号为CGMCC NO.9951，分类命名为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)。

实施例2 凝结芽孢杆菌CGMCC NO.9951抗逆性验证

1、模拟胃酸的耐受试验：将保藏编号为CGMCC NO.9951的凝结芽孢杆菌接种于LB培养基中，37℃培养36h，菌液5000rpm离心10min收集菌体。将菌体等量加入到pH为1，2，3，4，5的10mL无菌PBS缓冲液中作为试验组；将菌体加入到pH 7.0的10mL 无菌PBS缓冲液中作为对照组。上述处理样品于37℃静置培养2h，平板计数。存活率为实验组与对照组活菌数之比乘以100%。结果表明：在pH 1-2的极端条件下暴露2h后仍有15％以上的存活率，在pH 4时存活率为91±3.5％。由此可见凝结芽孢杆菌具有较强的耐酸能力，在pH 3以上均能良好存活。

2、模拟胆盐的耐受实验：将保藏编号为CGMCC NO.9951的凝结芽孢杆菌接种于LB培养基中37℃培养36h，菌液5000rpm离心10min收集菌体。将菌体等量加入到10mL胆盐浓度为0.03％、0.1％、0.3％、0.5％及0.7％（w/v）的无菌PBS缓冲液（pH 7.0）中作为试验组；将菌体加入到无胆盐的10mL无菌PBS缓冲液（pH 7.0）中作为对照组。上述处理样品于37℃静置培养2h，平板计数。存活率为实验组与对照组活菌数之比乘以100%。结果表明：在胆盐浓度为0.03％时存活率为100%，在胆盐浓度为0.1％和0.3％时存活率达到40％以上，因此，凝结芽孢杆菌CGMCC NO.9951具有良好的耐胆盐能力。

其中，上述模拟试验中的计数方法：样品用无菌生理盐水十倍梯度稀释，吸取适当梯度稀释液各100µL均匀涂布在LB固体平板上，每个稀释度三个重复，37℃培养36h后计数取平均数。

实施例3凝结芽孢杆菌最佳抑菌效果培养时间的确定

将凝结芽孢杆菌CGMCC NO.9951接种至优化的LB培养基中，230rpm、37℃下培养16h，以培养16h为起点取样，每间隔8h取样，连续取样至培养56h，共计取样6次，分别以4000rpm离心获得无细胞发酵上清液，采用牛津杯抑菌实验方法，测量抑菌圈直径，每组实验重复三次，抑菌圈直径取平均值。结果显示凝结芽孢杆菌CGMCC9951无细胞上清液随着培养时间的增长其抑菌活性不断增强，在48h时其抑菌活性达到最大，结果见图6。

实施例4 凝结芽孢杆菌CGMCC NO.9951益生性验证

牛津杯法，步骤包括：①将已灭菌的未凝固的LB固体培养基倒在培养皿内，每皿30mL，待其凝固。②用移液枪吸取200µL由指示菌(大肠杆菌、禽巴氏杆菌、伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏杆菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌等)制备的最佳指示浓度（10⁷CFU/mL）的菌液，用无菌涂布棒涂布均匀。③在无菌条件下，将已灭菌的牛津杯(牛津杯的尺寸：内径6mm、外径8mm、高10mm)垂直放在LB固体培养基的表面，使其与培养基接触无空隙。④向牛津杯中分别加入200μL待测样品(凝结芽孢杆菌CGMCC NO.9951发酵上清液)，于37℃培养24h，测量抑菌圈直径。每个试验三个重复，分别测量抑菌圈直径，取平均值。结果见表2。部分指示菌的抑菌效果图如图1-5所示。

表2：凝结芽孢杆菌CGMCC NO.9951对病原菌的抑菌效果

实施例5 抑菌物质的定性试验

1、酸抑制作用的排除

测定凝结芽孢杆菌CGMCC NO.9951的发酵液的pH值，测得pH值为4.5。向两个烧杯中分别加入适量蒸馏水，用质量分数为36％的乳酸调节蒸馏水的pH值，使烧杯中的蒸馏水的pH值达到4.5。取200μL配置好的pH4.5乳酸溶液于牛津杯中做抑菌实验。将凝结芽孢杆菌CGMCC NO.9951置于LB液体培养基中37℃下培养16h后，在4000r/m离心20min，取200μL发酵上清液作为对照于牛津杯中做抑菌试验。指示菌为志贺氏菌。抑菌试验重复进行3次。实验结果：乳酸溶液无抑菌圈出现，这说明乳酸溶液无抑菌性，由此可以排除发酵液中乳酸抑制了指示菌的生长。

2、热稳定性试验

将凝结芽孢杆菌CGMCC NO.9951的上清发酵液在30℃、37℃、50℃、60℃、80℃、100℃下水浴20分钟，通过牛津杯扩散法检测其抑菌活性，抑菌试验重复进行3次。经热处理后的凝结芽孢杆菌CGMCC NO.9951的抑菌活性基本不变，表明凝结芽孢杆菌CGMCC NO.9951具有良好的热稳定性。结果见图7。

3、不同pH下稳定性试验

用HCl将凝结芽孢杆菌CGMCC NO.9951的上清发酵液pH分别调节至2、3、4、5、6、7、8、9、10，在室温下处理2h，通过牛津杯扩散法检测其抑菌活性，抑菌试验重复进行3次。结果显示，凝结芽孢杆菌CGMCC NO.9951在pH2-4条件下抑菌活性良好，在pH6以上时抑菌活性丧失，表明凝结芽孢杆菌CGMCC NO.9951在酸性条件下能够发挥良好的抑菌活性。结果见图8。

4、蛋白酶消化试验

将木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶分别溶解在凝结芽孢杆菌CGMCC NO.9951的上清发酵液中，使酶终浓度为10mg/ml，并于37℃下水浴2h，取200μL做牛津杯抑菌试验。抑菌试验重复进行3次。凝结芽孢杆菌CGMCC NO.9951的上清发酵液经木瓜蛋白酶、胰蛋白酶水解后，抑菌圈直径缩小6mm，抑菌活性下降50%，表明凝结芽孢杆菌CGMCC9951的上清发酵液中主要的抑菌物质为蛋白类物质。结果见图9。

实施例6 抑菌物质粗提取方法

取凝结芽孢杆菌CGMCC NO.9951的上清发酵液均等分为8份50ml，分别向上清发酵液中缓慢加入饱和度分别为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%的硫酸铵，充分搅拌，于4℃冰箱中静置2h使其充分盐析，10000rpm离心20min，去除上清保留沉淀，通过牛津杯扩散法检测其抑菌活性。抑菌实验重复进行3次。结果显示：50%饱和度的硫酸铵盐析的蛋白具有良好的抑菌活性，抑菌活性基本不变。结果见图10。

实施例7 凝结芽孢杆菌的黏附性

选取新鲜活鱼解剖，取其肠，挤出肠内容物，PBS冲洗两到三次，剪开鱼肠，用载玻片刮取肠道粘液。用PBS缓缓冲洗三次。调整枯草芽孢杆菌S0562的菌液浓度为10⁸CFU/mL，吸取200µl菌悬液与肠黏液暴露在平板中，2h后再次用PBS缓缓冲洗三次，收集肠黏液进行平板涂布，放置37℃恒温培养箱过夜培养，平板计数，做三个平行。结果显示，凝结芽孢杆菌对肠粘液的黏附能力达41.67±3.73％，良好的黏附性保证其发挥更好的益生作用。

上述凝结芽孢杆菌的培养方法如下：培养基组成成分：葡萄糖15.80g/L，蛋白胨15.90g/L，酵母粉11g/L，MgSO4 4.60g/L。摇瓶发酵条件：接种量3%，初始pH 8.0，转速230rpm，培养温度37℃，培养时间20h。

上述实施例中，若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明提供了一种产细菌素的凝结芽孢杆菌，通过形态观察、生理生化鉴定、抑菌性能检测及16S rDNA序列分析和体外益生效果评价得到，该菌株抗逆性强、耐酸耐胆盐、益生效果良好。该产细菌素的凝结芽孢杆菌CGMCC NO.9951对革兰氏阳性致病菌和革兰氏阴性致病菌均具有良好抑制作用，这说明该凝结芽孢杆菌的抑菌产物具有广谱抗菌作用，同时，该抑菌物质具有良好的热稳定性，在酸性环境下也具有良好的抑菌性能。其中大肠杆菌、禽巴氏杆菌、伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏杆菌等为常见禽畜致病菌，说明该凝结芽孢杆菌可应用于禽畜疾病的防治。其中溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌等为常见水产致病菌，说明该凝结芽孢杆菌可应用于水产疾病的防治。

需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种细菌素，其特征在于：所述细菌素从凝结芽孢杆菌中提取所得；所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京市，保藏编号为CGMCC NO.9951，保藏日期为2014年11月13日。

2.如权利要求1所述的一种细菌素，其特征在于：所述提取的方法为：将凝结芽孢杆菌培养发酵，取上清发酵液，向上清发酵液中加入饱和度为10%-80%的硫酸铵，搅拌均匀，4℃下静置2h使充分盐析，得盐析产物；将盐析产物离心，去除上清保留沉淀，所得沉淀即为细菌素粗品。

3.如权利要求2所述的一种细菌素，其特征在于：向上清发酵液中加入饱和度为50%的硫酸铵。

4.一种广谱抗菌剂，其特征在于：包括如权利要求1-3任意一种所述的细菌素。

5.如权利要求1-3任意一种所述的细菌素在制备生物防腐剂上的应用。

6.如权利要求1-3任意一种所述的细菌素在畜禽或水产疾病防治中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，所述细菌素通过抑制致病菌的生长代谢达到疾病防治的效果，所述致病菌包括畜禽致病菌和水产致病菌；所述畜禽致病菌包括但不限于大肠杆菌、禽巴氏杆菌、伤寒沙门氏菌、沙门氏菌和志贺氏杆菌；所述水产致病菌包括但不限于溶藻弧菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌。