CN110863030A - 一种利用秀丽隐杆线虫检测发育毒性的方法 - Google Patents

一种利用秀丽隐杆线虫检测发育毒性的方法 Download PDF

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尹大强
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Abstract

本发明提供了一种利用秀丽隐杆线虫检测发育毒性的方法，属于生态风险评价领域，本发明以24孔细胞培养板作为主要暴露环境，配制有特定坡度的NGM培养基，在其一侧对秀丽隐杆线虫卵进行受试物质暴露，利用秀丽隐杆线虫从虫卵到成虫的发育阶段对外界环境变化的敏感性，在另一侧采用大肠杆菌食物诱导线虫产生运动行为，根据该发育与运动的特征进行发育毒性的检测，甚至不需要显微镜的辅助即可直接观察，采用肉眼直接观察食物侧线虫的有无及多少，即可快速、定性判断受试物质的发育毒性，从暴露至指标检测的用时在24h左右，缩短了指标检测时间，并集肉眼观测与显微观测于一体，检测结果具有较高的准确性和可靠性。

Description

一种利用秀丽隐杆线虫检测发育毒性的方法
技术领域
本发明涉及生态风险评价领域，具体涉及一种利用秀丽隐杆线虫检测发育毒性的方法。
背景技术
随着人类科技的进步和生活质量的不断提高，越来越多的化学品用于人们的生活，伴随而来是大量进入环境中的化学品在不断地迁移、转化，通过各种途径最终可能重新流入水体、土壤、大气环境中，并可能随着食物链逐步累积，最终对人类产生健康危害、对生态系统的稳定产生干扰。因此，对化学品的毒性检测是评估其健康风险、环境危害的重要手段。
秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)，具有精确而短暂的生命周期、体积小、容易培养等诸多优点，以细菌为食、非寄生，对人、动植物没有危害，安全性高。秀丽隐杆线虫对外界环境的变化非常敏感，在环境胁迫下秀丽隐杆线虫会改变它们的生长发育、运动能力等生物指标。
目前化学品的毒性检测多采用急性致死毒性指标，该方法通常采用高浓度、急性暴露的实验条件，与实际环境低浓度、慢性暴露的实际情况不符，检测准确度相对不高，因此低浓度条件下的生长发育等毒性效应的环境意义日渐凸显，同时传统的方法中进行后续的指标检测时还需将其进行转移，从暴露开始、到转移操作以及后续指标检测耗费的时间通常在36h左右，其发育毒性生物检测方法都存在检测周期长等缺点，难以高效的推广。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本申请提供了一种利用秀丽隐杆线虫检测发育毒性的方法。本发明检测周期短、接近实际环境暴露情况，集肉眼观测与显微观测于一体，检测结果具有较高的准确性和可靠性。
本发明的技术方案如下：
一种利用秀丽隐杆线虫检测发育毒性的方法，该方法包括如下步骤：
a.制备菌液：利用培养基培养尿嘧啶缺陷型大肠杆菌，获得菌体后与无菌钾溶液混合，得到特定浓度的菌液；
b.制备秀丽隐杆线虫卵液：采用同步化方法制备秀丽隐杆线虫卵，向秀丽隐杆线虫卵中加入无菌钾溶液稀释，得到特定浓度的卵液；
c.制备培养基：采用24孔细胞培养板制备培养基并使24孔细胞培养板与水平面的夹角呈12°-15°放置，以此形成24孔细胞培养板中孔底面的倾斜状态，向24孔细胞培养板的各孔中加入液态NGM培养基，待液态NGM培养基冷凝后，得到具有坡度的多个固态NGM培养基；将24孔细胞培养板与水平面的夹角呈18°-20°放置，在各固态NGM培养基的最高处滴加步骤a得到的菌液，保持24孔细胞培养板的角度不变将其置于培养箱内放置12-24h，之后取出24孔细胞培养板，对菌液中的尿嘧啶缺陷型大肠杆菌进行灭活处理；
d.分组：将步骤c中的24孔细胞培养板水平放置，在各固态NGM培养基的最低处滴加步骤b制备的秀丽隐杆线虫卵液，以24孔细胞培养板每一列中的全部固态NGM培养基作为一组，选取其中一组作为空白对照组，其余五组作为暴露组；
e.配制受试物溶液：采用无菌钾溶液稀释受试物质得到受试物溶液，对应每个暴露组均配制一份受试物溶液；
f.观察计算：向各暴露组内秀丽隐杆线虫卵液处滴入与之对应浓度的受试物溶液，向空白对照组内滴入同一浓度的无菌K-溶液，在20℃条件下暴露2小时后，将24孔细胞培养板置于生物洁净台上开盖吹15-20min，蒸发多余水分，之后将24孔细胞培养板置于20℃条件下培养，22h后使用肉眼或显微镜观察秀丽隐杆线虫运动至步骤c中固态NGM培养基上滴加菌液位置的数量，计算该处线虫数量与线虫总数之比，得到线虫通过率；
g.数值比较：将秀丽隐杆线虫的通过率数据作为纵坐标及受试物溶液浓度数据作为横坐标进行线性拟合，获得y＝ax+k形式的拟合方程式中a及k的数值，其中，x是受试物溶液浓度，y是秀丽隐杆线虫通过率，k是常数，a是系数，利用拟合方程式计算秀丽隐杆线虫通过率为50％：y＝0.5时受试物溶液浓度的数值，记为半数效应浓度：EC50，基于此EC50数值，比较不同受试物质的发育毒性强弱，EC50数值越低，发育毒性越强。
上述方案中：所述步骤a中，向菌液中逐次加入2mL无菌钾溶液稀释，直至菌液中细菌总量为109至1010个/mL。
上述方案中：所述步骤b中，向秀丽隐杆线虫卵中逐次加入2mL无菌钾溶液稀释，直至秀丽隐杆线虫卵液所含秀丽隐杆线虫得浓度为10-12枚/μL。
上述方案中：所述步骤f中先用无菌吸水纸在孔板最深处吸取固态NGM培养基上的多余水分，再将其置于生物洁净台上。
本发明有益的技术效果在于：
(1)本发明配制有特定坡度的NGM培养基，在其一侧将秀丽隐杆线虫卵在受试物质中暴露，利用秀丽隐杆线虫从虫卵到成虫的发育阶段对外界环境变化的敏感性，在另一侧采用大肠杆菌食物诱导线虫产生运动行为，以24孔细胞培养板作为主要暴露环境，使暴露与指标检测之间不需要进行转移，甚至不需要显微镜的辅助即可直接观察，采用肉眼直接观察食物侧线虫的有无及多少，即可快速、定性判断受试物质的发育毒性，且后续指标的检测用时在24h左右，缩短了后续指标的检测时间，随后的显微观察还可进一步定量判断受试物质的发育毒性；
(2)本发明配制了特定形状的培养基，利用同一培养基完成便于后续暴露与发育毒性检测，省略了传统方法中暴露环节与指标检测环节之间的转移步骤，极大地加快了发育毒性检测的便捷度。并且基于幼虫可辨识的大小，肉眼即可直接观察线虫的有无，便于快速、定性地判断受试物质发育毒性。另外，本发明也可以基于显微镜计数观察，进一步判断运动至有食物培养基一侧的线虫比例，即可定量判断受试物质的发育毒性。
(3)秀丽隐杆线虫在经过接近实际环境的有食物共存、低浓度的暴露能够为化学品受试物质发育毒性的评价与管理提供更为合理、更加接近实际环境暴露情形的数据基础，进而为评价生态风险提供更加可靠的数据。
附图说明
图1为本发明特制NGM培养基形状与受试物质对秀丽隐杆线虫发育毒性结果示意图；
图2为氯化钙(mol/L)对秀丽隐杆线虫发育毒性检测结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例：
本实施例利用秀丽隐杆线虫检测氯化钙发育毒性的方法包括如下步骤：
a.制备菌液：采用大肠杆菌液体培养基在37℃、200rpm条件下将尿嘧啶缺陷型大肠杆菌(即E.coli OP50)培养24h，混匀后倒入已灭菌的15mL离心管中，4000rpm离心5min，弃上清液，保留沉于底部的菌体，加入8mL无菌钾溶液混匀，以24孔板为容器、以酶联免疫检测仪为检测仪器，测定每300μL该混合液在570nm处的吸光度，若吸光度值小于1.1或大于1.3，则将混合液重新离心，弃上清液，保留沉于底部的菌体，加入6mL或10mL无菌钾溶液混匀，再次测定混合液在570nm处的吸光度，通过减少或增加无菌钾溶液的体积将吸光度值调整至1.1与1.3之间，此时E.coli OP50的总量为109至1010个/mL，该数量条件下的菌个数能够为步骤b所得秀丽隐杆线虫虫卵的正常生长发育提供足够的食物，标记为大肠杆菌菌液，待用；
b.制备秀丽隐杆线虫卵液：按照传统秀丽隐杆线虫培养方法，采用NGM培养基(线虫培养基)培养秀丽隐杆线虫卵，在20℃条件下将秀丽隐杆线虫卵培养36小时后，用2mL无菌水将NGM表面的秀丽隐杆线虫卵冲洗至15mL具刻度的离心管中，静置30分钟，去除上清液至虫液1.5mL，根据传统同步化方法，按照虫卵液:次氯酸钠裂解液为1:7的体积比，将次氯酸钠裂解液加入离心管中，混合摇匀，反应20分钟，每5分钟摇匀一次，裂解母体，留下对次氯酸钠裂解液有抵抗能力的虫卵，2500rpm离心3分钟，弃上清液；再加入无菌水至离心前相同的刻度，摇匀，2500rpm离心3分钟，弃上清液；重复该操作两次，然后向离心管中加入10mL按照传统配方获得的无菌钾溶液后混匀；采用体视镜观察40μL混合液的虫卵数量，若虫卵数量多于500枚，则向离心管中再加入2mL无菌钾溶液再混匀、观察；若虫卵数量少于300枚，则静置沉淀10分钟，去除2mL上清液再混匀、观察，直至将虫卵浓度稀释为每40μL含有400枚虫卵为止，该密度能够不影响虫卵的正常孵化，标记为秀丽隐杆线虫卵液，待用；
大肠杆菌液体培养基即LB(Luria Bertani)培养基，NGM(Nematode GrowthMedium)培养基即线虫生长培养基；
上述大肠杆菌液体培养基、NGM培养基、无菌钾溶液和次氯酸钠裂解液的制备方法如下：
①根据《分子克隆试验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔等)配制LB培养基(1L)：10g胰蛋白胨、5g酵母浸膏、10g氯化钠，用1mol/L NaOH溶液将pH值调为7.0，在121℃、0.105MPa灭菌20min。另：配制1mol/L NaOH溶液(100mL)：4g氢氧化钠，100mL水。
②根据S.Brenner在1974年Genetics刊物上发表的论文(The genetics ofCaenorhabditis elegans)配制NGM固体培养基(1L)：17g琼脂粉、2.5g蛋白胨、3g氯化钠、25mL pH＝6.0的K2HPO4-KH2PO4溶液；121℃、0.105MPa高压灭菌20min，冷却至50℃左右时，加入经抽滤灭菌处理过的1mol/L MgSO4、1mol/LCaCl2、5mg/mL胆固醇/乙醇溶液各1mL，混合均匀后倒入灭菌后的培养皿中，静置冷却至室温凝固后，待接种。另：配制1mol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲液(pH＝6.0，150mL)：11.4g K2HPO4·3H2O，50mL蒸馏水；6.8g KH2PO4，50mL蒸馏水；按前者比后者为2:1比例配成pH＝6.0的缓冲液。配制胆固醇溶液(100mL)：0.5g胆固醇，100mL无水乙醇溶解；抽滤灭菌。配制1mol/L MgSO4(100mL)：24.6g MgSO4·7H2O，100mL蒸馏水；抽滤灭菌。配制1mol/L CaCl2：11.1g CaCl2，100mL蒸馏水；抽滤灭菌。抽滤除菌：用无菌Φ13mm孔径0.45μm的硝酸纤维素膜过滤菌类。将滤膜装在高温灭菌处理过的容量为5mL的玻璃注射器靠针管处，将待过滤的液体装入注射器，推压注射器活塞杆，压出液膜的溶液即抽滤除菌后的溶液。
③根据P.L.Williams等人在1990年Environmental Toxicology and Chemistry刊物上发表的论文(Aquatic toxicity testing using the nematode,Caenorhabditiselegans)配制钾溶液(1L)：3.00g NaCl，2.36g KCl；在121℃、0.105MPa灭菌20min。
④根据S.W.Emmons等人在1979年在Proceedings of the National Academy ofSciences刊物上发表的论文(An analysis of the constancy of DNA sequences duringdevelopment and evolution of the nematode Caenorhabditis elegans)配制次氯酸钠裂解液(30mL)：5mL NaOCl溶液(有效成分6％)，0.6g NaOH，25mL蒸馏水。根据需要的量现用现配。将大肠杆菌OP50(E.coli OP50)接种至灭菌后恢复至室温的LB培养基中，37℃培养24h即可使用。将培养好的OP50接种至NGM培养基上，37℃培养24h即可使用；将秀丽隐杆线虫接种至该NGM培养基上，20℃常规培养，本发明所用秀丽隐杆线虫以及E.coli OP50均由复旦大学发育生物学研究所惠赠；
c.制备培养基：采用无菌透明24孔板制备培养基，采用1×1×2cm的木块将24孔板左侧垫高至1cm，使24孔板形成15°左高右低的斜坡，每个孔板加入750μL的液态NGM培养基并冷凝形成固态NGM培养基，水平放置时该固态NGM培养基呈左薄右厚的分布；采用1×1×2cm的木块将孔板左侧垫高至2cm，使其形成20°左高右低的坡度，然后在固态NGM培养基右侧低处用直径约0.5cm的平头杵棒盖印一滴步骤a的大肠杆菌菌液，保持坡度不变将24孔板置于37℃培养箱放置12h，在固态NGM培养基右侧形成固定的大肠杆菌菌落，将该24孔板水平放置，开盖置于紫外灯下灭菌15分钟，将大肠杆菌灭活，待用；
d.分组：将24孔板划分为4行、6列，每列作为一组，选取其中1组作为空白对照组，其余5组作为暴露组；
e.配制受试物溶液：采用无菌钾溶液稀释受试物质得到氯化钙溶液，对应5个暴露组配制5份氯化钙溶液，浓度分别为：0.02mol/L、0.04mol/L、0.06mol/L、0.08mol/L和0.10mol/L；
f.观察计算：向5个暴露组的固态NGM培养基左侧低处滴加与其对应浓度的50uL氯化钙溶液，向空白对照组内滴入同一浓度的无菌K-溶液(蛋白酶K溶液)；在20℃条件下暴露2小时后，在孔板上方放置一块无菌吸纸，向左侧竖立孔板以吸走多余可流动水分，在生物洁净台上开盖吹15分钟，以蒸发虫液中的多余水分，将24孔板置于20℃条件下培养并开始计时；计时22h后，采用肉眼观察24孔板各孔中秀丽隐杆线虫的运动情况，以此结果即可快速、定性判断受试物质的发育毒性；基于显微镜计数观察，可进一步判断运动至有食物培养基一侧的线虫比例即通过率，即可定量判断受试物质的发育毒性，通过率的计算方法为：
Figure BDA0002259149870000081
秀丽隐杆线虫卵不具有运动能力，孵化成幼虫后具有运动与觅食能力，本发明配制特定坡度的NGM培养基，在其一侧将秀丽隐杆线虫虫卵在受试物质暴露2h小时，在另一侧采用食物诱导线虫产生运动行为，采用肉眼直接观察食物侧线虫的有无与多少，即可快速、定性判断受试物质的发育毒性，随后的显微观察可进一步定量判断受试物质的发育毒性，本发明配制了特定坡度的NGM培养基，利用同一培养基完成暴露与发育毒性检测，省略了传统方法中暴露环节与指标检测环节之间的转移步骤，极大地加快了发育毒性检测的便捷度；确定了发育毒性检测环节中虫卵起始浓度、食物投加浓度等条件，便于归一化检测条件进行多物质发育毒性的直接比较。
g.数值比较：以氯化钙浓度数据为横坐标，以秀丽隐杆线虫的通过率数据为纵坐标，进行线性拟合、获得y＝ax+k的拟合方程式中a及k的数值，其中，x是受试物溶液浓度，y是秀丽隐杆线虫通过率，k是常数，a是系数，得到的拟合曲线方程为y＝-7.8429x+0.9305，结果如图2所示。从图2可以看到秀丽隐杆线虫通过率数据与氯化钙溶液浓度数据具有较强的线性关系，测试结果具有较高的准确性和可靠性。利用该拟合方程式计算秀丽隐杆线虫通过率为50％：y＝0.5时受试物溶液浓度的数值，记为半数效应浓度：EC50，基于此EC50数值，比较不同受试物质的发育毒性强弱，EC50数值越低，发育毒性越强。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，对于本领域的普通技术人员而言，在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (4)

1.一种利用秀丽隐杆线虫检测发育毒性的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
a.制备菌液：利用培养基培养尿嘧啶缺陷型大肠杆菌，获得菌体后与无菌钾溶液混合，得到特定浓度的菌液；
b.制备秀丽隐杆线虫卵液：采用同步化方法制备秀丽隐杆线虫卵，向秀丽隐杆线虫卵中加入无菌钾溶液稀释，得到特定浓度的卵液；
c.制备培养基：采用24孔细胞培养板制备培养基并使24孔细胞培养板与水平面的夹角呈12°-15°放置，以此形成24孔细胞培养板中孔底面的倾斜状态，向24孔细胞培养板的各孔中加入液态NGM培养基，待液态NGM培养基冷凝后，得到具有坡度的多个固态NGM培养基；将24孔细胞培养板与水平面的夹角呈18°-20°放置，在各固态NGM培养基的最高处滴加步骤a得到的菌液，保持24孔细胞培养板的角度不变将其置于培养箱内放置12-24h，之后取出24孔细胞培养板，对菌液中的尿嘧啶缺陷型大肠杆菌进行灭活处理；
d.分组：将步骤c中的24孔细胞培养板水平放置，在各固态NGM培养基的最低处滴加步骤b制备的秀丽隐杆线虫卵液，以24孔细胞培养板每一列中的全部固态NGM培养基作为一组，选取其中一组作为空白对照组，其余五组作为暴露组；
e.配制受试物溶液：采用无菌钾溶液稀释受试物质得到受试物溶液，对应每个暴露组均配制一份受试物溶液；
f.观察计算：向各暴露组内秀丽隐杆线虫卵液处滴入与之对应浓度的受试物溶液，向空白对照组内滴入同一浓度的无菌K-溶液，在20℃条件下暴露2小时后，将24孔细胞培养板置于生物洁净台上开盖吹15-20min，蒸发多余水分，之后将24孔细胞培养板置于20℃条件下培养，22h后使用肉眼或显微镜观察秀丽隐杆线虫运动至步骤c中固态NGM培养基上滴加菌液位置的数量，计算该处线虫数量与线虫总数之比，得到线虫通过率；
g.数值比较：将秀丽隐杆线虫的通过率数据作为纵坐标及受试物溶液浓度数据作为横坐标进行线性拟合，获得y＝ax+k形式的拟合方程式中a及k的数值，其中，x是受试物溶液浓度，y是秀丽隐杆线虫通过率，k是常数，a是系数，利用拟合方程式计算秀丽隐杆线虫通过率为50％：y＝0.5时受试物溶液浓度的数值，记为半数效应浓度：EC50，基于此EC50数值，比较不同受试物质的发育毒性强弱，EC50数值越低，发育毒性越强。
2.根据权利要求1所述的一种利用秀丽隐杆线虫检测发育毒性的方法，所述步骤a中，向菌液中逐次加入2mL无菌钾溶液稀释，直至菌液中细菌总量为109至1010个/mL。
3.根据权利要求1所述的一种利用秀丽隐杆线虫检测发育毒性的方法，所述步骤b中，向秀丽隐杆线虫卵中逐次加入2mL无菌钾溶液稀释，直至秀丽隐杆线虫卵液所含秀丽隐杆线虫得浓度为10-12枚/μL。
4.根据权利要求1所述的一种利用秀丽隐杆线虫检测发育毒性的方法，所述步骤f中先用无菌吸水纸在孔板最深处吸取固态NGM培养基上的多余水分，再将其置于生物洁净台上。
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毕晶晶 等: ""利用秀丽线虫开展毒性鉴别评价技术研究"", 《环境科学与技术》 *

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