CN101095949B - 鸡志贺氏菌灭活油乳疫苗及其研制方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种兽用生物制品及其研制方法，特别是涉及一种鸡志贺氏菌灭活油乳苗及其研制方法。鸡志贺氏菌灭活油乳苗是利用鸡志贺氏菌经菌种传代、大量培养、调整浓度、灭活、按适当比例加入佐剂制备而成，疫苗中含灭活鸡志贺氏菌数为5亿～7.5亿/ml。利用本发明的油乳疫苗，结合鸡志贺氏菌灭活铝胶苗对鸡进行免疫接种，可有效预防鸡的志贺氏菌感染。经测定，免疫动物的细胞免疫和体液免疫水平显著提高，免疫保护率达85.1～100％以上；本发明疫苗具有性能稳定、易保存、无毒、无污染等优点；鸡免疫后产生免疫作用快、免疫力强、保护率高，简便易行等特点。本发明产品应用于畜牧养殖业，对有效控制鸡志贺氏菌感染，防止人和动物交叉感染具有重要的意义。

Description

鸡志贺氏菌灭活油乳疫苗及其研制方法

一、技术领域：

本发明涉及一种新型兽用生物制品及其研制方法，特别是涉及一种鸡志贺氏菌灭活油乳疫苗及其研制方法。

二、背景技术：

鸡志贺氏菌病是由鸡志贺氏菌引起的鸡的一种新发急性传染病。该病主要特征为拉稀、痢疾和明显的肠道病变。早期调查显示：在同一个养鸡场发病率可高达100％，死亡率达3.84～33.5％。耐过鸡表现消瘦，生长发育缓慢。由于该病是鸡的一种新发传染病，人们对其知之甚少，常常被误诊为鸡白痢或鸡球虫病等，给该病防治工作造成很大困难，结果导致了严重的经济损失。本发明人除首次发现鸡志贺氏菌病，近年还利用发明的鸡志贺氏菌诊断液和微量平板凝集试验快速检测方法，对我国河南、山东等不同地区35家鸡场具有拉稀病史的670只鸡血清灭活样品进行了检测。通过检测对鸡志贺氏菌病的发病率、流行地区、品种、日龄及有无混合感染等进行了血清流行病学调查。调查结果表明：目前我国部分地区存在有鸡志贺氏菌感染，其血清抗体阳性率较高，达28.3～33.7％，已远远超过鸡白痢。

目前国内外教科书均指出：志贺氏菌具有高度的传染性，可引起人的肠炎痢疾，并以1～4岁儿童发病率和死亡率较高。国内外多篇报道指出：志贺氏菌可感染猴子，还可感染犊牛、仔猪、家兔、小白鼠、豚鼠等。所有痢疾杆菌均能产生内毒素、细胞毒素、肠毒素(外毒素)。痢疾杆菌对肠道的致病作用主要依靠菌毛对粘膜上皮细胞的粘附，继而穿入粘膜上皮细胞内及粘膜固有层内繁殖而引起炎症。为了有效预防鸡志贺氏菌的感染，降低该病的发病率和死亡率，防止人禽交叉感染，减少因该病造成的环境污染，本发明人开展了鸡志贺氏菌灭活疫苗的研制，这对提高养殖业的经济和社会效益具有重要的意义和价值。

由查新报告得知，以前鸡志贺氏菌病在国内外均未见有报道，2003年初该病由本发明人首次发现，并于2003年和2005年在国内外重要专业学术会议上及2004年国内重要专业刊物上公开发表，“鸡志贺氏菌病在我国的发现及其病原特性研究”一文，不仅公开发表于2004年第4期《中国预防兽医学报》，而且还于2003年10月获得第10次全国家畜传染病学术会议大会优秀学术论文。此外，该论文英文摘要还被收录于2005年8月在土耳其举办的第14届世界禽病学术大会论文集。

为了对多种动物有效预防该病的发生，本发明人利用分离到的鸡志贺氏菌研制出该菌灭活疫苗，并利用本发明产品对鸡进行免疫接种，同时进行了疫苗免疫功能和免疫保护力的测定，为有效预防该病提供了可靠依据和重要条件。

三、发明内容：

本发明的目的：在于提供一种能够有效预防鸡志贺氏菌感染的灭活油乳疫苗及其制备方法。

本发明的技术方案是：

一种鸡志贺氏菌灭活油乳疫苗，含有有效剂量的灭活鸡志贺氏菌和兽医学上可接受的佐剂。

所述的佐剂为费氏佐剂、矿物油、植物油乳化佐剂中的任一种；所述的灭活鸡志贺氏菌为鸡痢疾志贺氏菌，或鸡鲍氏志贺氏菌，或鸡福氏志贺氏菌，或鸡宋内氏志贺氏菌中的任一种灭活菌；所述的疫苗中含灭活鸡志贺氏菌数为5亿～7.5亿/ml。

一种鸡志贺氏菌灭活油乳疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)菌种传代和复壮：将纯化的鸡志贺氏菌用1％葡萄糖肉汤进行接种，在37±0.5℃条件下培养24～30h，然后用血液平板培养复壮；

(2)细菌接种和扩大培养：将复壮的鸡志贺氏菌接种1％葡萄糖肉汤进行一代培养，然后将一代培养物用大量1％葡萄糖肉汤进行扩大培养，并用灭菌棉球蘸取培养好的鸡志贺氏菌菌液，均匀涂抹于SS琼脂平板上，置37±0.5℃培养24～30h；

(3)收集细菌：在长满鸡志贺氏菌菌苔的SS平板上，每平板倾入0.85％灭菌生理盐水3～5ml，刮取SS平板上的鸡志贺氏菌菌苔，然后将刮取的菌液移入无菌瓶中；

(4)细菌计数和浓度调整：将1％葡萄糖肉汤的细菌扩大培养物进行活菌计数，并用SS平板上刮取的鸡志贺氏菌菌液对肉汤培养物进行细菌浓度调整，调整菌数为20～30亿/ml；

(5)细菌灭活：向调整好细菌浓度的1％葡萄糖肉汤细菌培养物中加入甲醛进行灭活，摇匀，使甲醛的最终浓度为0.5％，37±0.5℃条件下作用24～30h；

(6)加入佐剂：向制备好的细菌灭活肉汤中加入佐剂，肉汤与佐剂的体积比为1∶3，混合均匀后制成疫苗。

所述的油乳疫苗中含灭活鸡志贺氏菌数为5～7.5亿/ml；所述的鸡志贺氏菌为鸡痢疾志贺氏菌，或为鸡鲍氏志贺氏菌，或为鸡福氏志贺氏菌，或为鸡宋内氏志贺氏菌中的任一种；所述的佐剂为费氏佐剂、矿物油、植物油乳化佐剂中的任一种；所述的鸡志贺氏菌灭活油乳疫苗在预防鸡志贺氏菌感染方面的应用。

本发明的积极有益效果：

(1)利用本发明的油乳疫苗，结合本发明人的另一发明灭活铝胶苗对鸡进行免疫接种，可有效预防鸡的志贺氏菌感染。经测定，免疫动物的细胞免疫和体液免疫水平显著提高，免疫保护率达85.1～100％以上，从而达到有效预防鸡志贺氏菌感染的目的。

(2)本发明疫苗具有性能稳定、易保存、无毒、无污染、简便易行等优点；鸡免疫后产生免疫作用快、免疫力强、保护率高等特点。

(3)由查新得知，利用鸡志贺氏菌发明的“鸡志贺氏菌灭活油乳疫苗”产品，目前在国内外尚属首创。本发明产品已广泛应用于生产实践中，使鸡志贺氏菌感染率大大减少，在有效预防和控制鸡志贺氏菌感染方面发挥了积极的重要作用。

(4)本发明产品应用于畜牧养殖业，对有效控制鸡志贺氏菌感染，保障养殖业健康发展和绿色食品安全，防止人和动物交叉感染具有重要意义。大量试验已证明，志贺氏菌可引起人禽交叉感染，故本发明产品和技术的推广应用，不仅在兽医方面，而且在医学公共卫生方面，均具有重要的理论和现实意义。

(5)我国是一个养殖大国，要生产出更多优质安全的畜禽产品，该疫苗具有十分广阔的应用前景，可产生显著的经济效益和社会效益。

四、附图说明：

图1两组E-花环形成率变化规律图，

图2各组抗体效价消长规律曲线图，

图3免疫组和未免疫组抗体效价水平曲线图，

图4免疫组和未免疫组E-花环形成率规律曲线图。

五、具体实施方式：

发明原理：利用分离鉴定的鸡志贺氏菌经加工研制成疫苗，可用于该病的免疫预防接种。其原理是根据免疫学中疫苗抗原能够刺激机体产生抗体和细胞因子，二者可分别提高机体的体液免疫功能和细胞免疫功能，从而使机体获得抵抗志贺氏菌感染的能力。该原理属于免疫学基本原理的特异性免疫应答反应。

实施例一：鸡鲍氏志贺氏菌灭活油乳疫苗的制备：

1、制备步骤：

(1)菌种传代和复壮：将纯化的鸡志贺氏菌接入1％葡萄糖肉汤中，在37℃条件下培养24h，然后用血液平板培养复壮；

(2)细菌接种和扩大培养：将复壮的鸡志贺氏菌接种1％葡萄糖肉汤进行一代培养，然后将一代培养物用大量1％葡萄糖肉汤进行扩大培养，用灭菌棉球蘸取培养好的鸡志贺氏菌菌液，均匀涂抹于SS琼脂平板上，置37℃培养24h；

(3)收集细菌：在长满志贺氏菌菌苔的SS平板上，每平板倾入3～5ml 0.85％灭菌生理盐水，刮取SS平板上的志贺氏菌菌苔，然后将菌液移入无菌瓶中；

(4)细菌计数和浓度调整：将1％葡萄糖肉汤的细菌扩大培养物进行活菌计数，并用SS平板上刮取的志贺氏菌菌液对肉汤培养物进行细菌浓度调整，调整菌数为20亿/ml；

(5)细菌灭活：向调整好细菌浓度的1％葡萄糖肉汤细菌培养物中加入甲醛进行灭活，摇匀，使甲醛的最终浓度为0.5％，37℃条件下作用24h；

(6)灭活效果检验：将灭活细菌肉汤分别接种三管1％葡萄糖无菌肉汤，每管0.2ml；接种的三管1％葡萄糖肉汤，经37℃24h培养，若均无细菌生长视为灭活合格；

(7)细菌灭活肉汤的保存：置于2～8℃保存备用；

(8)加入佐剂：将制备好的细菌灭活肉汤，按肉汤与矿物油佐剂1∶3的体积比加入矿物油油乳(10号白油，杭州产)，充分混合后制成油乳疫苗，每毫升油乳苗中含菌数为5亿/ml。

(9)各项检验：疫苗制成后，按要求分别进行成品无菌检验、安全检验和效力检验。

①无菌检验：按国家兽用生物制品质量检验标准进行，应无菌生长。

②安全检验：用1月龄健康小鸡5只，每只胸肌注射2ml油乳疫苗，观察10天均应健活。用2月龄以上的健康鸡5只，每只胸肌注射4ml油乳疫苗，观察10天均应健活。

③效力检验：

免疫组为10只23日龄固始鸡，用鸡鲍氏志贺氏菌灭活铝胶苗首次免疫，每只胸肌注射1ml，首免后第4周用鸡鲍氏志贺氏菌灭活油乳苗二免，每只胸肌注射2ml。同时设立未免疫对照组10只。二免后第21天，两组均用鸡鲍氏志贺氏菌肉汤培养物(菌数为7.32亿个/ml)进行攻毒，每只灌服1ml，同时腹腔注射1ml。攻毒后连续观察10天，若免疫攻毒组有1/10鸡只出现轻微腹泻症状，未免疫攻毒组有10/10鸡只出现典型腹泻症状，疫苗判为合格。

2、性状：鸡志贺氏菌油乳剂灭活苗为乳白色稍粘液体，静置久贮时上面可能浮有少量清油，底层出现微量肉汤液体，但振摇后呈均匀乳白色稍粘液体。

3、作用及用途：该疫苗可用于预防鸡和其它动物的志贺氏菌感染。利用本发明人的另一发明鸡志贺氏菌铝胶灭活疫苗首免后2周产生免疫力，免疫期1个月左右；铝胶灭活苗首免后28天，再用鸡志贺氏菌油乳剂灭活疫苗进行二免，免后1周产生免疫力，免疫期达5～6个月。

4、用法及用量：用时摇匀，每只成鸡肌肉注射2ml；每只雏鸡肌肉注射0.5～1ml。利用鸡志贺氏菌铝胶灭活疫苗作基础免疫，用鸡志贺氏菌油乳剂灭活苗作加强免疫。

5、贮藏：置4～10℃避光保存，有效期为1年；室温避光保存，有效期半年。

6、注意事项及说明：防冻结，用前需恢复至室温。

实施例二：鸡痢疾志贺氏菌灭活油乳疫苗的制备：

1、制备步骤：

(1)菌种传代和复壮：将纯化的鸡痢疾志贺氏菌接入1％葡萄糖肉汤中，在37℃条件下培养30h，然后用血液平板培养复壮；

(2)细菌接种和扩大培养：将复壮的鸡痢疾志贺氏菌接种1％葡萄糖肉汤进行一代培养，然后将一代培养物用大量1％葡萄糖肉汤进行扩大培养，用灭菌棉球蘸取培养好的鸡痢疾志贺氏菌菌液，均匀涂抹于SS琼脂平板上，置37℃培养30h；

(3)收集细菌：在长满志贺氏菌菌苔的SS平板上，每平板倾入3～5ml 0.85％灭菌生理盐水，刮取SS平板上的志贺氏菌菌苔，然后将菌液移入无菌瓶中；

(4)细菌计数和浓度调整：将1％葡萄糖肉汤的细菌扩大培养物进行活菌计数，并用SS平板上刮取的鸡痢疾志贺氏菌菌液对肉汤培养物进行细菌浓度调整，调整菌数为30亿/ml；

(5)细菌灭活：向调整好细菌浓度的1％葡萄糖肉汤细菌培养物中加入甲醛进行灭活，摇匀，使甲醛的最终浓度为0.5％，37℃条件下作用30h；

(6)灭活效果检验：将灭活细菌肉汤分别接种三管1％葡萄糖无菌肉汤，每管0.2ml；接种的三管1％葡萄糖肉汤，经37℃24h培养，若均无细菌生长视为灭活合格；

(7)细菌灭活肉汤的保存：置于2～8℃保存备用；

(8)加入佐剂：将制备好的细菌灭活肉汤，按肉汤与矿物油1∶3的体积比加入油乳佐剂，充分混合后制成油乳疫苗，每毫升油乳苗中含菌数为7.5亿/ml。

(9)各项检验：疫苗制成后，按要求分别进行成品无菌检验、安全检验和效力检验。无菌检验及安全检验同实施例一、不再详述。

效力检验：

用2月龄以上健康鸡5只，每只胸肌注射2ml油乳灭活疫苗，经21天，连同条件相同的未免疫对照鸡5只，用鸡痢疾志贺氏菌对免疫组和未免疫对照组同时进行攻毒(鸡痢疾志贺菌攻毒菌数为1.36亿/只)，攻毒方法均为口腔灌服。攻毒后连续观察10天，未免疫对照组5只鸡均出现拉稀症状(5/5)；免疫组攻毒后无拉稀症状出现(0/5)，即临床免疫保护率达100％(5/5)，疫苗判为合格。

其它步骤及说明同实施例一，不再详述。

在鸡志贺氏菌灭活油乳疫苗制备的实施例中，肉汤培养物细菌浓度调整后细菌数在20～30亿/ml的变化范围内可任意选择，这些变化都是本发明实施例的常见变化，不再一一列举。

实施例三：鸡鲍氏志贺氏菌灭活疫苗的研究——免疫功能及免疫保护力的测定

为了检测鸡鲍氏志贺氏菌灭活苗的免疫功能，用铝胶灭活苗给免疫组进行首免，一免后第四周用油乳灭活苗进行二免，并设立未免疫对照组。在首免和二免后每周同时对免疫组和未免疫组采血，分别进行E-玫瑰花环试验、微量平板凝集试验和攻毒试验。免疫试验结果显示：免疫组的E-花环形成率和免疫抗体效价均明显高于未免疫对照组。由此表明，鸡鲍氏志贺氏菌灭活苗可显著提高机体的细胞免疫功能和体液免疫功能。攻毒试验结果显示：免疫组进行攻毒，其免疫保护指数明显高于未免疫对照组。由此表明，鸡鲍氏志贺氏菌灭活苗能够显著提高动物机体的免疫保护力，可使动物有效预防鲍氏志贺氏菌的感染。

1材料与方法

1.1试验地点、时间

2003.8.9～2004.1.10于河南农业大学工程楼1108重点开放实验室。

1.2实验动物

1.2.1动物来源及饲养管理  80只普通鸡购自河南农业大学种鸡场1日龄固始鸡，淘汰8只弱雏，保留72只外观健康雏鸡，按正常饲养管理标准和免疫程序进行；未免疫对照组的1日龄SPF鸡10只，购自北京梅里亚维通实验技术公司，严格隔离饲养至3周。

1.2.2动物分组免疫组为40只23日龄固始鸡，用鸡鲍氏志贺氏菌灭活铝胶苗首次免疫，每只胸肌注射1ml，首免后第4周用鸡鲍氏志贺氏菌灭活油乳苗二免，每只胸肌注射2ml。未免疫组分为固始鸡32只，SPF鸡10只，均未经鸡鲍氏志贺氏菌灭活疫苗免疫接种。

1.3疫苗

(1)鸡鲍氏志贺氏菌灭活油乳苗，简称油乳苗或油苗。(2)本发明人的另一发明产品鸡鲍氏志贺氏菌灭活铝胶苗，简称铝胶苗或胶苗。两种疫苗批号均为030420，由河南农业大学工程楼1108微生物重点实验室研制。

1.4待测样品的采集和处理

各组试验鸡每周进行翼下静脉采血两份，一份新鲜抗凝血随即进行E-花环试验；另一份新鲜血液进行血清分离，将分离血清-20℃冻存，待测时先将冷冻血清融解，并进行56℃30min灭活。

1.5主要药品试剂和仪器设备

1.5.1E-花环形成试验所需试剂  肝素钠(效价≥160单位/毫克，批号为020509)由上海化学试剂公司生产，用前配制成200单位/毫升溶液；淋巴细胞分层液(ρ＝1.077±0.002，pH＝6.5-7.5)由上海恒信化学试剂有限公司生产(原上海试剂二厂)；绵羊血采于郑州北郊路寨正常成年羊；小牛血清由杭州四季青生物工程材料有限公司生产，用前进行56℃30min灭活；50％戊二醛溶液，由天津市科密欧化学试剂开发中心生产(批号为020716)，用前配制成2.5％溶液；pH＝6.4PBS，pH＝7.4无钙镁Hank’s液，瑞氏染液和姬姆萨染液，pH＝7.2阿氏液。

1.5.2E-花环形成试验所需仪器  台式水平离心机(型号：TDL-40B)，由上海安亭科学仪器厂制造；800型离心机由上海手术器械厂制造；电热恒温水温箱(型号：HH.W21.600-C)，由北京长源实验设备厂制造；真空干燥箱(型号：DZF-IB型)，由上海跃进医疗器械厂制造；OLYMPUS光学显微镜为日本进口。

1.5.3免疫抗体测定所需主要试剂  鸡鲍氏志贺氏菌微量凝集监测抗原，由河南农业大学工程楼1108微生物重点实验室制备，菌种由该室分离保存。鲍氏志贺氏菌标准阳性血清(批号：040401)，由兰州生物制品研究所生产；阴性血清用SPF鸡制备；0.5％石炭酸灭菌生理盐水自备。

1.5.4免疫抗体测定所需主要仪器设备  50孔U型有机玻璃板，由江苏姜堰市容飞器械厂制造；20～200ul单道可调式移液器和50～300ul多道可调式移液器(型号：Y32979和Y34540)，由上海雷勃分析仪器有限公司制造；电热恒温水温箱(型号：HH.W21.600-C)，由北京长源设备厂制造；隔水式电热恒温培养箱(型号：PYX-DHS-50×65-B)，由上海跃进医疗器械厂制造。台式离心机(型号为TDL-40B)由上海安亭科学仪器厂制造；755B型紫外可见光分光光度计由上海精密科学仪器有限公司制造。

1.6E-玫瑰花环形成试验

简称“E-花环试验”，操作方法按常规法进行，具体内容参见王世若等主编的第二版《现代动物免疫学》(2001年吉林科学出版社出版)第518～519页。

1.7微量平板凝集试验

试验方法：首先在50孔U型有机玻璃板上做好标记，横向共五排，每排10孔。每排第1孔均加入0.5％石炭酸灭菌生理盐水930μL，而其它各孔均加入50μL。然后每排第一孔加入已灭活处理的待检血清30μL，吹打三次混匀，弃去860μL，然后再从第1孔内吸出50μL加入第2孔，依次类推至第10孔，混匀后弃去50μL。用带乳胶头的滴管每孔加1滴(50μL)混匀的鸡鲍氏志贺氏菌凝集抗原。同时设立标准阳性血清、阴性血清和抗原三个对照。摇动U型板使孔内加样充分混匀，反应温度为20～35℃，反应时间为30～40min。结果判定方法：当有少量凝集颗粒，液体不甚透明时，即出现50％抗原凝集(用“++”表示)，此时血清最高稀释倍数为该待检血清的抗体效价。

1.8免疫攻毒保护试验

在首免后第16天、第28天用分离的鸡鲍氏志贺氏菌接种于1％葡萄糖肉汤中，经37℃24h培养，对免疫组和未免疫组进行攻毒，同时对细菌肉汤培养物进行计数(首免后第16天攻毒鲍氏志贺菌肉汤培养物为3.72亿个/ml，首免后第28天和二免后攻毒鲍氏志贺菌肉汤培养物均为7.32亿个/ml)，每组每只灌服1ml，同时腹腔注射1ml。攻毒后连续观察10天，每天观察2次，记录免疫组和未免疫组鸡的症状表现，且免疫组攻毒后前7天每天解剖1只鸡，未免疫组攻毒后前3天每天解剖1只鸡，剩余鸡第10天观察症状表现并全部进行剖检。

2结果

2.1免疫组和未免疫组E-花环形成率测定结果

详见表1，E-花环形成率变化规律详见附图1。

表1免疫组和未免疫组E-花环形成率测定结果

                                       单位：％

2.2鸡鲍氏志贺氏菌灭活苗免疫抗体水平测定结果

详见表2，抗体水平消长规律详见附图2。

表2免疫组和未免疫组抗体效价测定结果

                                        单位：log2

2.3免疫攻毒保护试验结果

用鸡鲍氏志贺氏菌灭活铝胶苗首免后，分别于第16天和第28天对免疫组和未免疫组鸡群进行攻毒。首免后第16天，免疫攻毒组有1/10鸡只出现轻微腹泻症状和剖检病变；首免后第28天，免疫攻毒组有4/10鸡只出现拉稀症状和剖检病变，剖检可见脾脏和肠道轻微病变；二免后第21天，免疫攻毒组有1/10鸡只出现轻微腹泻症状和剖检病变。而未免疫攻毒组攻毒后10多小时，多数鸡只开始出现典型拉稀症状，重者为脓血便。据统计，未免疫攻毒组于首免后第16天，攻毒后1～7天有3/6鸡只出现典型拉稀症状，3/6出现典型剖检病变，主要病变为脾淤血肿大和肠道出血等；首免后第28天，未免疫攻毒组有5/6鸡只出现典型拉稀症状和剖检病变；二免后第21天，未免疫攻毒组有10/10鸡只出现典型腹泻症状和剖检病变。总之，免疫攻毒组与未免疫攻毒组相比，免疫攻毒组发病率低，免疫保护率高，剖检病变少而轻，症状和剖检病变阳性率均明显低于未免疫攻毒组。有关症状和剖检病变阳性率统计结果详见表3和表4。

表3攻毒鸡症状阳性率及免疫保护指数

                                          单位：只，％

注：表3中分母为观察只数，分子为观察到相应症状的只数。

免疫保护指数计算公式：PI＝(攻毒对照阳性率-免疫阳性率)/攻毒对照阳性率。

表4攻毒鸡病变阳性率及免疫保护指数

                                         单位：只，％

注：表4中分母为观察只数，分子为观察到相应病变的只数。

免疫保护指数计算公式：PI＝(攻毒对照阳性率-免疫阳性率)/攻毒对照阳性率。

3讨论与小结

3.1鸡鲍氏志贺氏菌灭活苗对细胞免疫功能的影响

试验结果表1和图1显示：胶苗一免后3周E-花环形成率达到高峰，为24.8±1.80％，第4周下降至23.6±0.60％；用油苗二免后1周E-花环形成率上升到25.5±0.80％，油苗二免后2周E-花环形成率达高峰，为28.8±1.58％；油苗二免后第12周E-花环形成率开始缓慢下降(28.1±1.17％)，第13周下降至27.3±0.53％，维持高峰期10周左右。随着疫苗免疫次数的增多，免疫组鸡的E-花环形成率也就相对越高。由此可以看出，首免胶苗鸡的细胞免疫功能产生慢，维持时间短；用油苗二免后，鸡的细胞免疫功能产生快，免疫力高，维持时间长，下降速度慢。由试验结果还可以看出，无论用胶苗还是用油苗进行免疫接种，免疫组鸡的E-花环形成率均明显高于同期的未免疫对照组，说明铝胶苗和油乳苗均可显著提高鸡的细胞免疫功能。

3.2鸡鲍氏志贺氏菌灭活苗对体液免疫功能的影响

试验结果表2和图2显示：胶苗一免后3周免疫抗体效价达到高峰，为11.7±0.43log2，第4周下降至10.7±0.43log2；用油苗二免后1周免疫抗体效价上升到12.0±0log2，油苗二免后2周免疫抗体效价达高峰，为13.0±0log2；油苗二免后第10周免疫抗体效价开始缓慢下降(12.5±0.50log2)，第13周下降至11.3±0.43log2，维持高峰期9周左右。随着疫苗免疫次数的增多，免疫组鸡的免疫抗体效价也就相对越高。由此可以看出，首免胶苗鸡的体液免疫功能产生慢，维持时间短；用油苗二免后，鸡的体液免疫功能产生快，免疫力高，维持时间长，下降速度慢。未免疫组中的普通鸡抗体效价水平始终维持在8log2左右，而未免疫组的SPF鸡三次免疫抗体效价测定值均为0，这说明未免疫组鸡(普通鸡)幼龄时曾有鸡鲍氏志贺氏菌的隐性感染。尽管如此，但仍可看出无论用胶苗还是油苗进行免疫接种，免疫组鸡的免疫抗体效价均明显高于同期的未免疫对照组，说明铝胶苗和油乳苗均可显著提高鸡的体液免疫功能。此外，测得SPF鸡的抗体效价三次均为0，表明该鸡符合试验标准要求未曾感染志贺氏菌，同时进一步证明本试验测得的各组抗体效价数据准确可靠。

3.3鸡鲍氏志贺氏菌灭活苗的免疫保护作用

用鸡鲍氏志贺氏菌灭活铝胶苗首免后，分别于第16天和第28天对免疫组和未免疫组鸡群进行攻毒。首免后第16天，免疫攻毒组有1/10鸡只出现轻微腹泻症状和剖检病变；首免后第28天，免疫攻毒组有4/10鸡只出现拉稀症状和剖检病变，剖检可见脾脏和肠道轻微病变；二免后第21天，免疫攻毒组有1/10鸡只出现轻微腹泻症状和剖检病变。而未免疫攻毒组攻毒后10多小时，多数鸡只开始出现典型拉稀症状，重者为脓血便。据统计，未免疫攻毒组于首免后第16天，攻毒后1～7天有3/6鸡只出现典型拉稀症状，3/6出现典型剖检病变，主要病变为脾淤血肿大和肠道出血等；首免后第28天，未免疫攻毒组有5/6鸡只出现典型拉稀症状和剖检病变；二免后第21天，未免疫攻毒组有10/10鸡只出现典型腹泻症状和剖检病变。首免后16天和二免后21天，免疫组的免疫保护指数分别为80％和90％。总之，免疫攻毒组与未免疫攻毒组相比，免疫攻毒组发病率低，免疫保护率高，剖检病变少而轻，症状和剖检病变阳性率均明显低于未免疫攻毒组。由此表明，鸡鲍氏志贺氏菌灭活铝胶苗和油乳苗均对预防该菌的感染起到了显著的免疫保护作用。

实施例四：鸡痢疾志贺氏菌灭活苗研究——免疫功能和免疫保护力的测定

用研制出的鸡痢疾志贺氏菌灭活苗对鸡进行免疫，并测定其免疫功能和免疫保护力。先利用本发明人的另一发明鸡痢疾志贺氏菌灭活铝胶苗对鸡首免，首免后第4周用本发明的鸡痢疾志贺氏菌灭活油乳苗进行二免，并于二免后第28周用油乳苗进行三免。对免疫组和未免疫组鸡只定期进行翼静脉采血，用微量平板凝集试验进行免疫抗体效价测定以了解机体的体液免疫功能，并用E-花环形成试验测定机体的T细胞数目，从而了解机体的细胞免疫功能。

1材料与方法

1.1试验时间、地点

2004年2月2日～2005年1月30日于河南农业大学工程楼1108微生物重点实验室进行。

1.2试验动物

1.2.1动物来源及饲养管理  普通鸡购自河南农业大学种鸡场1日龄固始鸡100只，淘汰弱小者，保留外观正常强壮鸡82只，按正常标准饲养管理和免疫。1日龄SPF鸡10只，购自北京梅里亚维通实验技术公司，严格隔离饲养至3周。

1.2.2动物分组  ①免疫胶油组：固始鸡饲养至23日龄用鸡痢疾志贺氏菌灭活铝胶苗首免45只，每只胸肌注射1ml；铝胶苗首免后第4周用鸡痢疾志贺氏菌灭活油乳苗二免，二免后第28周(196天)用油苗进行三免，二免和三免每只鸡均胸肌注射2ml。②未免疫对照组：未免疫鸡痢疾志贺氏菌疫苗的固始鸡37只，作阴性血清对照SPF鸡10只。

1.3疫苗

(1)鸡痢疾志贺氏菌灭活油乳苗，简称油乳苗或油苗。(2)本发明人的另一发明产品鸡痢疾志贺氏菌灭活铝胶苗，简称铝胶苗或胶苗。两种疫苗批号均为040502，由河南农业大学工程楼1108微生物重点实验室研制。

1.4待测样品的采集和处理：同实施例一。

1.5主要药品试剂和仪器设备

1.5.1免疫抗体测定所需主要试剂  鸡痢疾志贺氏菌微量凝集监测抗原，由河南农业大学工程楼1108微生物重点实验室制备，菌种由该室分离保存。痢疾志贺氏菌标准阳性血清(批号：040401)，由兰州生物制品研究所生产；阴性血清用SPF鸡制备；0.5％石炭酸灭菌生理盐水自备。

1.5.2免疫抗体测定所需主要仪器设备：同实施例一。

1.5.3E-花环形成试验所需主要试剂：同实施例一。

1.5.4E-花环形成试验所需主要仪器设备：同实施例一。

1.6微量平板凝集试验

以鸡痢疾志贺氏菌代替鸡鲍氏志贺氏菌进行试验，试验方法及结果判定方法同实施例一。

1.7E-玫瑰花环形成试验：简称“E-花环试验”，操作方法同实施例一。

1.8免疫攻毒保护试验

在试验鸡群首免、二免和三免后的不同时间内，用鸡痢疾志贺氏菌肉汤培养物经活菌计数，对免疫组和未免疫组鸡群进行攻毒，每只鸡均同时口腔灌服和腹腔注射。首免后第16天和第28天每只鸡攻毒菌数分别为1.098千万个和6.56千万个；二免后第21天和第189天每只鸡攻毒菌数分别为7.63千万个和8.28千万个；三免后第108天每只鸡攻毒菌数为1.36亿个。首免后第16天和第28天、二免后第21天和第189天，免疫组攻毒后前7天每天解剖1只鸡，未免疫组攻毒后前3天每天解剖1只鸡，其余鸡只观察症状至第10天全部进行剖检。三免后108天对免疫组和未免疫组攻毒后，连续观察10天，并全部剖检。

2结果

2.1免疫组和未免疫组抗体水平测定结果

鸡痢疾志贺氏菌灭活疫苗免疫组和未免疫组抗体效价测定结果详见表5，抗体水平曲线详见附图3。

表5免疫组和未免疫组抗体效价测定结果

                                           单位：log2

表5中利用双因素无重复数据方差分析可知：胶苗一免，油苗二免，油苗三免与未免疫组相比可极显著(P＜0.01)提高机体体液免疫功能。

2.2免疫组和未免疫组E-花环形成率测定结果

鸡痢疾志贺氏菌灭活疫苗免疫组和未免疫组E-花环形成率测定结果详见表6，其形成规律曲线详见附图4。

表6免疫组和未免疫组E-花环形成率测定结果

                                             单位：％

表6中利用双因素无重复数据方差分析可知：胶苗一免，油苗二免，油苗三免与未免疫组相比可极显著(P＜0.05)提高机体细胞免疫功能。

2.3免疫攻毒保护试验结果

对免疫组和未免疫组试验鸡群攻毒后，两组出现明显不同的结果。免疫组首免后第16天和二免后第21天攻毒，个别鸡只(1/10)在观察期间出现轻微拉稀症状，剖检可见个别鸡只(1/10)出现脾脏和肠道的轻微病变；免疫组首免后第28天和二免后第189天攻毒，部分鸡只(4/10)在观察期间出现拉稀症状，剖检可见部分鸡只(4/10或2/10)出现脾脏和肠道病变；免疫组三免后108天攻毒后鸡只(5/5)粪便均正常，剖检未见脾脏和肠道明显病变。未免疫组于首免后第16天和第28天攻毒，绝大多数鸡只(4/6～5/6)出现典型拉稀症状和剖检病变；未免疫组二免后第21天和第189天攻毒，鸡只均出现(10/10)典型拉稀症状和剖检病变。典型剖检病变主要表现为脾淤血肿大和肠道出血。此外，剖检可见部分鸡腹腔内出现纤维素性炎症、心包膜有胶冻样物质，肝脏发生脂肪变性等。三免后108天攻毒，未免疫组鸡群(5/5)于攻毒后24h可见不成形粪便，48h后均出现水样稀粪，剖检均可见脾脏淤血肿大、部分鸡肠道出血等。总之，免疫组与未免疫组相比，攻毒后免疫组症状阳性率和剖检病变阳性率均远远低于未免疫组，而免疫保护指数在免疫鸡的高水平免疫期内均较高，可达85.1％～100％。由此说明，免疫组鸡群免疫保护力显著增强。

免疫组和未免疫组攻毒后，试验鸡症状阳性率和免疫保护指数统计结果详见表7，剖检病变阳性率和免疫保护指数统计结果详见表8。

表7攻毒鸡症状阳性率及免疫保护指数统计

                                              单位：只，％

注：表7中数字分母均为攻毒鸡只数，分子为拉稀症状鸡只数。

免疫保护指数计算公式：PI＝(攻毒对照阳性率-免疫阳性率)/攻毒对照阳性率。

表8攻毒鸡剖检病变阳性率及免疫保护指数统计

                                              单位：只，％

注：表8中数字分母均为攻毒鸡只数，分子为剖检病变鸡只数。

免疫保护指数计算公式：PI＝(攻毒对照阳性率-免疫阳性率)/攻毒对照阳性率。

3讨论与小结

3.1鸡痢疾志贺氏菌灭活苗对体液免疫功能的影响

抗体水平测定结果表5和图3表明：免疫组的抗体水平明显高于未免疫组，由此说明鸡痢疾志贺氏菌灭活铝胶苗和油乳苗均可显著提高机体的免疫抗体水平。从表5和图3中可以看出：铝胶苗一免后第3周抗体效价上升至高峰达11.5log2，第4周开始下降。油苗二免后第2周抗体水平上升至高峰达12.4log2，并维持较长时间，第13周开始缓慢下降，第15周下降至11.5log2，第28周降至9.5log2。油苗三免后第1周即上升至高峰达14log2，并一直维持至第6周，第7周下降至12.75log2，并一直维持至第13周不变，第15周下降至12.5log2，但与二免后第15周抗体效价(11.5log2)相比仍高出一个滴度。由此可见，二免和三免均可使抗体产生速度更快，数量更多，效价维持时间更长。此外，测定未免疫组SPF鸡第1周至第3周的三次抗体效价值均为0，这说明未免疫组SPF鸡是符合试验标准的；而普通鸡(固始鸡)未免疫组抗体水平始终维持在8log2左右，这说明试验鸡(固始鸡)早期幼龄时曾有痢疾志贺氏菌的隐性感染，但即使在这种情况下仍可以看出，经灭活苗免疫鸡的抗体效价均明显高于隐性感染鸡的抗体水平。总之，上述抗体测定试验结果数据表明，鸡痢疾志贺氏菌灭活苗能显著提高动物机体的体液免疫功能，并进一步表明用本试验测定动物机体的免疫抗体其方法是标准可行的。

3.2鸡痢疾志贺氏菌灭活苗对细胞免疫功能的影响

从E-花环形成试验结果表6和图4可以看出，免疫组E-花环形成率明显高于未免疫组，由此说明鸡痢疾志贺氏菌灭活铝胶苗和油乳苗均可显著提高机体的E-花环形成率。从表6和图4中可看出：铝胶苗首免后第3周E-花环形成率上升至高峰达24.93±3.54％，第4周下降至23.20±2.94％；油苗二免后第2周上升至高峰达28.41±1.43％，比一免后高峰(24.93±3.54％)高出3.48％，至第11周后缓慢下降，第13周下降至27.20±1.91％；由三免后第11周和第15周的E-花环测定结果可知，三免后第11周E-花环形成率36.69±2.24％明显高于二免后第11周的28.23±1.09％，而15周的E-花环形成率则更高，可达38.04±2.97％。此外，由表6和图4还可看出，未免疫组E-花环形成率随鸡的日龄增长而增长，但达一定年龄时未免疫组鸡的E-花环形成率保持一定水平而不再升高。总之，E-花环形成试验结果表明，鸡痢疾志贺氏菌灭活苗能显著提高动物机体的细胞免疫功能，同时表明用E-花环形成试验测定动物机体的细胞免疫功能是行之有效的。

3.3鸡痢疾志贺氏菌灭活苗的免疫保护作用

本研究免疫攻毒试验充分证明：未免疫组攻毒后短时间内均出现了典型症状，表现拉稀，重者脓血便。剖检后均出现典型的脾脏淤血肿大、肠出血等病理变化。免疫组免疫后进行攻毒，虽然攻毒菌数偏高，但免疫组仅有少数鸡只发生轻微的症状和病变，且免疫组动物机体的免疫保护力随着免疫次数的增多而不断加强，攻毒动物的免疫保护指数由85.1％至100％。由此表明，鸡痢疾志贺氏病灭活苗对预防该菌感染起到了显著的免疫保护作用。用铝胶苗首免后动物机体免疫力明显增强，免疫组免疫抗体水平和E-花环形成率比未免疫组鸡群显著升高，首免后16天攻毒鸡群临床免疫保护指数可达85.1％；当使用油乳苗进行二免时，随着免疫抗体水平和E-花环形成率的不断升高，动物机体免疫保护力不断加强，二免后21天攻毒鸡群临床免疫保护指数可达90％；使用油乳苗三免后动物机体免疫保护力大大加强，三免后108天攻毒免疫保护指数可达100％。

Claims (3)

1.一种鸡志贺氏菌灭活油乳疫苗，含有有效剂量的灭活鸡志贺氏菌和兽医学上可接受的佐剂，所述的佐剂为费氏佐剂、矿物油、植物油乳化佐剂中的任一种，其特征是：所述疫苗中含灭活鸡志贺氏菌数为5亿～7.5亿/ml；所述的灭活鸡志贺氏菌为鸡痢疾志贺氏菌或鸡鲍氏志贺氏菌。

2.一种权利要求1所述的鸡志贺氏菌灭活油乳疫苗的制备方法，其特征是：包括以下步骤：

(1)菌种传代和复壮：将纯化的鸡志贺氏菌用1％葡萄糖肉汤进行接种，在37±0.5℃条件下培养24～30h，然后用血液平板培养复壮；

(2)细菌接种和扩大培养：将复壮的鸡志贺氏菌接种1％葡萄糖肉汤进行一代培养，然后将一代培养物用1％葡萄糖肉汤进行扩大培养，并用灭菌棉球蘸取培养好的鸡志贺氏菌菌液，均匀涂抹于SS琼脂平板上，置37±0.5℃培养24～30h；

(3)收集细菌：在长满鸡志贺氏菌菌苔的SS平板上，每平板倾入0.85％灭菌生理盐水3～5ml，刮取SS平板上的鸡志贺氏菌菌苔，然后将刮取的菌液移入无菌瓶中；

(4)细菌计数和浓度调整：将1％葡萄糖肉汤的细菌扩大培养物进行活菌计数，并用SS平板上刮取的鸡志贺氏菌菌液对肉汤培养物进行细菌浓度调整，调整菌数为20～30亿/ml；

(5)细菌灭活：向调整好细菌浓度的1％葡萄糖肉汤细菌培养物中加入甲醛进行灭活，摇匀，使甲醛的最终浓度为0.5％，37±0.5℃条件下作用24～30h；

(6)加入佐剂：向制备好的细菌灭活肉汤中加入佐剂，肉汤与佐剂的体积比为1∶3，混合均匀后制成疫苗。

3.权利要求1所述的鸡志贺氏菌在制备预防鸡志贺氏菌感染的灭活油乳疫苗中的应用。

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