CN110241172A - 一种预测典型抗生素与农药联合毒性相互作用的方法 - Google Patents

一种预测典型抗生素与农药联合毒性相互作用的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种预测典型抗生素与农药联合毒性相互作用的方法。运用直接均分射线法设计抗生素与农药二元混合体系，共有5条具有不同浓度配比的射线，建立三种混合培养绿藻的毒性微板分析方法，测试抗生素与农药二元混合物对混合培养绿藻的联合毒性。应用浓度加和与独立作用模型分析混合物对混合培养绿藻的毒性相互作用。本方法既结合了自然水体中多种水藻共生的局面，又结合了实际环境中污染物普遍以混合物形式存在的局面，从而可以更客观、全面地评价实际环境中污染物对环境和生态的潜在威胁。此外，本发明利用96孔微板吸光法，对比标准锥形瓶绿藻毒性测试，它具有测试简便快速，所需样品体积少，便于多次平行毒性测试等优点。

Description

一种预测典型抗生素与农药联合毒性相互作用的方法
技术领域
本发明属于环境毒理学领域，特别涉及一种利用羊角月牙藻(Selenastrumcapricornutum)、斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)、蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)三种藻混合培养，预测两种典型抗生素(土霉素(OXY)及环丙沙星(CIP))，与一种典型的三唑类杀菌剂农药(三唑酮(SZT))联合毒性相互作用的方法。
背景技术
藻类是水生生态系统的初级生产者，对水体的平衡和稳定起着极其重要的作用，是反映水体环境质量的重要指标。羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum)、斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)作为淡水水体中三种常见的绿藻，因其敏感性，常被用作水体安全评价的实验材料，也是水环境毒理试验的标准藻种。在自然水体中，不存在单一藻种垄断，都是多种水藻共生的局面，研究混合绿藻对环境污染物的毒性反应对于评价污染物对淡水环境的生态风险具有重要意义。
水体中农药与抗生素可能会以各种形态和浓度共存，形成各种各样的混合污染物。抗生素与农药作为水体生物乃至人类频繁接触的外源物，会同时被水体生物或人体摄入，可能对其健康产生潜在的影响。药物及个人护理品的广泛使用和不当处置引起的环境效应已经引起了国际环境科学界乃至公众的广泛关注。其中，抗生素是人类日常生活中最广泛接触化学品之一。目前，由于抗生素滥用的现象不断加剧，导致在不同水体环境中均出现不同程度的抗生素残留，特别是目前使用量较大、使用较频繁的土霉素与环丙沙星对水环境以及其中的生物均可能造成重大影响。三唑酮是目前应用最广泛的三唑类广谱杀菌剂之一，在我国的使用量有逐年增长的趋势。三唑酮使用后被土壤吸附和解吸，经雨水淋溶作用进入地表或地下水环境，在丰水期检出率与检出浓度较高，能够在水生生物体内累积代谢，在不同浓度下对不同类群、不同生命阶段的水生生物表现出不同的毒性效应。因此，开展抗生素与农药联合作用研究具有重要的实际意义。
目前，已经广泛采用纯培养条件下的单一藻种进行单一抗生素、农药的毒性安全性评价的研究，然而，鉴于在自然水体中，不存在单一藻种垄断，都是多种水藻共生的局面，同时实际环境中不可能存在单一化学物质而普遍以混合物形式存在的局面，采用混合培养条件下的多种藻种进行抗生素与农药联合毒性作用研究鲜有报道。因此，提供一种易操作、实用性强的多种藻种混合培养条件测定农药与抗生素联合作用的方法，为实际水生生态系统的风险评价提供科学依据尤其重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种预测典型抗生素与农药联合毒性相互作用的方法，使之可以更客观、全面地预测抗生素与农药联合作用对环境和生态的潜在威胁。
具体步骤为：
(1)藻种混合培养：选择纯培养条件下处于对数生长期的羊角月牙藻、斜生栅藻、蛋白核小球藻三种藻，并用血球计数法计算藻细胞浓度，用GB-11培养液稀释保证三种藻相同的初始接种藻细胞浓度，再按比例均匀混合培养。
(2)试验液配置：称取抗生素与农药原药，溶于超纯水中配置母液，并将母液稀释至所需浓度，配制成梯度浓度的试验液。
(3)空白对照制备：对于溶解性的抗生素与农药，将超纯水作为空白对照；对于不溶或微溶的抗生素与农药，将含有与之对应样品具有相同含量的二甲基亚砜作为空白对照。
(4)混合物设计：采用直接均分射线法设计混合物二元混合体系。
(5)毒性测试：采用微板吸光法，以96孔微板为载体，将设计好的混合组分试验药液与均匀混合的藻液加入板中，微板加样完后并盖上透明盖密封，静置15min后，将板置于酶标仪中测定光密度值(Optical density,OD)，作为暴露时间t＝0h，然后将测完后的板置于光照培养箱中培养；每天定时将微板交叉调换位置4次，待培养96h后将微板放入酶标仪中测定，作为暴露时间t＝96h。
(6)毒性数据处理与拟合：根据t＝0h与t＝96h的光密度值计算藻的抑制率，再采用两参数非线性函数对浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合。
(7)混合物毒性相互作用分析：用两种经典混合毒性评估参考模型分析混合物毒性相互作用。
所述步骤(1)中的三种藻的初始藻细胞浓度为106个/mL，混合比列为1:1:1。
所述步骤(2)中抗生素是指土霉素和环丙沙星；所述农药原药是指三唑酮。
所述步骤(3)中的助溶剂二甲基亚砜的体积浓度应控制在5‰之内。
所述步骤(4)中直接均分射线法为设计抗生素与农药二元混合体系5条射线，即R1、R2、R3、R4和R5，每条射线组分及其浓度配比不同。
所述步骤(5)中培养条件为：温度22℃，光照度2500～3000lux，光暗周期12h:12h。
所述步骤(6)中采用基于Matlab软件编辑的MixToxPred_CAIA软件，两参数非线性函数是指Weibull和Logit。
所述步骤(7)中两种经典混合毒性评估参考模型指浓度加和(CA)模型与独立作用(IA)模型来预测抗生素与农药联合毒性相互作用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明提供了一种操作简单、测试简便快速、实用性强的混合培养绿藻预测抗生素与农药联合毒性作用的方法；该方法可初步预测出抗生素与农药二元混合毒性相互作用，速度快，精确度高。
(2)本发明提供了一种多种绿藻在混合培养条件下预测抗生素与农药毒性联合作用的方法，试验周期短，预测结果容易判断，具有简单、易操作的优势。
附图说明
图1为本发明实施例中直接均分射线法示意图。
图2为本发明实施例中96孔微板加样设计示意图。
图3为本发明实施例中抗生素与农药二元混合对混合培养绿藻的CA/IA预测图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
以下将以举例形式进行说明，如有未详尽之处，可以参见常用的实验手册，以及所用试剂和仪器的厂商说明书。其中，所有化学试剂均采用分析级，实验用水为超纯水，各试剂均和材料可以商用渠道获得，具体而言：实验中所用到的两种抗生素包括：土霉素(OXY)、环丙沙星(CIP)；一种三唑类杀菌剂农药指三唑酮(SZT)，均购自CATO Research ChemicalsInc。所培养的藻种包括羊角月牙藻【FACHB-271】、斜生栅藻【FACHB-12】、蛋白核小球藻【FACHB-5】，均购自中国科学院淡水藻种库。
实施例：
1.混合藻种培养
1.1藻种纯培养：购买藻种，收到藻种后，将试管内藻液摇匀，在无菌操作下直接转入玻璃三角瓶(25～50mL)内，封好瓶口，放置在光照培养箱内弱光照培养2～3天；培养温度25℃，光照条件1000～2000Lux，时间设置为12Hr昼/12Hr夜；2-3天后，取5～10mL相应的藻液加入新鲜BG11培养基定容至100mL，在无菌的三角瓶(250mL)内培养，每天定时摇动三角瓶3次，培养至三代后方可用来做实验。
1.2确定初始接种藻细胞浓度：用血球计数法，将处于对数生长期的羊角月牙藻、斜生栅藻、蛋白核小球藻在纯培养下的原液在显微镜下数藻细胞计数，每种藻计数不少于三次，取平均值，并用BG11培养基将原藻液稀释到同一藻细胞浓度为106个/mL。
1.3将稀释好的同一藻密度的三种藻种按1:1:1比例均匀混合。
2.混合物设计
采用直线均分射线(EquRay)：直接均分射线法示意图如图1所示，先通过二元混合物组分构建一个二维浓度(X-Y)坐标平面，然后分别在X轴和Y轴上点出组分A和组分B的EC50，将连接两坐标轴EC50的点形成的线段平均分为6份，并从原点出发通过这5个均分点做5条射线(R1、R2、R3、R4、R5)，其中，每条射线代表一个固定浓度分数的混合物。
3.相关药品的配制
3.1检测物质抗生素与农药母液的配置：称取一定量的原药，放入小烧杯中加超纯水溶解定容，对于不溶或微溶的抗生素与农药加入体积浓度控制在5‰以内的二甲基亚砜，并超声助溶，溶解后加水定容。
3.2毒性实验相关浓度的配制：用超纯水将母液稀释并配制成已设计好的混合物按一定配比均匀混合并配制成一定梯度浓度的试验液。
3.3配制BG11培养基：三种绿藻的纯培养基及混合培养基均采用BG11培养基，其配方见表1。按照表1的配方配制BG11培养基配方，其制备方法为：将表1中的成分配制成相应母液浓度，并按照标明顺序依次将相应母液用量转移至1000mL容量瓶中，密封并贴好标签，并用蒸馏水定容至1000mL，在121℃、101KPa下灭菌20min，灭完菌冷却后，置于4℃冰箱保存，有效期2个月。
表1：BG11培养基配方
注：使用1M NaOH或HCl将pH调至7.1。
4.毒性测定实验步骤
1)开机预热酶标仪30min，备用，酶标仪的操作过程按照相应型号仪器的操作手册进行。
2)微板吸光法具体步骤：微板的加样设计方法如图2所示，96孔微孔板的具体加法以先加水再加药最后加藻液的原则，板的四周加超纯水，第2、6、7及11列为空白对照组，剩下的第3、4、5及8、9、10列为实验组，实验组以0.618的稀释因子加试验药液，补给超纯水保证各孔总体积为100μL，其具体步骤为：为防止边缘效应先在板的四周(共36孔)加300μL的超纯水；再在第2、6、7及11列(共24孔)中分别加入100μL已配好的与对应样品空白对照液作为空白对照；接着再按0.618的稀释因子在第3、4、5及8、9、10列(共60孔)分别加入超纯水与试验药液保证各孔总体积为100μL；最后在除边缘外的中间60个孔中加入100μL已混合均匀的藻液，保证中间60个孔总体积为200μL，微板加样完成后为防止挥发对实验造成影响，盖上透明盖密封，静置15min。
3)将板置于酶标仪中测定光密度值(Optical density,OD),作为暴露时间t＝0h，然后并将测完后的板置于恒温光照培养箱中培养，将培养箱设定温度22℃，光照度约2500～3000lux，光暗周期12h:12h；每天定时将微板交叉调换位置4次，使之均匀接受光照，待培养96h后将微板放入酶标仪测定OD值，作为暴露时间t＝96h。
5.毒性数据处理及拟合
5.1藻抑制率的计算
I＝1-(ODti-ODt0)/(OD0i-OD00) (1)
式中ODti为第i(i＝0,96)时刻污染物实验组的藻液OD值，OD0i为i时刻空白对照组的藻液OD值；
5.2采用两参数非线性函数Weibull(2)和Logit(3)对不同时间节点的浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合，拟合相关系数(correlation coefficient，简称R)与均方根误差(root mean square error,RMSE)最小者为最优，2个用于描述实验毒性数据的非线性函数公式如下:
I＝1-exp(-exp(α+βlgc)) (2)
I＝1/(1+exp(-α-βlgc)) (3)
式中α、β是Weibull和Logit的位置与斜率参数，I为效应即污染物对绿藻的生长抑制率；c是污染物的浓度。
拟合后，提取抗生素与农药联合作用对混合绿藻的96h毒性拟合值及EC50见表2。
表2 抗生素与农药联合作用对混合培养绿藻抑制的96h毒性拟合值及EC50
由表2可知农药与抗生素对混合绿藻的浓度-效应曲线均可用Weibull函数拟合，且拟合效果较好，确定系数r2均在0.97以上，且RMSE均小于0.1。
6.混合物毒性相互作用分析
用于混合毒性评估参考模型CA见公式(4)，IA模型(5)是另一个常用的参考模型，常与CA模型同时使用。当观测毒性大于参考模型预测毒性时称混合物产生协同作用，小于预测毒性时则称有拮抗作用，若等于预测毒性则称为无相互作用或加和作用。
抗生素与农药二元混合对混合培养绿藻的CA/IA预测图见图3。
由图3显而可知，(1)土霉素(OXY)与环丙沙星(CIP)联合作用时，CA与IA预测效应均大于实验混合物95％观测置信区间上限，表现出拮抗相互作用；(2)土霉素(OXY)与三唑酮(SZT)联合作用时，CA与IA预测效应均小于实验混合物95％观测置信区间上限，表现出拮抗相互作用；(3)环丙沙星(CIP)与三唑酮(SZT)联合作用时，CA与IA预测效应基本上均处于95％观测置信区间内，表现为加和，没有毒性相互作用。显然此方法简单明了且易预测。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，只为说明本发明的技术构思及特点，并非对本发明做任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。其目的在于让任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (1)

1.一种预测典型抗生素与农药联合毒性相互作用的方法，其特征在于具体步骤为：
（1）藻种混合培养：选择纯培养条件下处于对数生长期的羊角月牙藻、斜生栅藻、蛋白核小球藻三种藻，并用血球计数法计算藻细胞浓度，用GB-11培养液稀释保证三种藻相同的初始接种藻细胞浓度，再按比例均匀混合培养；
（2）试验液配置：称取抗生素与农药原药，溶于超纯水中配置母液，并将母液稀释至所需浓度，配制成梯度浓度的试验液；
（3）空白对照制备：对于溶解性的抗生素与农药，将超纯水作为空白对照；对于不溶或微溶的抗生素与农药，将含有与之对应样品具有相同含量的二甲基亚砜作为空白对照；
（4）混合物设计：采用直接均分射线法设计混合物二元混合体系；
（5）毒性测试：采用微板吸光法，以96孔微板为载体，将设计好的混合组分试验药液与均匀混合的藻液加入板中，微板加样完后并盖上透明盖密封，静置15min后，将板置于酶标仪中测定光密度值，作为暴露时间t=0h，然后将测完后的板置于光照培养箱中培养；每天定时将微板交叉调换位置4次，待培养96h后将微板放入酶标仪中测定，作为暴露时间t=96h；
（6）毒性数据处理与拟合：根据t=0h与t=96h的光密度值计算藻的抑制率，再采用两参数非线性函数对浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合；
（7）混合物毒性相互作用分析：用两种经典混合毒性评估参考模型分析混合物毒性相互作用；
所述步骤（1）中的三种藻的初始藻细胞浓度为106个/mL，混合比列为1:1:1；
所述步骤（2）中抗生素是指土霉素和环丙沙星；所述农药原药是指三唑酮；
所述步骤（3）中的助溶剂二甲基亚砜的体积浓度应控制在5‰之内；
所述步骤（4）中直接均分射线法为设计抗生素与农药二元混合体系5条射线，即R1、R2、R3、R4和R5，每条射线组分及其浓度配比不同；
所述步骤（5）中培养条件为：温度22℃，光照度2500~3000lux，光暗周期12h:12h；
所述步骤（6）中采用基于Matlab软件编辑的MixToxPred_CAIA软件，两参数非线性函数是指Weibull和Logit；
所述步骤（7）中两种经典混合毒性评估参考模型指浓度加和模型与独立作用模型来预测抗生素与农药联合毒性相互作用。
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