CN113244274A

CN113244274A - 凝结芽孢杆菌在缓解微塑料毒性中的应用

Info

Publication number: CN113244274A
Application number: CN202110464216.3A
Authority: CN
Inventors: 吴影; 刘晓亮; 古绍彬; 赵丽娜; 段思琪; 李欣; 王明月; 李璇; 曹力
Original assignee: Henan University of Science and Technology
Current assignee: Henan University of Science and Technology
Priority date: 2021-04-28
Filing date: 2021-04-28
Publication date: 2021-08-13
Anticipated expiration: 2041-04-28
Also published as: CN113244274B

Abstract

本发明涉及凝结芽孢杆菌在缓解微塑料毒性中的应用，属于微生物技术领域。本发明通过将秀丽隐杆线虫（C.elegans）暴露于不同浓度的聚苯乙烯微塑料（PS），同时喂食不同食物：标准食物E.coli OP50和益生菌B.coagulans，发现进行PS暴露并且喂食B.coagulans的C.elegans的体长显著延长，存活率显著提高，C.elegans体内的微塑料蓄积量显著降低。说明凝结芽孢杆菌能够缓解PS暴露对C.elegans的毒理作用。本发明将B.coagulans用于缓解PS毒性的研究，为B.coagulans的功能性食品及新的药用方向奠定基础。

Description

凝结芽孢杆菌在缓解微塑料毒性中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及凝结芽孢杆菌的应用，具体涉及凝结芽孢杆菌应用于缓解秀丽隐杆线虫微塑料暴露毒性。

背景技术

自进入21世纪后，塑料制品的大范围运用，塑料制品的难降解与高危害使得微塑料以一种新型污染物的身份进入人们的生活，也被人们形象地称为“海中的 PM2.5”。塑料污染威胁到了海洋生物的生存以及旅游业、渔业和商业的发展。2004年，英国Thompson教授发表于Science文章中首次提出“微塑料”的概念。微塑料是一种直径小于5毫米的塑料颗粒，亦是一种造成污染的主要载体。其来源十分广泛，包括各种塑料制品，如牙膏、发胶、洁面乳和空气清新剂中的微粒、纺织物和汽车轮胎。对于自然界中存在的生物，游荡的微塑料很容易被贻贝、浮游动物等低端食物链生物吃掉，微塑料不能被消化掉，从而导致动物生病甚至死亡。处于食物链底端的生物会被上层动物吃掉，而微塑料，甚至微塑料和有机污染物都进入了上层动物体内，在底层动物体内有害物质只有1%，但是到上层就变成了 20%，这样会使大量的食用微塑料的生物生病或者死亡。食物链的顶端的生物是人类，人类在富集的作用下，会累积大量的微塑料在体内，这些难以消化的小颗粒对人产生难以预计的危害。

塑料制品进入环境后会通常会被分解为颗粒尺度小于 5mm的微塑料（Microplastics，MP），生物体长期暴露于微塑料环境下，可引起生命体生理学、细胞学、组织学以及行为学等改变，近年来，微塑料对生物的影响也成为新的研究热点。由于其尺寸小，更易吸收进入生物细胞。研究表明，胃肠道是微塑料蓄积的主要部位，且会对消化系统造成严重影响，微塑料也能进入血液、淋巴系统和肝脏，肠道中的微塑料也可能影响消化系统的免疫反应。除了在环境治理方面对微塑料进行严格管控之外，我们也应当密切关注如何寻找新型药物从而减弱微塑料对人体健康造成的危害。

益生菌可促进小肠蠕动，改善肠道功能，从而促进机体对营养物质的消化吸收及有害物质的排泄，并对氧化应激反应和肠道菌群起到调节作用。同时，益生菌可富集和清除镉、铅、砷、铬和汞等重金属，适当利用益生菌可帮助人体排出重金属。此外，研究发现，黄粉虫肠道微生物对聚氯乙烯类塑料具有生物降解作用。肠道益生菌是否会富集并分解代谢微塑料并不可知，益生菌凝结芽孢杆菌，不仅具有抗氧化、提高免疫力以及改善肠道功能等特性，且已获得 FDA“食用安全”认证批准。

发明内容

为了缓解微塑料的毒性问题，本发明的目的在于揭示出凝结芽孢杆菌在缓解微塑料毒性中的应用，特别是通过饲喂凝结芽孢杆菌缓解秀丽隐杆线虫中聚苯乙烯微塑料暴露毒性。在微塑料暴露的条件下，给秀丽隐杆线虫分别喂食标准食物大肠杆菌和益生菌凝结芽孢杆菌，结果表明，凝结芽孢杆菌能够缓解PS毒性导致的线虫体长缩短现象，提高线虫的存活率，减低聚苯乙烯（PS）在线虫体内的蓄积水平，说明凝结芽孢杆菌能够缓解微塑料暴露对秀丽隐杆线虫的毒理作用，这为凝结芽孢杆菌应用于抗微塑料毒性的功能性食品及新的药用方向奠定基础。

为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：

凝结芽孢杆菌在缓解微塑料毒性中的应用。

所述凝结芽孢杆菌优选为保藏编号为CGMCC No. 9951的凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans），该菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京市，保藏时间为2014年11月13日。

进一步地，所述微塑料毒性是以秀丽隐杆线虫为主体，将其暴露于微塑料中进行培养产生毒性。更进一步地，通过喂食凝结芽孢杆菌缓解秀丽隐杆线虫微塑料暴露毒性。以上所述微塑料是聚苯乙烯。

一种利用凝结芽孢杆菌缓解秀丽隐杆线虫微塑料暴露毒性的方法，包括以下步骤：

（1）、以大肠杆菌为食物培养秀丽隐杆线虫至产卵期进行同步化处理；

（2）将同步化至L1期的秀丽隐杆线虫暴露于微塑料的同时喂食凝结芽孢杆菌，观察秀丽隐杆线虫的体长生长、存活率以及线虫体内的微塑料蓄积情况。

进一步地，所述同步化处理时，先用M9缓冲液将处于产卵期的雌雄同体线虫成虫从NGM培养皿上冲洗至离心管，离心，去除上清液；在只剩虫体的离心管中加入体积比为2:1的M9缓冲液和线虫裂解液，振荡处理暴露出虫卵至只剩极少量虫体时离心，用M9缓冲液清洗，最后在20℃生化培养箱培养12h使线虫全部生长到L1期。

进一步地，所述暴露方式为：将秀丽隐杆线虫暴露在涂有PS的凝结芽孢杆菌B.coagulans的NGM培养皿中，72h后检测线虫体长、线体内的微塑料蓄积情况，11d后观察线虫的存活率。

本发明还请求保护凝结芽孢杆菌或其代谢产物在制备抗微塑料毒性的药品或功能性食品中的应用。

本发明以兼具产乳酸和芽孢优势的益生菌凝结芽孢杆菌为研究材料，借助与人类基因组高度同源的模式生物秀丽隐杆线虫，建立微塑料对秀丽隐杆线虫的染毒模型；通过秀丽线虫体长和存活率指标评估微塑料的毒理效应，并通过荧光标记微塑料揭示微塑料在秀丽线虫体内的富集和定位情况；建立益生菌凝结芽孢杆菌替换大肠杆菌 OP50 作为线虫食物的培养模型，研究其对微塑料暴露秀丽线虫生长和存活率的影响；借助荧光标记微塑料探究凝结芽孢杆菌对线虫富集微塑料的干预作用，明确益生菌凝结芽孢杆菌对微塑料暴露毒性的影响机制。为揭示微塑料的毒理作用提供了重要证据。

模式生物秀丽隐杆线虫生命周期短，从卵到成虫只要3.5天，寿命约2~3周，便于进行微塑料毒理效应导致的生长发育异常检测。秀丽隐杆线虫通体透明，便于进行荧光微塑料的体内蓄积检测。并且秀丽隐杆线虫的全部基因序列已完成测定，其基因组序列全长9.7×10⁴kb，大约编码19000个基因，其中约有40%的基因与人类的相似，以秀丽隐杆线虫为实验动物探究微塑料毒性的解决方案一定程度上可适用于人类。

有益效果：

1、本发明通过给PS暴露条件下的线虫喂食凝结芽孢杆菌，缓解了PS对线虫的毒理效应。本发明以秀丽隐杆线虫（C.elegans）为实验材料进行实验，结果表明：凝结芽孢杆菌缓解了PS毒性导致的秀丽隐杆线虫体长缩短现象，提高了秀丽隐杆线虫的存活率，降低了秀丽隐杆线虫体内的微塑料蓄积水平。

2、本发明是凝结芽孢杆菌应用于缓解微塑料毒理作用的首次发现，为凝结芽孢杆菌应用于抗微塑料毒性的功能性食品及新的药用方向提供依据。

附图说明

图1是以E.coli OP50为食物，不同浓度PS暴露对线虫体长的影响对比图；

图2是以E.coli OP50为食物，不同浓度PS暴露对线虫存活率的影响对比图；

图3是以E.coli OP50为食物，不同浓度PS暴露后线虫体内微塑料蓄积水平对比图；

图4是不同凝结芽孢杆菌对线虫寿命的影响对比图；

图5是不同凝结芽孢杆菌对羟自由基的清除能力比较图；

图6是不同凝结芽孢杆菌对PS暴露线虫SOD酶活力的影响对比图；

图7是以B.coagulans（BC9951）为食物的培养模型的检验图；

图8是以B.coagulans（BC9951）为食物，不同浓度PS暴露对线虫体长的影响对比图；

图9是以B.coagulans（BC9951）为食物，不同浓度PS暴露对线虫存活率的影响对比图；

图10是以B.coagulans（BC9951）为食物，不同浓度PS暴露后线虫体内微塑料蓄积水平对比图；

图11是分别以E.coli OP50和B.coagulans（BC9951）为食物，秀丽隐杆线虫体内微塑料蓄积水平对比图。

具体实施方式

本发明所采用的技术方案包括如下步骤：

（1）NGM培养基的配制方法：

每100mL去离子水：氯化钠0.3g、蛋白胨0.25g、琼脂粉1.7g、水97.5mL；灭菌；灭菌后加1mol/L氯化钙0.1ml、1mol/L硫酸镁0.1mL、磷酸缓冲液2.5mL、胆固醇溶液0.1mL。

（2）LB培养基的配制方法：

每100mL去离子水：胰蛋白胨1.0g、酵母粉0.5g、氯化钠1g。

（3）凝结芽孢杆菌培养基的配制方法：

每100ml去离子水：葡萄糖1.5g、胰蛋白胨1.5g、酵母1.0g、MgSO4 0.5gl、pH=8±0.2。

（4）染毒液的配制方法：

取聚苯乙烯原液离心，去上清，在 75%乙醇中浸泡，离心后用无菌水和乙醇重悬聚苯乙烯微球，然后在 4℃环境储存或直接使用。将聚苯乙烯微球溶液在超声波清洗机中振荡重悬，将除菌并充分重悬后的 MP 与菌液混合，涡旋振荡仪振荡混匀，进行倍比稀释，从而得到 PS 浓度分别为 0mg/ml、0.01mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml、5mg/ml 的染毒菌液。

（5）秀丽隐杆线虫的同步化方法：

用 M9 缓冲液从NGM 固体培养基表面冲洗下处于产卵期的雌雄同体线虫成虫，转移至离心管，用M9冲洗1-3次，每次清洗去除上清液。清洗后，加入 M9 和裂解液（体积比 2:1），在涡旋振荡器充分振荡，待虫裂解至只剩极少量虫体时，离心机 1300xg离心2min，弃上清，收集沉淀，用 M9 清洗3次，每次清洗均弃掉上清。将裂解后的虫卵留在离心管中，加入适量 M9缓冲液，在20℃培养12h得到 L1 期幼虫。

（6）秀丽隐杆线虫的染毒暴露方法：

用移液器吸取一定量的染毒液于 NGM 固体培养皿上，用涂布棒将菌液涂开，形成大小一致的同心圆。将培养皿于生化培养箱中37℃过夜培养，在NGM上得到均匀混有PS的圆形菌苔。将同步化至L1期的秀丽隐杆线虫幼虫转移至NGM中进行染毒暴露。

（7）秀丽隐杆线虫体长检测的方法：

线虫同期化处理后，将培养至 L1 期的线虫转入对照组和各实验组，培养72h。暴露结束后，将线虫挑至载玻片上，用打火机或酒精灯在载玻片底部灼烧，线虫会瞬间变直，盖上盖玻片，于显微镜下拍照，用显微镜配套测量软件进行测量。随机选取线虫，利用测量尺沿线虫身体中线从头至尾部，即为线虫体长每组测30条线虫。

（8）秀丽隐杆线虫存活率的检测方法：

线虫同期化处理后，将培养至 L1 期的线虫转入对照组和各实验组，培养72h。每组线虫20条，设置三组平行实验，进行实验并观察线虫的存活情况。线虫到达产卵期后，每天将线虫转移至对应微塑料浓度的新的培养基内，直至产卵结束。每天观察并记录线虫存活量和死亡量。

（9）荧光PS在C.elegans体内蓄积的检测方法：

本检测方法所使用的微塑料为荧光微塑料，线虫同期化处理后，将培养至 L1 期的线虫转入对照组和各实验组，培养 72h。各组暴露结束后，将线虫用 M9 清洗，并禁食2h。将各组线虫转移至24孔板中，加入 100μL 60μM 的左旋咪唑溶液，待麻醉 1min后，将线虫转移至载玻片上，用荧光倒置显微镜拍照并观察 MP 颗粒在线虫中的分布位置和荧光强度，利用 Image J 软件分析荧光强度，根据荧光强度评价 PS 在线虫体内的蓄积水平。

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1以E.coli OP50为食物，不同浓度PS暴露对线虫体长的影响。

实验过程如下：

线虫同期化处理后，将培养至 L1 期的线虫转入只涂有E.coli OP50的对照组和含有浓度分别为 0mg/ml、0.01mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml、5mg/ml PS染毒液的各实验组，培养72h。暴露结束后，将线虫挑至载玻片上，用打火机或酒精灯在载玻片底部灼烧，线虫会瞬间变直，盖上盖玻片，于显微镜下拍照，用显微镜配套测量软件进行测量。随机选取线虫，利用测量尺沿线虫身体中线从头至尾部，即为线虫体长每组测30条线虫。

结果显示：与空白对照组相比，各浓度PS暴露组线虫均表现出较为显著的体长缩短现象。表明微塑料暴露能显著影响线虫的生长发育，结果图见图1。

实施例2以E.coli OP50为食物，不同浓度PS暴露对线虫存活率的影响。

实验过程如下：

线虫同期化处理后，将培养至 L1 期的线虫转入只涂有E.coli OP50的对照组和含有浓度分别为 0mg/ml、0.01mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml、5mg/ml PS染毒液的各实验组。每组线虫20条，设置三组平行实验，进行实验并观察线虫的存活情况。线虫到达产卵期后，每天将线虫转移至对应微塑料浓度的新的培养基内，直至产卵结束。每天观察并记录线虫存活量和死亡量。

结果显示：空白对照组仍有80%线虫存活，PS浓度0.01mg/ml组存活率为50%，PS浓度0.1mg/ml组存活率为50%，PS浓度1mg/ml组存活率为70%，PS浓度5mg/ml组存活率为30%。实验数据表明，相对于空白对照，微塑料暴露条件下，线虫的存活率显著降低，结果图见图2。

实施例3以E.coli OP50为食物，不同浓度PS暴露后线虫体内微塑料蓄积水平。

实验过程如下：

此实验所使用的微塑料为荧光微塑料，将培养至 L1 期的线虫转入只涂有E.coli OP50的对照组和含有浓度分别为 0mg/ml、0.01mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml、5mg/ml PS染毒液的各实验组，培养72h。各组暴露结束后，将线虫用M9清洗，并在K液中禁食2h。将各组线虫转移至24孔板中，加入100μL 60μM的左旋咪唑溶液，待麻醉1min后，将线虫转移至载玻片上，用荧光倒置显微镜拍照并观察MP 颗粒在线虫中的分布位置和荧光强度，利用Image J软件分析荧光强度，根据荧光强度评价PS在线虫体内的蓄积水平。

结果显示：0.01、1mg/ml浓度组荧光微塑料颗粒在线虫体内均有明显蓄积。分析平均荧光强度得知，1mg/ml浓度组蓄积更为显著（P＜0.01），结果图见图3。

实施例4 延长线虫寿命凝结芽孢杆菌的筛选。

以E. coli OP50为对照组，四种凝结芽孢杆菌分别为BC9951、BC235、BC303、BC310，观察线虫并记录线虫到死亡所存活的天数。对于四种凝结芽孢杆菌的来源：BC9951即为保藏编号为CGMCC No. 9951的菌种，已保藏；BC235、BC303和BC310三种菌已在“赵丽娜.凝结芽孢杆菌的筛选及高密度培养工艺研究[d].河南科技大学.2017”中公开。

如图4所示，对照组的线虫生存时间达到19.4天，与对照组相比，4株凝结芽孢杆菌均能延长线虫寿命，其中，BC9951对线虫寿命的延长作用有极显著效果（P<0.01），BC235有显著影响（P<0.05），BC303和BC310影响不显著。研究发现一些益生菌具有延长寿命的作用，如Gayeung Kwon等饲喂秀丽隐杆线虫B. pullicaecorum和M. elsdenii，与大肠杆菌OP50相比，显示出脂褐藻糖质积累减少，运动活动性增加以及MLS升高。本研究发现4株凝结芽孢杆菌也增加了秀丽线虫的寿命，可能是凝结芽孢杆菌增强线虫消化吸收功能，提高机体免疫力，进而延长线虫寿命。

实施例5 凝结芽孢杆菌对羟自由基的清除力。

羟自由基的清除能力是评价凝结芽孢杆菌体外抗氧化能力的一个重要指标，以E. coli OP50为对照组，四种凝结芽孢杆菌分别为BC9951、BC235、BC303、BC310，测定四种凝结芽孢杆菌的羟自由基的清除能力。如图5所示，与对照组相比四种凝结芽孢杆菌均具有一定的羟自由基清除能力，BC9951有显著影响（P<0. 01），BC235、BC303、BC310有影响（P<0.05）。对照组的羟自由基清除率为55. 6%，其中BC9511的清除率达到了93. 9%，BC235和BC303的清除率差别不大，分别为76. 6%和75. 6%，而BC310的清除率仅达到了65. 6%。四种凝结芽孢杆菌都具有羟自由基清除能力，其中效果最好的是BC9951，效果最差的是BC310。

实施例6 凝结芽孢杆菌对PS暴露线虫SOD酶活力的影响。

在普通NGM培养基中添加1 mg/mL 粒径1μm PS，以4株凝结芽孢杆菌为食物培养线虫，测定其对SOD酶活力的影响，如图6所示。结果表明，与对照组相比，4株凝结芽孢杆菌均能使秀丽线虫SOD酶活力显著增加（P<0.01），其中BC9951使其SOD酶活力增加的最多，增加了72.7%；BC303使酶活力只增加了10.7%。表明BC9951、BC235和BC310凝结芽孢杆菌均能提高PS暴露秀丽线虫的抗氧化性。

实施例7 以B.coagulans（BC9951）为食物的培养模型的检验。

实验过程如下：

分别以E.coli OP50和B.coagulans平铺于NGM培养基上作为对照组，分别在E.coli OP50和B.coagulans菌液中均匀混合浓度分别为 0mg/ml、0.01mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml、5mg/ml PS，作为实验组。每组线虫20条，设置三组平行实验，进行实验并观察线虫的存活情况。线虫到达产卵期后，每天将线虫转移至对应微塑料浓度的新的培养基内，直至产卵结束。每天观察并记录线虫存活量和死亡量。

结果显示：秀丽隐杆线虫以E.coli OP50为食物，最长存活寿命为19天。以B.coagulans为食物，最长存活寿命为22天。相比于标准实物E.coli OP50，B.coagulans对秀丽隐杆线虫的寿命有较显著的延长作用。结果图见图7。

实施例8以B.coagulans（BC9951）为食物，不同浓度PS暴露对线虫体长的影响。

实验过程如下：

结果显示：PS浓度为0.01mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml组的线虫体长与空白对照组相比，没有显著性差异（P＞0.05）。而PS浓度5mg/ml组的线虫体长与空白组相比显著缩短（P＜0.01），结果图见图8，表明该菌能缓解低浓度微塑料对秀丽线虫体长的影响，基本恢复到未暴露水平。

实施例9以B.coagulans（BC9951）为食物，不同浓度PS暴露对线虫存活率的影响。

实验过程如下：

线虫同期化处理后，将培养至 L1 期的线虫转入只涂有B.coagulans的对照组和含有浓度分别为 0mg/ml、0.01mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml、5mg/ml PS染毒液的各实验组。每组线虫20条，设置三组平行实验，进行实验并观察线虫的存活情况。线虫到达产卵期后，每天将线虫转移至对应微塑料浓度的新的培养基内，直至产卵结束。每天观察并记录线虫存活量和死亡量。

结果显示：各微塑料浓度组的线虫在实验期间的存活率相对空白对照组均有所降低。其中，空白对照组仍有90％的受试线虫存活，而PS浓度0.01mg/ml组存活率为70%，PS浓度0.1mg/ml存活率65%，PS浓度1mg/ml存活率85%，PS浓度5mg/ml存活率60%，结果图见图9。

实施例10以B.coagulans（BC9951）为食物，不同浓度PS暴露后线虫体内微塑料蓄积水平。

实验过程如下：

此实验所使用的微塑料为荧光微塑料，将培养至 L1 期的线虫转入只涂有B.coagulans的对照组和含有浓度分别为 0mg/ml、0.01mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml、5mg/mlPS染毒液的各实验组，培养72h。各组暴露结束后，将线虫用M9清洗，并在K液中禁食2h。将各组线虫转移至24孔板中，加入100μL 60μM的左旋咪唑溶液，待麻醉1min后，将线虫转移至载玻片上，用荧光倒置显微镜拍照并观察MP 颗粒在线虫中的分布位置和荧光强度，利用Image J软件分析荧光强度，根据荧光强度评价PS在线虫体内的蓄积水平。

结果显示：相比于空白对照组，0.01mg/ml、1mg/ml组仍有荧光微塑料蓄积，且均有显著性差异（P＜0.05）。结果图见图10。

图11为分别以E.coli OP50和B.coagulans为食物，秀丽隐杆线虫体内微塑料蓄积水平对比，发现在相同PS浓度暴露条件下，PS浓度为0.01mg/mL时，B.coagulans组的平均荧光强度低于E.coliOP50组（P＜0.05），微塑料浓度1mg/mL，B.coagulans组平均荧光强度显著低于E.coliOP50组（P＜0.001），表明B.coagulans能促进微塑料在肠道内的代谢，有利于微塑料排出。

需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。

Claims

1.凝结芽孢杆菌在缓解微塑料毒性中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，所述凝结芽孢杆菌的分类命名为凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans），已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京市，保藏编号为CGMCC No. 9951，保藏时间为2014年11月13日。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述微塑料毒性是以秀丽隐杆线虫为主体，将其暴露于微塑料中进行培养产生的毒性。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：通过喂食凝结芽孢杆菌缓解秀丽隐杆线虫微塑料暴露毒性。

5.根据权利要求1-4任意一种所述的应用，所述微塑料是聚苯乙烯。

6.一种利用凝结芽孢杆菌缓解秀丽隐杆线虫微塑料暴露毒性的方法，其特征在于：包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述同步化处理时，先用M9缓冲液将处于产卵期的雌雄同体线虫成虫从NGM培养皿上冲洗至离心管，离心，去除上清液；在只剩虫体的离心管中加入体积比为2:1的M9缓冲液和线虫裂解液，振荡处理暴露出虫卵至只剩极少量虫体时离心，用M9缓冲液清洗，最后在20℃生化培养箱培养12h使线虫全部生长到L1期。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述暴露方式为：将秀丽隐杆线虫暴露在涂有聚苯乙烯的凝结芽孢杆菌B.coagulans的NGM培养皿中，72h后检测线虫体长、线体内的微塑料蓄积情况，11d后观察线虫的存活率。

9.凝结芽孢杆菌或其代谢产物在制备抗微塑料毒性的药品或功能性食品中的应用。