CN1993610A - 表征生物学流体的细胞组分的方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及区分并计数在生物学流体样品中存在的细胞组分的方法，包括一般通过流式细胞术设备(1)施行的初步细胞学分析步骤，以获得一组初步结果，使得能够将样品中的所有细胞组分区分成不同的群体并计数；以及基于所鉴定的细胞特性，对特定类型细胞组分进行补充细胞学分析步骤，以获得补充结果，使得能够区分并计数样品的至少一种细胞群或亚群从而鉴定所述细胞特性。本发明特别适合于血液分析。

Description

表征生物学流体的细胞组分的方法和装置

本发明涉及表征生物学流体的细胞组分及定量生物学流体中的细胞群和亚群的方法，以及可以用于施行该方法的装置。

在本发明的范围内，术语“生物学流体”指包含细胞组分或可能包含此类组分的任何天然流体或生物制品，例如血液、骨髓、脑脊液、胸膜液，和术语“细胞组分”指任何在其最传统意义上的细胞，例如红细胞和白细胞，以及存在于生物学流体中的任何其他细胞类型，例如血小板。同样地，术语“群体”指同一类别的一组细胞，例如，嗜碱性粒细胞、淋巴细胞等，和术语“亚群”指同一类型的一亚组特殊细胞，例如淋巴细胞群的B、T4、T8淋巴细胞等，但还指未成熟或变化的形式。

确定并计数在不同生物学流体例如血液中的全部细胞群，在临床诊断方面具有非常大的重要性。生物学流体的细胞学分析的传统方法利用各种常规设备例如基于流式细胞术的血液学自动装置，其用于区分并精确地自动计数在生物学流体样品中存在的所有细胞，所述细胞随后可以进行分群。这些设备通常包括一般为电学和/或光学测量装置的测量装置，其与可能存在的各种不同的试剂和染色剂相容，产生如上所述的分析结果。因此，对于血液样品，这些自动装置使得能够形成血像，它提供血细胞计数、白细胞分类计数和血小板计数的常规参数。利用相互不同的另外设备，可以获得关于网织红细胞、成红细胞、未成熟细胞等的鉴定的补充结果以便补全全部血像数据。例如，可以参考由本申请人提交的专利申请FR0102489，它涉及通过利用流式细胞术的多参数测量方法来鉴定并计数生物细胞的方法和试剂。

因此可以由此推断出关于每种生物细胞种类的信息，从而产生其分类。

在绝大多数情况下，所有细胞组分的精确自动化计数及每种细胞组分群体的区分足以给从业医师提供关于存在细胞学失调或紊乱的信息。然而，当利用常规细胞学分析自动装置分析生物学流体时，与正常期望的那些相比，某些异常的细胞计数结果可以验证额外的调查以便改善一个或多个这些结果。此外，此类分析不能使得能够精确定量同一群体或家族中的不同细胞群，这是一个很大的缺点，特别是对于检测患者中的某些病理学状况或对于监测其发展。

因此补充分析被证实对于获得血液样品中的所选细胞(例如白细胞)亚群的计数的更精确结果来说是必需的。某些病理学状况(免疫反应或白血病)的出现可以与白细胞类型的细胞群的异常水平相关。

这种补充分析与利用常规自动装置进行的那些不同，其可以是进行手工涂片随后在显微镜下观察。在这种情况下，细胞组分的鉴定和计数一般用于对由自动装置获得的那些进行补充或替代。

它们还可以由特异性细胞标记组成，所述细胞标记通过被选择用于区别经标记的所选细胞群的抗体(可选地包括荧光染料)来进行，或通过本领域已知的任何其他标记方法来进行。例如，可以提及专利申请EP0552707，它公开了利用例如抗-CD45和抗-CD71单克隆抗体进行标记，以便在流式细胞仪中区分所有白细胞。专利申请WO00/16103描述了通过利用抗体或抗体试剂盒进行区别并经荧光测量术进行检测来定量嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。同样地，用抗-CD19、抗-CD14和抗-CD8抗体标记淋巴细胞群使得能够分别分开B淋巴细胞、T辅助淋巴细胞和抑制性T细胞(T Suppressor)的亚群。

尽管这些分析使得能够监督和/或校正由常规自动装置获得的结果，但它们经常导入不准确度并只允许与经自动装置获得的结果的统计学相关。使用更高效的方法例如流式细胞术几乎产生相同的结果，但与利用自动装置获得的结果直接相关是不可能的，因为进行的是两种分开的分析，这降低了全部结果的准确性。

实际上，当生物学流体的等分试样中的细胞组分的分析揭示所述细胞组分的精确计数中的异常时，使用者利用两种独立的分析系统对同一生物学流体的不同等分试样进行第二个独立分析，因此在分开的基础上进行测量，即，每次测量提供不同的结果，这因而需要通过每次测量获得的结果的数学相关性以便最终获得具有误差的结果。这导致具有主观性的结果解释，因为它不允许可靠地鉴定异常结果的真实原因，所述异常结果可以是由于样品自身或设备所引起的，并且还可以显示是病理学状况的精确诊断(如果需要的话)所不能接受的。

本发明提出了现有技术缺点的补救。

为此目的，本发明提出了区分并计数在生物学流体样品中存在的细胞组分的方法，包括：

-一般通过流式细胞术施行的初步细胞学分析步骤，以获得一组初步结果，使得能够将样品中的所有细胞组分区分成不同的群体并计数；以及

-基于所鉴定的细胞特性，对特定类型细胞组分进行补充细胞学分析步骤，以获得补充结果，使得能够区分并计数样品的至少一种细胞群或亚群从而鉴定所述细胞特性。

因此，根据本发明的方法包括对生物学流体或生物学流体等分试样进行常规细胞学分析的第一个步骤，其通常通过流式细胞仪来施行，包括电学和/或光学类型的测量手段(moyen)和试剂，所述试剂为本领域技术人员已知的细胞裂解剂、细胞内材料的染色剂、水性稀释剂及其混合物。来自上述测量手段的信号通常进行处理并转化为“标准化系列结果”，即，整合了分析常规参数的一组结果。因此这使得能够鉴定细胞组分并精确计数，这些细胞组分随后被分为不同群，如在例如专利申请FR9701090中所述的。

第二个步骤，或补充步骤，使得能够获得补充结果，这些补充结果使得能够鉴定细胞特性。

关于特定种类的细胞组分或关于多个群体的异常计数结果使得能够鉴定一种或多种异常。在根据本发明的方法中，这些异常可以例如与异常高数目的胚细胞或异常结构的淋巴细胞相关。

在一个优选实施方案中，首先施行单独的初步步骤，并且如果初步结果允许鉴定至少一种与所鉴定的细胞特性相关的异常，那么同时施行被重复以重新获得该组初步结果的初步步骤和用于获得与这种细胞特性相关的补充结果的补充步骤。

有利地，所述方法进一步包括基于所鉴定的细胞特性的特异性细胞标记步骤，随后为细胞学分析步骤，这使得能够获得用于鉴定样品中包含的所有群体的全部初步结果以及用于鉴定与所鉴定的细胞特性相关的群体或亚群的补充结果。

因此，这些特性产生特殊类型细胞组分的特异性标记步骤，例如血液中的淋巴细胞的亚群，它在血液等分试样中的数目与正常预期的相比是异常的，因此验证了更深入的研究，用于区分并计数这种特殊群体以便尝试确定其不同的亚群。

因此，一旦进行细胞组分标记，那么必需揭示被特异性标记的细胞组分，或者需要时，揭示未被标记的那些。这通过施行补充细胞学测量步骤来完成，所述补充步骤导致用于定量并区分细胞群或亚群细胞组分的额外结果，所述细胞群或亚群细胞组分是与它们的数目或它们的存在相关的异常的根源。如已提及的，操作者施行与经标记的细胞组分的补充步骤相关联并且同时的初步分析的重复分析。因此，这些补充测量的结果联合对于相同生物学流体等分试样而获得的初步分析步骤的重复结果为目标亚群提供了区分和计数结果，所述结果建立在与使得能够建立标准化系列结果的那个等同的参照基础上。因此消除了在连续分析中、在不同分析方法中、在未整合的设备中所固有的所有误差或不精确。

因此，可以对于相同细胞组分测量不同的物理化学特征，特别是利用由于其对至少一种物理化学特征特异的亲和力而选择出的标记物，例如细胞内材料(DNA、RNA)、特殊蛋白或酶、膜结构等。这使得能够区分每种经标记的细胞组分与未标记的细胞组分。因此，随后通过已知方法检测经标记的或未标记的细胞组分(参见下文)。同样地，细胞标记使得能够非常精确地定量细胞组分的不同亚群，例如淋巴细胞群的B、T4、T8淋巴细胞等。

因此，在同一生物学流体样品中，施行根据本发明的方法使得能够表征与对于某些病理学状况来说特有的某些细胞组分存在相关或与其异常低或高的数目相关的特性。因此，允许在确定的群体或亚群中进行细胞内研究。根据本发明的方法使得能够为具有以前从未达到的精确度和可靠性的结果提供可能性，因为对应这些可能性的补充分析与导致标准化系列结果的分析同时并联合进行，由此确保存在所有补充结果和标准化系列结果所共有的参照基础，并由此特别消除了分开的分析的所有缺点。

根据本发明的方法还使得能够消除对于标准化系列结果所观察到的偏差的最大多数的解释误差(erreur d′interprétation)，作为异常这可以接受标准化的系统处理。

根据本发明的方法在单次施行中产生完整和总体的结果，这避免了需要依靠连续、多次和分开的分析，这样的分析可能是从业医师为了获得精确的病理状况诊断而要求的。这个的优点在于它降低了与这些分析有关的成本。

相似地，在鉴定了病理状况以为了监控其发展或治疗有效性的情况下，从业医师有更大的选择来以保证一组与唯一参照基础相关的结果的可靠性的方式来规定待施行的分析。

最后，根据本发明的方法在检测并表征标准化系列结果的细胞特性方面给了从业医师更大的可靠性。

初步细胞学分析步骤有利地包括利用第一种测量手段，其使得能够通过至少一种电学区分手段或光学区分手段来区分样品中存在的所有细胞组分，所述电学区分手段包括阻抗，所述光学区分手段包括衍射、漫射、透射和荧光。

此外，这个初步步骤可以包括利用使得能够区分样品中存在的所有细胞组分的一种或多种试剂。

补充细胞学分析步骤有利地包括利用第二种测量手段，其使得能够区分和计数在生物学流体样品中存在的至少一种细胞群或亚群。

第二种测量手段优选包括利用至少一种光学区分手段。因此，这些第二种测量手段优选包括一种或多种测量通道(canal)，所述测量通道以光学方式运作并能够以单一或组合方式测量选自衍射、透射、荧光或吸光度的光学参数，特别是在某些波长处或波长范围内。

第二种测量手段可以由至少一种测量途径组成，所述测量途径以荧光方式运作并利用一个或多个合理选择的波长。特别地，第二种测量手段在选自从紫外到红外的波长上是可有效运作的。

优选地，特异性细胞标记步骤包括利用至少一种使得能够区分所述细胞特性的标记物，而补充细胞学分析步骤包括利用第二种测量手段，它包括至少一种能够与该组测量同时地鉴定标记物的测量途径。

测量信号的处理可以利用计算机来进行，所述计算机包括用于处理数据和重建结果的适当手段。这些手段可以为两个计算软件，其中一个用于处理信号以便提供结果的图形显示，和另一个用于处理由结果分析获得的信号。计算机可以与指导特异性细胞标记步骤的控制手段相连。

为了施行标记步骤，可以利用至少一种为分子探针的细胞标记物，其选自至少一种染色剂、至少一种与染色剂或荧光染料缀合的抗体。

作为标记物而选择出的染色剂必须与预定测量中的细胞内材料的染色剂不同，即它必须能够通过光学测量技术在与对于检测预定测量中的染色剂所需的波长不同的波长上被检测。

采用至少一种抗体或抗体混合物或抗体试剂盒的标记通常通过抗原/抗体反应来施行，其优选利用单克隆抗体来进行，所述单克隆抗体有利地接合了常规染色剂或荧光染料，例如荧光素或藻红蛋白-花青苷5(PC5)。

此外，对于分析步骤，电学和光学类型的测量手段分别为直流电或交流电的细胞阻抗测量手段，以及选自光衍射、光漫射、光透射或荧光的测量手段。

在本发明的范围内，生物学流体优选为稀释或未稀释的全血、血清、稀释或未稀释的骨髓、脑脊液、尿液、滑液、胸膜液等。

当生物学流体样品为血液样品时，初步细胞学分析步骤有利地包括产生血像所需的测量，包括细胞计数、白细胞分类计数和血小板计数的全部或部分参数。

在这种情况下，可以利用特异性抗体来标记血液样品的细胞组分，这些抗体选自红细胞、白细胞和血小板群体。因此，可以通过在红细胞上进行靶向标记并连同在白细胞或血小板上进行靶向标记来施行根据本发明的方法，在分析中没有彼此相互作用和干扰的风险。

标记步骤有利地利用特异性抗体来进行，所述特异性抗体用于在血液样品细胞群中存在的至少一种特殊亚群的细胞标记。

优选地，标记步骤通过利用用于标记至少一种亚群的特异性抗体来进行，所述亚群选自淋巴细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、红细胞、血小板及其所有前体。

细胞标记步骤可以通过至少一种与荧光染料缀合的抗体或抗体混合物来进行，和补充细胞学分析步骤采用通过正交(orthogonal)荧光类型(FL2)的细胞荧光的测量手段。

细胞标记步骤有利地通过至少一种选自下列的抗体来进行：CD3、CD4、CD8、CD9、CD10、CD11b、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD33、CD34、CD45、CD63、CD64、CD71、CD203、CRTH2、FMC7和HLA-DR。

细胞标记步骤还可以利用至少一种为分子探针的细胞标记物，其选自至少一种染色剂、至少一种与染色剂或荧光染料缀合的抗体。

根据本发明的另一个特征，初步细胞学分析步骤以及补充细胞学分析步骤同时测量同一流中的相同细胞组分的不同物理特征。

根据本发明的方法可以包括下述步骤：将试剂和细胞标记物与生物学流体混合，并将由此获得的混合物转移到分析池中，这使得能够对于相同生物学流体或生物学流体等分试样进行总体和同时的分析，如上文所解释的。

根据本发明的方法使得能够例如为血液样品建立完整的血像，即超越标准化系列结果并包括血液中细胞群的区分和计数的详细鉴定，所述细胞群即淋巴细胞、单核细胞、红细胞、粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞、成红细胞、未成熟的颗粒细胞、血小板及其他胚细胞，并且在如果需要时还有可能检测和计数淋巴细胞群中的异常胚细胞亚群，它不具有与所预期的一致的淋巴细胞分布。例如，这些淋巴母细胞根据其对抗-CD45抗体的非阳性而与其他淋巴细胞群分离。

在另一个方面，本发明涉及施行上述方法的装置，该装置包括以流式细胞术进行运作的设备，具有第一种测量手段，包括至少一种能够测量选自光学参数和电学参数的参数的测量通道，所述光学参数选自衍射、漫射、透射和荧光，以及所述电学参数包括阻抗；第二种分析手段，包括至少一种能够测量选自衍射、透射、荧光和吸光度的光学参数的测量通道；以及用于处理从第一种测量手段和第二种测量手段获得的结果的计算机。

在一个优选实施方案中，第一种测量手段包括轴向衍射(FSC)的传感器、正交漫射(SSC)的传感器、正交荧光(FL1)的传感器和用于测量电阻率的电极，以及所述第二种测量手段包括用于测量正交荧光(FL2)的传感器。

因此，根据本发明的设备包括整合到流式细胞仪中的预定的第一种常规分析手段。有利地，这些手段为生物学流体样品或等分试样的至少一种选自轴衍射(FSC)、正交漫射(SSC)、正交荧光(FL1)和电阻率(RES)的测量或通道参数，如申请人在专利申请EP0425381中所描述的。因此，这些第一种分析手段导致细胞组分的区分及其精确计数，使得能够将其进行分群。

有利地，如申请人在专利申请FR0102489中所述的，初步手段被布置用于引入至少一种用于区分并计数生物学流体的所有细胞组分的试剂，所述试剂选自细胞裂解剂、细胞内材料的染色剂、水性稀释剂及其混合物。

例如利用离子型和/或非离子型去污剂来进行生物学流体的某些细胞组分特别是红细胞的裂解，所述去污剂可以为伯胺、胆酰胺等。裂解剂的选择取决于生物学流体的性质，并且将因此可容易地由本领域技术人员来决定。

细胞组分的染色剂用于与细胞内的DNA或RNA结合。它通常可以为噻唑橙、噻唑蓝等。所述试剂可以任选包括细胞组分的固定剂(agentde fixation)，其是本领域技术人员已知的。

根据本发明的设备的一个实施方案，其进一步包括：

-至少一种细胞特性的鉴定手段，其对应于某些细胞群或某些细胞组分的存在或数目的，

-根据所鉴定的特性的特异性细胞标记手段。

所述标记手段优选包括至少一种为分子探针的细胞标记物，其选自至少一种染色剂、至少一种与染色剂或荧光染料缀合的抗体，并且更优选地，它们为其上接合有荧光染料的至少一种抗体或抗体混合物。

根据本发明的设备的一个实施方案，适合于所述标记手段为一种或多种测量通道，其分别为直流电或交流电的细胞阻抗测量手段以及选自在从紫外到红外波长上经标记的细胞的衍射、光透射和荧光或吸光度的至少一种测量手段。

优选地，通过细胞荧光的测量手段为接合在特异性抗体上的荧光染料的正交荧光(FL2)。

根据本发明的装置的一个优选实施方案，它包括计算机，其被布置用于将来自第一种测量手段和第二种测量手段的结果相关联，并形成来自第一种测量手段和第二种测量手段的结果的图形。

有利地，计算机被布置用于根据其家族或其物理特征对所述细胞组分进行解释和分类。

如上所述，计算机被布置用于处理测量信号，并进一步包括处理数据和重建结果的适当手段。它优选包括储存通过各种分析获得的结果的存储器。

可以想象，在涉及施行这样的分析是否适当时，此类设备可以具有自动决策能力，所述分析是对常规分析的补充，是鉴定和计数被搜寻或被怀疑应对所揭示的异常负责的成分所必需的。

本发明的特征和优点由于下文中的详细描述以及由于非限制性实施例将变得更为明显，其中参考其后所附的图，其中：

-图1显示构成根据一个优选实施方案的分析设备的具体元件(élément)的图；

-图2-19显示通过多参数测量法FSC、RES、SSC、FL1和FL2而获得的细胞分布或二维矩阵的图。

在图1中，以功能图的形式显示了组成根据本发明的设备1的具体元件，所述设备1用于分析生物学流体等分试样。该图部分地采用了专利申请FR0102489中所描述的参数。设备1是基于流式细胞术的自动装置，其具有下述参数和元件：

-单色激光10，

-用于形成光束的装置11，

-通过电阻率和通过光学测量来测量细胞体积的循环池12，

-用于收集轴向衍射(FSC)的辐射的光学系统13，

-提供大小解释的轴向衍射(FSC)的传感器14，

-表示所观察到的细胞结构的正交漫射(SSC)的传感器15，

-测量细胞内RNA和DNA表达的正交荧光(FL1)的传感器16，

-测量与荧光染料接合的抗体的反应性的正交荧光(FL2)的传感器17，

-用于收集正交辐射的光学系统18，

-整合在池12中的电阻率(RES)测量电极19，

-计算机20，

-显示结果的系统21。

在包括光学测量通道的设备1上分析生物学流体等分试样，通过细胞的轴向衍射、正交漫射和正交荧光来进行，其原理在下文中得到简要阐述。

在第一种情况下，将生物学流体的细胞置于测量池12中并且被由源10发出并经设备11调整的光辐射穿透，这些细胞引起入射辐射的衍射，其强度取决于细胞的大小。用于收集衍射辐射的光学系统13被放置成与辐射在一直线上。被衍射的辐射在传感器14上收集，其响应取决于细胞衍射。

正交漫射的原理基于测量穿过细胞组分的光辐射的漫射。辐射在传感器15上被收集并且响应与漫射成正比，所述传感器15与在池12的出口处漫散的辐射成直角。

正交荧光FL1和FL2的测量分别基于这样的原理，即染色细胞在特定波长上激发而发射出具有不同于激发波长的波长的荧光辐射，而接合在特异抗体上的荧光染料的激发反过来又发射出特定的荧光辐射。

用于收集正交辐射FL1和FL2的光学系统18被放置成与由辐射源10所发射的辐射成直角。

设备1还包括通过电阻率(RES)的电学测量通道。这种测量基于下述原理，在其中电流是恒定的电场中，将待测物(élément)放置在池12中，根据欧姆定律该电场中由这个待测物呈现的电阻率导致维持恒流所需的电压增加。

整合在池12中的电极19测量元件的电阻率，从而使得能够评测其体积。

实施例1

如专利申请FR 0102489所述，在基于流式细胞术的常规自动分析装置上分析一等分试样的正常血液以便表征和定量白细胞成分(élément)。

以二维矩阵的形式观察这种分析的结果，所述二维矩阵代表从每种测量通道获得的测量结果的不同组合。为了清晰起见，每个矩阵中代表每种细胞成分的点已被省去。只有界定所获得的每个群体的轮廓线被画出。

图2显示了通过两种通道FSC和SSC获得的矩阵。观察到4个群体：L为淋巴细胞、M为单核细胞、E为嗜酸性粒细胞和N为嗜中性粒细胞。在这个图2中，群体N和E没有明显分开。

图3显示了通过两种通道FSC和FL1获得的矩阵。群体N和E混在一起，并且群体L和M之间存在部分重叠。

图4显示了通过测量通道SSC和FL1形成的矩阵。群体N和E混在一起，并且群体L和M互相完全分开。

图5也显示了通过两种通道RES和FSC形成的矩阵，根据这个安排，群体L和E是分开的，但群体N和M没有分开。

实施例2

利用专利申请FR 0102489中所述的测量通道，在基于流式细胞术的常规自动分析装置上分析一等分试样的血液以便表征和定量白细胞组分。

图6显示了利用两种通道FSC和SSC获得的矩阵。尽管群体L和N具有与图2中的外形相似的外形，但群体L与图2中所示的正常的那种相比异常扩展。这还可以在图7-9中看出，所述图7-9分别对应于图3-5中的矩阵视图。在这些分析结束时，看起来可能的是，在图中的分布比正常淋巴细胞群的分布更为扩展的淋巴细胞群具有异常的细胞成分例如胚细胞成分。

实施例3

利用设备1根据本发明的方法分析一等分试样的实施例2的血液。

该分析如下进行：

抽取50μl的人类血液样品等分试样，将其与包含PC5作为荧光染料的50μl抗-CD45单克隆抗体溶液混合。将由此获得的溶液在没有任何光辐射的情况下并在环境温度下孵育数分钟，大约3-30分钟。由此获得的溶液随后与包含噻唑橙作为细胞内染色剂的试剂混合以裂解红细胞并固定细胞成分，这是进行初步分析步骤所必需的。

在这种情况下，利用激光10发出的噻唑橙的激发波长为488nm，和发射波长为530nm。在这个实施例中，抗-CD45抗体用于特异性标记成熟且正常的白细胞，以表达减少的顺序为淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞和嗜中性粒细胞。

随后将溶液转移到分析设备1的循环池12中。使用者开始以四个通道来分析等分试样从而提供用于区分和计数不同细胞群的常规结果，并且利用计算机20以第五个通道FL2(PC5的激发波长为488nm，和发射波长为660nm)同时进行分析。软件处理来自通过上述通道的每种测量的结果。

图10显示通过两种通道FSC和SSC获得的矩阵。观察到5个群体：L为淋巴细胞、M为单核细胞、E为嗜酸性粒细胞和B为对于抗-CD45抗体来说是阴性的胚细胞。

在该图10中，群体N和E没有明显分开，并且在群体L、M和B之间可以观察到部分重叠。

图11显示通过两种通道FSC和FL1获得的矩阵。群体N和E混在一起，并且群体L、M和B之间存在部分重叠。

图12显示通过测量通道SSC和FL1而形成的矩阵。群体N和E同样也混在一起，并且尽管群体M与其他群体分开，但是可以看出群体B和L没有完全分开。

图13也显示了通过两种通道RES和FSC而形成的矩阵。在这个安排中，存在的群体没有一个明显地分开。

图14显示通过两种通道FL2和SSC而形成的矩阵。这个矩阵视图使得能够分开异常胚细胞群B与淋巴细胞群。

通过利用设备1施行根据本发明的方法，使得能够表征和定量在所分析的血液等分试样中胚细胞B(对于抗-CD45来说为阴性)的存在。图14中显示的补充测量使得能够明确区分胚细胞B，这用血像的所有预定测量是不可能实现的。

实施例4

这个实施例用于提供血液样品中非胚性细胞组分的精确计数，所述血液样品中的胚细胞群在监控对于患者的治疗的范围内是已知的。先前的分析已显示了淋巴细胞群的异常分布，验证了补充的检查。

随后的分析用于鉴定淋巴细胞成分以对它们进行精确计数。

这个鉴定将利用与相同荧光染料PC5缀合的抗-CD19和抗-CD3抗体并且通过经通道FL2检测标记的淋巴细胞来完成。

在早先所述的设备1上就已知的胚细胞群体分析50μl的血液等分试样，并对其实施实施例3中所述分析步骤和试剂。

图15显示通过两种通道FSC和SSC获得的矩阵。观察到3个群体：L为对于经抗-CD3和抗-CD19标记来说为阳性的淋巴细胞，N为嗜中性粒细胞和B为对于这两种抗体来说为阴性的淋巴细胞成分。群体N并非与其他两种群体L和B完全不同，所述群体L和B被观察到有一定程度的群体间重叠。这还可以在图16-18中被看出，所述图16-18分别对应于根据图3-5中的安排的矩阵视图。

图19显示通过两种通道FL2和SSC形成的矩阵。这个矩阵视图使得能够分开所考虑的3个群体，并且特别是在整个白细胞分类计数中分开对于抗-CD3和抗-CD19来说为阳性的淋巴细胞与阴性的淋巴细胞，从而使得能够进行精确计数。图19中显示的补充测量使得能够明确区分对于CD3抗体和对于CD19抗体来说为阳性的淋巴细胞，这用血像的所有预定测量是不可能实现的。

Claims (24)

1.区分并计数在生物学流体样品中存在的细胞组分的方法，其特征在于，所述方法包括：

-一般通过流式细胞术施行的初步细胞学分析步骤，以获得一组初步结果，使得能够将样品中的所有细胞组分区分成不同的群体并计数，以及

-基于所鉴定的细胞特性，对特定类型细胞组分进行补充细胞学分析步骤，以获得补充结果，使得能够区分并计数样品的至少一种细胞群或亚群从而鉴定所述细胞特性。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于，首先施行单独的初步步骤，并且如果初步结果允许鉴定至少一种与所鉴定的细胞特性相关的异常，则随后同时施行被重复以重新获得该组初步结果的初步步骤和用于获得与这种细胞特性相关的所述补充结果的补充步骤。

3.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述方法进一步包括基于所鉴定的细胞特性的特异性细胞标记步骤，随后为细胞学分析步骤，这使得能够获得用于鉴定样品中包含的所有群体的该组初步结果以及用于鉴定与所鉴定的细胞特性相关的群体或亚群的补充结果。

4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其特征在于，所述初步细胞学分析步骤包括利用第一种测量手段，所述第一种测量手段使得能够通过至少一种电学区分手段或光学区分手段来区分在所述样品中存在的所有细胞组分，所述电学区分手段包括阻抗，和所述光学区分手段包括衍射、漫射、透射和荧光。

5.根据权利要求4的方法，其特征在于，所述初步细胞学分析步骤包括使用使得能够区分在所述样品中存在的所有细胞组分的一种或多种试剂。

6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其特征在于，所述补充细胞学分析步骤包括利用第二种测量手段，所述第二种测量手段使得能够区分并计数在生物学流体样品中存在的至少一种细胞群或亚群。

7.根据权利要求6的方法，其特征在于，所述第二种测量手段包括使用至少一种光学区分手段。

8.根据权利要求7的方法，其特征在于，所述第二种测量手段包括一种或多种测量途径，所述测量途径以光学方式运作并能够以单一或组合方式测量选自衍射、透射、荧光或吸光度的光学参数，特别是在某些波长处或波长范围内。

9.根据权利要求8的方法，其特征在于，所述第二种测量手段由至少一种测量途径组成，所述测量途径以荧光方式运作并利用一个或多个合理选择的波长。

10.根据权利要求9的方法，其特征在于，通过以荧光方式运作的所述第二种测量手段在选自从紫外到红外的波长上是可有效运作的。

11.根据组合在一起的权利要求3和6的方法，其特征在于，所述特异性细胞标记步骤包括利用至少一种使得能够区分所述细胞特性的标记物，和所述补充细胞学分析步骤包括利用第二种测量手段，它包括至少一种能够与该组测量同时地鉴定标记物的测量途径。

12.根据权利要求1-11中任一项的方法，其特征在于，所述生物学流体样品选自下列：

-稀释或未稀释的全血或非全血，

-血清，

-稀释或未稀释的骨髓，

-脑脊液，

-尿液，

-滑液，

-胸膜液。

13.根据权利要求1-12中任一项的方法，其特征在于，所述生物学流体样品为血液样品，和所述初步细胞学分析步骤包括产生血像所需的测量，包括细胞计数、白细胞分类计数和血小板计数的全部或部分参数。

14.根据权利要求3-13中任一项的方法，其特征在于，所述生物学流体样品为血液样品，和所述细胞标记步骤包括利用用于标记血液样品的细胞组分的特异性抗体，这些抗体选自红细胞、白细胞和血小板群体。

15.根据权利要求14的方法，其特征在于，所述细胞标记步骤包括利用特异性抗体，其用于进行在所述血液样品的细胞群中存在的至少一种特殊亚群的细胞标记。

16.根据权利要求14和15中任一项的方法，其特征在于，所述细胞标记步骤包括利用用于标记至少一种亚群的特异性抗体，所述亚群选自淋巴细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、红细胞、血小板及其所有前体。

17.根据权利要求3-16中任一项的方法，其特征在于，所述细胞标记步骤通过至少一种与荧光染料缀合的抗体或抗体混合物来进行，和所述补充细胞学分析步骤采用通过正交荧光类型(FL2)的细胞荧光的测量手段。

18.根据权利要求3-17中任一项的方法，其特征在于所述细胞标记步骤通过至少一种选自下列的抗体来进行：CD3、CD4、CD8、CD9、CD10、CD11b、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD33、CD34、CD45、CD63、CD64、CD71、CD203、CRTH2、FMC7和HLA-DR。

19.根据权利要求3-17中任一项的方法，其特征在于，所述细胞标记步骤利用至少一种为分子探针的细胞标记物，其选自至少一种染色剂、至少一种与染色剂或荧光染料缀合的抗体。

20.根据权利要求1-19中任一项的方法，其特征在于，所述初步细胞学分析步骤和所述补充细胞学分析步骤同时测量同一流中的相同细胞组分的不同物理特征。

21.用于施行根据权利要求1-20中任一项的方法的装置，其特征在于，它包括以流式细胞术进行运作的设备(1)，具有第一种测量手段(14、15、16、19)，包括至少一种能够测量选自光学参数和电学参数的参数的测量通道，所述光学参数选自衍射、漫射、透射和荧光，以及所述电学参数包括阻抗；第二种分析手段(17)，包括至少一种能够测量选自衍射、透射、荧光和吸光度的光学参数的测量通道；以及用于处理从第一种测量手段和第二种测量手段获得的结果的计算机(20)。

22.根据权利要求21的装置，其特征在于，所述第一种测量手段包括轴向衍射(FSC)的传感器(14)、正交漫射(SSC)的传感器(15)、正交荧光(FL1)的传感器(16)和用于测量电阻率(RES)的电极(19)，以及所述第二种测量手段包括用于测量正交荧光(FL2)的传感器(17)。

23.根据权利要求21和22中任一项的装置，其特征在于，所述计算机(20)被布置用于将来自第一种测量手段和第二种测量手段的结果相关联，并形成来自第一种测量手段和第二种测量手段的结果的图形。

24.根据权利要求23的装置，其特征在于，所述计算机(20)被布置用于根据其家族或其物理特征对所述细胞组分进行解释和分类。

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