CN109696393A - 一种测定环境实验模拟条件下聚苯乙烯微球含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于实验检测技术领域，为测定环境实验模拟条件下聚苯乙烯(PS)微球含量的方法，主要步骤为：取PS微球悬浊液进行倍比稀释，稀释混匀后的悬浊液加入血球计数板计数区，在湿盒中静置，相应物镜下对若干个计数区进行拍照编号，随后用ImageJ图像分析软件进行计数，最后对数据进行稳定性和显著性分析。本发明所述方法能直观展示微塑料的形态和含量，结合血球计数板法和ImageJ软件能做到准确定性定量，该方法重复性好、稳定性高，能有效达到检测PS微球含量的目的。
Description
技术领域
本发明涉及实验检测技术领域，具体为测定环境实验模拟条件下聚苯乙烯(PS)微球含量的方法。
背景技术
近二三十年来，随着塑料制品工艺的成熟和塑料产量的逐年增长，塑料污染已成为全球生态系统面临的重大环境污染问题。据报道，全球的塑料废弃物主要排放堆积在土壤和淡水环境中，少部分直接排放在海洋环境中，而随着塑料废弃物分解、洗护化妆用品或医药用途的塑料微球排放等行为的累积，产生了当前受到高度关注的新型污染问题——微塑料污染。在风、降雨和环流等生态现象和人类日常生产活动的影响下，微塑料大范围渗透进入海洋河口和土壤环境中。由于微塑料的粒径微小，一方面容易被各种动植物误食吸附，造成阻塞消化道、胁迫生长发育等直接危害；另一方面，微塑料可能会作为载体富集其他有毒污染物或病原菌，对生物造成复合毒性，甚至还会通过生物放大作用沿食物链进行传播，危及生态环境安全，对人类健康构成威胁。
为了研究生物个体在微塑料胁迫下的生理和损伤机制，明确微塑料在生物体中的去留和毒性问题，在实验室模拟条件下建立微塑料和生物之间的互作模型很有必要。研究微塑料颗粒在生物体内的富集含量和分布情况是建立模型的前提。目前环境调查微塑料含量主要通过显微镜计数统计，以定性为主，且在计数过程中存在主观性；实验室构建模型的检测方法大多通过测定荧光微塑料溶液的荧光强度，进而换算成微塑料含量，做到定量检测。但这种方法对处理后的微塑料形态和含量没有直观的展示，另外，荧光微塑料的荧光成分会随着时间的推移而衰减，在预处理后也有可能减弱甚至消失，造成不可控的误差。
在现有技术中，倒置荧光显微镜(如尼康倒置荧光显微镜)的总放大倍数可达1000倍，可以检测到微米级甚至纳米级的微粒，结合其荧光功能，还可以对微小物质进行定性定量检测；血球计数板的使用可以客观选择计数区，避免处理过程中存在主观性；ImageJ图像分析软件可以精确计量选定微球的面积并计数。若将三种技术结合，可直观简便的检测PS微球的含量，具有较好的重复性和精确度，但目前尚无相关结合技术的报道。
发明内容
本发明为了克服现有技术的缺陷和不足，提供一种测定环境实验模拟条件下聚苯乙烯微球含量的方法，该方法使用倒置荧光显微镜拍照，结合血球计数板计数法和ImageJ图像处理技术对环境实验模拟条件下聚苯乙烯(PS)微球含量进行测定，具有较好的重复性和稳定性。
本发明通过以下技术方案给予实现：一种测定环境实验模拟条件下聚苯乙烯微球含量的方法，包括如下步骤：
取聚苯乙烯微球悬浊液置于离心管底部，根据粒径大小稀释至相应倍数，反复吹打混匀，继续倍比稀释得到相应倍数稀释液，并进行相应编号；
将血球计数板放置在加了水的湿盒中，随后分别从各个离心管中吸取混匀的聚苯乙烯微球悬浊液，从血球计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘注入，让悬浊液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生；
盖上湿盒，静置片刻，静置时间随微球粒径的减小而加长，待微球颗粒沉降到计数板上，不再随液体漂移；
待微球颗粒沉降到计数板上，从湿盒中缓慢取出血球计数板放置在显微镜载物台上，相应物镜下找到血球计数板的若干个计数区，分别按编号顺序进行拍照，命名保存；
用ImageJ软件打开照片，录制或编写一个ImageJ宏，选定计数区，对计数区的微球个数或总面积进行计数测量；
计算不同稀释倍数下的微球个数N，分析其稳定性和最高最低检测限。
优选地，用移液枪取聚苯乙烯微球悬浊液置于离心管底部，并用移液枪对稀释液进行反复吹打混匀。
微球个数N＝n/V，其中V为每个计数区的体积，n为微球个数。
从以上技术方案可知，本发明方法的主要步骤为：取PS微球悬浊液进行倍比稀释，稀释混匀后的悬浊液加入血球计数板计数区，在湿盒中静置，相应物镜下对多个计数区进行拍照编号，随后用ImageJ图像分析软件进行计数，最后对数据进行稳定性和显著性分析。本发明方法能直观展示微塑料的形态和含量，结合血球计数板法和ImageJ软件能做到准确定性定量，该方法重复性好、稳定性高，能有效达到检测PS微球含量的目的。
附图说明
图1为本发明技术方案的流程图。
图2为20倍物镜下1个大方格计数区20μm粒径PS微球的照片。
图3为40倍物镜下1个中方格计数区1μm粒径PS微球的照片。
图4为本发明一个实施例中对1μm粒径PS微球的测量结果图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步详细阐述，所述实施例只用于解释本发明所述高效测定环境实验模拟条件下聚苯乙烯微球含量方法的思想，实施方式中简单参数的替换不能一一在实施例中赘述，但并不因此限制本发明的保护范围，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，应被视为等效的置换方式，包含在本发明的保护范围之内。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
本发明测定环境实验模拟条件下PS微球含量的方法，如图1所示，包括如下步骤：
1.聚苯乙烯微球(PS微球)的倍比稀释：用10μL移液枪取PS微球悬浊液10μL置于1.5mL离心管底部，根据粒径大小稀释至相应倍数后为原液，反复吹打混匀，继续倍比稀释得到2、4、8、16、32、64、128、256、512倍稀释液，并进行相应编号。
聚苯乙烯微球为可以均匀分散在水溶液中的固体粉末，所得到的混悬液为乳浊液，粒径范围为70nm-50μm。
2.血球计数板加样：准备使用的血球计数板要在显微镜下检查是否洁净，如有污染，反复流水冲洗直至洗净为止；将血球计数板放置在加了水的湿盒中，随后分别从各个离心管中吸取混匀的PS微球悬浊液10μL，从血球计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘注入，让悬浊液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生。
所述盖玻片为与血球计数板配套的专用盖玻片，需擦拭干净后使用。
3.PS微球的沉降：盖上湿盒，静置片刻，静置时间随微球粒径的减小而加长，待微球颗粒沉降到计数板上，不再随液体漂移。
4.血球计数板拍照：待微球颗粒沉降到计数板上，从湿盒中缓慢取出血球计数板放置在显微镜载物台上，相应物镜下找到血球计数板的5个计数区，分别按编号顺序进行拍照，命名保存。
5.ImageJ分析计数：用ImageJ软件打开照片，录制或编写一个ImageJ宏，选定计数区，对计数区的微球个数或总面积进行计数测量，所有照片统计后的数据导出为Excel文件，用于后续分析。所述ImageJ软件为基于java的公共图像处理软件。
6.数据稳定性分析：每个计数区的体积为V，微球个数为n，则1μL体积的悬浊液中的微球个数N＝n/V，计算不同稀释倍数下的微球个数N，分析其稳定性和最高最低检测限。
本实施例针对的水样为实验条件下单一粒径的微塑料悬浊液。
在步骤1中，PS微球为购买的用于实验检测的微球产品。在步骤2中，湿盒最好使用免疫组化湿盒，并加水保湿。在步骤3中，微球的粒径越小，静置的时间要越长。在步骤4中，血球计数板计数区和物镜要根据粒径大小进行选择；大粒径微球选择大方格计数区，20倍物镜，如图2所示；小粒径微球选择中方格或小方格计数区，40或100倍物镜，如图3所示。
在步骤5中，ImageJ软件分析的具体步骤为：File/Open，打开一张照片；Image/Type/8-bit；Image/Adjust/Brightness/Contrast/Auto；Image/Adjust/Threhold；Analyze/Analyze Particles。为了减少ImageJ软件的重复操作，可录制或编写一个macro宏，进行快速测量。
在步骤6中，计数区共分为大方格、中方格和小方格计数区，大方格计数区体积为0.1μL，中方格计数区体积为0.004μL，小方格计数区体积为0.00025μL。大方格的4个计数区按左上、右上、右下、左下顺序编号；中方格的5个计数区按左上、右上、右下、左下、中心顺序编号；小方格的4个计数区按左上、右上、右下、左下顺序编号。
在以上步骤中，根据粒径大小稀释为原液时，粒径较大的可以不稀释或稀释2倍，粒径较小的稀释至10倍至100倍。在湿盒中静置片刻时，操作要保持匀速缓慢，防止加样不均匀，避免晃动造成微球再次悬浮，静置时间视微球粒径大小而定，粒径越小，静置时间越长。
下面以1μm粒径PS微球为例，对本发明作进一步说明：
实施例1.环境实验模拟条件下1μm粒径PS微球含量的测定
1.1μm粒径PS微球的倍比稀释：用10μL移液枪取1μm粒径的PS微球悬浊液10μL置于1.5mL离心管底部，稀释100倍作为原液，反复吹打混匀，继续倍比稀释得到2、4、8、16、32、64、128、256、512倍稀释液。
2.血球计数板加样：将血球计数板放置在加了水的湿盒中，随后从离心管中吸取混匀的1μm PS微球悬浊液10μL，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘注入，让悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生。
3.PS微球的沉降：盖上湿盒，静置片刻，静置30min，待微球颗粒沉降到计数板上，不再随液体漂移。
4.血球计数板拍照：从湿盒中缓慢取出血球计数板放置在显微镜载物台上，找到血球计数板的5个中方格计数区，在40倍物镜下按顺序进行拍照，命名保存。
5.ImageJ分析计数：用ImageJ软件打开照片，选定计数区，对总面积进行计数测量，所有数据测量后导出为Excel文件，用于后续分析。
6.数据稳定性分析：中方格计数区的体积为V＝0.004μL，微球个数为n，则1μL体积的悬浊液中的微球个数N＝250n，计算不同稀释倍数下的微球个数N，分析其稳定性和最高最低检测限，如下表所示：
在稀释到400倍至12800倍时，微球个数呈线性关系，最高检测限和最低检测限分别为266个和8个，检测浓度范围为8-266个微球。测定结果如图4。
如上所述，便可较好地实现本发明。
Claims (7)
1.一种测定环境实验模拟条件下聚苯乙烯微球含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
取聚苯乙烯微球悬浊液置于离心管底部，根据粒径大小稀释至相应倍数，反复吹打混匀，继续倍比稀释得到相应倍数稀释液，并进行相应编号；
将血球计数板放置在加了水的湿盒中，随后分别从各个离心管中吸取混匀的聚苯乙烯微球悬浊液，从血球计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘注入，让悬浊液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生；
盖上湿盒，静置片刻，静置时间随微球粒径的减小而加长，待微球颗粒沉降到计数板上，不再随液体漂移；
待微球颗粒沉降到计数板上，从湿盒中缓慢取出血球计数板放置在显微镜载物台上，相应物镜下找到血球计数板的若干个计数区，分别按编号顺序进行拍照，命名保存；
用ImageJ软件打开照片，录制或编写一个ImageJ宏，选定计数区，对计数区的微球个数或总面积进行计数测量；
计算不同稀释倍数下的微球个数N，分析其稳定性和最高最低检测限。
2.根据权利要求1所述的测定环境实验模拟条件下聚苯乙烯微球含量的方法，其特征在于，用移液枪取聚苯乙烯微球悬浊液置于离心管底部，并用移液枪对稀释液进行反复吹打混匀。
3.根据权利要求1所述的测定环境实验模拟条件下聚苯乙烯微球含量的方法，其特征在于，继续倍比稀释得到2、4、8、16、32、64、128、256、512倍稀释液。
4.根据权利要求1所述的测定环境实验模拟条件下聚苯乙烯微球含量的方法，其特征在于，微球个数N＝n/V，其中V为每个计数区的体积，n为微球个数。
5.根据权利要求1所述的测定环境实验模拟条件下聚苯乙烯微球含量的方法，其特征在于，血球计数板的计数区设有5个。
6.根据权利要求5所述的测定环境实验模拟条件下聚苯乙烯微球含量的方法，其特征在于，计数区共分为大方格、中方格和小方格计数区，大方格计数区体积为0.1μL，中方格计数区体积为0.004μL，小方格计数区体积为0.00025μL；大方格的4个计数区按左上、右上、右下、左下顺序编号；中方格的5个计数区按左上、右上、右下、左下、中心顺序编号；小方格的4个计数区按左上、右上、右下、左下顺序编号。
7.根据权利要求1所述的测定环境实验模拟条件下聚苯乙烯微球含量的方法，其特征在于，湿盒使用免疫组化湿盒，并加水保湿。
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