CN111549093A - 一种水中阿米巴孢子的快速计数方法及其应用 - Google Patents

一种水中阿米巴孢子的快速计数方法及其应用 Download PDF

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Abstract

一种水中阿米巴孢子的快速计数方法及其应用，本发明涉及微生物的检测方法领域。本发明要解决现有阿米巴孢子计数方法存在操作复杂，效率低的技术问题。方法：制备多种浓度的阿米巴孢子液；对各浓度阿米巴孢子液进行精确计数测量，获得各浓度阿米巴孢子液中阿米巴孢子量；测定各浓度阿米巴孢子液吸光度；通过建立标准曲线，获得线性回归方程；稀释待测样品；测定稀释阿米巴孢子液的吸光度；利用线性回归方程计算稀释阿米巴孢子液中的阿米巴孢子量。本发明方法设计巧妙，方便快速，准确性高，结果可靠，成本低，应用广泛，具有良好的实用性和广泛性。本发明用于快速测量水中阿米巴孢子计数及阿米巴孢子相关检测中。

Description

一种水中阿米巴孢子的快速计数方法及其应用
技术领域
本发明涉及微生物的检测方法领域。
背景技术
阿米巴(amoebas)是原生生物六大类群之一，分布十分广泛，是土壤中主要的原生动物，在土壤的物质循环、能量转化、细菌群落调控、碳氮元素矿化、植物促生等方面都发挥了关键作用。研究表明，阿米巴与细菌有着复杂的互作关系：它捕食细菌，也会被致病菌感染，还能和细菌形成稳定的共生关系。阿米巴利用孢子进行繁殖，其孢子具有迁移能力强、抗热抗氧化等特性。一旦阿米巴被致病菌感染，产出的孢子经过土壤进入水体，进一步污染地下水、江河湖泊地表水、饮用水，将严重危害生态安全和人体健康。临床上，溶组织内阿米巴引发的病例多，感染面广，危害大。
对水中阿米巴孢子的定量监测和准确计数，是防控污染、保护饮用水源安全和人体健康的重要措施。现有的孢子计数方法有平板菌落计数法、血球计数板计数法、流式细胞仪计数法等。
传统的平板菌落计数法需要将待测样品充分稀释，其中的微生物充分分散成单个细胞，然而待测样品往往不宜完全分散成单个细胞，阿米巴繁殖速度很快，影响孢子量测定，难以获得精确的结果。
血球计数板计数法需要利用血球计数板和显微镜进行逐点计数，在样品浓度较高时容易出现重复计数或漏数的情况，存在人工操作繁琐、工作量大、耗时长、效率低、准确度欠缺等问题。
使用流式细胞仪、库尔特计数仪等仪器进行计数成本较高，同时阿米巴孢子容易沉淀，堵塞管道，虽然计数快速准确，但是不利于广泛推广使用。
发明内容
本发明要解决现有阿米巴孢子计数方法存在操作复杂，效率低的技术问题，而提供一种水中阿米巴孢子的快速计数方法及其应用。
一种水中阿米巴孢子的快速计数方法，按以下步骤进行：
一、挑取含有阿米巴孢子的培养基，然后采用磷酸盐缓冲液进行稀释，分别稀释1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍，获得不同浓度的阿米巴孢子液；
二、采用血球计数板计数法，将步骤一获得各浓度阿米巴孢子液进行精确计数测量，每种浓度重复测量3～5次，计算平均值即为各浓度阿米巴孢子液中阿米巴孢子量C；
三、采用紫外可见分光光度计分别测定步骤一获得各浓度阿米巴孢子液吸光度A；测定波长为250nm～265nm；
四、以步骤二获得的各浓度阿米巴孢子液中孢子量C为横坐标，以步骤三获得的各浓度阿米巴孢子液的吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程y＝ax+b，其中y为不同浓度阿米巴孢子液的吸光度A，x为不同浓度的阿米巴孢子液中孢子量C，单位为个/mL，并根据步骤二和步骤三中已测得的数据，计算得出a和b的值；
五、将含阿米巴孢子的待测样品稀释，获得稀释阿米巴孢子液；
六、采用紫外可见分光光度计测定步骤五获得的稀释阿米巴孢子液的吸光度；
七、通过步骤六获得的吸光度，利用步骤四获得的线性回归方程计算步骤五获得的稀释阿米巴孢子液中的阿米巴孢子量。
本发明方法在原有的传统计数方法基础上，结合了吸光光度法的理论，即光被吸收的量正比于光程中产生光吸收的分子数目。根据通过血球计数板计数法得到的阿米巴孢子量和通过分光光度计测得的吸光度之间的线性关系，建立标准曲线，具有良好的相关性。
本发明的有益效果是：
本发明方法设计巧妙，方便快速，准确性高，结果可靠，成本低，应用广泛，具有良好的实用性和广泛性。与平板菌落计数法相比，本发明不需要将待测样品充分稀释培养，减少了复杂步骤，数据结果更为准确，在短时间实时监测中更具优势；与血球计数板计数法相比，本发明操作简便，相同时间内测定的样品数量显著增加，同时排除了人为可能造成的重复计数和漏数等问题，在需要进行大量样品检测工作中更具优势；与流式细胞仪计数法相比，本发明方法能达到相当的准确性和可靠性，同时降低检测成本，对仪器的污染损耗更低，在监测领域的广泛应用中更具优势。
通过验证当阿米巴孢子液中阿米巴孢子量在105-107个/mL范围内，在250nm、255nm、260nm、265nm波长处的吸光度和孢子量的线性相关系数为0.999，说明回归方程有良好的线性关系，准确率高。建立标准曲线和线性回归方程后，可对大量含阿米巴孢子的样品进行吸光度检测，从而快速计算出阿米巴孢子液中孢子量C，显著提高检测效率。
本发明用于快速测量水中阿米巴孢子计数及阿米巴孢子相关检测中。
附图说明
图1为采用紫外可见分光光度计对实施例一步骤一中稀释1倍的阿米巴孢子液的190～900nm全波长扫描图；
图2为实施例一步骤四获得标准曲线图；
图3为实施例二步骤四获得标准曲线图；
图4为实施例三步骤四获得标准曲线图；
图5为实施例四步骤四获得标准曲线图；
图6是实施例五检测两种过滤介质对阿米巴孢子去除效果图，其中■代表过滤介质T1，●代表过滤介质T2；
图7为对比实验得到的流式细胞仪计数法的回归曲线图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举的具体实施方式，还包括各具体实施方式之间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式一种水中阿米巴孢子的快速计数方法，按以下步骤进行：
一、挑取含有阿米巴孢子的培养基，然后采用磷酸盐缓冲液进行稀释，分别稀释1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍，获得不同浓度的阿米巴孢子液；
二、采用血球计数板计数法，将步骤一获得各浓度阿米巴孢子液进行精确计数测量，每种浓度重复测量3～5次，计算平均值即为各浓度阿米巴孢子液中阿米巴孢子量C；
三、采用紫外可见分光光度计分别测定步骤一获得各浓度阿米巴孢子液吸光度A；测定波长为250nm～265nm；
四、以步骤二获得的各浓度阿米巴孢子液中孢子量C为横坐标，以步骤三获得的各浓度阿米巴孢子液的吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程y＝ax+b，其中y为不同浓度阿米巴孢子液的吸光度A，x为不同浓度的阿米巴孢子液中孢子量C，单位为个/mL，并根据步骤二和步骤三中已测得的数据，计算得出a和b的值；
五、将含阿米巴孢子的待测样品稀释，获得稀释阿米巴孢子液；
六、采用紫外可见分光光度计测定步骤五获得的稀释阿米巴孢子液的吸光度；
七、通过步骤六获得的吸光度，利用步骤四获得的线性回归方程计算步骤五获得的稀释阿米巴孢子液中的阿米巴孢子量。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中稀释后阿米巴孢子液中阿米巴孢子量为105～107个/mL。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾和氢氧化钠的混合溶液，pH为7，其中磷酸二氢钾的浓度为0.0068g/mL，氢氧化钠的浓度为29.1mol/mL。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤二血球计数板计数法采用25格×16格计数板或16格×25格计数板。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤三在测定前，采用步骤一所述的磷酸盐缓冲液校准分光光度计基线。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤三中测定波长为250nm、255nm、260nm或265nm。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤五中采用步骤一所述的磷酸盐缓冲液对含阿米巴孢子的待测样品稀释。其它与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤五中获得稀释阿米巴孢子液中阿米巴孢子量为105～107个/mL。其它与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤六在测定前，采用步骤一所述的磷酸盐缓冲液校准分光光度计基线，且测定波长采用步骤三检测吸光度时的测定波长。其它与具体实施方式一至八之一相同。
具体实施方式十：本实施方式一种水中阿米巴孢子的快速计数方法作为检测手段应用在检测过滤介质对阿米巴孢子的截流过滤效果中。
采用以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例一
本实施例一种水中阿米巴孢子的快速计数方法，按以下步骤进行：
一、用灭菌接种环挑取含有生长状态良好的阿米巴孢子的培养基，然后采用磷酸盐缓冲液进行稀释，分别稀释1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍，获得不同浓度的阿米巴孢子液；
二、采用血球计数板计数法，用血球计数板和显微镜将步骤一获得各浓度阿米巴孢子液进行精确计数测量，每种浓度重复测量3次，计算平均值即为各浓度阿米巴孢子液中阿米巴孢子量C；
三、采用步骤一所述的磷酸盐缓冲液校准紫外可见分光光度计基线，然后采用该紫外可见分光光度计分别测定步骤一获得各浓度阿米巴孢子液吸光度A；其中紫外可见分光光度计测定波长为265nm，且每组浓度设置3个平行样，结果取平均值；
四、以步骤二获得的各浓度阿米巴孢子液中孢子量C为横坐标，以步骤三获得的各浓度阿米巴孢子液的吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程y＝ax+b，其中y为不同浓度阿米巴孢子液的吸光度A，x为不同浓度的阿米巴孢子液中孢子量C，单位为个/mL，并根据步骤二和步骤三中已测得的数据，计算得出a和b的值；
五、将含阿米巴孢子的待测样品稀释，获得稀释阿米巴孢子液；
六、采用紫外可见分光光度计测定步骤五获得的稀释阿米巴孢子液的吸光度；其中紫外可见分光光度计测定波长为265nm，且每组浓度设置3个平行样，结果取平均值；
七、通过步骤六获得的吸光度，利用步骤四获得的线性回归方程计算步骤五获得的稀释阿米巴孢子液中的阿米巴孢子量。
实施例二：本实施例与实施例一不同的是：步骤三中紫外可见分光光度计测定波长为260nm；步骤六中紫外可见分光光度计测定波长为260nm。其他步骤及参数与实施例一均相同。
实施例三：本实施例与实施例一不同的是：步骤三中紫外可见分光光度计测定波长为255nm；步骤六中紫外可见分光光度计测定波长为255nm。其他步骤及参数与实施例一均相同。
实施例四：本实施例与实施例一不同的是：步骤三中紫外可见分光光度计测定波长为250nm；步骤六中紫外可见分光光度计测定波长为250nm。其他步骤及参数与实施例一均相同。
图1为采用紫外可见分光光度计对实施例一步骤一中稀释1倍的阿米巴孢子液的190～900nm全波长扫描图；由图中可以看出阿米巴孢子液的最佳吸收波长范围为250～265nm。
图2为实施例一步骤四获得标准曲线图；
图3为实施例二步骤四获得标准曲线图；
图4为实施例三步骤四获得标准曲线图；
图5为实施例四步骤四获得标准曲线图；
通过对实施例一～实施例四获得的标准曲线图进行线性回归分析，得到线性回归方程，结果如表1所示。
表1各波长下获得的线性回归方程
Figure BDA0002494636060000061
表1中，y为特定波长处不同浓度阿米巴孢子液的吸光度A，x为特定波长处不同浓度的阿米巴孢子液中孢子量C，单位为个/mL，R2为线性相关系数。
由表1可知，当阿米巴孢子液中阿米巴孢子量在105-107个/mL范围内，在250nm、255nm、260nm、265nm波长处的吸光度和孢子量的线性相关系数为0.999，说明回归方程有良好的线性关系。
因此建立标准曲线和线性回归方程后，可对大量含阿米巴孢子的样品进行吸光度检测，从而快速计算出阿米巴孢子液中孢子量C，显著提高检测效率。
实施例五
本实施例一种水中阿米巴孢子的快速计数方法作为检测手段应用在检测过滤介质对阿米巴孢子的截流过滤效果中，具体按以下步骤进行：
一、用灭菌接种环挑取含有生长状态良好的阿米巴孢子的培养基，然后采用磷酸盐缓冲液进行稀释，分别稀释1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍，获得不同浓度的阿米巴孢子液；
二、采用血球计数板计数法，用血球计数板和显微镜将步骤一获得各浓度阿米巴孢子液进行精确计数测量，每种浓度重复测量3次，计算平均值即为各浓度阿米巴孢子液中阿米巴孢子量C；
三、采用步骤一所述的磷酸盐缓冲液校准紫外可见分光光度计基线，然后采用该紫外可见分光光度计分别测定步骤一获得各浓度阿米巴孢子液吸光度A；其中紫外可见分光光度计测定波长为265nm，且每组浓度设置3个平行样，结果取平均值；
四、以步骤二获得的各浓度阿米巴孢子液中孢子量C为横坐标，以步骤三获得的各浓度阿米巴孢子液的吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程y＝ax+b，其中y为不同浓度阿米巴孢子液的吸光度A，x为不同浓度的阿米巴孢子液中孢子量C，单位为个/mL，并根据步骤二和步骤三中已测得的数据，计算得出a和b的值；
五、挑取固体培养基中生长状态良好的阿米巴孢子，溶于pH＝7的磷酸盐缓冲液并稀释10倍，获得稀释阿米巴孢子液；
六、选用两种规格的过滤介质T1和T2，分别采用过滤介质T1和T2湿法填充到内径
Figure BDA0002494636060000071
的过滤柱中，控制过滤流量为5mL/min，pH＝7.00±0.1，离子强度为50mmol/L KCl，室温条件下依次对步骤五获得的稀释阿米巴孢子液进行过滤实验；过滤介质T1为粒径0.707-0.841mm的石英砂，过滤介质T2为粒径0.354-0.420mm的石英砂；
七、步骤六实验开始后，随时间取样，使用紫外可见分光光度计测定过滤后稀释阿米巴孢子液在波长265nm处的吸光度，通过吸光度和孢子量之间建立的线性回归方程计算样品中阿米巴孢子量。
实施例五步骤一所述的含有生长状态良好的阿米巴孢子的培养基与实施例一步骤一所述的含有生长状态良好的阿米巴孢子的培养基相同；实施例五步骤四获得标准曲线与实施例一步骤四获得标准曲线相同。
图6是实施例五检测两种过滤介质对阿米巴孢子去除效果图，其中■代表过滤介质T1，●代表过滤介质T2。
由图6可知，采用本发明测定样品中阿米巴孢子量可以反映两种不同规格的过滤介质T1和T2对阿米巴孢子去除效果的影响。
由此本方法与传统的血球计数板计数法相比，传统方法需要进行大量含阿米巴孢子样品测得工作，而使用本发明方法计数具有更简便、更高效率等优势。并且本发明除了在本实施例中的应用，还能广泛推广到其他阿米巴孢子相关检测中。
对比实验
流式细胞仪是指对处在快速直线流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数的、快速的定量分析和分选的技术。样品中的悬浮颗粒(如阿米巴孢子)在鞘液的包被下呈单行排列，依次流经检测区域；在检测区，激光束照射在通过的颗粒上，一方面由于颗粒大小和内部结构等的差异向四周发射不同角度的散射光；另一方面颗粒吸收光能激发不同波长或颜色的荧光，而这些散射光和荧光都能被不同的检测器检测产生信号。流式细胞仪具有分析速度快、精确度高、样品预处理更简单等优点，但是由于价格昂贵，且属精密仪器，应用受限。
使用流式细胞仪对阿米巴孢子计数的具体实施步骤为：
一、准备含阿米巴孢子的待测液，挑取固体培养基中生长状态良好的阿米巴孢子，分别用pH＝7的磷酸盐缓冲液稀释，其中孢子量为1×104～1×106个/mL，移入试管；
二、振荡摇匀后，从试管中移取400μL的待测溶液至3.5mL的样品管，随后加入适量染色剂振荡混匀并避光存放30min；
三、取磷酸盐缓冲液稀释样品指定倍数，混匀过滤后即可使用流式细胞仪进行计数；
四、将测得的数据与阿米巴孢子浓度进行拟合，得到流式细胞仪计数法的回归曲线。
图7为对比实验得到的流式细胞仪计数法的回归曲线图；由图可以看出强度和孢子量的线性相关系数为0.999，说明回归方程有良好的线性关系。因此与流式细胞仪计数法相比，本发明方法能达到相当的准确性和可靠性，同时降低检测成本，对仪器的污染损耗更低，降低了阿米巴孢子准确定量对昂贵仪器的依赖性，在监测领域的广泛应用中更具优势。

Claims (10)

1.一种水中阿米巴孢子的快速计数方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
一、挑取含有阿米巴孢子的培养基，然后采用磷酸盐缓冲液进行稀释，分别稀释1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍，获得不同浓度的阿米巴孢子液；
二、采用血球计数板计数法，将步骤一获得各浓度阿米巴孢子液进行精确计数测量，每种浓度重复测量3～5次，计算平均值即为各浓度阿米巴孢子液中阿米巴孢子量C；
三、采用紫外可见分光光度计分别测定步骤一获得各浓度阿米巴孢子液吸光度A；测定波长为250nm～265nm；
四、以步骤二获得的各浓度阿米巴孢子液中孢子量C为横坐标，以步骤三获得的各浓度阿米巴孢子液的吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程y＝ax+b，其中y为不同浓度阿米巴孢子液的吸光度A，x为不同浓度的阿米巴孢子液中孢子量C，单位为个/mL，并根据步骤二和步骤三中已测得的数据，计算得出a和b的值；
五、将含阿米巴孢子的待测样品稀释，获得稀释阿米巴孢子液；
六、采用紫外可见分光光度计测定步骤五获得的稀释阿米巴孢子液的吸光度；
七、通过步骤六获得的吸光度，利用步骤四获得的线性回归方程计算步骤五获得的稀释阿米巴孢子液中的阿米巴孢子量。
2.根据权利要求1所述的一种水中阿米巴孢子的快速计数方法，其特征在于步骤一中稀释后阿米巴孢子液中阿米巴孢子量为105～107个/mL。
3.根据权利要求1所述的一种水中阿米巴孢子的快速计数方法，其特征在于步骤一磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾和氢氧化钠的混合溶液，pH为7，其中磷酸二氢钾的浓度为0.0068g/mL，氢氧化钠的浓度为29.1mol/mL。
4.根据权利要求1所述的一种水中阿米巴孢子的快速计数方法，其特征在于步骤二血球计数板计数法采用25格×16格计数板或16格×25格计数板。
5.根据权利要求1所述的一种水中阿米巴孢子的快速计数方法，其特征在于步骤三在测定前，采用步骤一所述的磷酸盐缓冲液校准分光光度计基线。
6.根据权利要求1所述的一种水中阿米巴孢子的快速计数方法，其特征在于步骤三中测定波长为250nm、255nm、260nm或265nm。
7.根据权利要求1所述的一种水中阿米巴孢子的快速计数方法，其特征在于步骤五中采用步骤一所述的磷酸盐缓冲液对含阿米巴孢子的待测样品稀释。
8.根据权利要求1所述的一种水中阿米巴孢子的快速计数方法，其特征在于步骤五中获得稀释阿米巴孢子液中阿米巴孢子量为105～107个/mL。
9.根据权利要求1所述的一种水中阿米巴孢子的快速计数方法，其特征在于步骤六在测定前，采用步骤一所述的磷酸盐缓冲液校准分光光度计基线，且测定波长采用步骤三检定吸光度时的测定波长。
10.如权利要求1所述的一种水中阿米巴孢子的快速计数方法的应用，其特征在于该方法作为检测手段应用在检测过滤介质对阿米巴孢子的截流过滤效果中。
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