CN113773962B - 一种定向灭活阿米巴体内细菌的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于饮用水消毒技术领域，具体涉及一种定向灭活阿米巴体内细菌的方法及其应用，本发明以磷化铁(FeP)作为灭活剂，通过磷化铁活化过硫酸盐产生活性自由基，该活性自由基可以穿透阿米巴的细胞壁，从而能够有效灭活阿米巴体内携带的致病菌，且不会对阿米巴本身造成多大损害。经检测表明，采用本发明方法处理携带细菌的阿米巴，30min的杀菌率达99.9％，180min的杀菌率达到99.99％，但是对阿米巴本身并没有太过于显著的灭活能力，说明本发明方法具有高效的灭活阿米巴体内细菌的效果，能够达到定向灭活阿米巴体内致病菌的目的，可应用于饮用水消毒。
Description
技术领域
本发明属于饮用水消毒技术领域，具体涉及一种定向灭活阿米巴体内细菌的方法及其应用。
背景技术
阿米巴(Amoeba)是一种可以通过伸长和缩回伪足来进行移动和捕食的单细胞真核生物，广泛分布于水、土壤等生境中。最近的研究表明，在家庭自来水和饮用水网中都发现了阿米巴的存在。阿米巴作为原生生物的重要类群之一，主要以细菌为食，通过与人体吞噬细胞类似的作用将细菌吞入体内。但随着细菌的进化和发展，一些细菌形成了可以躲避阿米巴捕食的机制，这些细菌可以在阿米巴体内存活，与阿米巴形成共生的关系。因此，阿米巴可以作为其他微生物(如细菌、真菌和病毒)的环境载体，其中许多是人类病原体。更有甚者，一些致病菌或病毒通过阿米巴携带的形式而进入体内，并保持活性和毒性，从而给饮用水的安全带来潜在的风险和威胁。
伯克氏菌属(Burkholderia)属于β-变形菌，广泛分布在环境中，该属的一些物种具有致病性，如B.pseudomallei和B.mallei这两种是动物和人类的病原体。伯克氏菌与阿米巴的共生系统广泛存在并分布于水、土壤等生境中。
研究表明，阿米巴具有极强的耐受性，可以形成坚硬厚实的孢子来躲避严酷的环境。因而在饮用水消毒阶段可以成功从传统的灭活工艺中逃脱，而躲藏在阿米巴体内的致病菌或病毒也常常因此“搭上便车”而躲过灭活处理。在近期的实验研究中发现，活的和失活的阿米巴孢子均能保护其体内的细菌免于饮用水消毒过程的灭活处理。而一些常用的传统水消毒技术(如紫外消毒、氯消毒、二氧化氯消毒等)主要是针对于单一的致病菌污染，却不能有效灭活躲藏在阿米巴体内的细菌。这使得这些可以被阿米巴庇护在体内的致病菌成为饮用水安全的新挑战，为饮用水安全带来了不可忽视的风险威胁。因此，寻找可以有效灭活躲藏在阿米巴体内的致病菌的灭活技术尤为重要和迫切。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种定向灭活阿米巴体内细菌的方法，该方法可以实现高效、定向灭活阿米巴体内携带的致病菌，且不会对阿米巴本身造成多大伤害，可应用于饮用水消毒。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供了一种定向灭活阿米巴体内细菌的方法，即，将含阿米巴溶液的阿米巴孢子浓度调整为2×105～2×106个/mL，然后加入磷化铁和过硫酸钾，经搅拌后即可灭活阿米巴体内的细菌。
优选地，所述磷化铁的制备方法为：将氯化铁、硫酸钠和磷酸氢二钠同时溶解后置于180～200℃下水热反应10～12h，经过滤、洗涤、干燥后得到α-Fe2O3，然后往α-Fe2O3中加入次磷酸钠充分研磨，研磨后置于300℃～400℃下煅烧2h，最后经研磨、洗涤和干燥即得磷化铁。
本发明利用地球环境中广泛存在的赤铁矿(a-Fe2O3)作为前驱体，采用低温磷化技术，制备出具有高活性的磷化铁。经研究发现，FeP中的Fe除了Fe2+，还带有丰富的正电荷(Feδ+，0<δ+<2)。此外，FeP中的P带有部分负电荷(Pγ-,-1<γ-<0)。因此，FeP中的Fe和P都可以高效活化过硫酸盐，从而产生大量的活性自由基(SO4 -和·OH)。而产生的活性自由基能够穿透阿米巴的细胞壁进入阿米巴里面，因此能够有效灭活阿米巴体内携带的致病菌。
进一步地，所述氯化铁、硫酸钠、磷酸氢二钠的浓度分别为40mM、1.1mM、0.36mM。
进一步地，所述次磷酸钠与α-Fe2O3的质量比为1～6：1。具体地，所述次磷酸钠与α-Fe2O3的质量比为6：1。
进一步地，所述水热反应的温度为200℃，时间为12h。
进一步地，所述煅烧为400℃煅烧2h。
优选地，所述磷化铁的投加量为0.1～0.4g/L。具体地，所述磷化铁的投加量为0.4g/L。
优选地，所述过硫酸钾的投加量为2.0～3.2g/L。具体地，所述过硫酸钾的投加量为3.2g/L。
优选地，所述搅拌的转速为200-400转/分钟，搅拌的温度为25℃。
优选地，当需要往含阿米巴溶液中添加溶液调整阿米巴孢子浓度时，添加的溶液采用KK2缓冲溶液，每升缓冲液含2.25g KH2PO4+0.67g K2HPO4，且溶液的pH值为7.0。
本发明还提供了上述的定向灭活阿米巴体内细菌的方法在饮用水消毒中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供一种定向灭活阿米巴体内细菌的方法，以磷化铁(FeP)作为灭活剂，通过磷化铁活化过硫酸盐产生活性自由基，该活性自由基可以穿透阿米巴的细胞壁，从而能够有效灭活阿米巴体内携带的致病菌，且不会对阿米巴本身造成多大损害。经检测表明，采用本发明方法处理携带细菌的阿米巴，30min的杀菌率达99.9％，180min的杀菌率达到99.99％，但是对阿米巴本身并没有太过于显著的灭活能力，说明本发明方法具有高效的灭活阿米巴体内细菌的效果，能够达到定向灭活阿米巴体内致病菌的目的，可应用于饮用水消毒。
附图说明
图1为磷化铁的X射线衍射图(a)和扫描电镜图(b)；
图2为磷化铁灭活阿米巴(a)以及阿米巴体内细菌(b)的效率图；
图3为磷化铁产生活性自由基的EPR图；
图4为携带细菌的阿米巴在磷化铁灭活前(a)后(b)的透射电镜图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到的。
实施例1磷化铁材料的制备
(1)将160mL超纯水移入200mL烧杯中，然后分别依次加入40mM氯化铁、1.1mM硫酸钠、0.36mM磷酸氢二钠，搅拌均匀。
(2)将步骤(1)得到的混合溶液移入25mL反应釜中，然后转移到烘箱中在200℃条件下水热反应12h。
(3)取出步骤(2)得到的反应物，经过滤、洗涤、干燥后得到α-Fe2O3。
(4)称取100mg步骤(3)的α-Fe2O3材料放入研钵中，然后加入600mg次磷酸钠，充分研磨后移入瓷舟中，并放入管式炉，在N2保护条件下400℃煅烧2h，最后经研磨(研磨10分钟)、水洗、过滤和真空干燥后得到磷化铁。
对实施例1制备得到的磷化铁进行X射线衍射和扫描电镜测试，测试结果如图1所示，表明所制备的磷化铁为纯净的磷化一铁(FeP),形貌呈花簇形。
实施例2磷化铁对阿米巴以及阿米巴体内细菌的灭活效率
以实施例1制得的磷化铁作为灭活剂，测定其对阿米巴以及阿米巴体内细菌的灭活效率，测定方法包括以下步骤。
(1)培养阿米巴：本实施例使用的阿米巴是盘基网柄菌(Dictyosteliumdiscoideum)Qs9菌株(购买自Dicty Stock Center：http://dictybase.org/StockCenter/ StockCenter.html)，将Qs9菌株接种在SM/5琼脂平板(每升固化前的培养基含2g葡萄糖、2g细菌蛋白胨、2g酵母提取物、0.2g MgCl2、1.9g KH2PO4、1g K2HPO4和15g琼脂)上，21℃下光照培养5天后，用接种环挑取收集，并用血球计数板计数得到2×105个阿米巴孢子。将肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，购买自ATCC)用LB培养液在32℃下培养两天后，配制600nm波长下吸光度为1.5的肺炎克雷伯菌悬浊液，将2×105个阿米巴孢子与200μL的肺炎克雷伯菌悬浊液混合(作为阿米巴的食物)，然后用平板涂布法将混合后的菌悬液涂布于SM/5琼脂平板上，在21℃光照下培养5天后用接种环收集。
(2)培养携带细菌的阿米巴：先将伯克氏菌(Burkholderia agricolaris B1qs70，购买自ATCC)用LB培养液在32℃下培养两天后，配制600nm波长下吸光度为1.5的伯克氏菌悬浊液，然后将2×105个步骤(1)中得到的阿米巴孢子、200μL的肺炎克雷伯菌悬浊液和10μL的伯克氏菌悬浊液混合后，用平板涂布法将混合后的菌悬液涂布于SM/5琼脂平板上，在21℃光照下培养5天。
(3)灭活样品的制备：用接种环收集步骤(2)中的阿米巴孢子于60mLKK2缓冲液(每升缓冲液含2.25g KH2PO4+0.67g K2HPO4，pH值为7.0)中，用血细胞计数板计数，至溶液中阿米巴孢子浓度约2×106个/mL。
(4)灭活阿米巴以及阿米巴体内的细菌：将0.4g/L实施例1制备的FeP和3.2g/L过硫酸钾(PS)加入到步骤(3)的溶液中，于室温下用磁力搅拌器持续搅拌，在不同的时刻(0,1,5,30,60,120,180min)依次取样2mL，同时加入15μL/mL硫代硫酸钠溶液(8mg/mL)终止反应。将2mL样品分装成两份分别进行下面的步骤(5)和步骤(6)。
(5)计算阿米巴的灭活效率：用KK2缓冲液按1:10的梯度稀释步骤(4)中得到的样品，每个梯度的样品取100μL与200μL的肺炎克雷伯菌悬浊液混合，然后涂布于SM/5琼脂平板上，在21℃光照下培养60小时后观察，用单菌落计数法(CFU计数法，colony-formingunit)计数，根据以下公式得到样品中存活的阿米巴的个数：
Nt——取样时间t时刻样品中存活的个数，单位个/mL；
N0——取样时间0时刻样品中存活的个数，单位个/mL；
nt——取样时间t时刻在稀释后涂布在平板上的单菌落个数；
x——对应nt的稀释次数；
n0——取样时间0时刻在稀释后涂布在平板上的单菌落个数；
y——对应n0的稀释次数。
(6)计算阿米巴体内细菌的灭活效率：用快速样品制备仪(FastPrep-245G)破碎步骤(4)中得到的样品，在4.5M/s的速度下“40s破碎+5min冷却”循环5次，用KK2缓冲液将破碎后的样品按1:10的梯度稀释，每个梯度的样品取100μL涂布于SM/5琼脂平板上，在32℃下培养48小时后观察，用单菌落计数法(CFU计数法，colony-forming unit)计数，根据以下公式得到样品中存活的细菌个数：
Nt——取样时间t时刻样品中存活的个数，单位个/mL；
N0——取样时间0时刻样品中存活的个数，单位个/mL；
nt——取样时间t时刻在稀释后涂布在平板上的单菌落个数；
x——对应nt的稀释次数；
n0——取样时间0时刻在稀释后涂布在平板上的单菌落个数；
y——对应n0的稀释次数。
如图2的结果所示，表明FeP能活化PS，并对阿米巴体内的细菌具有优异的杀灭效果，30min的杀菌效率接近99.9％，在180min超过99.99％，但是对阿米巴本身并没有太过于显著的灭活能力，说明FeP能够达到定向灭活阿米巴体内细菌的效果。
实施例3磷化铁在杀菌过程中自由基的产生情况
以实施例1制得的磷化铁作为灭活剂，测试其在杀菌过程中自由基的产生情况，测定方法如下。
(1)取5mg FeP于10mL样品管中，再加入10mg PS试剂，然后加入5mL KK2缓冲溶液，在反应2min和5min的时候分别取样1mL，再加入20L 5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO)，充分摇匀。
(2)用点样毛细管取步骤(1)的液体样品，用电子顺磁共振测试仪(EPR)检测溶液中自由基的产生情况。
如图3的结果所示，表明本发明中的磷化铁在KK2缓冲溶液中能够产生大量具有高杀菌能力的·OH，而产生的·OH能够轻易穿透阿米巴的细胞壁，从而能够快速高效灭活阿米巴体内的细菌。
实施例4磷化铁对阿米巴及其体内细菌灭活前后形貌变化的影响
以实施例1制得的磷化铁作为灭活剂，测试阿米巴及其体内细菌灭活前后的形貌变化。
(1)收集灭活前后含有细菌的阿米巴：配制两份60mL浓度约为2×106个/mL的携带细菌的阿米巴孢子溶液(制备方法同实施例2)，一份8000rpm离心5min使阿米巴沉淀，去掉上清得到灭活前的样品。另一份加入0.4g/L实施例1制备的FeP和3.2g/L的PS，于室温下用磁力搅拌器持续搅拌180min，再加入硫代硫酸钠终止反应，8000rpm离心5min，去掉上清后得到灭活后的样品。
(2)投射电镜(TEM)制样：取离心后的阿米巴样品5mg置于1.5mL的EP管中，用1.5mL2.5％的戊二醛固定阿米巴样品，置于4℃冰箱中12小时以上后倒掉固定液，并用pH为7.0的0.1M磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15分钟，再用1.5mL 1％锇酸溶液固定样品1-2小时，小心取出锇酸废液，用pH 7.0的0.1M磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15分钟。之后用梯度浓度(30％，50％，70％，80％，90％和95％五种浓度)的乙醇溶液依次对样品进行脱水处理，每种浓度处理15分钟，再用100％的乙醇处理20分钟，过渡后再用纯丙酮处理20分钟，并用包埋剂(OCT包埋剂)与丙酮的混合液(V/V＝1/1)处理样品1小时，再用包埋剂与丙酮的混合液(V/V＝3/1)处理样品3小时，再用纯包埋剂处理样品过夜。最后将经过渗透处理的样品包埋起来，70℃加热过夜，得到包埋好的样品。
(3)透射电镜观察：将包埋好的样品置于LEICA EM UC7型超薄切片机中切片，获得70-90nm的切片，然后分别用柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50％乙醇饱和溶液对切片各染色5-10分钟，晾干后在日立H-7650型透射电子显微镜中观察。
如图4的结果所示，表明在灭活处理前，阿米巴及其体内细菌的形态结构没有遭到明显破坏。在灭活后阿米巴结构依然完好无损，而细菌虽没有受到明显损伤却已经失去活性。进一步说明本发明的磷化铁作为灭活剂可以定向灭活阿米巴体内的细菌，而不会对阿米巴本身造成多大的损害。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
Claims (5)
1.一种定向灭活阿米巴体内细菌的方法，其特征在于，将含阿米巴溶液的阿米巴孢子浓度调整为2×105～2×106个/mL，然后加入磷化铁和过硫酸钾，所述磷化铁的投加量为0.1～0.4g/L，所述过硫酸钾的投加量为2.0～3.2g/L，经搅拌后即可灭活阿米巴体内的细菌；
所述磷化铁的制备方法为：将氯化铁、硫酸钠和磷酸氢二钠同时溶解后置于180～200℃下水热反应10～12h，经过滤、洗涤、干燥后得到α-Fe2O3，然后往α-Fe2O3中加入次磷酸钠充分研磨，研磨后置于300℃～400℃下煅烧2h，最后经研磨、洗涤和干燥即得磷化铁；所述氯化铁、硫酸钠、磷酸氢二钠的浓度分别为40mM、1.1mM、0.36mM，所述次磷酸钠与α-Fe2O3的质量比为1～6：1。
2.根据权利要求1所述的一种定向灭活阿米巴体内细菌的方法，其特征在于，所述水热反应的温度为200℃，时间为12h。
3.根据权利要求1所述的一种定向灭活阿米巴体内细菌的方法，其特征在于，所述煅烧为400℃煅烧2h。
4.根据权利要求1所述的一种定向灭活阿米巴体内细菌的方法，其特征在于，所述搅拌的转速为200-400转/分钟，搅拌的温度为25℃。
5.权利要求1-4任一项所述的定向灭活阿米巴体内细菌的方法在饮用水消毒中的应用。
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