CN101451983B - 用秀丽线虫测定药品与个人护理品的世代毒性的方法 - Google Patents
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Abstract
用秀丽线虫测定药品与个人护理品的世代毒性的方法，涉及一种用秀丽线虫对药品与个人护理品类物质(PPCPs)的世代毒性测试方法。在已同步化的秀丽线虫对PPCPs不同浓度梯度和暴露时间的染毒后，对亲代(P0)、子一代(F1)和子二代(F2)的秀丽线虫的寿命、孵化规模、世代时间、身体大小、身体弯曲频率、逆向运动以及嗅觉刺激等指标进行检测，并对结果进行比较。这些指标从不同的侧面表征了PPCPs的毒性效应，以此评价其世代毒性。本发明操作、存放方便，仪器少，在暴露剂量和暴露时间两个层面上为真实环境中的PPCPs毒性的检测与预测提供指导，也能为PPCPs的生产过程、突发事件处理的实效判断、新型PPCPs的生态风险等提供快速的评价途径。
Description
技术领域
用秀丽线虫测定药品与个人护理品的世代毒性的方法，涉及一种用秀丽线虫测定药品与个人护理品类物质(PPCPs)的世代毒性的方法。属于环境保护、生态风险评价等技术领域。
背景技术
秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)属于线形动物门、线虫纲动物，生活在世界各地的泥土中，以细菌为食，容易人工养殖，对人、动物和植物没有危害，非寄生，安全性高。它能感知气味和味道，对光线、温度有反应。秀丽线虫基因组全序列测定在1998年底完成，是第一个已知基因组全序列的多细胞动物。现在，已知的线虫基因组有97Mbp，相当于人类基因组的1/30。该模式生物具有生命周期短、体积小、容易培养等诸多优点，易于在试验室中进行培养。另外，秀丽线虫对外界环境的变化非常敏感，环境胁迫会改变它们的生殖速度、生命周期以及其他发育特性。无论是利用胚胎发育来检测毒物的毒性试验，还是在分子生物学水平对毒物进行分析，秀丽线虫都是比较可靠而有效的模式生物。秀丽线虫是国内外研究的模式生物中最为简单、遗传与发育背景了解最清楚的物种之一，已经在2002年和2006年获得诺贝尔生理学/医学奖，2008年获得诺贝尔化学奖，这么短的时间获得三次诺贝奖，已经充分证明了秀丽线虫研究的优势，也充分奠定了秀丽线虫丰厚的基础数据。
采用秀丽线虫作为毒性测试模式动物是很普遍的现象，诸多文献所采用的方法均采用行为学的指标相似，而且对行为学指标的界定已经非常明确，但是对于世代毒性的检测并没有非常明确，而且尚无文章提出对药品和个人护理品类物质(PPCPs)采用线虫进行毒性测试的方法研究。
已经有很多文献报道，药品与个人护理品类物质(PPCPs)在全球环境中普遍存在，无论是饮用水源、瓶装饮用水，还是污水处理厂的出水、普通江河湖泊里的水均有检出。鉴于药品等物质能够增强环境中微生物对药品的抗性作用以及药品等物质能够随着食物链等途径对人体发挥预想不到的作用，确定PPCPs的毒性以及致毒机理至关重要。普通的急性毒性测试方法，虽然具有快速的优点，但是由于其浓度的选择均明显高于环境中检出的PPCPs的浓度而无法判断真实环境中的PPCPs产生的毒性效应，从而无法判断真实环境中的PPCPs所产生的生态风险。而普通的慢性毒性，所检测的是PPCPs在其所选受试生物(比如小白鼠等)生命期内某段时间所产生的毒性效应，无法表征PPCPs对生物、生物子代及其子代的子代等的长期作用的毒性效应。
发明内容
本发明的目的在于提供一种方便快捷、成本低廉、操作简单的用秀丽线虫测定药品与个人护理品的世代毒性的方法。
为了达到上述目的，本发明充分利用秀丽线虫已有的丰厚的基础数据，在急性毒性和传统的慢性毒性测试方法的基础上进行进一步的研究，通过检测PPCPs对秀丽线虫产生的世代毒性，能够测定待测PPCPs在很低的浓度条件产生的毒性效果，并且能够判断得出该效果是否能够传递给下一代，而且通过检测指标可以判断毒性效果的产生是基于对何种器官的刺激而引起的，以及对不同的器官产生毒性作用的相对顺序，从而初步判断致毒机理。具体包括如下步骤：
A，卵液的制备：将秀丽线虫放在接种有大肠杆菌OP50(OP50 E.coli)的NGM固体培养基上，23℃培养三天后用M9溶液冲洗得到含有秀丽线虫虫体的NGM固体培养基得到虫液，将虫液转移至离心管中，静置30min，用移液枪移去上清液，按照虫液∶clorox溶液＝1∶7体积比，将clorox溶液加入虫液中，混合摇匀，反应20min，每五分钟摇匀一次，杀死母体，留下对clorox溶液有抵抗能力的虫卵，2500rpm离心3min，弃上清液，再加入M9溶液至离心前相同的刻度，摇匀，2500rpm离心3min，弃上清液，重复该操作两次，然后向离心管内加入M9溶液，摇匀，标记为卵液，待用；
B，同步化虫液的获得
向依照传统方法配置但并没有接种OP50 E.coli的NGM固体培养基上接种上述A步的卵液200μL，培养1-2天至秀丽线虫四次蜕皮后，其生长状态相对同步化。与NGM固体培养基配方相同，不使用琼脂粉，配置NGM培养液，用于冲洗固体培养基，将得到的含有秀丽线虫的溶液转移至已灭菌的离心管中，溶液中虫浓度很高时需要稀释，直至每100μL溶液中有10±1只秀丽线虫，标记为“虫液”，待用。
若NGM培养液能够使待测PPCPs的澄清溶液变浑浊，则使用M9溶液代替本步骤的NGM培养液。
C，用于测定半数致死浓度(LC50)的待测PPCPs样品的制备
先确定待测PPCPs的溶解性及溶剂：若PPCPs溶于水，则采用去离子水；若PPCPs不溶于水，则采用体积百分浓度为1％的二甲亚砜(DMSO)作为溶剂。在待测PPCPs溶解度的浓度以下根据等对数间距的原则配置十一个浓度梯度的PPCPs，采用与待测PPCPs溶剂相同的溶液作为空白对照，得到不同浓度的样品十二组，每组八个平行，共计96个样品，待测。
D，样品与虫液的混合
将C步骤获得的十二组不同浓度、每组八个平行，共计96个样品加入96孔板中，样品的使用量均为100μL；向96个样品中加入虫液100μL。96孔板中每一孔的混合液中合计有：200μL的液体和10±1只秀丽线虫。
E，半数致死浓度(LC50)的测定
采用体视显微镜对步骤D操作后的96孔板中的秀丽线虫进行观察，每4小时(4h)观测一次，虫体僵直则认定其死亡，记录死亡数目，直至空白对照组的秀丽线虫出现幼虫/卵为止。以浓度对数为横坐标，死亡率为纵坐标，采用直线内插法获得半数致死浓度(LC50)。
若所设定的浓度梯度没有同时包含死亡率大于50％与死亡率小于50％的效应，则根据情况调整待测PPCPs的浓度梯度：若所设定的浓度梯度所产生的死亡率均小于50％，则保持待测PPCPs样品空白对照组之外的最低浓度不变，适当增加所采用的等对数间距，设定较高的浓度梯度；若所设定的浓度梯度所产生的死亡率均大于50％，则保持待测PPCPs样品的最高浓度不变，适当增加所采用的等对数间距，设定较低的浓度梯度。然后重复步骤A、B、D、E，直至获得半数致死浓度(LC50)。其特征是：
F，用于测定世代毒性的待测PPCPs样品的制备
在步骤E获得的半数致死浓度(LC50)以下，根据等对数间距的原则设定十一个浓度梯度，采用与待测PPCPs溶剂相同的溶液作为空白对照，得到不同浓度的样品十二组，每组设有8个平行，共计96个样品，待测。
G，重复步骤A、B，获得同步化的虫液，10±1只/100μL，并将该虫液标记为亲代，待用。
H，待测PPCPs对亲代的毒性结果的测定
将步骤F获得的十二组不同浓度、每组8个平行，共计96个样品加入96孔板，样品的使用量均为100μL；向96个样品中加入100μL由步骤G获得的亲代虫液。96孔板中每一孔的混合液中合计有：200μL的液体、10±1只秀丽线虫。
暴露4h后，用移液枪移取十二组浓度中每一组浓度的八个平行中的四个样品，置于同一个离心管中，即每一组浓度收集一份混合液，该平板共收集对应于十二组浓度的十二个离心管。考虑到水分蒸发和移液枪无法完全吸取的原因，每一个离心管的混合液为500-700μL。向离心管中加入4mLM9溶液，摇匀后静置10min，去上清，再次加入4mLM9溶液，摇匀后静置10min，去上清。加入适量M9溶液，以使秀丽线虫保持5±1只/50μL。23℃下，采用体视显微镜对亲代(P0)进行如下指标的测定：寿命测定，孵化规模及世代时间测定；身体大小测定，身体弯曲频率测定，逆向运动检测，嗅觉刺激测定。
寿命与孵化规模和世代时间同时测定，嗅觉刺激与身体大小、身体弯曲频率、逆向运动同时测定，以简化操作。
采用待测PPCPs的浓度对数作为横坐标，采用上述指标作为纵坐标，获得秀丽线虫相应的指标在不同的PPCPs浓度下暴露4h所受到的毒性结果，记录为“待测PPCPs对P0的毒性结果(4h)”。
I，待测PPCPs对P0的子一代(F1)的毒性结果的测定
在对亲代(P0)进行步骤H时，每一个浓度系列(共八孔)的剩余部分(四孔)也停止对待测PPCPs的暴露。用移液枪将虫液从96孔板中取出，一个浓度系列的虫液置于一个有OP50 E.coli生长的NGM培养基上，每一个暴露时间的96孔板上的12个浓度对应着12个培养皿。重复步骤A，获得亲代(P0)不同浓度组对应的“卵液”；重复步骤B，获得子一代(F1)的“虫液”，重复步骤H，获得“待测PPCPs对F1的毒性结果(4h)”。
J，待测PPCPs对P0的子二代(F2)的毒性结果的测定
在对子一代(F1)进行步骤H时，每一个浓度系列(共八孔)的剩余部分(四孔)也停止对待测PPCPs的暴露。用移液枪将秀丽线虫从96孔板中取出，一个浓度系列的秀丽线虫置于一个有OP50 E.coli生长的NGM培养基上，每一个暴露时间的96孔板上的12个浓度对应着12个培养皿。重复步骤A，获得子一代(F1)不同浓度组对应的“卵液”；重复步骤B，获得子二代(F2)的“虫液”，重复步骤H，获得“待测PPCPs对F2的毒性结果(4h)”。
K，待测PPCPs暴露不同时间的世代毒性测定
将暴露时间修改为8h，重复步骤H、I、J，获得8h待测PPCPs对亲代的毒性结果和待测PPCPs对子一代的毒性结果以及待测PPCPs对子二代的毒性结果；依照上述步骤，将暴露时间修改为12h、16h、20h、24h，共获得12h待测PPCPs对亲代、子一代和子二代的毒性结果；16h待测PPCPs对亲代、子一代和子二代的毒性结果；20h待测PPCPs对亲代、子一代和子二代的毒性结果；24h待测PPCPs对亲代、子一代和子二代的毒性结果；
L，世代毒性的评价
采用软件Origin 7.5对数据进行显著性分析：将同一个暴露时间下获得的待测PPCPs对秀丽线虫亲代(P0)、子一代(F1)和子二代(F2)的同一个指标的三个毒性结果输入数据列表，在statistics下打开anova的下拉按钮中的one-way anova，从候选列表中将“P0”与“F1”的数据选择，并将“显著性参数”设定为0.05，进行计算。若计算结果显示为“At the 0.05 level，the populationmeans are not significantly different.”则说明所测PPCPs对亲代与子一代的该指标的毒性效果之间没有显著差异；若结果显示为“At the 0.05 level，thepopulation means are significantly different.”则说明所测PPCPs对亲代与子一代的该指标的毒性效果之间具有显著差异。对“F1”与“F2”之间的数据进行相同的分析，就可以获得所测PPCPs对子一代与子二代的毒性效果之间是否具有显著差异。结论：若PPCPs的毒性效果在“P0与F1”和“F1与F2”两个比较中均得到“显著差异”的结果，说明所测PPCPs对该指标具有明确的世代毒性，并且其毒性效果随着世代增加而增强；若前者比较结果为“非显著差异”而后者比较结果为“显著差异”，说明PPCPs对该指标具有世代毒性，但是其世代毒性需要长期的作用才能够显现出来；若前者比较结果为“显著差异”而后者比较结果为“非显著差异”或者两个比较中均为“非显著差异”，则说明所测PPCPs对该指标不具有世代毒性。
对其它的指标通过相同的步骤进行“显著性分析”，即可获得所测PPCPs对哪些指标具有世代毒性。
在不同的暴露时间下获得的待测PPCPs对亲代、子一代和子二代的同一个指标的毒性效果的数据，采用同样的“显著性分析”的方法，可以用于进一步佐证“PPCPs对秀丽线虫该指标的毒性是否随着暴露时间的增加而具有更强的世代毒性”。
本发明的效果和优点是：
1.与以往的慢性毒性试验相比，指标更全面，不仅应用了对秀丽线虫身体的直接影响，还有对其神经、肌肉以及嗅觉的影响等，而且秀丽线虫具有丰厚的基础数据可以进行比对；而且它还具有更易培养、占据空间小，便于操作、便于存放；该方法中的秀丽线虫敏感性高、对仪器要求少(体视显微镜)；同时，相较于生命期较长的暴露时间所产生的毒性效应还能够用于判断毒性产生作用的顺序及机理，并且有利于指导下一步致毒机理研究的方向。
2.不同浓度的PPCPs在不同的暴露时间里所产生的不同的时代毒性的比较，能够获得在秀丽线虫暴露于不同的时间后所遭受到的世代毒性的强弱。从而在暴露剂量和暴露时间两个层面上为真实环境中的PPCPs毒性的检测与预测提供指导，也能够为PPCPs相关的生产过程、突发事件后续处理方法的实效判断、新型PPCPs的生态风险等等内容，提供快速的评价途径。
具体实施方式
实施例1
首先，进行毒性测试所用的材料和器具准备：体视显微镜(包含成像系统)，96孔板(无菌)，离心管(灭菌)，移液枪(含灭菌的枪头)，培养皿(灭菌)，铂丝等；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钠、胰蛋白胨、蛋白胨、琼脂粉、胆固醇、硫酸镁、氯化钙、次氯酸钠(溶液)、酵母浸膏。然后配制LB(Luria Bertani)培养基、NGM(Nematode Growth Medium)固体培养基、M9溶液和Clorox溶液。LB培养基的配方(1L)是：10g胰蛋白胨、5g酵母浸膏、10g氯化钠，用1mol/L氢氧化钠溶液将pH值调为7.0，在121℃、0.105MPa灭菌20min。NGM固体培养基的配方(1L)：17g琼脂粉、2.5g蛋白胨、3g氯化钠、25mLpH＝6.0的K2HP04-KH2PO4溶液，121℃、0.105MPa高压灭菌20min，冷却至50℃左右时，加入经抽滤灭菌处理过的1mol/LMgSO4、1mol/LCaCl2、5mg/mL胆固醇乙醇溶液各1mL，混合均匀后倒入灭菌后的培养皿中，静置冷却至室温凝固后，待接种。
①配制1mol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液(pH＝6.0)：11.4g(K2HPO4·3H2O)+50mL蒸馏水；6.8g KH2PO4+50mL蒸馏水；按2∶1比例配成pH＝6.0的缓冲液。
②配制1mL胆固醇溶液(5mg/mL乙醇)：0.025g胆固醇+5mL无水乙醇溶解。
③配制1mol/L MgSO4：1.232g(MgSO4·7H2O)+5mL蒸馏水；配制1mol/LCaCl21mL：0.554g+5mL蒸馏水。
④抽滤除菌：用无菌Φ13mm孔径0.45μm的硝酸纤维素膜过滤菌类。将滤膜装在高温灭菌处理过的容量为5mL的玻璃注射器靠针管处，将待过滤的液体装入注射器，推压注射器活塞杆，压出液膜的溶液即抽滤除菌后的溶液。
配制NGM培养液：配方除了不使用琼脂粉之外，其余的与NGM固体培养基配置方法相同。121℃、0.105MPa灭菌20min。
M9溶液配方(1L)：15.12g Na2HPO4·12H2O(或6g Na2HPO4)，3g KH2PO4，5g NaCl，0.25g MgSO4·7H2O。121℃、0.105MPa灭菌20min。
clorox溶液：含有1％体积的NaOCl，0.5mol/L的NaOH。根据需要的量现用现配。
将大肠杆菌OP50(OP 50 E.coli)接种至灭菌后恢复至室温的LB培养基中，37℃培养24h，待用。将培养好的OP50 E.coli接种至NGM培养基上，37℃培养24h，待用。将线虫接种至有OP50 E.coli的NGM培养基上，23℃常规培养。
待测PPCPs的世代毒性测定的具体步骤：
A，“卵液”的制备：采用NGM培养基、大肠杆菌OP50(OP50 E.coli)作为食物，23℃培养秀丽线虫。本发明所用秀丽线虫由复旦大学发育生物学研究所惠赠。应用范围：本方法适用于无挥发性或者挥发性较弱的可溶于水或者DMSO的药品及个人护理品类物质(简称PPCPs)的世代毒性测试。
三天后，采用2mL的M9溶液冲洗培养皿表面，将含有虫体的M9溶液转移至15mL的离心管，静置30min，用移液枪移去上清液。按照1∶7(虫液∶clorox溶液)的体积比例，加入clorox溶液，混合摇匀，反应20min，每五分钟摇匀一次，杀死母体，保留对clorox溶液有抵抗能力的虫卵。平衡离心管之间的重量之后，2500rpm离心3min，弃上清液。加入M9溶液至相同刻度，摇匀，2500rpm离心3min，弃上清液；重复该操作两次。然后向离心管内加入2mL M9溶液，摇匀，标记为“卵液”，待用。
B，同步化“虫液”的获得
向依照传统方法配置但并没有接种OP50的NGM固体培养基上接种上述A步骤获得的“卵液”200μL，培养1-2天至秀丽线虫四次蜕皮后(L4期)，其生长状态相对同步化。参照NGM固体培养基的配方，不使用琼脂粉，配置NGM培养液，用于冲洗培养基表面，将含有秀丽线虫的溶液转移至已灭菌的离心管中，虫液浓度很高时需要稀释，直至每100μL溶液中有10±1只秀丽线虫，标记为“虫液”，待用。
若NGM培养液能够使待测PPCPs的澄清溶液变浑浊，则使用M9溶液代替本步骤的NGM培养液。
C，用于测定半数致死浓度(LC50)的待测PPCPs样品的制备
先确定待测PPCPs的溶解性及溶剂：若PPCPs溶于水，则采用去离子水；若PPCPs不溶于水，则采用体积百分浓度1％的二甲亚砜(DMSO)作为溶剂。在待测PPCPs溶解度的浓度以下根据等对数间距的原则配置十一个浓度梯度的PPCPs，采用与待测PPCPs溶剂相同的溶液作为空白对照，得到不同浓度的样品十二组，每组八个平行，共计96个样品，待测。
D，样品与“虫液”的混合
将C步骤获得的十二组不同浓度、每组八个平行，共计96个样品加入96孔板中，样品的使用量均为100μL；向96个样品中加入“虫液”100μL。96孔板中每一孔的混合液中合计有：200μL的液体、10±1只秀丽线虫。
E，半数致死浓度(LC50)的测定
采用体视显微镜对步骤D操作后的96孔板中的秀丽线虫进行观察，每4小时(4h)观测一次，虫体僵直则认定其死亡，记录死亡数目，直至空白对照组的秀丽线虫出现幼虫/卵为止。以浓度对数为横坐标，死亡率为纵坐标，采用直线内插法获得半数致死浓度(LC50)。
若所设定的浓度梯度没有同时包含死亡率大于50％与死亡率小于50％的效应，则根据情况调整待测PPCPs的浓度梯度：若所设定的浓度梯度所产生的死亡率均小于50％，则保持待测PPCPs样品空白对照组之外的最低浓度不变，适当增加所采用的等对数间距，设定较高的浓度梯度；若所设定的浓度梯度所产生的死亡率均大于50％，则保持待测PPCPs样品的最高浓度不变，适当增加所采用的等对数间距，设定较低的浓度梯度。然后重复步骤A、B、D、E，直至获得半数致死浓度(LC50)。
F，用于测定世代毒性的待测PPCPs样品的制备
在步骤E获得的半数致死浓度(LC50)以下，根据等对数间距的原则设定十一个浓度梯度，采用与待测PPCPs溶剂相同的溶液作为空白对照，得到不同浓度的样品十二组，每组设有8个平行，共计96个样品，待测。
G，重复步骤A、B，获得同步化的“虫液”，10±1只/100μL，并将该虫液标记为P0，待用。
H，待测PPCPs对P0的毒性结果的测定
将步骤F获得的十二组不同浓度、每组8个平行，共计96个样品加入96孔板，样品的使用量均为100μL；向96个样品中加入100μL由步骤G获得的虫液“P0”。96孔板中每一孔的混合液中合计有：200μL的液体、10±1只秀丽线虫。
暴露4h后，用移液枪移取十二组浓度中每一组浓度的八个平行中的四个样品，置于同一个15mL离心管中，即每一组浓度收集一份混合液，该平板共收集对应于十二组浓度的十二个15mL离心管。考虑到水分蒸发和移液枪无法完全吸取的原因，每一个离心管的混合液为500-700μL。向离心管中加入4mLM9溶液，摇匀后静置10min，去上清，再次加入4mLM9溶液，摇匀后静置10min，去上清。加入适量M9溶液，以使秀丽线虫保持5±1只/50μL。23℃室温下，采用体视显微镜对亲代(P0)进行如下指标的测定：寿命测定，孵化规模及世代时间测定；身体大小测定，身体弯曲频率测定，逆向运动检测，嗅觉刺激测定。
a，寿命、孵化规模和世代时间测定：
将秀丽线虫置于NGM培养基上(平均每个培养基上有5个左右的L4期的线虫)，此时记为T0，培养皿在23℃培养，在孵化期，每隔1.5天就将成年秀丽线虫转接到新的NGM培养基上；在第二天计数原培养基上孵化出的秀丽线虫数。在孵化期之后，每隔四天将成年秀丽线虫转移到新的培养基上。
如果反复的触碰刺激其尾端而秀丽线虫没有反应，那么就认定其死亡，记为T1，T1与T0之间的时间间隔即为秀丽线虫的寿命。由于偶然因素导致的线虫的损失，比如线虫爬离培养基或者在培养皿侧壁干燥致死，不计入分析数据。
孵化规模，即每一只秀丽线虫所产生的后代数目。世代时间，即从亲代P0的卵出现到子一代F1的卵出现的时间间隔，以及从子一代F1的卵出现到子二代F2的卵出现的时间间隔，以及子二代F2的卵到其子代再次产卵之间的时间间隔。
重复10个培养皿以保证统计学可靠性。
b，嗅觉刺激对逆向运动的影响，同时进行身体大小、身体弯曲频率、逆向运动检测
将秀丽线虫置于没有OP50 E.coli的NGM培养基上，并且允许其自由爬行以脱离黏附的OP50 E.coli。然后将这些秀丽线虫转移到新的无OP50 E.coli的NGM培养基上，在其适应环境之后(约1分钟)，采用体视显微镜所带的成像软件对秀丽线虫进行3min的录像。
通过录像测定秀丽线虫的身体大小、身体弯曲频率、逆向运动检测以及嗅觉刺激。
秀丽线虫的身体大小采用其身体平滑表面的面积来表征。
身体弯曲的定义为：如果设定秀丽线虫的运动方向为x轴方向，则其咽后部球形部分在y轴方向上的运动方向的一次改变，即为一次身体弯曲。
逆向运动：任何从前向后的运动的改变就计数为一次逆向运动；“欧米伽转向”也作为逆向运动的一种。“欧米伽转向”指的是，线虫的身体通过头部向尾部的弯曲而完成180度的转弯而使得其运动方向反向的转向。5s内没有运动的线虫不作为分析对象(这样的线虫总是占极少数的)。
在线虫经过了3min的逆向运动检测之后，1μL的特定气味的物质被置于培养皿的上盖，上盖随后重新盖在培养皿上(如果有气味的物质为液体，则开盖3h，待上盖干燥后再将上盖盖好)，再次进行3min的逆向运动检测。
I，待测PPCPs对P0的子一代(F1)的毒性结果的测定
在对亲代(P0)进行步骤H时，每一个浓度系列(共八孔)的剩余部分(四孔)也停止对待测PPCPs的暴露。用移液枪将秀丽线虫从96孔板中取出，一个浓度系列的秀丽线虫置于一个有OP50 E.coli生长的NGM培养基上，每一个暴露时间的平板上的12个浓度对应着12个培养皿。重复步骤A，获得亲代(P0)不同浓度组对应的“卵液”；重复步骤B，获得子一代(F1)的“虫液”，重复步骤H，获得“待测PPCPs对F1的毒性结果(4h)”。
J，待测PPCPs对P0的子二代(F2)的毒性结果的测定
在对子一代(F1)进行步骤H时，每一个浓度系列(共八孔)的剩余部分(四孔)也停止对待测PPCPs的暴露。用移液枪将秀丽线虫从96孔板中取出，一个浓度系列的秀丽线虫置于一个有OP50 E.coli生长的NGM培养基上，每一个暴露时间的平板上的12个浓度对应着12个培养皿。重复步骤A，获得子一代(F1)不同浓度组对应的“卵液”；重复步骤B，获得子二代(F2)的“虫液”，重复步骤H，获得“待测PPCPs对F2的毒性结果(4h)”。
K，待测PPCPs暴露不同时间的世代毒性测定
将暴露时间修改为8h，重复步骤H、I、J，获得“待测PPCPs对P0的毒性结果(8h)”、“待测PPCPs对F1的毒性结果(8h)”、“待测PPCPs对F2的毒性结果(8h)”。
依照上述步骤，将暴露时间修改为12h、16h、20h、24h，共获得“待测PPCPs对P0的毒性结果(12h)”、“待测PPCPs对F1的毒性结果(12h)”、“待测PPCPs对F2的毒性结果(12h)”；“待测PPCPs对P0的毒性结果(16h)”、“待测PPCPs对F1的毒性结果(16h)”、“待测PPCPs对F2的毒性结果(16h)”；“待测PPCPs对P0的毒性结果(20h)”、“待测PPCPs对F1的毒性结果(20h)”、“待测PPCPs对F2的毒性结果(20h)”；“待测PPCPs对P0的毒性结果(24h)”、“待测PPCPs对F1的毒性结果(24h)”、“待测PPCPs对F2的毒性结果(24h)”。
L，世代毒性的评价
采用软件Origin 7.5对数据进行显著性分析：将同一个暴露时间下获得的待测PPCPs对秀丽线虫亲代(P0)、子一代(F1)和子二代(F2)的同一个指标的三个毒性结果输入数据列表，在statistics下打开anova的下拉按钮中的one-way anova，从候选列表中将“P0”与“F1”的数据选择，并将“显著性参数”设定为0.05，进行计算。若计算结果显示为“At the 0.05level，the populationmeans are not significantly different.”则说明所测PPCPs对亲代与子一代的该指标的毒性效果之间没有显著差异；若结果显示为“At the 0.05level，thepopulation means are significantly different.”则说明所测PPCPs对亲代与子一代的该指标的毒性效果之间具有显著差异。对“F1”与“F2”之间的数据进行相同的分析，就可以获得所测PPCPs对子一代与子二代的毒性效果之间是否具有显著差异。结论：若PPCPs的毒性效果在“P0与F1”和“F1与F2”两个比较中均得到“显著差异”的结果，说明所测PPCPs对该指标具有明确的世代毒性，并且其毒性效果随着世代增加而增强；若前者比较结果为“非显著差异”而后者比较结果为“显著差异”，说明PPCPs对该指标具有世代毒性，但是其世代毒性需要长期的作用才能够显现出来；若前者比较结果为“显著差异”而后者比较结果为“非显著差异”或者两个比较中均为“非显著差异”，则说明所测PPCPs对该指标不具有世代毒性。
对其它的指标通过相同的步骤进行“显著性分析”，即可获得所测PPCPs对哪些指标具有世代毒性。
在不同的暴露时间下获得的待测PPCPs对亲代、子一代和子二代的同一个指标的毒性效果的数据，采用同样的“显著性分析”的方法，可以用于进一步佐证“PPCPs对秀丽线虫该指标的毒性是否随着暴露时间的增加而具有更强的世代毒性”。
Claims (1)
1.用秀丽线虫测定药品与个人护理品类物质的世代毒性的方法，包括A，卵液的制备：将秀丽线虫放在接种有E.coli OP50的线虫生长固体培养基上，23℃培养三天后用根据传统方法配制并灭菌的M9溶液冲洗含有秀丽线虫虫体的线虫生长固体培养基得到虫液，将虫液转移至离心管中，静置30min，用移液枪移去上清液，依据传统方法配制次氯酸钠溶液，按照虫液∶次氯酸钠溶液＝1∶7体积比，将次氯酸钠溶液加入虫液中，混合摇匀，反应20min，每五分钟摇匀一次，杀死母体，留下对次氯酸钠溶液有抵抗能力的虫卵，2500rpm离心3min，弃上清液，再加入M9溶液至离心前相同的刻度，摇匀，2500rpm离心3min，弃上清液，重复该操作两次，然后向离心管内加入M9溶液，摇匀，标记为卵液，待用；B，同步化虫液的获得：将A步获得的卵液200μL接种到依照传统方法配制但并没有接种E.coli OP50的线虫生长固体培养基上，培养1-2天至秀丽线虫四次蜕皮，达到了生长状态相对同步化后，用线虫生长培养液冲洗培养基表面，将含有秀丽线虫的溶液转移至已灭菌的离心管中；含有秀丽线虫的溶液浓度很高时需要稀释，直至每100μL溶液中有10±1只秀丽线虫，标记为虫液，待用；上述线虫生长培养液是按照线虫生长固体培养基的配方，但不使用琼脂粉配置得到的，若线虫生长培养液能够使待测药品与个人护理品类物质的澄清溶液变浑浊，则使用M9溶液代替本步骤的线虫生长培养液；C，制备用于测定半数致死浓度的药品与个人护理品类物质样品：先确定待测药品与个人护理品类物质的溶解性及溶剂，若药品与个人护理品类物质溶于水，则采用去离子水；若药品与个人护理品类物质不溶于水，则采用体积百分浓度为1％的二甲亚砜作为溶剂，在待测药品与个人护理品类物质的饱和溶液的浓度以下、根据等对数间距的原则配置十一个浓度梯度的药品与个人护理品类物质样品，采用与待测药品与个人护理品类物质溶剂相同的溶液作为空白对照，得到不同浓度的药品与个人护理品类物质样品十二组，每组八个平行，共计96个样品；D，样品与虫液的混合：将C步获得的96个样品加入96孔板中，每个孔内的样品量均为100μL，再向96个已经有100μL样品的孔中各加入B步得到的虫液100μL；E，半数致死浓度的测定：采用体视显微镜对D步的96孔板中的秀丽线虫进行观察，每4小时观测一次，虫体僵直则认定其死亡，记录死亡数目，直至空白对照组的秀丽线虫出现幼虫/卵为止；以浓度对数为横坐标，死亡率为纵坐标，采用直线内插法获得半数致死浓度，简称LC50；若所设定浓度梯度所产生的死亡率均小于50％，则保持待测药品与个人护理品类物质样品空白对照组之外的最低浓度不变，适当增加所采用的等对数间距，设定较高的浓度梯度；若所设定的浓度梯度所产生的死亡率均大于50％，则保持待测药品与个人护理品类物质样品的最高浓度不变，适当增加所采用的等对数间距，设定较低的浓度梯度；然后重复步骤A、B、D、E，直至获得LC50，其特征是：
F，用于测定世代毒性的待测药品与个人护理品类物质样品的制备在步骤E获得的LC50以下，根据等对数间距的原则设定十一个浓度梯度，采用与待测药品与个人护理品类物质的溶剂相同的溶液作为空白对照，得到不同浓度的样品十二组，每组设有8个平行样品，共计96个样品，待测；
G，重复A步和B步，获得同步化的每100μL溶液中有10±1只秀丽线虫的虫液，待用；
H，待测药品与个人护理品类物质对亲代的毒性结果的测定
将步骤F获得的96个样品加入96孔板，加入量均为100μL；再向96个样品中加入100μL由步骤G获得的虫液，暴露4h后，用移液枪移取十二组浓度中每一组浓度的八个平行样品中的四个样品，置于同一个15mL离心管中，再向离心管中加入4mL M9溶液，摇匀后静置10min，去上清液，再次加入4mL M9溶液，摇匀后静置10min，再去除上清液，再加入适量M9溶液，使秀丽线虫保持5±1只/50μL，23℃室温下，采用体视显微镜对亲代进行如下指标的测定：寿命，孵化规模及世代时间，身体大小，身体弯曲频率，逆向运动，嗅觉刺激；其中，寿命、孵化规模和世代时间同时测定，嗅觉刺激、身体大小、身体弯曲频率和逆向运动同时测定，最后，采用待测药品与个人护理品类物质的浓度对数作为横坐标，采用上述指标测定结果作为纵坐标，获得秀丽线虫在不同的药品与个人护理品类物质浓度下暴露4h所受到的毒性结果，记录为4h待测药品与个人护理品类物质对亲代的毒性结果；
I，待测药品与个人护理品类物质对子一代的毒性结果的测定
将进行H步待测药品与个人护理品类物质对亲代的毒性结果的测定时留下的每一个浓度系列的剩余四孔也停止对待测药品与个人护理品类物质的暴露，用移液枪将虫液从96孔板中取出，一个浓度系列的亲代置于同一个有E.coli OP50的线虫生长固体培养基的培养皿上，因此进行同样4h的暴露时间的12个浓度系列对应了12个培养皿，重复步骤A，获得亲代不同浓度组对应的卵液；重复步骤B，获得子一代的虫液，重复步骤H，获得4h待测药品与个人护理品类物质对子一代的毒性结果；
J，待测药品与个人护理品类物质对子二代的毒性结果的测定
将进行I步子一代的毒性结果的测定时留下的每一个浓度系列的剩余四孔也停止对待测药品与个人护理品类物质的暴露，用移液枪将秀丽线虫虫液从96孔板中取出，一个浓度系列的秀丽线虫置于一个有E.coli OP50的线虫生长固体培养基的培养皿上，于是进行同样的4h的暴露时间的12个浓度系列对应了12个培养皿，然后重复步骤A，获得子一代不同浓度组对应的卵液；重复步骤B，获得子二代的虫液，重复步骤H，获得4h待测药品与个人护理品类物质对子二代的毒性结果；
K，待测药品与个人护理品类物质暴露不同时间的世代毒性测定
将暴露时间修改为8h，重复步骤H、I、J，获得8h待测药品与个人护理品类物质对亲代的毒性结果和待测药品与个人护理品类物质对子一代的毒性结果以及待测药品与个人护理品类物质对子二代的毒性结果；依照上述步骤，将暴露时间修改为12h、16h、20h、24h，共获得12h待测药品与个人护理品类物质对亲代、子一代和子二代的毒性结果；16h待测药品与个人护理品类物质对亲代、子一代和子二代的毒性结果；20h待测药品与个人护理品类物质对亲代、子一代和子二代的毒性结果；24h待测药品与个人护理品类物质对亲代、子一代和子二代的毒性结果；
L，世代毒性的评价
采用软件Origin 7.5对数据进行显著性分析：将同一个暴露时间下获得的待测药品与个人护理品类物质对秀丽线虫亲代、子一代和子二代的同一个指标的三个毒性结果进行显著性分析，分别将亲代与子一代、子一代与子二代进行比较：若两个比较均得到显著差异的结果，则说明药品与个人护理品类物质对该指标具有明确的世代毒性，并且其毒性效果随着世代增加而增强；若前者结果为非显著差异而后者结果为显著差异，则说明药品与个人护理品类物质对该指标具有世代毒性，但其世代毒性需要较长的时间才能够显现出来；若前者结果为显著差异而后者结果为非显著差异，或者两个比较中均为非显著差异，则说明所测药品与个人护理品类物质对该指标不具有世代毒性；对其它的指标通过相同的步骤进行显著性分析，即可获得所测药品与个人护理品类物质对哪些指标具有世代毒性；在不同的暴露时间下获得的待测药品与个人护理品类物质对亲代、子一代和子二代的同一个指标的毒性效果的数据，采用同样的显著性分析的方法，用于进一步佐证药品与个人护理品类物质对秀丽线虫该指标的毒性是否随着暴露时间的增加而具有更强的世代毒性。
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