CN109541173A - 一种土壤中秀丽隐杆线虫的分离方法 - Google Patents
一种土壤中秀丽隐杆线虫的分离方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种土壤中秀丽隐杆线虫的分离方法，该方法包括：将用于分离秀丽隐杆线虫的器皿分成左、右两个区域，分别为大肠杆菌培养区和土壤放置区；向大肠杆菌培养区内加入固体培养基，并在固体培养基上接种大肠杆菌；培养大肠杆菌一段时间后，向土壤放置区内加入含有秀丽隐杆线虫的土壤，静置3～5h，利用秀丽隐杆线虫对大肠杆菌的趋食性，使线虫从土壤放置区爬至大肠杆菌培养区；取出固体培养基，冲洗固体培养基表面，收集得到秀丽隐杆线虫。本发明利用线虫的趋食性，对线虫进行分离，可使线虫从土壤中自由爬出取食，不仅操作简便，可进行大批量分离，而且能够在保持线虫生物活性的同时大大提高秀丽隐杆线虫的回收率。
Description
技术领域
本发明涉及一种土壤中线虫的分离方法，尤其涉及一种简易、保持生 物活性和高分离率的秀丽隐杆线虫的分离方法。
背景技术
线虫是土壤生态系统的重要功能组分，在有机质分解、植物营养矿化 及养分循环过程中起着重要作用。由于线虫的类群和数量丰富，很多物种 可以在极端条件下生存，所以可以利用线虫结构简单、身体透明、易于观 察、繁殖周期短和对污染物反应敏感等生物学特征进行环境毒性物质评 价，线虫有着其它模式生物无法比拟的优势，是生态毒理学研究的理想材 料，可以来判断土壤污染程度，评估污染对农田土壤健康的危害程度，从 生态功能上揭示土壤环境的健康状况，进而为评价土壤污染提供理论依 据。
William等(Williams P L,Dusenbery D B.Aquatic Toxicity Testing Usingthe Nematode Caenorhabditis elegans.Environmental Toxicology and Chemistry,1990,9:1285-1290.)最早以C.elegens作为模式生物，证实了运 动和摄食行为对多种重金属具有较高的敏感性。Dhawan等(Dhawan R, Dusenbery D B,Williams P L.Acomparisonof metal-induced lethality and behavioral responses in the nematodeCaenorhabditis elegans.Environmental Toxicology and Chemistry,2000,19:3061-3067.)的研究进一步证实重金属 对C.elegens运动行为的EC50比LC50低20-50倍。Anderson等(Anderson G L,Boyd W A,Williams P L.Assessment of sublethalendpoints for toxicity testing with the nematode Caenorhabditiselegans.Environmental Toxicology and Chemistry,2001,20:833-838.)测定了24h内Cu、Pb、Cd对C.elegens 运动及摄食行为的影响，结果表明运动、摄食率的24h EC50大小顺序为 Cu>Pb>Cd。最近，Wang等(Wang D Y,Xing X J.Assessment of locomotion behaviordefects induced by acute toxicity from heavy metal exposure in nematodeCaenorhabditis elegans.Journal of Environmental Sciences,2008, 20:1132-1137.)提出C.elegens的运动和学习行为可作为评价重金属急性 毒性的敏感指标。
在国内并没有系统的秀丽隐杆线虫的分离方法，目前通用的线虫分离 方法主要为贝尔曼漏斗法和浅盘法以及蔗糖离心分离法。其中，贝尔曼漏 斗法操作方法可简单表述为将玻璃漏斗置于漏斗架上，下面接一段橡皮 管，橡皮管上装一个止水夹。将分离材料用两层纱布包好，放入漏斗中， 然后放入清水，清水以浸没分离材料为度。经过24h，由于趋水性和本身 的重量，线虫离开材料，并在水中游动，最后沉降到漏斗底部的橡皮管中。 而浅盘法和蔗糖离心法也都是通过线虫的趋水性和自身重量来实现线虫 的分离。但是，上述现有技术有以下几个方面的缺点：
(1)线虫需要穿过纱布到达漏斗底部或穿过筛盘、筛网，这大大降 低了线虫的回收率；
(2)因反渗透作用而易使虫体变形、影响虫体的活性，降低了其生 物生理化学行为，不利于显微镜观察；
(3)为了防止污染，每个过滤装置都需要清洗，浅盘法和漏斗法都 需要取下过滤装置用水清洗，然后晾干再使用，步骤较为复杂且若分离样 品个数多需大批量的装置。
发明内容
针对上述的问题，本发明提供了一种土壤中秀丽隐杆线虫的分离方 法，该分离方法不仅操作简便、可进行大批量分离，而且能够在保持线虫 生物活性的同时大大提高秀丽隐杆线虫的回收率。
具体技术方案如下：
一种土壤中秀丽隐杆线虫的分离方法，包括以下步骤：
(1)将用于分离秀丽隐杆线虫的器皿分成左、右两个区域，分别为 大肠杆菌培养区和土壤放置区；向大肠杆菌培养区内加入固体培养基，并 在固体培养基上接种大肠杆菌；
(2)培养大肠杆菌一段时间后，向土壤放置区内加入含有秀丽隐杆 线虫的土壤，静置3～5h，利用秀丽隐杆线虫对大肠杆菌的趋食性，使秀 丽隐杆线虫从土壤放置区爬至大肠杆菌培养区；
(3)取出器皿内含有秀丽隐杆线虫的固体培养基，冲洗固体培养基 表面，收集得到秀丽隐杆线虫。
将接种大肠杆菌的固体培养基与含有秀丽隐杆线虫的土壤放置在一 个器皿中，通过利用线虫的趋食性，对线虫进行分离可使线虫从土壤中自 由爬出取食，在保持线虫生物活性的同时大大提高线虫的回收率。
固体培养基的选择将影响秀丽隐杆线虫的回收率，应当采用既能够培 养大肠杆菌，又能够培养秀丽隐杆线虫的培养基；作为优选，步骤(1) 中，所述固体培养基为NGM培养基，其组成为：琼脂或琼脂替代品25g/L， 蛋白胨20.0g/L，氯化钠3g/L，硫酸镁1mol/L，氯化钙1mol/L，磷酸 钾1mol/L，胆固醇乙醇溶液5mg/L，其余为超纯水。
秀丽隐杆线虫对于不同大肠杆菌有喜好差别，作为优选，所述大肠杆 菌为E.coliOP 50。
先对大肠杆菌进行活化和预培养，可以提高大肠杆菌在固体培养基中 存活率，从而引诱更多地秀丽隐杆线虫从土壤中爬出觅食；但是，大肠杆 菌的接种量也不宜过多，否则影响分离。作为优选，步骤(1)中，先将 大肠杆菌接入LB溶液中预培养后，再接种至固体培养基上；其中，预培 养时间为11～13h，接入固体培养基时的接种量为1.2×108～1.8×108CFU/ml。
步骤(2)中，加入含有秀丽隐杆线虫的土壤后，则可在室温下静置， 静置的过程中即是秀丽隐杆线虫从土壤放置区爬至大肠杆菌培养区的过 程，应当合理考虑静置时间，时间过短则无法保证秀丽隐杆线虫完全爬出 土壤，时间过长则可能导致线虫进行生长繁殖，产生下一代幼虫。作为优 选，所述静置的时间为4h。
作为优选，步骤(2)中，加入土壤后，采用透气薄膜封住器皿顶部 的开口，再进行静置；可避免因培养基水分蒸发而造成部分秀丽隐杆线虫 的死亡。
冲洗溶液的选择会影响秀丽隐杆线虫的生物活性，不适宜的冲洗溶液 会影响秀丽隐杆线虫的渗透压平衡，造成部分秀丽隐杆线虫因细胞破裂而 死亡。作为优选，步骤(3)中，采用M9溶液进行冲洗；所述M9溶液的 组成为：5.8g/L磷酸氢二钠，3.0g/L磷酸二氢钾，0.5g/L氯化钠，1.0g/L 氯化铵，其余为超纯水。
为了便于固体培养基的加入，防止固体培养基加入时向土壤放置区流 动，作为优选，所述器皿的中部设有可拆卸的隔板；步骤(2)中，在加 入固体培养基和土壤后，先取出隔板，再进行静置。
进一步地，也可以在大肠杆菌培养区和土壤放置区中同时加入固体培 养基，静置后，再插入隔板，利于大肠杆菌培养区中固体培养基的分离。
为了防止土壤中的水分流入固体培养基中，造成培养基污染，影响秀 丽隐杆线虫的回收，作为优选，在加入固体培养基和土壤后，在大肠杆菌 培养区对应的培养皿外底面上安装支撑件，使器皿倾斜放置，提升培养皿 大肠杆菌培养区一侧的高度；倾斜角度为5～15°。
所述器皿可以是实验室内常用的培养皿，也可以是专门设计的用于分 离秀丽隐杆线虫的任意形状的器皿，器皿的大小根据土壤的量而定。在分 离秀丽隐杆线虫的过程中，所有仪器器皿均需经过严格的消毒。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明分离方法利用线虫的趋食性，对线虫进行分离，可使线 虫从土壤中自由爬出取食，不仅操作简便，可进行大批量分离，而且能够 在保持线虫生物活性的同时大大提高秀丽隐杆线虫的回收率。
(2)本发明分离方法操作过程简单方便，回收效率高，通过将线虫 从土壤中分离得到，可避免传统方法中土壤杂质对分离方法的污染，从而 得到干净的线虫。
(3)本发明分离方法中线虫回收选用的M9溶液能方便快捷地彻底 将线虫从固体培养基上清洗下来，且不影响线虫的活性和生理状态。
(4)本发明分离方法使用的试剂和器材为各实验室常规材料，适用 广泛，容易上手，可进行大批量的分离实验，且不需要搭设、拆卸任何复 杂装置。
附图说明
图1为实施例1中采用不同分离方法的实验结果；
其中，1为采用漏斗法分离秀丽隐杆线虫；5为采用漏斗法分离获得 的线虫分离液，其中含有部分土壤残渣且线虫量较少；
2为采用浅盘法分离秀丽隐杆线虫；6为采用浅盘法分离获得的线虫 分离液，其中含有较多土壤细颗粒杂质且线虫量极少；
3为采用ISO国际标准胶体悬浮法分离秀丽隐杆线虫；7为采用胶体 悬浮法分离获得的线虫悬浮液，其中线虫量较多但是还有较多的土壤细颗 粒杂质，悬浮液较浑浊；
4为采用实施例1方法的秀丽隐杆线虫分离过程；8采用实施例1方 法获得的秀丽隐杆线虫在40倍显微镜下观察结果，可见线虫数量极多且 无杂质。
图2为实施例2中分离秀丽隐杆线虫的器皿的结构示意图；
其中，A为加入固体培养基和接种大肠杆菌时器皿平铺于桌面上的立 体示意图；B为静置过程中盒盖倾斜放置的立体示意图；C为加入固体培 养基和接种大肠杆菌时器皿平铺于桌面上的主视示意图；D为静置过程中 盒盖倾斜放置的主视示意图；1为盒体；2为盒盖；3为盒体和盒盖的连接 处；4为三角架。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明 的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
实施例1
一种简易的分离土壤中秀丽隐杆线虫的方法，具体步骤如下：
1、NGM培养基、LB培养基和M9溶液的组成及制作方法
(一)NGM培养基：
(1)组成：琼脂或琼脂替代品，6.25g；蛋白胨5.0g；氯化钠0.75g； 硫酸镁0.25mL1mol/L；氯化钙，0.25mL 1mol/L；磷酸钾6.25mL 1 mol/L；胆固醇乙醇溶液0.25mL 5mg/ml；其余为超纯水。
(2)制作：称取6.25g琼脂或琼脂替代品，5.0g蛋白胨，0.75g氯 化钠，0.25mL1mol/L硫酸镁，0.25ml 1mol/L氯化钙，再加超纯水至 250mL，放入锥形瓶中高压灭菌加热使琼脂全部融化后，加入6.25mL 1 mol/L磷酸钾和0.25mL 5mg/ml胆固醇乙醇溶液，倒入灭菌后的培养皿 中自然冷却至室温，得到NGM固体培养基。
(二)LB培养基：
(1)组成：胰蛋白胨，4.0g；酵母抽提物，2.0g；氯化钠，4.0g；其 余为超纯水
(2)制作：称取4.0g胰蛋白胨，2.0g酵母抽提物和4.0g氯化钠， 加超纯水至400mL，放入锥形瓶中高压灭菌，得到LB液体培养基。
(三)M9冲洗液：
(1)组成：磷酸氢二钠，5.8g；磷酸二氢钾，3.0g；氯化钠，0.5g；氯 化铵，1.0g；其余为超纯水
(2)制作：称取5.8g磷酸氢二钠，3.0g磷酸二氢钾，0.5g氯化钠 和1.0g氯化铵，加入超纯水至1000mL，放入锥形瓶中高压灭菌，得到 M9溶液。
2、实验装置
本实施例采用实验室中常用的培养皿(直径为9cm)作为分离秀丽隐 杆线虫的器皿，培养皿的中部设有可拆卸的隔板，将培养皿分成左、右两 个半圆区域，分别为大肠杆菌培养区和土壤放置区。在大肠杆菌培养区下 方对应的培养皿外底面上可以安装支撑件(三角支架)，用于提升培养皿 大肠杆菌培养区一侧的高度，避免土壤中的水分流入固体培养基中，污染 固体培养基；根据支撑件的高度可调整倾斜角度。
3、实验步骤：
(1)消毒：所有使用仪器器皿严格消毒；
(2)用铂丝挑取大肠杆菌OP50单菌落于100mL LB溶液中，37℃ 过夜振荡培养后放入4℃冰箱保存备用(该菌液可保存一个月左右)；
(3)向大肠杆菌培养区内加入NGM固体培养基(接种量为1.4×108 CFU/ml)，并用移液枪吸取200μL接种有大肠杆菌的LB溶液接种至 NGM固体培养基上，并放置在37℃培养箱中培养；
(4)24h后，取出培养皿，再用取2g湿润含有线虫的沉积土放于 另一半圆处(未涂有大肠杆菌的土壤放置区)，再将培养皿用保鲜膜封住 防止培养基水分蒸发，然后在大肠杆菌培养区下方对应的培养皿外底面上 安装支撑件，提升培养皿大肠杆菌培养区一侧的高度，以土壤放置区所在 的一侧为支点，实现培养皿的倾斜放置，倾斜角度为15°；
(5)静置4h后，利用线虫自身的趋食性，使线虫从土壤中爬出在 至大肠杆菌培养区，再用M9溶液冲洗在NGM固体培养基表面的线虫， 收集冲洗下来的线虫，保证线虫的渗透压平衡，该操作应缓慢小心，以免 吸入大肠杆菌。
以现有的线虫分离方法作为对照，对照的方法分别是：
(1)贝尔曼漏斗法：参照Weaver R W,Angle S,Bottomley P,et al. Methods ofSoil analysis,Part2:microbiological and biochemical properties.Madison:soilScience Society of America,1994,461-487.所述；
(2)浅盘法：参照叶维青,张维谦,周鹏里等译.[日]土壤微生物实验 法.日本土壤微生物研究会编.北京:科学出版社.1983,216所述；
(3)胶体悬浮法：参照UNI EN.ISO 10872.2010所述。
3、实验结果：
表1为四种分离方法的实验结果；
其中，平均放入是指培养实验开始三个平行组中分别在不同分离方法 下秀丽隐杆线虫初始数量的平均值；平均得到是指实验结束时三个平行组 在不同分离方法下秀丽隐杆线虫的平均值。
实验表明，1000条的秀丽隐杆线虫通过土-琼脂法经过平均4h的分 离可以平均得到850条秀丽隐杆线虫。
表1为四种分离方法实验结果
采用本发明方法对秀丽隐杆线虫进行分离，获得结果如图1所示，从 分离结果可以看出：
①利用线虫自身的趋食性，选用大肠杆菌OP50菌株作为分离土壤中 秀丽隐杆线虫的引诱物，能够有效保证分离得到的线虫具有很强的生物活 性。
②采用本发明方法获得的秀丽隐杆线虫十分干净，不含任何土壤杂 质。
③采用本发明方法能够大大提高秀丽隐杆线虫的回收效率，与目前通 用的贝尔曼漏斗法(图1中1和5所示)、浅盘法(图1中2和6所示)和胶 体悬浮法(图1中3和7所示)相比，本方法获得的秀丽隐杆线虫数量提高 了数倍。
④采用本发明方法还能够进行大批量分离线虫，以便进行分子致毒机 理分析。
实施例2
除上述器皿外，本发明还提供了一种新的专门用于分离秀丽隐杆线虫 的容器，如图2所示。
该容器分为可上下盖和的上部盒盖1和下部盒体2两部分，两者连接 在一起(连接部位如图2中的3所示)；下部盒体即为大肠杆菌培养区， 用于放置接种大肠杆菌的NGM固体培养基，上部盒盖即为土壤放置区， 用于放置含有秀丽隐杆线虫的土壤。
该容器的使用方法为：
先展开盒盖，向盒体内加入固体培养基，并在固体培养基上接种大肠 杆菌；由于大肠杆菌适宜在密闭的环境下生长，所以接种大肠杆菌后，将 盒盖盖和在盒体上，使容器内部形成密闭空间；当大肠杆菌培养完成后， 展开盒盖，将含有秀丽隐杆线虫的土壤加入盒盖内，并在盒盖和盒体的连 接处涂抹或倒上固体培养基；然后，在盒盖下方安装支撑件4(三角架)， 提升盒盖一侧的高度，避免土壤中的水分流入固体培养基中，污染固体培 养基。最后，进行静置，等线虫从土壤中爬出至盒体内后，再将盒体内的 固体培养基取出即可。
Claims (8)
1.一种土壤中秀丽隐杆线虫的分离方法，包括以下步骤：
(1)将用于分离秀丽隐杆线虫的器皿分成左、右两个区域，分别为大肠杆菌培养区和土壤放置区；向大肠杆菌培养区内加入固体培养基，并在固体培养基上接种大肠杆菌；
(2)培养大肠杆菌一段时间后，向土壤放置区内加入含有秀丽隐杆线虫的土壤，静置3～5h，利用秀丽隐杆线虫对大肠杆菌的趋食性，使秀丽隐杆线虫从土壤放置区爬至大肠杆菌培养区；
(3)取出器皿内含有秀丽隐杆线虫的固体培养基，冲洗固体培养基表面，收集得到秀丽隐杆线虫。
2.如权利要求1所述的土壤中秀丽隐杆线虫的分离方法，其特征在于，步骤(1)中，所述固体培养基为NGM培养基，其组成为：琼脂或琼脂替代品25g/L，蛋白胨20.0g/L，氯化钠3g/L，硫酸镁1mol/L，氯化钙1mol/L，磷酸钾1mol/L，胆固醇乙醇溶液5mg/L，其余为超纯水。
3.如权利要求1所述的土壤中秀丽隐杆线虫的分离方法，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coli OP 50。
4.如权利要求1所述的土壤中秀丽隐杆线虫的分离方法，其特征在于，步骤(1)中，先将大肠杆菌接入LB溶液中预培养后，再接种至固体培养基上；其中，预培养时间为11～13h，接入固体培养基时的接种量为1.2×108～1.8×108CFU/ml。
5.如权利要求1所述的土壤中秀丽隐杆线虫的分离方法，其特征在于，步骤(2)中，加入土壤后，采用透气薄膜封住器皿顶部的开口，再进行静置。
6.如权利要求1所述的土壤中秀丽隐杆线虫的分离方法，其特征在于，步骤(3)中，采用M9溶液进行冲洗；所述M9溶液的组成为：5.8g/L磷酸氢二钠，3.0g/L磷酸二氢钾，0.5g/L氯化钠，1.0g/L氯化铵，其余为超纯水。
7.如权利要求1所述的土壤中秀丽隐杆线虫的分离方法，其特征在于，所述器皿的中部设有可拆卸的隔板；步骤(2)中，在加入固体培养基和土壤后，先取出隔板，再进行静置。
8.如权利要求1所述的土壤中秀丽隐杆线虫的分离方法，其特征在于，在加入固体培养基和土壤后，在大肠杆菌培养区对应的培养皿外底面上安装支撑件，使器皿倾斜放置，提升培养皿大肠杆菌培养区一侧的高度；倾斜角度为5～15°。
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