CN104897653A - 一种成组生物毒性检测方法 - Google Patents

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徐波
蔡强
孙向武
陈文艳
肖娴
仇爱峰
俞洁
孙娜
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Abstract

本发明公开了一种成组生物毒性检测方法，属于生物分析检测技术领域。主要是通过培育一种特定的生物菌，用安息香双甲醚作为光引剂，并且用紫外线照射使其发光，然后用光度测量仪测量发光菌的初始光率和后发光率，发光率越高，毒性检测率越高，从而实现对该生物毒性的检测。本发明针对于目前技术缺陷发明了生物化学发光毒性检测法，解决了毒性检测率低、工作效率比较低、容易受到菌种影响的问题，提高了工作效率以及毒性检测率，具有分析速度快、成本比较低、不受菌种影响等特点。

Description

一种成组生物毒性检测方法
技术领域
本发明公开了一种成组生物毒性检测方法，属于生物分析检测技术领域。
背景技术
生物毒性是指样品对生物的毒性强弱，分急性毒性和慢性毒性，通常以半致死浓度表示，应用环保，医学临床，自来水，海关及公安，目前常见的生物传感器分为鱼类、贝类、藻类、跳骚类和发光菌等。
随着近代工业的发展，化学物质的使用日一次增多，使人类赖以生存的水生生态系统受到了越来越严重的污染，而且突发性环境污染事故时有发生，如人为投毒、自然灾害引起的水质突变，尤其是石油化工原料，产成品及有害有危险品的生产、储运和运输过程发生的事故对环境水体所造成的污染等；这就要求我们要快速地对各种突发性环境污染事故，尽量减少各种经济损失和社会影响；几十年来，各种理化分析手段的灵敏度越来越高，大多数研究者都是关注单一污染物对生物体的生态系统的毒性效应，但是环境中的生物体常常暴露于多组分污染物共存的混合体系中，而非简单的单一体系；混合物体系产生的毒性效应是所以组分污染物叠加、协同或抑制作用的综合结果，即使混合物体系中的单一组分处于无毒性效应浓度时，该组分对混合物的总毒性效应仍有一定的贡献；因此，发展新的快速、准确评价各类污染毒性的有效方法显得非常迫切和必要。
随着社会的发展，生物毒性已经逐步成为评价污染的手段之一；目前生物毒性检测所采用的方法有：微生物毒性试验、藻类毒性试验、鱼类毒性试验。
首先微生物毒性试验其实是菌体内一种新陈代谢的生理过程，是光呼吸进程，是呼吸链上的一个侧支，该光的波长在500nm左右，凡是干扰或者损害细菌呼吸或生理过程任何因素都能使细菌发光强度发生变化，有毒有害物质与发光细菌接触时，水样中的毒性物质会影响发光菌的新陈代谢，从而反应水体毒性，但是这个方法要在特定环境下进行，容易会因为不同菌种得到不同的试验数据；其次藻类毒性试验是说海藻的存亡与水体的质量有着密不可分的关系，可以利用海藻的生物量来反应水体的毒性，但是试验时间比较长，而且毒性检测率比较低；最后的鱼类毒性试验是指水中的有毒物质达到一定浓度时候，会给鱼带来一系列的中毒症状，包括食饵、生殖或形态变化，行为迟钝，种群数量和结构变化等，因而是毒性试验的重要指示生物，但是这样的测试方法成本高、速度慢，降低了工作效率，容易受到外界其他因素影响。
以上列举的方法中，第一种方法需要在特定的环境下进行，对环境要求比较高，而且容易会因为菌种不同受到影响；第二种方法毒性的检测率比较低，试验的时间比较长，很难快速得到试验结果；第三种方法成本高、速度慢，降低了工作效率，容易受到外界其他因素影响。
发明内容
本发明针对上述方法存在的毒性检测率低、工作效率比较低、容易受到菌种影响的问题，提出了一种化学发光毒性检测法；培养一种特定的生物菌进行发光，当待测水中存在有毒物质时，光的强度会变强，用光度测量仪测量初始和试验后发光率，从而得出毒性检测率是否提高，具有分析速度快、成本比较低、不受菌种影响等特点。
1.为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
(1)取一种特定培育的生物菌进行试验；
(2)首先将生物菌与水凝胶混合在一起，并且用安息香双甲醚作为光引发剂，发出蓝色的光；
(3)然后把混合后的生物菌滴在一张长20cm，宽10cm的试纸材料上面，用紫光灯对其照射10～15s；
(4)最后将在紫光灯照射后的生物菌放入含有3％的生理盐水中复苏，复苏完毕，用光度测量仪器测量发光菌的初始发光量，随后生物菌放入待测水体中，放置2～3分钟拿出，用测量仪器测量试验后的生物菌发光量，对比两次发光率来鉴别生物菌的毒性。
所述的特定培养生物菌培育步骤为：
(1)培养皿用报纸包起来灭菌；
(2)配制培养基，培养基完全溶于水后调pH值7.2～7.4之间；
(3)配制好并调完pH值的培养基中按1.8％的比例加入1～2g琼脂、5～6g葡萄糖、4～7g蛋白质，然后用紫外线进行照射进行杀菌；
(4)灭菌后的培养基倒入平板中倒置；
(5)接种环在酒精灯的火焰上烧红后降温，取一生物菌在平板上划线；
(6)划线后的平板倒置放入培养箱中培养；
(7)培养24小时后得到生物菌。
所述的试纸材料为防水、防潮试纸。
所述的水凝胶是一种集吸水、保水、缓释于一体并且亲水性但不溶于水的高分子聚合物，按质量浓度百分比计，其中胰蛋白胨5％，酵母膏10％，甘油20％，KH2PO4115％，Na2HPO425％，NaCl10％，琼脂15％，再添加质量为4～5mg生物菌粉对应120～150mL水凝胶。
所述的安息香双甲醚是一种性能优良的新型紫外光引剂，按照质量比为4～5mg生物菌粉对应1～2g的安息香双甲醚。
所述的培养基中含有1～2g琼脂、5～6g葡萄糖、4～7g蛋白质。
本发明与其它传统方法相比，具有的明显特征：
(1)试剂稳定，测试方便，数据重复性好，避免了生物毒性检测法由于使用不同菌种而干扰；
(2)测试速度快，5分钟之内就可以得到第一测量结果，而传统的检测法则至少需要20分钟；
(3)可以有效显示毒性的含量，提高毒性检测率。
具体实施方式
一种成组生物毒性检测方法，其特征在于具体步骤为：
(1)培养皿用报纸包起来灭菌；
(2)配制培养基，培养基完全溶于水后调pH值7.2～7.4之间；
(3)配制好并调完pH值的培养基中按1.8％的比例加入1～2g琼脂、5～6g葡萄糖、4～7g蛋白质，然后用紫外线进行照射进行杀菌；
(4)灭菌后的培养基倒入平板中倒置；
(5)接种环在酒精灯的火焰上烧红后降温，取一生物菌在平板上划线；
(6)划线后的平板倒置放入培养箱中培养；
(7)培养24小时后得到生物菌。
所述的试纸材料为防水、防潮试纸。
所述的水凝胶是一种集吸水、保水、缓释于一体并且亲水性但不溶于水的高分子聚合物，按质量浓度百分比计，其中胰蛋白胨5％，酵母膏10％，甘油20％，KH2PO4115％，Na2HPO425％，NaCl10％，琼脂15％，再添加质量为4～5mg生物菌粉对应120～150mL水凝胶。
所述的安息香双甲醚是一种性能优良的新型紫外光引剂，按照质量比为4～5mg生物菌粉对应1～2g的安息香双甲醚。
所述的培养基中含有1～2g琼脂、5～6g葡萄糖、4～7g蛋白质。
实例1
(1)取一培育后的生物菌进行试验；
(2)将4mg的生物菌粉与120mL的水凝胶混合，取1g的安息香双甲醚作为光引发剂，颜色为蓝色；
(3)将混合后的生物菌滴在一张长20cm，宽10cm的试纸材料上面，用紫光灯对其照射10秒；
(4)将在紫光灯照射后的生物菌放入含有3％的生理盐水中复苏，复苏完毕，用光度测量仪器测量发光菌的初始光量，做好记录，随后将发光性生物菌放入待测水体中，放置2分钟，拿出测试试验后的发光菌发光量，做好记录，将前后的测试光度进行对比。
本发明生物菌发光率不变则待测水中没有毒，发光率改变则待测水中有毒，毒性显示与发光率成正比，发光率越高，毒性检测率越大，此实例初始光量和后光量分别为20％和80％，提高了75％毒性检测率。
实例2
(1)取一培育后的生物菌进行试验；
(2)将4.5mg的生物菌粉与130mL的水凝胶混合，取1.5g的安息香双甲醚作为光引发剂，颜色为蓝色；
(3)将混合后的生物菌滴在一张长20cm，宽10cm的试纸材料上面，用紫光灯对其照射13秒；
(4)将在紫光灯照射后的生物菌放入含有3％的生理盐水中复苏，复苏完毕，用光度测量仪器测量发光菌的初始光量，做好记录，随后将发光性生物菌放入待测水体中，放置2.5分钟，拿出测试试验后的发光菌发光量，做好记录，将前后的测试光度进行对比。
本发明生物菌发光率不变则待测水中没有毒，发光率改变则待测水中有毒，毒性显示与发光率成正比，发光率越高，毒性检测率越大，此实例初始光量和后光量分别为15％和90％，提高了83.3％毒性检测率。
实例3
(1)取一培育后的生物菌进行试验；
(2)将5mg的生物菌粉与150mL的水凝胶混合，取2g的安息香双甲醚作为光引发剂，颜色为蓝色；
(3)将混合后的生物菌滴在一张长20cm，宽10cm的试纸材料上面，用紫光灯对其照射15秒；
(4)将在紫光灯照射后的生物菌放入含有3％的生理盐水中复苏，复苏完毕，用光度测量仪器测量发光菌的初始光量，做好记录，随后将发光性生物菌放入待测水体中，放置3分钟，拿出测试试验后的发光菌发光量，做好记录，将前后的测试光度进行对比。
本发明生物菌发光率不变则待测水中没有毒，发光率改变则待测水中有毒，毒性显示与发光率成正比，发光率越高，毒性检测率越大，此实例初始光量和后光量分别为10％和95％，提高了94.4％毒性检测率。

Claims (6)

1.一种成组生物毒性检测方法，其特征在于具体步骤为：
(1)取一种特定培育的生物菌进行试验；
(2)首先将生物菌与水凝胶混合在一起，并且用安息香双甲醚作为光引发剂，发出蓝色的光；
(3)然后把混合后的生物菌滴在一张长20cm，宽10cm的试纸材料上面，用紫光灯对其照射10～15s；
(4)最后将在紫光灯照射后的生物菌放入含有3％的生理盐水中复苏，复苏完毕，用光度测量仪器测量发光菌的初始发光量，随后生物菌放入待测水体中，放置2～3分钟拿出，用测量仪器测量试验后的生物菌发光量，对比两次发光率来鉴别生物菌的毒性。
2.根据权利要求1所述的一种成组生物毒性检测方法，其特征在于所述的特定培养生物菌培育步骤为：
(1)培养皿用报纸包起来灭菌；
(2)配制培养基，培养基完全溶于水后调pH值7.2～7.4之间；
(3)配制好并调完pH值的培养基中按1.8％的比例加入1～2g琼脂、5～6g葡萄糖、4～7g蛋白质，然后用紫外线进行照射进行杀菌；
(4)灭菌后的培养基倒入平板中倒置；
(5)接种环在酒精灯的火焰上烧红后降温，取一生物菌在平板上划线；
(6)划线后的平板倒置放入培养箱中培养；
(7)培养24小时后得到生物菌。
3.根据权利要求1所述的一种成组生物毒性检测方法，其特征在于：所述的试纸材料为防水、防潮试纸。
4.根据权利要求1所述的一种成组生物毒性检测方法，其特征在于：所述的水凝胶是一种集吸水、保水、缓释于一体并且亲水性但不溶于水的高分子聚合物，按质量浓度百分比计，其中胰蛋白胨5％，酵母膏10％，甘油20％，KH2PO4115％，Na2HPO425％，NaCl10％，琼脂15％，再添加质量为4～5mg生物菌粉对应120～150mL水凝胶。
5.根据权利要求1所述的一种成组生物毒性检测方法，其特征在于：所述的安息香双甲醚是一种性能优良的新型紫外光引剂，按照质量比为4～5mg生物菌粉对应1～2g的安息香双甲醚。
6.根据权利要求2所述的一种成组生物毒性检测方法，其特征在于：所述的培养基中含有1～2g琼脂、5～6g葡萄糖、4～7g蛋白质。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108051428A (zh) * 2018-01-26 2018-05-18 杭州绿洁水务科技股份有限公司 一种水质测试方法、装置、在线毒性监测仪
CN108120812A (zh) * 2017-12-14 2018-06-05 常州大学 一种印染废水中成组生物毒性监测及鉴别评估方法

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