CN107101943A - 一种光流控无透镜全息成像微藻活性检测装置与方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种光流控无透镜全息成像微藻活性检测装置，其特征在于：所述装置包括依次连接的光源组件、通光孔组件、光传播组件、微流控芯片、图像采集组件、图像处理组件；光源组件包括稳压电路、光源固定结构以及与所述通光孔组件紧密贴合的LED光源，所述LED光源发出的光束经所述光传播组件照射微流控芯片检测区域并投射于图像采集组件生成的全息图样，此全息图样被送至图像处理组件进行分析，根据图样特征判断微藻活性。本发明采用微流控芯片作为船舶压载水微藻活性检测的微平台，可直接使用，操作方便，而相关的图像采集设备亦采用体积较小的结构形式，具有体积小、重量轻、便于携带等优点。

Description

一种光流控无透镜全息成像微藻活性检测装置与方法

技术领域

本发明涉及一种对船舶压载水中的微藻进行活性判别的技术，特别是一种船舶压载水中微藻的活性检测装置和检测方法。

背景技术

船舶压载水是用于为船舶提供稳定性及调整船舶的吃水，以满足船舶良好的操纵性能要求。船舶压载水中含有大量的水生生物，并且由船舶压载水造成的外来海洋生物入侵，已被全球环境基金组织(GEF)确认为危害海洋的四大威胁之一。为了有效应对压载水造成的生物入侵问题，2007年《国务院关于印发国家环境保护“十一五”规划的通知》(国发[2007]37号)提出，“以近岸海域为重点，开展重点海域生物多样性普查，查清外来物种入侵现状，对引进外来海洋生物物种实行管理”的要求。而微藻是船舶压载水中最普遍存在的一种生物，准确鉴别船舶压载水中的微藻活性，筛选后进行相关研究，这对于目前船舶压载水处理具有重大科学意义。对于我国而言,通过立法的形式來实现防治压载水造成的海洋生物入侵也已成为必然。目前海事执法部口只能通过查看船舶压载水排放日志或经验法(如检查压载水给排管道是否有压载水残留等)判断船舶是否按照规定进行压载水置换进而判断船舶所载圧载水是否满足排放D-1标准,故难做出及时、准确的判断。有害微藻是船舶圧载水中最普遍存在的一种生物,也是船舶压载水处理和检测的主要目标,《压载水公约》规定,港口国授权官员有权对到港船舶进行压载水取样并分析,以确认处理后的压载水是否满足公约规定的排放标准,但现有的样品的提取和分析手段不得造成船舶的不当延误,这就要求对船舶压载水生物监测鉴别提出了快速和便携性的要求。对于生物的检测技术,传统的方法是培养计数法,该方法广泛应用在水生生物数量、种群研究方面,但是检测的过程较为复杂,虽然检测手段容易操作,但是耗时较长,同时要求专业技术人员熟知了解此领域。观测过程需要通过肉眼判断海洋生物的存活状态。对于海水中的一些动态藻类,它们具有运动能力,在显微镜中可以观察到游动,这种情况极容易造成漏记或者重复计数。随着各种生物技术不断地发展,一些简单、快速、准确、新型的检测方法随之出现。

目前对于船舶压载水微藻活性检测的方法主要有：流式细胞术法、光学分析及成像方法、光学色素分析法等。

流式细胞仪计数法起源于上个世纪70年代初并得到充分发展,成为当今最先进的生物定量分析技术,是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段。流式细胞仪可以高速定量分析数以万计的细胞,研究分析单一细胞颗粒,并能同时从一个细胞中测得多个参数,能够对细胞的大小、数量、细胞核、细胞器及内部物质等细胞参数进行精确分析。与传统的细胞分析方法相比,流式细胞术法克服人工操作带来的计数误差,工作效率高,具有速度快、精度高、准确性好等优点,是目前生物数定量测定分析的标准方法之一,成为当代最先进的细胞检测技术利用流式细胞术可对生物细胞的存活情况进行判定,基于此特点比较适合检测压载水中海洋生物体的数量。但并没有被广泛采用流式细胞仪探测个体较大的或特别微小的稀有微藻物种,压载水样品中的微藻尺寸范围很广、商用原位水下流式细胞仪的操作时间过长以及仪器体积过大价格昂贵,这些都是制约流式细胞仪应用于压载水检测的关键因素。

基于光学的微藻形态区分主要有光散射分析法和光学成像法。光散射分析法可以用于估量微藻的体积,测量结果可以初略的判断微藻的大小并对其鉴别,但不同的光散射方向可W表征微藻颗粒体态的不同性质,前向散射与微藻体积、营养物、盐度变化等因素有关,侧向散射表征衡量它的形状,后向散射受单个微藻的叶绿素含量影响较大,光散射分析法不适用于形状不规则及非球形微藻颗粒,没有统一的衡量标准,因此鉴别结果较为模糊。光学成像法是目前比较通用的方法之一,是利用CCD对微藻进行成像,而后与数据库中已有的形状信息进行对比,匹配来确定类型,但它存在的问题是:高性能处理器硬件和实时图像处理算法(包括:数据库建立,与数据库中图像匹配算法)是制约该方法应用的重要因素,主要用于静态分类的方法,如果动态分类的话,就需要高速相机进行数据采集。

光合色素在植物光合作用中起着至关重要的作用,是微藻检测鉴别的良好探针。基于色素颜色区分主要有分光光度法(光谱吸收法)、巧光测定术。分光光度法(光谱吸收法)是利用一定带宽的光照福射压载水样品,然后观测它吸收的光线波长的函数。由于不同微藻种类含有的辅助色素含量不同,得到的吸收光谱结果也随着微藻种类不同而有一定差异,但这种差异很小,函数曲线变化微小,而且不管是远程光谱测量仪器还是原位测量仪器造价都十分昂贵。巧光测定术提供更少的关于色素中相对和绝对量的详细信息,然而,它是一种无需样品制备的快速实时现场鉴别技术。荧光测定术通过测量微藻叶绿素、辅助色素的激发荧光强度并且提供辅助色素的光谱吸收信息来对微藻进斤鉴别,一些荧光测定仪器鉴别区分出多种微藻,但荧光测定仪器的组成过于精密,造价十分昂贵。

综上分析，现有船舶压载水中微藻活性检测方法存在不同程度的缺点，如所需设备昂贵、笨重,基本采用收集样品后拿回实验室进行培养鉴定,耗时费力,效率不高,并且进行检测的种类也相对有限,而简单便捷的微藻活性检测方法是船舶压载水微藻活性检测领域中急需解决的关键问题。

发明内容

鉴于已有技术存在的不足，本发明的目的是要提供一种光流控无透镜全息成像可以实现现场快速活性检测、操作过程简单、成本低廉且鉴定指标稳定的船舶压载水中微藻的活性检测装置和检测方法。

为了实现上述目的，本发明技术方案如下：

一种光流控无透镜全息成像微藻活性检测装置，其特征在于：所述装置包括依次连接的光源组件、通光孔组件、光传播组件、微流控芯片、图像采集组件、图像处理组件；

所述光源组件包括稳压电路、光源固定结构以及与所述通光孔组件紧密贴合的LED光源，所述LED光源发出的光束经所述光传播组件照射微流控芯片检测区域并投射于图像采集组件；

所述图像采集组件承接并采集微流控芯片检测区域在光束作用下生成的全息图样，此全息图样被送至与所述图像采集组件相连接的图像处理组件进行分析。

进一步的，所述通光孔组件除通光孔外，其他部分为光密闭结构，且无光的透射。

进一步的，所述LED光源发射的光束经通光孔组件与光传播组件作用后，其光斑投射区域完全覆盖图像采集组件的探测区域。

进一步的，所述微流控芯片包括聚二甲基硅氧烷片和载玻片，所述聚二甲基硅氧烷片依次凹刻有检测区域，所述检测区域两端对称连接第一聚焦通道和第二聚焦通道，所述第一聚焦通道的另一端宽度渐增直至等宽连接于第一通道，所述第一通道另一端设有进液孔，所述第二聚焦通道以相同方式连接第二通道且第二通道末端设有废液孔。

进一步的，所述LED光源为装置唯一照明光源，其未开启时图像采集组件不能记录任何有用信息。

本发明的另一目的要提供一种基于上述装置的微藻活性检测方法，其特征在于：其包括如下步骤：

S1、样品滴加，将船舶压载水样品加入到微流控芯片的进液孔中；

S2、开启装置，依次开启LED光源、图像采集组件和图像处理组件，液体样本在自身张力的作用下沿着第一通道经过第一聚焦通道流向检测通道，多余液体样品流入废液孔中；

S3、全息图样采集，LED光源发出的相干光经过通光孔和光传播组件照射在微流控芯片检测区域的样品上形成全息图像并由图像采集组件采集；

S4、全息图样分析，图像采集组件采集的全息图样经数据线传输至图像处理组件中；

S5、微藻活性的判断，根据全息图样中的微藻图样特征判断微藻活性。

进一步的，步骤S5中所述微藻图样特征包括：

微藻细胞形成的全息图样中最中心的亮斑和所述亮斑外圈的暗环灰度差值；

微藻细胞形成的全息图样中不同级条纹之间灰度值的对比度；

微藻细胞形成的全息图样中的条纹级数；

微藻细胞形成的全息图样中不同级圆形条纹的缺口大小。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1、本发明为检测微藻活性的小型化平台，携带方便，检测速度快，而后端的图像处理部分亦可以采用嵌入式方法缩减设备提及，其相对于现有的检测设备，具有有体积超小、重量轻、易于携带，可用于现场快速检测等优点；

2、本发明所用的器件均为市面上的通用产品，成本低廉。

3、本发明基于全息光学并利用不同活性微藻的光投射性质差异进行活性检测，检测方法快速高效，且不需对微藻样品进行预处理，取样后可直接进行检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为船舶压载水中微藻活性检测装置结构示意图；

图2为本发明通光孔组件结构示意图；

图3为本发明微流控芯片结构示意图；

图4为本发明微藻活性检测方法流程图；

图5为实施例扁藻的活性检测结果；

图6为实施例金藻的活性检测结果；

图7为实施例小球藻的活性检测结果。

附图标号说明：

1、光源组件，2、通光孔组件，3、光传播组件，4、微流控芯片，5、图像采集组件，6、图像处理组件，7、聚二甲基硅氧烷片，8、载玻片，9、第一通道，10、第一聚焦通道，11、检测通道，12、第二聚焦通道，13、第二通道，A、进液孔，B、废液孔。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

由于活性不同的微藻形成的全息图像不同，其形成的全息图样特征不同，根据上述原理本发明涉及了一种光流控无透镜全息成像的微藻活性检测装置，下面结合附图对本发明作进一步地说明。如图1所示为微藻活性检测装置结构，装置包括依次连接的光源组件(1)、通光孔组件(2)、光传播组件(3)、微流控芯片(4)、图像采集组件(5)、图像处理组件(6)。光源组件(1)包括稳压电路、光源固定结构以及与所述通光孔组件(2)紧密贴合的LED光源，所述LED光源发出的光束经所述光传播组件照射微流控芯片检测区域并投射于图像采集组件(5)。图像采集组件(5)承接并采集微流控芯片(4)检测区域在光束作用下生成的全息图样，此全息图样被送至与所述图像采集组件(5)相连接的图像处理组件(6)进行分析。通光孔组件(2)除通光孔外，其他部分为光密闭结构，且无光的透射，通光孔组件的结构如图2所示，LED光源发射的光束经通光孔组件(2)与光传播组件(3)作用后，其光斑投射区域完全覆盖图像采集组件(5)的探测区域。所述LED光源为装置唯一照明光源，其未开启时图像采集组件(5)不能记录任何有用信息。

如图3所示，微流控芯片(4)包括聚二甲基硅氧烷片(7)和载玻片(8)，聚二甲基硅氧烷片(7)依次凹刻有检测区域(11)，所述检测区域两端对称连接第一聚焦通道(10)和第二聚焦通道(12)，所述第一聚焦通道(10)的另一端宽度渐增直至等宽连接于第一通道(9)，所述第一通道另一端设有进液孔，所述第二聚焦通道以相同方式连接第二通道(13)且第二通道(13)末端设有废液孔。

另外，如图4所示本发明还提供了一种基于上述装置的微藻活性检测方法，其特征在于：其包括如下步骤：

S1、样品滴加，将船舶压载水样品离心后与缓冲液混合作为样本溶液，将10μL样本溶液滴加到微流控芯片的任意一个储液孔中；

S2、开启装置，依次开启LED光源、图像采集组件和图像处理组件(6)，液体样本在自身张力的作用下沿着第一通道(9)经过第一聚焦通道(10)流向检测通道(11)，多余液体样品流入废液孔中；

S3、全息图样采集，LED光源发出的相干光经过通光孔(2)和光传播组件(3)照射在微流控芯片(4)检测区域的样品上形成全息图像并由图像采集组件(5)采集；

S4、全息图样分析，图像采集组件(5)采集的全息图样经数据线传输至图像处理组件(6)中；

S5、微藻活性的判断，根据全息图样中的微藻图样特征判断微藻活性。

微藻细胞形成的全息图样中最中心的亮斑和所述亮斑外圈的暗环灰度值；微藻细胞形成的全息图样中不同级条纹之间灰度值的对比度；微藻细胞形成的全息图样中的条纹环数；微藻细胞形成的全息图样中不同级圆形条纹的缺口大小。

本发明在使用时，首先将船舶压载水样品放在微流控芯片上，将微流控芯片置于载物台，LED光源发出的相干光经过通光孔和光传播组件照射在放置于载物台上的样品上形成的衍射图像由图像采集组件采集。该装置选用LED作为光源，光源组件中LED发出的光为部分相干光，可以有效的抑制相干散斑噪声和干扰。光源组件中的LED光源发出的部分相干光通过通光孔组件中的通光孔后发散成一束球面波，发散形成的球面波经过合适传播距离传播到样品面。该装置利用穿过样品的支透光作为参考光，无需另外引入参考光。样品与图像采集组件中电荷耦合元件(CCD)的距离非常近，距离在几毫米左右，部分相干光照射在样品上形成的的全息图样由图像采集组件采集，最后将采集到的全息图像由图像处理组件进行处理。

活性不同的微藻形成的全息图像不同，通过判断全息图的一些特征来辨别微藻细胞的活性情况。

微藻细胞形成的全息图中最中心的亮斑和亮斑外圈的暗环灰度值有差异，微藻活细胞的全息图中心亮斑与中心亮斑外圈暗环的灰度值差值和微藻死细胞的中心亮斑与中心亮斑外圈暗环的灰度值差值存在明显的偏差，通过分析微藻细胞形成的全息图像中心亮斑与中心亮斑外圈灰度差值对微藻的活性进行辨别。不同的微藻细胞的活性不同时，灰度差值的阈值对应微藻活性的具体关系也不同，如扁藻活细胞的灰度值差值大小为10～30，扁藻死细胞的灰度值差值为30～50；金藻活细胞灰度值差值大小为10～20，金藻死细胞灰度值差值大小为20～30；小球藻活细胞灰度值差值大小为10～20，小球藻死细胞灰度值差值大小为20～30。

不同活性微藻细胞形成的全息图中不同级条纹之间灰度值的对比度有所差别，可以通过分析不同条纹的灰度值的对比度来辨别微藻细胞的活性，不同微藻细胞活性不同时，不同级条纹之间灰度值的对比度对应微藻活性的具体关系不同，如扁藻活细胞一级和二级暗纹之间的对比度在0.1左右，扁藻死细胞的一二级条纹之间的对比度在0.07左右；新月藻活细胞的一二级条纹对比度在0.065左右，新月藻死细胞的一二级条纹对比度在0.06左右。不同活性的微藻细胞形成的全息条纹的环数也不同，可以通过判断全息图条纹的环数来辨别微藻细胞的活性，不同微藻细胞活性不同时，条纹级数的多少对应微藻活性的具体关系不同，如塔胞藻活细胞有三级暗条纹，塔胞藻死细胞有四级暗纹；扁藻活细胞有二级暗纹，扁藻死细胞有三级暗纹。

此外，不同活性的微藻细胞形成全息图中不同级圆形条纹的缺口大小不同，可以通过分析缺口的大小辨别微藻细胞的活性。

如图5-图7所示分别为将扁藻、金藻和小球藻通过本发明所述装置和方法进行试验后绘制的微藻全息图像最中心亮斑和亮斑外圈暗环灰度值的差值散点图，通过观察实验结果，统计微藻细胞形成的全息图中最中心亮斑和亮斑外圈暗环灰度值的差值，根据差值大可得到微藻活性结果。

本发明还可以利用微藻细胞形成的全息图样中不同级条纹之间灰度值的对比度、微藻细胞形成的全息图样中的条纹环数、微藻细胞形成的全息图样中不同级圆形条纹的缺口大小等特征来表征微藻活性。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (7)

1.一种光流控无透镜全息成像微藻活性检测装置，其特征在于：所述装置包括依次连接的光源组件(1)、通光孔组件(2)、光传播组件(3)、微流控芯片(4)、图像采集组件(5)、图像处理组件(6)；

所述光源组件(1)包括稳压电路、光源固定结构以及与所述通光孔组件(2)紧密贴合的LED光源，所述LED光源发出的光束经所述光传播组件照射微流控芯片检测区域并投射于图像采集组件(5)；

所述图像采集组件(5)承接并采集微流控芯片(4)检测区域在光束作用下生成的全息图样，此全息图样被送至与所述图像采集组件(5)相连接的图像处理组件(6)进行分析。

2.根据权利要求1所述的光流控无透镜全息成像的微藻活性检测装置，其特征在于：所述通光孔组件(2)除通光孔外，其他部分为光密闭结构，且无光的透射。

3.根据权利要求2所述的光流控无透镜全息成像的微藻活性检测装置，其特征在于：所述LED光源发射的光束经通光孔组件(2)与光传播组件(3)作用后，其光斑投射区域完全覆盖图像采集组件(5)的探测区域。

4.根据权利要求1所述的光流控无透镜全息成像的微藻活性检测装置，其特征在于：所述微流控芯片(4)包括聚二甲基硅氧烷片(7)和载玻片(8)，所述聚二甲基硅氧烷片(7)依次凹刻有检测区域(11)，所述检测区域两端对称连接第一聚焦通道(10)和第二聚焦通道(12)，所述第一聚焦通道(10)的另一端宽度渐增直至等宽连接于第一通道(9)，所述第一通道另一端设有进液孔，所述第二聚焦通道以相同方式连接第二通道(13)且第二通道(13)末端设有废液孔。

5.根据权利要求1所述的光流控无透镜全息成像的微藻活性检测装置，其特征在于：所述LED光源为装置唯一照明光源，其未开启时图像采集组件(5)不能记录任何有用信息。

6.一种基于权利要求1所述装置的微藻活性检测方法，其特征在于：其包括如下步骤：

S1、样品滴加，将船舶压载水样品加入到微流控芯片的进液孔中；

S2、开启装置，依次开启LED光源、图像采集组件和图像处理组件(6)，液体样本在自身张力的作用下沿着第一通道(9)经过第一聚焦通道(10)流向检测通道(11)，多余液体样品流入废液孔中；

S3、全息图样采集，LED光源发出的相干光经过通光孔(2)和光传播组件(3)照射在微流控芯片(4)检测区域的样品上形成全息图像并由图像采集组件(5)采集；

S4、全息图样分析，图像采集组件(5)采集的全息图样经数据线传输至图像处理组件(6)中；

S5、微藻活性的判断，根据全息图样中的微藻图样特征判断微藻活性。

7.根据权利要求6所述的一种微藻活性检测方法，其特征在于：步骤S5中所述微藻图样特征包括：

微藻细胞形成的全息图样中最中心的亮斑和所述亮斑外圈的暗环灰度值差值；

微藻细胞形成的全息图样中不同级条纹之间灰度值的对比度；

微藻细胞形成的全息图样中的条纹级数；

微藻细胞形成的全息图样中不同级圆形条纹的缺口大小。