CN107727556A - 一种水中铜绿微囊藻快速定量方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水中铜绿微囊藻快速定量方法：配制一组不同浓度的铜绿微囊藻藻液，通过分光光度计分别在220、360、420、520、640、680nm波长处测定其吸光度，用血细胞板计数法对每个样品的藻细胞计数，得到单位体积藻液中藻细胞数；分别测定空白样品在220、360、420、520、640、680nm波长处的吸光度，根据吸光度和细胞浓度绘制校正曲线，或线性回归得到对应波长处的回归方程；将含铜绿微囊藻的待测样品稀释后，采用分光光度计在特定波长处测定藻液的吸光度，根据建立的校正曲线或回归方程，计算得到待测样品中铜绿微囊藻的细胞浓度。本发明测定其生物量，对水华藻类的监测预警有着重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及能源回收利用及环保领域，更具体的说，是涉及一种水中藻类定量监测的方法，尤其是涉及一种水中铜绿微囊藻快速定量方法。
背景技术
铜绿微囊藻是我国淡水湖泊水华的主要藻种，是蓝藻爆发时的优势藻种，且其所合成的微囊藻毒素也是目前已知的蓝藻水华中出现频率最高、产生量最大和危害最严重的藻毒素。目前，我国许多城市的饮用水水源都是河流或者湖泊水，这些水体都不同程度地受到了藻类的污染，因此，对铜绿微囊藻的实时监控显得尤为重要。
通常，水中铜绿微囊藻的定量测定方法有测定光合色素含量、显微镜计数法、流式细胞仪仪计数法等。传统的镜检法需要连续观测多个视野存在检测费时、样品保存时间短、效率低等不足且由于容易漏数、重复计数，准确度不高。流式细胞仪虽然准确快速，但是其价格昂贵，不利于普遍使用。目前最常用的利用藻类光合色素(叶绿素a)的分光光度法，需要用到有机溶剂(丙酮等)且分析操作繁琐，一般不适用于大量样品的测定。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中的不足，针对我国藻类定量监测手段匮乏和效率低的问题，提供了一种简易、快速有效的水中铜绿微囊藻快速定量方法，测定其生物量，对水华藻类的监测预警有着重要意义。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的。
一种水中铜绿微囊藻快速定量方法，包括以下步骤：
步骤一：建立校正曲线或回归方程
配制一组不同浓度的铜绿微囊藻藻液，通过分光光度计分别在220、360、420、520、640、680nm波长处测定其吸光度，同时用血细胞板计数法对每个样品的藻细胞进行精确计数，得到单位体积藻液中藻细胞数；分别测定空白样品在220、360、420、520、640、680nm波长处的吸光度，根据吸光度和细胞浓度绘制校正曲线，或线性回归得到对应波长处的回归方程；
步骤二：铜绿微囊藻计数
将含铜绿微囊藻的待测样品稀释后，在与步骤一相同的条件下，采用分光光度计在特定波长处测定稀释后藻液的吸光度，根据建立的吸光度和细胞浓度之间的校正曲线或回归方程，计算得到待测样品中铜绿微囊藻的细胞浓度。
步骤一中所述校正曲线或回归方程的具体建立过程：
取一定量灭菌培养基培养的对数期的铜绿微囊藻，分别稀释1、3、5、8、10、30、50、80、100、300、500、800、1000、3000、5000、8000倍，空白组加入灭菌的培养基，将稀释后不同浓度的铜绿微囊藻藻液和空白组加入微孔板中，每组3-5个平行样；通过分光光度计分别测定每个浓度的藻液在220、360、420、520、640、680nm波长处的吸光度，空白样品的吸光度；同时用血细胞计数法对每个浓度的藻细胞精确计数，每个样品重复3-5次，取平均值得到细胞浓度，在吸光度和细胞浓度之间建立校正曲线或回归方程。
所述铜绿微囊藻的培养基为灭菌的BG-11、MA、M-11或HGZ培养基。
步骤二中所述含铜绿微囊藻的待测样品稀释后的藻液取3-5个平行样，加入10ml石英比色皿中，依次采用分光光度计测定在220、360、420、520、640、680nm任一波长处的光度值，取平均值。
与现有技术相比，本发明的技术方案所带来的有益效果是：
本发明的铜绿微囊藻的快速定量方法，直接测定待测样品的吸光度值，根据吸光度和铜绿微囊藻细胞浓度之间的线性关系实现对其的定量。与显微细胞计数等传统方法相比，更加便捷，降低了藻细胞定量对人力的依赖，能有效提高对微囊藻细胞定量的准确度，建立回归方程后可对大量样品进行检测，检测的可重复性强，效率高。与流式细胞仪计数法相比，更加经济，降低了藻细胞定量对昂贵仪器的依赖性，适合广泛的推广应用。与传统藻类叶绿素a分光光度法相比，样品的前处理简单，全程无须使用有毒化学溶剂，样品损失小且可回收，有效降低了检测过程对环境安全和检测人员健康的影响。故本检测方法具有可重复性强、简洁快速、成本低、样品可回收等特点。
附图说明
图1是不同吸光度下的校正曲线；
图2是本发明的分光计数和传统的显微计数方法测得的细胞浓度结果
图3是本发明利用两种规格滤料测得的铜绿微囊藻细胞浓度结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的描述。
针对现有技术中藻类生物量定量监测方法不足的技术现状，本发明提供一种更方便、简单、有效的水中铜绿微囊藻快速定量方法，本发明直接测定待测样品的吸光度，根据铜绿微囊藻细胞浓度和吸光度之间的线性关系实现对其的快速定量。与传统的显微镜计数法相比，其操作更为简单，相同时间内测定的样品数量显著增加，同时由于排除了人为可能造成的漏数、重复计数，因而准确性更高。与光合色素含量定量方法相比，本发明无需对样品进行预处理，操作简易、环保、效率高，且通过适宜波长的筛选保证了其更高的准确性和可靠性。
根据朗伯-比尔定律，光被吸收的量正比于光程中产生吸收的分子数目。铜绿微囊藻内色素含量与特定吸收波长处的峰高相关，所以测定不同稀释倍数藻液在不同波长处的吸光度，并与血细胞板计数法得到的藻细胞溶度建立回归方程或校正曲线，选取相关性较好的波长，保证了方法应用的广泛性和可靠性。
本发明的水中铜绿微囊藻快速定量方法，具体过程如下：
步骤一：建立校正曲线或回归方程
取一定量灭菌培养基培养的对数期的铜绿微囊藻，分别稀释1、3、5、8、10、30、50、80、100、300、500、800、1000、3000、5000、8000倍，得到了一组不同浓度的铜绿微囊藻藻液，空白组加入灭菌的培养基，将稀释后不同浓度的铜绿微囊藻藻液和空白组加入微孔板中，每组3-5个平行样。其中，所述铜绿微囊藻的培养基为灭菌的BG-11、MA、M-11或HGZ培养基。
通过分光光度计分别测定每个浓度的藻液在220、360、420、520、640、680nm波长处的吸光度A，同时用血细胞板计数法对每个浓度的藻细胞进行精确计数，每个样品重复3-5次，取平均值得到单位体积藻液中藻细胞数，即细胞浓度C。分别测定空白样品在220、360、420、520、640、680nm波长处的吸光度AI，根据吸光度A-AI和细胞浓度C绘制校正曲线，或线性回归得到对应波长处的回归方程。所用血细胞计数板通常可选25格*16格或16格*25格的计数板。
步骤二：铜绿微囊藻计数
将含铜绿微囊藻的待测样品稀释一定倍数，使稀释后的藻细胞浓度在回归方程或校正曲线的线性范围内，取3-5个平行样，加入10ml石英比色皿中，在与步骤一相同的条件下，依次采用分光光度计测定在220、360、420、520、640、680nm任一波长处的吸光度，取平均值，根据建立的吸光度和细胞浓度之间的校正曲线或回归方程，计算得到待测样品中铜绿微囊藻的细胞浓度。
实施例1
根据本发明的铜绿微囊藻的快速定量方法，首先建立藻液吸光度和铜绿微囊藻细胞之间校正曲线或回归方程，具体步骤如下：
1.藻液准备。用对数期的藻液，分别用超纯水稀释1、3、5、8、10、30、50、80、100、300、500、800、1000、3000、5000、8000倍。
2.细胞计数。用血细胞板计数法对每个浓度的细胞精确计数，每个样品重复3次，取平均值得到细胞浓度C。
3.测定吸光度。将空白组和不同浓度组的藻液加入10ml石英比色皿，通过分光光度计测定不同浓度藻液在220、360、420、520、640、680nm波长处的吸光度，每组3个平行样，取平均值。
4.线性关系的建立。根据测得的吸光度A，细胞浓度C，得到校正曲线，420、520、640、680nm波长处的校正曲线具有良好的线性关系，如图1所示。
同时，对校正曲线进行线性回归分析，在吸光度和细胞浓度间建立线性回归方程，结果如表1所示。
表1
| 波长(nm) | 线性回归方程 | R2 | 线性范围(个/ml) |
| 220 | y360＝8.812×10-6x-0.01800 | 0.953 | 104-106 |
| 360 | y360＝4.616×10-7x-0.01096 | 0.999 | 104-106 |
| 420 | y420＝4.922×10-7x-0.01811 | 0.999 | 104-106 |
| 520 | y520＝4.0964×10-7x-0.01233 | 0.998 | 104-106 |
| 640 | y640＝4.050×10-7x-0.01448 | 0.999 | 104-106 |
| 680 | y680＝4.1417×10-7x-0.0155 | 0.999 | 104-106 |
其中，y为紫外可见分光光度计测定的对应波长处的光度值A，x为藻细胞浓度(C)，单位为个/ml，线性相关系数为R2。
由表1可知，当铜绿微囊藻细胞浓度在104-106个/ml范围内，360、420、520、640、680nm波长处的光度值和藻细胞浓度的线性相关系数均为0.999(除520nm处为0.998外)，说明回归方程有良好的线性关系。根据朗伯比尔定律，当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时，其吸光度A与吸光物质的浓度C及吸光层厚度b成正比。所以，本方法得到的回归方程适宜用于铜绿微囊藻细胞浓度的定量。
实施例2
根据实施例1在680nm波长处建立的校正曲线或回归方程，采用本发明的铜绿微囊藻的快速定量方法测定藻细胞浓度，研究铜绿微囊藻的生长曲线，并与显微计数法进行对照，具体步骤如下：
1.藻液准备。在光照培养箱中，用灭菌的BG-11培养基培养。培养条件为：用对数期的藻种接入新配制的BG-11培养基进行试验，设3个平行样。试验用500ml的锥形瓶，内装200ml培养液，初始接种藻细胞浓度7.08*105个/ml，照度2500lx，培养温度25℃，光暗比12h:12h，每日定时摇动，按时取样。
2.细胞计数。用血细胞板，在显微镜下对每个样品的藻细胞进行精确计数，每个样品重复3次，取平均值得到细胞浓度C。
3.测定吸光度(分光计数)。通过分光光度计测定每天藻液样品在波长680nm波长处的吸光度。通过吸光度和藻细胞浓度之间的线性关系计算藻细胞浓度(C)，计算公式为CI＝(AI-A0)/4.0×10-8。传统的显微计数和本发明的分光计数结果如图2所示。
由图2可以看出，显微计数结果与分光计数结果相当接近，表明分光计数方法具有较好的准确度。
同时，计算显微计数和分光计数结果的标准偏差及变异系数，结果如表2所示。
表2
由表2数据可以看出，显微计数的标准偏差＞分光计数的标准偏差(除NO.3，4，9，11外)，显微计数的变异系数＞分光计数的变异系数(除NO.12外)，说明与显微计数相比，分光计数方法具有更好的精密度。
实施例3
根据本发明的铜绿微囊藻的快速定量方法，研究不同过滤介质对铜绿微囊藻的过滤效果，具体步骤如下：
1.藻液准备。在光照培养箱中，用灭菌的BG-11培养基培养，取连续培养15d的藻细胞浓度进行过滤实验。
2.过滤实验采用内径的中压过滤柱进行湿法填充。滤柱填充完成后，进行过滤实验，过滤流速1.5m/h，1mM KCl离子强度下，pH＝9.0±0.2，室温下进行实验，详细实验过程可参看[Jin C,Normani S D,Emelko M B.Surface roughness impacts ongranular media filtration at favorable deposition conditions:Experiments andmodeling[J].Environmental science&technology,2015,49(13):7879-7888.]。选用两种规格的滤料T1和T2考察其对铜绿微囊藻的过滤效果。
3.测定吸光度。随时间取样，通过分光光度计测定过滤后藻液样品在波长680nm波长处的吸光度。通过吸光度和藻细胞浓度之间的线性关系计算藻浓度。结果如图3所示。
由图3可知，采用本发明测定藻细胞浓度可以反映两种不同规格的过滤介质对藻细胞去除效果的影响。在需要进行大量样品测得工作中，与传统的显微计数相比，本方法更快速，更简单易行。
尽管上面结合附图对本发明的功能及工作过程进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体功能和工作过程，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可以做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。
Claims (4)
1.一种水中铜绿微囊藻快速定量方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：建立校正曲线或回归方程
配制一组不同浓度的铜绿微囊藻藻液，通过分光光度计分别在220、360、420、520、640、680nm波长处测定其吸光度，同时用血细胞板计数法对每个样品的藻细胞进行精确计数，得到单位体积藻液中藻细胞数；分别测定空白样品在220、360、420、520、640、680nm波长处的吸光度，根据吸光度和细胞浓度绘制校正曲线，或线性回归得到对应波长处的回归方程；
步骤二：铜绿微囊藻计数
将含铜绿微囊藻的待测样品稀释后，在与步骤一相同的条件下，采用分光光度计在特定波长处测定稀释后藻液的吸光度，根据建立的吸光度和细胞浓度之间的校正曲线或回归方程，计算得到待测样品中铜绿微囊藻的细胞浓度。
2.根据权利要求1所述的水中铜绿微囊藻快速定量方法，其特征在于，步骤一中所述校正曲线或回归方程的具体建立过程：
取一定量灭菌培养基培养的对数期的铜绿微囊藻，分别稀释1、3、5、8、10、30、50、80、100、300、500、800、1000、3000、5000、8000倍，空白组加入灭菌的培养基，将稀释后不同浓度的铜绿微囊藻藻液和空白组加入微孔板中，每组3-5个平行样；通过分光光度计分别测定每个浓度的藻液在220、360、420、520、640、680nm波长处的吸光度，空白样品的吸光度；同时用血细胞计数法对每个浓度的藻细胞精确计数，每个样品重复3-5次，取平均值得到细胞浓度，在吸光度和细胞浓度之间建立校正曲线或回归方程。
3.根据权利要求2所述的水中铜绿微囊藻快速定量方法，其特征在于，所述铜绿微囊藻的培养基为灭菌的BG-11、MA、M-11或HGZ培养基。
4.根据权利要求1所述的水中铜绿微囊藻快速定量方法，其特征在于，步骤二中所述含铜绿微囊藻的待测样品稀释后的藻液取3-5个平行样，加入10ml石英比色皿中，依次采用分光光度计测定在220、360、420、520、640、680nm任一波长处的光度值，取平均值。
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