CN103234949A - 一种船舶压载水中微藻活性检测方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种船舶压载水中微藻活性检测方法及装置，所述装置包括平台、微流控芯片、驱动组件、光激发组件、光检测组件和数据处理组件，所述平台为暗室结构，光激发组件与平台连接，微流控芯片和光检测组件固定在平台内，驱动组件与微流控芯片连接，光检测组件与数据处理组件连接，本发明有益效果为检测装置结构简单、携带方便，检测方法简单科学。

Description

一种船舶压载水中微藻活性检测方法及装置

技术领域

本发明涉及一种船舶压载水中微藻活性检测方法及装置。

背景技术

船舶压载水是外来海洋生物入侵的主要途径之一，外来有害海洋生物入侵传播造成的灾害，对生态、工业、农业以及人类健康等都造成了严重的影响，在《船舶压载水及沉积物控制和管理国际公约》中规定了船舶排放时的压载水性能应满足的标准，其中重要的一项内容是压载水中不同尺寸存活生物的浓度，而微藻是船舶压载水中最普遍存在的一种生物，也是目前船舶压载水处理和检测的主要目标。

目前对于船舶压载水检测的方法主要有：光学显微镜计数法、染料荧光显微镜计数法、流式细胞仪计数法、分子及生化方法等。

光学显微镜计数法，即利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微藻计数方法，将微藻悬液放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室内，由于载玻片上的计数室盖上盖玻片后的容积是一定的，所以可以根据在显微镜下观察判断微藻活性并将活性微藻数目换算为单位体积内的微藻数目。该方法克服了非藻颗粒物的干扰，计数结果更接近真实值，但工作强度大、效率低，同时要求实验人员必须具备丰富的水生生物学知识，能鉴定识别常见藻类并判断活性，人为因素影响和误差较大。

染料荧光显微镜计数法，即通过对微藻样品进行荧光染料的染色，荧光染料与微藻体内某些活性物质（如DNA等）结合，不同活性的微藻所染荧光强度不同，通过荧光显微镜即可观察记录活性微藻数量。该种方法克服了人为观察微藻活性的缺点，一定程度上提高了准确性；然而每种染料根据各自染色机理的不同，只能对某些藻成立，普适性差，并且染色过程繁琐，需要具有专业知识的人员进行染色，染色过程易受外界各种因素干扰，某些染料本身存在毒性。

流式细胞仪计数法，即利用商用化流式细胞仪进行微藻细胞的计数，经荧光染料标记过的微藻细胞制成的悬液，以一定的流速通过检测区域，微藻细胞在外界激发光的作用下，发出特异荧光信号和散射光信号，根据这些信号来判断微藻细胞的大小、数量、内部物质等，克服人工操作带来的计数误差，工作效率高，具有快速准确的优点，是目前生物数量测定的标准方法之一；该方法的缺点是：商用流式细胞仪价格昂贵、体积庞大，不便于现场检测，样前处理繁琐，操作复杂，另外，藻类活性的判断依然依靠荧光染料进行，荧光染料存在的上述缺点仍未得到解决。

分子及生化方法，主要包括：核酸杂交技术，聚合酶链反应（PCR）技术、基因芯片技术、DNA指纹技术、酶活性分析等，优点是：检测灵敏度高，是目前检测灵敏度最高的技术；缺点是：对于微藻体积测量无能为力，所需设备昂贵、笨重，基本采用收集样品后拿回实验室进行培养鉴定，耗时费力，效率不高，并且进行检测的种类也相对有限，对不断出现的新的种类缺乏了解而无法确认，该方法需要受过高度训练的技术人员来准备样品和分析结果。

综上分析，微藻活性现场快速实时检测及计数是船舶压载水检测急需解决的关键问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种结构简单、方便携带，免标记的用于现场快速测量的船舶压载水中微藻活性检测方法及装置，本发明克服了现有船舶压载水中微藻活性检测方法中存在的无法现场检测、检测设备昂贵、样品处理繁琐、染料带来的普适性和误差等问题，从根本上解决船舶压载水中微藻活性计数问题。这将对于生化传感领域以及船舶运输行业具有重要的科学意义和现实价值。

本发明提供了一种船舶压载水中微藻活性检测装置，所述装置包括平台、微流控芯片、驱动组件、光激发组件、光检测组件和数据处理组件，所述平台为暗室结构，光激发组件与平台连接，微流控芯片和光检测组件固定在平台内，驱动组件与微流控芯片连接，光检测组件与数据处理组件连接；

所述微流控芯片由玻璃片和固定在玻璃片上的聚二甲基硅氧烷组成，所述聚二甲基硅氧烷表面设有若干个样品储液池、若干个鞘液储液池和若干个废液储液池，样品储液池设有与样品储液池连通的样品通道，鞘液储液池设有与鞘液储液池连通的鞘液通道，废液储液池设有与废液储液池连通的检测通道，样品通道和鞘液通道交汇后与检测通道连通，检测通道设有检测区域，样品储液池、鞘液储液池和废液储液池设有驱动组件。

本发明所述装置采用微流控芯片、数据处理组件使用微处理器、光检测组件使用光电倍增管或单光子计数模块，使装置具有微型化的特征，比现有仪器具有体积小、重量轻、便于携带，能用于现场检测。

本发明所述光激发组件的光斑所覆盖区域布满所述微流控芯片的检测区域。

本发明所述驱动组件优选为压力驱动组件或电力驱动组件。

本发明所述光激发组件优选为固定在平台内或通过密封结构与平台连接。

本发明所述平台为暗室结构，能有效排除除激发光之外其余杂散光的干扰，光激发组件优选为固定在平台内或通过密封结构与平台连接，其目的在于使平台不透光。

本发明提供了一种船舶压载水中微藻活性检测方法，所述方法包括如下步骤：

①将鞘液加入到鞘液储液池，将船舶压载水加入到样品储液池，开启光激发组件、光检测组件、数据处理组件、鞘液储液池的驱动组件和样品储液池的驱动组件，使鞘液和船舶压载水分别沿着鞘液通道和样品通道经过检测通道流向废液储液池，船舶压载水中微藻经过检测区域时微藻单细胞内叶绿素被激发光激发产生瞬时光子辐射；

②通过脉冲信号的强弱和数量，获取船舶压载水中微藻活性强弱和微藻数量。

本发明所述船舶压载水在鞘液作用下，船舶压载水中微藻细胞聚焦后一个一个经过检测区域，避免了多个微藻细胞同时经过检测区域而产生的误差，在检测区域处，利用一束激发光照射微藻细胞，使微藻细胞内叶绿素吸收激发光并产生叶绿素荧光，叶绿素荧光被光检测组件检测到，光强大小表征微藻细胞活性强弱，光强越强，则微藻细胞活性越强；反之，光强越弱，则微藻细胞活性越弱。

本发明有益效果为：

①通过检测微藻自身荧光信号强度自动完成对微藻活性的区分，操作简单，克服了传统方法中人工计数时带来的人为因素影响、误差以及对操作人员须具备丰富的水生生物学知识的要求；

②对于微藻活性的判别是通过检测微藻自身荧光信息进行的，这些荧光信息是与其活性密切相关的内在探针，这样无需对微藻进行外部标记，不仅能够克服外部标记过程中带来的误差、操作复杂、耗时等缺点，更重要的是这种利用微藻自身内在探针的免标记方法具有普适性；

③由于采用微流控芯片作为船舶压载水检测的微平台，而相关的光电检测设备亦可采用体积较小的结构形式，因此，相对于现有大型检测设备，本检测装置具有体积小、重量轻、便于携带，能够进行手持用于现场检测等优点。

附图说明

本发明附图4幅，

图1为船舶压载水中微藻活性检测装置结构示意图；

其中，1、微流控芯片，2、光检测组件，3、数据处理组件，4、光激发组件，5、平台。

图2为微流控芯片结构示意图；

其中，11、玻璃片，12、聚二甲基硅氧烷，13、样品储液池，14、鞘液储液池，15、样品通道，16、鞘液通道，17、检测通道，18、检测区域，19、废液储液池，6、电力驱动组件。

图3为实施例1有活性盐藻的数量检测结果。

图4为实施例1不同温度下盐藻活性强弱检测结果。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

结合附图1、2说明实施例1。

一种船舶压载水中微藻活性检测装置；

所述装置包括平台5、微流控芯片1、电力驱动组件6、光激发组件4、光检测组件2和数据处理组件3，所述平台1为暗室结构，光激发组件2通过密封结构与平台5连接，微流控芯片1和光检测组件2固定在平台1内，电力驱动组件6与微流控芯片1连接，光检测组件2与数据处理组件3连接；

所述微流控芯片1由玻璃片11和固定在玻璃片上的聚二甲基硅氧烷12组成，所述聚二甲基硅氧烷12表面设有一个样品储液池13、两个鞘液储液池14和一个废液储液池19，样品储液池13设有与样品储液池13连通的样品通道15，鞘液储液池14设有与鞘液储液池14连通的鞘液通道16，废液储液池19设有与废液储液池19连通的检测通道17，样品通道15和鞘液通道16交汇后与检测通道17连通，检测通道17设有检测区域18，样品储液池13、鞘液储液池14和废液储液池19设有电力驱动组件6。

所述船舶压载水中微藻活性检测方法；

所述方法包括如下步骤：

①将10μL鞘液加入到鞘液储液池14，将1μL船舶压载水加入到样品储液池13，开启光激发组件4、光检测组件2、数据处理组件3、鞘液储液池14的电力驱动组件6和样品储液池13的电力驱动组件6，使鞘液和船舶压载水分别沿着鞘液通道16和样品通道15经过检测通道17流向废液储液池19，船舶压载水中微藻经过检测区域18时微藻单细胞内叶绿素被激发光激发产生瞬时光子辐射；

②数据处理组件的脉冲信号，其脉冲强度的绝对值均大于100mV，脉冲数量为16个，获取船舶压载水中微藻密度为16个/微升，结果见附图3。

③将上述活性盐藻样品分别在20、30、40、50、60、70、80和90℃进行恒温10min的热处理，保持盐藻形状完好，而后通过上述步骤①和②进行检测，当样品经过检测区域18时，产生的脉冲电压绝对值随温度升高而减小，90℃热处理的样品无脉冲产生，测五次取平均值，结果见附图4。

对比例1

血球计数板细胞计数法测定船舶压载水中微藻数量；

在细胞计数板计数区放置计数专用的盖玻片，用玻璃虹吸管吸取混匀的船舶压载水，在盖玻片下侧的计数板凹槽滴入船舶压载水至盖玻片被充满，将计数板置于显微镜下计数，测定三次取平均值，获取船舶压载水中微藻密度为10～20个/微升。

Claims (4)

1.一种船舶压载水中微藻活性检测装置，其特征在于：所述装置包括平台（5）、微流控芯片（1）、驱动组件（6）、光激发组件（4）、光检测组件（2）和数据处理组件（3），所述平台（5）为暗室结构，光激发组件（4）与平台（5）连接，微流控芯片（1）和光检测组件（2）固定在平台（5）内，驱动组件（6）与微流控芯片（1）连接，光检测组件（2）与数据处理组件（3）连接；

所述微流控芯片（1）由玻璃片（11）和固定在玻璃片上的聚二甲基硅氧烷（12）组成，所述聚二甲基硅氧烷（12）表面设有若干个样品储液池（13）、若干个鞘液储液池（14）和若干个废液储液池（19），样品储液池（13）设有与样品储液池（13）连通的样品通道（15），鞘液储液池（14）设有与鞘液储液池（14）连通的鞘液通道（16），废液储液池（19）设有与废液储液池（19）连通的检测通道（17），样品通道（15）和鞘液通道（16）交汇后与检测通道（17）连通，检测通道（17）设有检测区域（18），样品储液池（13）、鞘液储液池（14）和废液储液池（19）设有驱动组件（6）。

2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于：所述驱动组件（6）为压力驱动组件或电力驱动组件。

3.根据权利要求1所述的装置，其特征在于：所述光激发组件（4）固定在平台（5）内或通过密封结构与平台（5）连接。

4.一种船舶压载水中微藻活性检测方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

①将鞘液加入到鞘液储液池（14），将船舶压载水加入到样品储液池（13），开启光激发组件（4）、光检测组件（2）、数据处理组件（3）、鞘液储液池（14）的驱动组件（6）和样品储液池（13）的驱动组件（6），使鞘液和船舶压载水分别沿着鞘液通道（16）和样品通道（15）经过检测通道（17）流向废液储液池（19），船舶压载水中微藻经过检测区域（18）时微藻单细胞内叶绿素被激发光激发产生瞬时光子辐射；

②通过脉冲信号的强弱和数量，获取船舶压载水中微藻活性强弱和微藻数量。

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