KR101436921B1 - 유글레나속 미생물을 이용한 수질 독성 평가 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (a) 측정용 용기에 수체 샘플을 넣는 단계, (b) 수체 샘플을 함유하는 측정용 용기에 유글레나속 미생물을 투입하는 단계, (c) 측정용 용기에 투입된 유글레나속 미생물을 배양하는 단계 및 (d) 배양이 완료된 유글레나속 미생물의 엽록소 형광 특성 또는 운동 특성을 측정하는 단계를 포함하는 수질 독성 평가 방법 제공한다. 본 발명에 따른 유글레나속 미생물을 이용한 수질 독성 평가 방법은 유글레나속 미생물의 엽록소 형광 특성 또는 운동 특성에 해당하는 파라미터를 평가 지표로 이용하기 때문에 수질 독성 평가시 소요되는 시간이 약 1시간 정도로 현저히 단축되고, 조작이 간단하며, 높은 독성 민감성을 가진다.

Description

유글레나속 미생물을 이용한 수질 독성 평가 방법 {Method for evaluatig aquatic ecotoxicity usig euglena}
본 발명은 수질 독성 평가 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 유글레나속 미생물을 이용한 수질 독성 평가 방법에 관한 것이다.
인류의 활동과 산업의 발달로 새롭고 잠재적인 위해성을 지닌 화학물질이 생산되고 수서 생태계로 유입되고 있다. 현대화학의 발전은 알려진 유용한 화학물의 생산량을 높이는데 기여했을 뿐만 아니라 매일 1200 여종 가량의 새로운 물질도 만들어내고 있다. 물질의 이동과 변환이 급속하게 일어나는 수서 생태계의 특성상, 이러한 독성 물질에 대한 위해성을 평가하고 법적인 대처를 취하는 노력이 이루어지지 않는다면 매년 수천 종의 화학물질을 함유한 산업폐수와 도시하수에 의해서 위기에 처하게 될 위험성에 노출되어 있다.
하천 및 호소를 오염시키는 오염물질에는 산업체에서 유래하는 중금속과 VOCs, 농업용 제초제, 살충제 그리고 인구 밀집도시에서 방출되는 방대한 생활폐수에 함유된 질소와 인 화합물 등이 있는데 이러한 오염물질들에 의한 위해성을 평가하기 위해서 물리화학적인 방법과 생물학적인 방법이 있다. 물리화학적 방법으로는 가스 크로마토그래피(GC)법, 유도결합 플라즈마(inductively coupled plasma)를 이용하는 방법 등이 있다. 그러나 이러한 방법은 GC-MS(gas chromatography-mass spectroscopy), ICPMS(inductively coupled plasma-mass spectroscopy) 등 고가의 분석장비와 고도로 숙련된 분석요원을 필요로 하며, 각각의 독성 물질에 따라 별도의 분석을 수행하여야 하는 문제가 있다. 또한 분석시간이 길고, 유입 독성 물질의 성분을 알 수 없는 경우에는 분석하기 어려운 문제가 있으며, 시료를 장거리로 이동시킬 경우 시료 내 반응으로 성분 및 농도 변화가 유발될 수 있다는 문제점이 있다.
이 같은 제약점을 극복하기 위해 국제적으로 수중 미생물, 조류(algae), 수중 무척추 동물 및 수생 관속 식물 등 지표 생물을 이용한 오염 진단 방식에 대한 관심이 고조되어 최근 국제 사회에서 제정한 환경 규약을 보면 환경 독성을 평가하는데 있어서 지표 생물에 의한 독성평가 자료를 차용하고 있음을 알 수 있다. 이러한 지표 생물을 이용한 오염 진단방식은 종래에 생물체 내의 오염물질의 농도를 직접 측정하거나 서식처의 오염 등급별 서식종의 존재 여부로 판정하는 Bioindicator식 개념에서 현재는 생물 개체 또는 그 하위의 생물학적 조직 단위의 특성을 이용하여 오염물질을 진단하는 Biomonitor식 방법으로 진화하고 있다. 후자의 방법은 생물의 다양한 생리학적 변화를 통해 환경에 존재하는 단독 혹은 혼합 물질의 위해성을 정량화하거나 그 물질의 잠재적인 영향력을 평가할 수 있으므로 환경오염이 광역화되기 이전에 그 징후를 사전에 파악할 수 있고 생태학적 의미를 찾을 수 있다는 장점을 내포하고 있다.
일반적으로 어류나 무척추 동물을 이용하는 경우에는 치사율, 움직임의 저해, 생물학적 특성 분석으로 판단하며, 미세조류를 이용하는 경우에는 성장저해로 측정한다. 물벼룩류(Daphnia)인 Daphnia magma와 Ceriodaphnia dubia 등은 환경 독성 물질에 매우 민감하고 기르기 용이하며, 수명이 짧고 생체가 작으며, 많은 생체 수를 실험에 사용할 수 있어 통계적 분석이 가능하므로 대표적 실험생물로 이용되고 있다. 그러나 이러한 어류, 무척추 동물 또는 원생동물을 이용하는 수질 독성 평가 방법은 측정자의 전문성과 고가의 기기가 요구되고, 장시간이 소요되며, 민감도가 높지 않다는 문제가 있다.
본 발명은 이러한 배경하에 도출된 것으로, 본 발명의 목적은 평가시 소요되는 시간이 현저히 단축되고 동시에 민감성이 높은 생물학적 수질 독성 평가 방법을 제공하는데에 있다.
본 발명의 상기 목적을 해결하기 위해, 본 발명은 (a) 측정용 용기에 수체 샘플을 넣는 단계, (b) 수체 샘플을 함유하는 측정용 용기에 유글레나속 미생물을 투입하는 단계, (c) 측정용 용기에 투입된 유글레나속 미생물을 배양하는 단계 및 (d) 배양이 완료된 유글레나속 미생물의 엽록소 형광 특성 또는 운동 특성을 측정하는 단계를 포함하는 수질 독성 평가 방법 제공한다.
본 발명에 따른 유글레나속 미생물을 이용한 수질 독성 평가 방법은 유글레나속 미생물의 엽록소 형광 특성 또는 운동 특성에 해당하는 파라미터를 평가 지표로 이용하기 때문에 수질 독성 평가시 소요되는 시간이 약 1시간 정도로 현저히 단축되고, 조작이 간단하며, 높은 독성 민감성을 가진다.
도 1은 유글레나속 미생물을 5분간 암적응시킨 후 포화 펄스 방법(Saturation pulse method)을 이용하여 엽록소 형광의 변화를 측정한 일반적인 그래프
도 2는 도 1의 엽록소 형광 변화를 암적응 상태와 광적응 상태로 나누어 도시한 그래프
도 3은 포화 펄스 방법(Sturation pulse method)을 이용하여 엽록소 형광의 변화를 측정하는 구체적인 과정을 나타낸 그래프
도 4는 페놀 농도에 따른 유글레나 아길리스(Euglena agilis)의 최대광자수율을 나타낸 그래프
도 5는 페놀 농도에 따른 유글레나 아길리스(Euglena agilis)의 최대전자전달율(ETRmax)을 나타낸 그래프
도 6은 페놀 농도에 따른 유글레나 아길리스(Euglena agilis)의 이동성을 나타낸 그래프
도 7은 페놀 농도에 따른 유글레나 아길리스(Euglena agilis)의 운동 방향을 나타낸 그래프
도 8은 페놀 농도에 따른 유글레나 아길리스(Euglena agilis)의 운동 속력을 나타낸 그래프
본 발명은 수체 샘플에 대해 수질 독성을 신속히 평가할 수 있고, 조작이 간단하며, 높은 독성 민감성을 가진 수질 독성 평가 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 수질 독성 평가 방법은 측정용 용기에 수체 샘플을 넣는 단계; 수체 샘플을 함유하는 측정용 용기에 유글레나속 미생물을 투입하는 단계; 측정용 용기에 투입된 유글레나속 미생물을 배양하는 단계; 및 배양이 완료된 유글레나속 미생물의 엽록소 형광 특성 또는 운동 특성을 측정하는 단계를 포함한다.
이하, 본 발명에 따른 수질 독성 평가 방법을 구성요소별로 나누어 설명한다.
수체 샘플
수체(water body) 샘플은 물이 주요 부피를 차지하는 샘플을 말하는 것으로서, 본 발명에 따른 수체 샘플은 해수, 하천, 호수, 폐수, 방류수, 오수, 슬러지 용출수, 토양 용출수, 퇴적토 용출수 등에서 채취한 샘플을 포함한다.
최초의 수체 샘플(이하, 원수)은 원수 이외에 원수를 인공 배지나 물과 같이 독성 물질을 포함하지 않는 액체로 희석하여 적어도 2가지 이상, 바람직하게는 4가지 이상의 농도로 구배화시킨 희석 원수들로 구성되는 것이 바람직하다. 이때, 사용되는 희석 방법은 크게 제한되지 않으며, 일 예로 반수 희석법[100%(원수 자체), 50%(원수의 1/2 농도로 희석한 것), 25%(원수의 1/4 농도로 희석한 것), 12.5%(원수의 1/8 농도로 희석한 것), 6.25%(원수의 1/16 농도로 희석한 것)]이 있다. 원수를 희석하기 위한 액체는 유글레나속 미생물의 광합성 효율 또는 운동성을 저해하는 독성 물질을 포함하지 않고 유글레나속 미생물의 배양과 양립할 수 있는 것이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 구체적으로 물, 유글레나속 미생물의 배양에 사용되는 배지 등이 있다. 유글레나속 미생물의 배양에 사용되는 배지는 공지된 다양한 배지 등에서 선택되는 등, 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 일 예로 유글레나속 미생물의 원활한 배양을 고려할 때 선행문헌(Checucci et al., 1976)에 개시되어 있는 미네랄 배지(Mineral medium)인 것이 바람직하다.
또한, 수체 샘플은 바람직하게는 원수의 대조군으로 유글레나속 미생물의 배양에 사용되는 배지를 더 포함할 수 있는데, 상기 배지는 유글레나속 미생물의 광합성 효율 또는 운동성을 저해하는 독성 물질을 포함하지 않는 것 바람직하다. 상기 유글레나속 미생물의 광합성 효율 또는 운동성을 저해하는 독성 물질은 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 은(Ag; Silver), 알루미늄, 비소(As; Arsenic), 카드뮴(Cd; Cadmium), 코발트(Co; Cobalt), 크롬(Cr; Chromium), 구리(Cu; Copper), 철(Fe; Iron), 수은(Hg; Mercury), 니켈(Ni; Nickel), 납(Pb; Lead), 아연(Zn; Zinc), 아세톤(acetone), 클로로포름(Chloroform), 디메틸황산화물(DMSO; Dimethyl sulfoxide), 에틸알코올(Ethylalcohol), 포르말린 (formaldehyde), 메틸알코올(methanol) 및 페놀(Phenol)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 있다. 상기 대조군을 구성하는 유글레나속 미생물 배양용 배지는 공지된 다양한 배지 등에서 선택되는 등, 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 일 예로 유글레나속 미생물의 원활한 배양을 고려할 때 선행문헌(Checucci et al., 1976)에 개시되어 있는 미네랄 배지(Mineral medium)인 것이 바람직하다.
측정용 용기
측정용 용기는 수체 샘플 및 유글레나를 수용하고, 이후 배양기에 넣어져 유글레나를 배양하기 위한 것으로서, 그 형태는 크게 제한되지 않으며, 일 예로 웰 플레이트(Well plate), 삼각플라스크(Erlenmeyer flask) 등이 있다. 웰 플레이트는 적어도 6개 이상의 웰(Well)을 포함하는 것이 바람직한데, 1개의 웰에는 대조군으로서 독성 물질을 포함하지 않는 인공 배지를 넣어 유글레나를 배양하고, 나머지 5개의 웰에는 원수와 4개의 희석 원수들을 넣어 유글레나를 배양한다. 또한, 웰 플레이트는 다양한 원수들의 수질 독성을 한번에 평가할 수 있는 측면을 고려할 때 더 바람직하게는 12개 이상의 웰, 가장 바람직하게는 24개 이상의 웰을 포함하는 것이 바람직하다. 삼각플라스크의 크기는 크게 제한 되지는 않으나 200㎖ 내지 100㎖인 것이 바람직하다.
유글레나속 미생물
유글레나(Euglena)는 연두벌레라고도 하며 엽록체를 갖는 단세포 생물이다. 식물과 동물의 중간에 위치한다고 볼 수 있는데 엽록소를 가지고 광합성을 하는 것은 식물적 특성이며, 입이나 수축포를 가지고 자유롭게 움직이는 것은 동물적 특성에 속한다. 본 발명에서 사용하는 유글레나속 미생물은 상기 식물적 특성과 동물적 특성을 가진 것이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 유글레나 아길리스(Euglena agilis), 유글레나 아쿠스(Euglena acus), 유글레나 스피로지라(Euglena spirogyra) 등이 있으며, 이 중에서 독성 물질에 대한 민감도 측면을 고려할 때 (Euglena agilis)인 것이 바람직하다. 본 발명은 수질 독성 평가를 위한 바이오마커로서 유글레나속 미생물을 이용하고, 수질 독성 평가 지표로 유글레나속 미생물의 엽록소 형광 특성 또는 운동 특성을 이용한다. 보다 구체적으로, 상기 유글레나속 미생물의 엽록소 형광 특성은 최대광자수율 또는 전자전달효율(ETRmax)과 같은 파라미터에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 최대광자수율 또는 전자전달효율(ETRmax)에 관한 자세한 내용은 후술한다. 또한, 상기 유글레나속 미생물의 운동 특성은 이동성(motility), 운동 방향(upwards) 또는 운동 속력(velocity)과 같은 파라미터에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 이동성(motility), 운동 방향(upwards) 또는 운동 속력(velocity)에 관한 자세한 내용은 후술한다. 상기와 같은 유글레나속 미생물의 엽록소 형광 특성 또는 운동 특성은 수체에 포함된 독성물질의 종류 또는 농도와 상관 관계를 가지기 때문에 수상 환경의 오염을 평가하는데에 이용되어질 수 있다. 특히, 유글레나속 미생물의 운동 특성 중 운동 속력(velocity)을 수질 독성 평가의 지표로 사용하는 경우가 민감도 및 신뢰성을 크게 향상시킬 수 있다.
유글레나속 미생물의 의 배양
유글레나속 미생물 및 수체 샘플을 함유하는 측정용 용기는 배양기에 옮겨지고, 이후 소정 시간 동안 유글레나속 미생물이 배양된다. 이때 배양 시간은 크게 제한되지 않으나 수질 독성 평가의 신뢰성을 확보하는 측면에서 30분 내지 5시간이 바람직하고 1시간 내지 2시간인 것이 더 바람직하다. 또한, 유글레나속 미생물의 배양시 광 조사량은 유글레나속 미생물의 원활한 배양을 위해 10~50 μ㏖ photon/㎡·s 인 것이 바람직하고, 20~40 μ㏖ photon/㎡·s 인 것이 더 바람직하다. 또한, 광 조사의 명암 주기는 유글레나속 미생물의 원활한 배양을 위해 18h:6h 내지 14h:10h이 바람직하고 17h:7h 내지 15h:9h인 것이 더 바람직하다. 또한, 유글레나속 미생물의 배양시 배양 온도는 유글레나속 미생물의 원활한 배양을 15~ 35℃인 것이 바람직하고 20~30℃인 것이 더 바람직하다.
유글레나속 미생물의 엽록소 형광 특성 측정
유글레나속 미생물을 수체 샘플이 담겨진 측정용 용기에 넣고 상술한 특정 배양 조건에서 약 1시간 동안 배양하면 유글레나속 미생물의 엽록소 형광 특성(예를 들어 최대광자수율 또는 최대전자전달율)은 수체 샘플에 함유된 독성 물질의 종류 또는 농도에 따라 달라진다.
도 1은 유글레나속 미생물을 5분간 암적응시킨 후 포화 펄스 방법(Saturation pulse method)을 이용하여 엽록소 형광의 변화를 측정한 일반적인 그래프이고, 도 2는 도 1의 엽록소 형광 변화를 암적응 상태와 광적응 상태로 나누어 도시한 그래프이며, 도 3은 포화 펄스 방법(Sturation pulse method)을 이용하여 엽록소 형광의 변화를 측정하는 구체적인 과정을 나타낸 그래프이다. 도 1 내지 도 3에서 보이는 바와 같이 암적응된 유글레나속 미생물에 순간적으로 펄스 형태의 포화광(Saturating Light, SL)을 비추면 엽록소 형광은 기저 상태 값인 초기형광값(Fo)에서 최대형광값(Fm)까지 증가한다. 약 5분간 암적응된 유글레나속 미생물은 광계 Ⅱ(Photosystem Ⅱ)의 첫 번째 전자 수용체인 QA가 완전히 산화되며, 광계 Ⅱ의 반응중심은 모두 열린 상태에 있다. 또한, 초기형광값(Fo)에서 최대형광값(Fm)에 도달하였을때 광계 Ⅱ(Photosystem Ⅱ)의 첫 번째 전자 수용체인 QA가 완전히 환원되며, 광계 Ⅱ의 반응중심은 모두 닫힌 상태에 있다. QA가 완전히 환원되면 하기 수학식 1로 표시되는 광계 Ⅱ의 최대광자자수율을 측정할 수 있다. 하기 수학식 1로 표시되는 최대광자수율은 암적응 상태, 즉 광합성이 최대의 효율로 운영될 때의 광계 Ⅱ(Photosystem Ⅱ)의 광화학 반응에 대한 광자수율을 의미한다.
[수학식 1]
Figure 112013015881405-pat00001
상기 수학식 1에서 Fv = Fm - Fo이고, Fm은 암적응 상태에서 포화광에 의한 최대형광값을 의미하고, Fo는 암적응 상태에서의 초기형광값을 의미한다.
이후, 계속해서 광합성을 일어나게 할 수 있는 연속광(Actinic Light, AL)을 비추면 형광이 일시적으로 증가하는 것을 볼 수 있다. 이것은 탄소고정이 시작되기 전의 유도기(Lag phase)이다. 빛을 비추기 시작한 후 수 밀리초(miliseconds)내에 전자전달이 일어나기 시작하여, 탄소 고정 효소(Carobon Fixing Enzymes) 중 일부는 빛에 의해 활성화된다. 광합성과 열의 방출이 활성화되면 엽록소 형광은 감소되기 시작하여(소광, quenching이라 함) 정상 상태의 형광값(Ft)에 도달하게 된다. 이렇게 광적응된 잎에 연속광(Actinic Light, AL)의 존재 하에서 다시 펄스 형태의 포화광(Saturating Light, SL)을 비추면 암적응 후에 측정한 최대형광값(Fm)보다 낮은 값을 가지는 최대형광값(Fm')을 얻을 수 있다. 보다 구체적으로 도 3에서 보이는바와 같이 연속광(Actinic Light, AL)의 존재 하에서 펄스 형태의 포화광(Saturating Light, SL)을 일정 시간 간격으로 비추면 특정 시점에서 형광 피크가 일정하게 유지되고 정상 상태에 도달하게 되며, 이때 나타난 형광 피크를 통해 하기 수학식 2로 표시되는 유효 양자수율을 측정할 수 있다. 하기 수학식 2로 표시되는 유효 양자수율은 광적응 상태에서 광계 Ⅱ(Photosystem Ⅱ)의 광화학 반응에 대한 양자수율을 의미한다. Fm' 특정시 QA는 완전히 환원된다. Fm'와 Ft의 차이는 광합성 반응에 의한 소광, 즉 광화학적 소광(Photochemical quenching)을 반영하며, Fm과 Fm'의 차이는 열의 소산에 의한 소광, 즉 비광화학적 소광(Non-photochemical quenching)을 반영한다.
[수학식 2]
Figure 112013015881405-pat00002
상기 수학식 2에서 Fv' = Fm' - Ft이고, Fm'는 광적응 상태에서 포화광에 의한 최대형광값을 의미하고, Ft는 광적응 후 정상상태 형광값을 의미한다.
한편, 유글레나속 미생물의 엽록소 형광 특성 중 하나인 최대전자전달율의 측정은 약 1시간 동안 배양된 유글레나를 5분간 안정시킨 다음 5분간 암 처리 후, 형광 측정 장치를 이용하여 수행된다. 엽록소 형광 측정 장치는 엽록소 형광 특성을 측정하는 것으로 최종 값은 형광 색상과 같이 가시적인 값으로 환산되어 표시될 수 있고, 또한 전자전달효율(Electron Transfer rate, ETR)과 같은 수치로 표시될 수도 있다. 일 예로 형광 측정 장치를 이용하여 유글레나속 미생물의 전자전달효율(ETR)의 변화를 측정하는 경우, 형광 측정 장치로 획득된 자료는 통계 프로그램에 입력하여 최대전자전달율(ETRmax) 값으로 산출될 수 있다. 이러한 엽록소 형광 측정 장치는 광합성의 활성이 변화하는 것을 탐지하기 위해 제작된 것이며, 환경 스트레스 하에서 광합성을 하는 식물, 조류, 원생동물 등의 광합성 기구 활성을 신속하고 비파괴적인 방법으로 탐지할 수 있는 기구로 알려져 있다.
유글레나의 운동 특성 측정
유글레나속 미생물을 수체 샘플이 담겨진 측정용 용기에 넣고 상술한 특정 배양 조건에서 약 1시간 동안 배양하면 유글레나속 미생물의 운동 특성은 수체 샘플에 함유된 독성 물질의 종류 또는 농도에 따라 달라진다. 유글레나속 미생물의 운동 특성은 공지의 장치를 이용하여 측정될 수 있는데, 예를 들어 ECOTOX 시스템(Erlangen, Germany)을 이용하여 측정할 수 있다. 본 발명에서 수질 독성 평가의 지표로 사용될 수 있는 유글레나속 미생물의 운동 특성은 이동성(motility), 운동 방향(upward) 또는 운동 속력(velocity) 등과 파라미터로 구체화될 수 있다. 이동성(motility)은 배양이 완료된 유글레나속 미생물의 전체 세포 수 중 운동하는 세포수를 전체 세포 수를 기준으로 하여 %로 나타낸 것이다. 또한, 운동 방향(upward)은 운동성을 가지는 유글레나속 미생물 전체 세포 수 중 중력 반대방향을 움직이는 세포의 수를 전체 세포 수를 기준으로 하여 %로 나타낸 것이다. 또한, 운동 속력(velocity)은 운동성을 가진 유글레나속 미생물 세포들의 평균 속력을 측정하여 μm/s단위로 나타낸 것이다.
수질 독성의 평가
수체 샘플의 수질 독성은 원수와 희석된 수체 샘플에서 배양된 유글레나속 미생물의 엽록소 형광 특성 측정값을 수질 독성 물질을 포함하지 않는 대조군에서 배양된 유글레나속 미생물의 엽록소 형광 특성 측정값과 비교하여 평가된다. 또한, 수체 샘플의 수질 독성은 원수와 희석된 수체 샘플에서 배양된 유글레나속 미생물의 운동 특성 측정값을 수질 독성 물질을 포함하지 않는 대조군에서 배양된 유글레나속 미생물의 운동 특성 측정값과 비교하여 평가된다. 이때, 대조군은 유글레나속 미생물의 광합성 효율을 저해하거나 운동 특성을 저해하는 수질 독성 물질을 포함하지 않고 유글레나속 미생물의 배양에 사용되는 공지의 배지, 예를 들면 선행문헌(Checucci et al., 1976)에 개시된 미네랄 배지(Mineral medium)일 수 있다.
본 발명에서 수체 샘플의 수질 독성은 유글레나속 미생물의 엽록소 형광 특성인 최대광자수율 또는 최대전자전달율에서 선택되는 어느 하나의 파라미터, 또는 유글레나속 미생물의 운동 특성인 이동성(motility), 운동 방향(upward) 또는 운동 속력(velocity)에서 선택되는 어느 하나의 파라미터를 이용하여 평가될 수 있고, 수체 샘플의 수질 독성은 다양한 형태로 표시될 수 있다. 예를 들어, 수체 샘플의 수질 독성은 반수 유효 농도(Half maximal effective concentration, EC50)값으로 표시될 수 있다. 반수 유효 농도(Half maximal effective concentration, EC50)는 독성 물질을 포함하지 않는 대조군에서 측정된 상기 파라미터 값을 기준으로 50% 감소시키는데 효과적인 수체 샘플의 농도를 의미하는 것으로서, 단일 독성 물질을 포함하는 수체 샘플의 경우 단일 독성 물질의 특정 농도로 표시되고 다수의 독성 물질을 포함하는 미지의 원수의 경우 원수의 희석률로 표시된다. 한편, 반수 유효 농도의 크기와 커질수록 실제 수체 샘플의 독성은 상대적으로 작다는 것을 의미하기 때문에 반수 유효 농도를 실제 수체 샘플 독성으로 환산하기 위해 독성 단위(Toxic Unit, TU)을 다음과 같이 표시할 수 있다.
TU = 100/반수 유효 농도(%)
본 발명에 따른 수질 독성 평가 방법은 다양한 독성 물질을 포함하는 수체 샘플에 적용될 수 있다. 이때, 수체 샘플에 포함되는 독성 물질은 예를 들어 은(Ag; Silver), 알루미늄, 비소(As; Arsenic), 카드뮴(Cd; Cadmium), 코발트(Co; Cobalt), 크롬(Cr; Chromium), 구리(Cu; Copper), 철(Fe; Iron), 수은(Hg; Mercury), 니켈(Ni; Nickel), 납(Pb; Lead), 아연(Zn; Zinc), 아세톤(acetone), 클로로포름(Chloroform), 디메틸황산화물(DMSO; Dimethyl sulfoxide), 에틸알코올(Ethylalcohol), 포르말린 (formaldehyde), 메틸알코올(methanol) 및 페놀(Phenol)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상일 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 수질 독성 평가 방법으로 수체 샘플의 페놀 독성을 측정하는 경우 민감도가 높고 신뢰성 있는 결과를 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 수질 독성 평가 방법의 용도
본 발명에 따른 수질 독성 평가 방법은 수체 샘플, 유글레나속 미생물, 측정용 용기 및 배양 장치를 포함하고, 엽록소 형광 측정 장치 또는 운동 특성 측정 장치를 선택적으로 포함하는 수질 독성 평가 시스템에 의하여 실시될 수 있는데, 추가적으로 배양된 유글레나속 미생물의 엽록소 형광 특성 또는 운동 특성을 측정하여 이를 전송하고 분석한 후 그 결과를 다시 반송하는 유비쿼터스 시스템(원격조정시스템)으로 구성될 수도 있다.
본 발명의 수질 독성 평가 방법은 하수 및 폐수 오니를 투척하기 전에 생태계에 부정적인 영향을 끼치지 않도록 하기 위해서 취해야할 오니 희석 배수를 신속하게 결정하는데도 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 종래의 화학적 분석 방식에 의존한 수질 오염 측정법에 내재된 문제점 중 화학적 분석에 의한 결과 수치만을 가지고는 실제 생태계에 끼칠 수 있는 수질 오염의 영향에 대해 전혀 예측할 수가 없다는 단점을 보완한 실용적인 기법이라고 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 수질 독성 평가 방법을 구현할 수 있는 수질 독성 평가 키트에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 수질 독성 평가 키트는 유글레나속 미생물, 수체 샘플 및 유글레나속 미생물을 수용하고 유글레나를 배양하기 위한 용기 및 수체 샘플을 희석하기 위한 희석수 또는 인공 배지를 포함한다. 또한, 본 발명에 따른 수질 독성 평가 키트는 은(Ag; Silver), 알루미늄, 비소(As; Arsenic), 카드뮴(Cd; Cadmium), 코발트(Co; Cobalt), 크롬(Cr; Chromium), 구리(Cu; Copper), 철(Fe; Iron), 수은(Hg; Mercury), 니켈(Ni; Nickel), 납(Pb; Lead), 아연(Zn; Zinc), 아세톤(acetone), 클로로포름(Chloroform), 디메틸황산화물(DMSO; Dimethyl sulfoxide), 에틸알코올(Ethylalcohol), 포르말린 (formaldehyde), 메틸알코올(methanol) 및 페놀(Phenol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 독성 물질을 희석수 또는 인공배지에서 용해시켜 제조한 표준 독성 물질 용액을 더 포함할 수 있다. 상기 표준 독성 물질 용액은 수체 샘플의 수질 독성을 평가하기 전에 유글레나속 미생물의 상태, 즉 독성 물질에 대한 반응 감응성 여부를 테스트하는데 이용될 수 있다. 구체적으로 본 발명에 따른 표준 독성 물질 용액이 페놀을 독성 물질로 포함하는 용액인 경우, 다양한 페놀 용액 및 대조군에서의 유글레나속 미생물의 엽록소 형광 특성 또는 운동 특성에 대한 데이터를 미리 확보하여 수질 독성 평가 키트와 함께 제공할 수 있다. 사용자는 페놀 용액에 대한 유글레나속 미생물의 엽록소 형광 특성 또는 운동 특성을 측정하고 이를 미리 제공하는 데이터와 비교하여 유글레나속 미생물이 독성 물질, 예를 들어 페놀에 대해 정상적으로 반응하는지 여부를 판단하고, 일정 범위(예를 들어, 본래 반응 감응성의 80% 이상)의 반응 감응성을 보이는 경우 미지의 수체 샘플에 대한 수질 독성 평가를 진행할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 명확하게 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 보호범위를 제한하는 것은 아니다.
1. 유글레나 아길리스( Euglena agilis )의 사전 배양
1ℓ의 삼각 플라스크에 공지의 미네랄 배지(Mineral medium; Checucci et al., 1976 참조) 500㎖를 넣고, 여기에 유글레나 아길리스(Euglena agilis)를 투입한 후 특정 조건하에서 배양하여 사전 배양액을 수득하였다. 이때, 유글레나 아길리스(Euglena agilis)의 배양은 30 μ㏖ photon/㎡·s의 광 조사량, 16h:8h(L:D)의 광 명암 주기 및 25℃의 온도 조건하에서 이루어졌고, 배양이 완료된 후 미네랄 배지를 사용하여 사전 배양액 내 유글레나 아길리스(Euglena agilis)의 농도를 106 세포수/㎖로 조정하였다.
하기 표 1은 유글레나 아길리스(Euglena agilis)의 사전 배양에 사용된 미네랄 배지의 성분과 조성비를 나타낸 것이다. 미네랄 배지에 포함된 각각의 성분은 유글레나의 배양에 필요한 유기 성분 내지 무기 성분으로 구성된다.
성분명 성분 함량
Sodium acetate 1.0 g/ℓ
Ammonium phosphate dibasic 1.0 g/ℓ
Potassium phosphate monobasic 1.0 g/ℓ
Magnesium sulfate heptahydrate 0.2 g/ℓ
Calcium chloride dihydrate 0.002 g/ℓ
EDTA-Ⅱ(Trtriples Ⅱ) 0.05 g/ℓ
Iron (Ⅲ) cholride hexahydrate 0.005 g/ℓ
Trace Elements Stock Solution 10.0 ㎖/ℓ
Vit. B1 (0.1㎎/100㎖) Solution 0.1 ㎖/ℓ
Vit. B12 (0.1㎎/100㎖) Solution 0.5 ㎖/ℓ
하기 표 2는 상기 표 1의 성분 중 미량원소 스톡 용액(Trace Element Stock Solution)의 성분 및 조성비를 미량원소 스톡 용액(Trace Element Stock Solution) 1ℓ를 기준으로 나타낸 것이다.
성분명 성분 함량(1ℓ 기준)
Zinc sulfate heptahydrate 4.4g
Manganese () sulfate monohydrate 3.09g
Sodium molybdate dihydrate 1.008g
Cobalt () chloride hexahydrate 0.087g
Copper () sulfate pentahydrate 0.039g
Boric Acid 0.0283g
Sodium Iodide 0.00118g
2. 표준 독성물질 용액 제조
수질 독성 물질 중 하나인 페놀을 이용하여 표준 독성물질 용액을 제조하였다. 구체적으로 페놀을 유글레나 아길리스(Euglena agilis)의 사전 배양시 사용한 미네랄 배지에 첨가하고 용해시켜 페놀 농도가 114 mM인 표준 독성물질 용액을 제조하였다. 또한, 페놀 농도가 114 mM인 표준 페놀 독성물질 용액을 반수 희석법에 의해 미네랄 배지로 희석하여 페놀 농도가 각각 57 mM, 28.5 mM, 14.25 mM, 7.126 mM, 3.562 mM, 1.782 mM인 6개의 표준 페놀 독성물질 용액을 추가적으로 제조하였다.
3. 표준 독성물질 용액 상에서 유글레나 아길리스( Euglena agilis )의 배양
100㎖의 삼각플라스크 7개에 유글레나 아길리스(Euglena agilis) 사전 배양액 25㎖를 각각 첨가하고, 여기에 앞에서 제조한 페놀 농도가 서로 다른 표준 페놀 독성물질 용액을 각각 첨가하고 혼합하여 최종 페놀 농도를 0.891 mM, 1.781 mM, 3.563 mM, 7.125 mM, 14.25 mM, 28.5 mM 및 57 mM가 되도록 하였다. 또한, 대조군으로 100㎖의 삼각플라스크에 유글레나 아길리스(Euglena agilis) 사전 배양액 25㎖ 및 미네랄 배지 25㎖을 첨가하고 혼합한 것을 사용하였다.
이후, 30 μ㏖ photon/㎡·s의 광 조사량, 16h:8h(L:D)의 광 명암 주기 및 25℃의 온도 조건하에서 약 1시간 동안 유글레나 아길리스(Euglena agilis)를 배양하여 유글레나 아길리스(Euglena agilis) 배양액을 수득하였다. 상기 시험을 총 3번 반복하였다.
4. 독성물질의 농도에 따른 유글레나 아길리스( Euglena agilis )의 엽록소 형광 특성 변화 측정
약 1시간의 배양 후 수득한 유글레나 아길리스(Euglena agilis) 배양액을 24웰 플레이트에 옮기고, 5분간 안정시킨 다음 5분간 암 처리 후, 형광 측정 장치(Imaging pulse-amplitude-modulated fluorometer; Imaging PAM; Walzco.,Driange, Germay)를 사용하여 유글레나 아길리스(Euglena agilis)의 엽록소 형광 특성을 측정하였다. 구체적으로, 엽록소 형광 특성의 측정은 최대광자수율과 최대전자전달율(ETRmax)을 측정하는 것으로 나누어진다. 여기서 최대광자수율은 유글레나 아길리스(Euglena agilis)가 광합성을 수행할 수 있는 최대능력을 나타내고 암적응된 유글레나 아길리스(Euglena agilis)의 Fv에 대한 Fm의 비율(Fv/Fm)로 계산된다. 여기서 Fm은 최대 형광값이며, Fv는 최대형광값(Fm)과 최소형광값(F0)의 차이 값으로 계산된다. 또한 광 조사량이 늘어감에 따라 변화되는 전자전달효율(ETR)의 값을 모두 획득하고 통계프로그램에 입력하여 최대전자전달율(ETRmax)의 값을 산출하였다. 최대광자수율은 단위를 가지지 않는 무차원으로 표시되고, 최대전자전달율(ETRmax)은 광 조사량과 동일한 μ㏖ photon/㎡·s 단위로 표시된다.
도 4는 페놀 농도에 따른 유글레나 아길리스(Euglena agilis)의 최대광자수율을 나타낸 그래프이고, 도 5는 페놀 농도에 따른 유글레나 아길리스(Euglena agilis)의 최대전자전달율(ETRmax)을 나타낸 그래프이다. 도 4 내지 도 5에서 보이는 바와 같이 유글레나 아길리스의 엽록소 형광 특성은 일정 범위에서 페놀의 농도와 선형 관계를 나타내었다. 도 4에서 보이는 바와 같이 페놀의 농도가 높아짐에 따라 유글레나 아길리스의 최대광자수율 값이 감소하는 경향을 보였다. 또한, 도 5에서 보이는 바와 같이 페놀의 농도가 높아질수록 유글레나 아길리스의 최대전자전달율(ETRmax) 값이 감소하는 경향을 보였다.
5. 독성물질의 농도에 따른 유글레나 아길리스(Euglena agilis)의 운동 특성 변화 측정
약 1시간의 배양 후 얻은 유글레나 아길리스(Euglena agilis)의 운동 특성은 ECOTOX(Erlangen, Germany)를 이용하여 측정하였다. 구체적으로 큐벳 안의 유글레나 아길리스(Euglena agilis) 세포의 운동 특성을 모니터하여 이동성(motility), 운동 방향(upwards) 및 운동 속력(velocity)를 측정하였다. 이때, 이동성(motility)은 배양이 완료된 유글레나 아길리스(Euglena agilis)의 전체 세포 수 중 운동하는 세포수를 전체 세포 수를 기준으로 하여 %로 나타내었다. 또한, 운동 방향(upward)은 운동성을 가지는 유글레나 아길리스(Euglena agilis) 전체 세포 수 중 중력 반대방향을 움직이는 세포의 수를 전체 세포 수를 기준으로 하여 %로 나타내었다. 또한, 운동 속력(velocity)은 운동성을 가진 유글레나 아길리스(Euglena agilis) 세포들의 평균 속력을 측정하여 μm/s단위로 나타내었다.
도 6은 페놀 농도에 따른 유글레나 아길리스(Euglena agilis)의 이동성을 나타낸 그래프이고, 도 7은 페놀 농도에 따른 유글레나 아길리스(Euglena agilis)의 운동 방향을 나타낸 그래프이며, 도 8은 페놀 농도에 따른 유글레나 아길리스(Euglena agilis)의 운동 속력을 나타낸 그래프이다. 도 4 내지 도 8에서 보이는 바와 같이 페놀 농도가 높아질수록 움직임을 가지는 세포의 수가 감소하고, 움직이는 세포 중 중력의 반대방향으로 움직이는 세포의 수가 감소하며, 움직이는 세포의 속력이 감소하는 경향을 보였다. 또한, 유글레나 아길리스(Euglena agilis)의 운동 특성에 해당하는 파라미터인 이동성(motility), 운동 방향(upwards) 및 운동 속력(velocity) 각각 페놀 농도가 증가할수록 선형적으로 감소하는 경향을 보였다.
6. 유글레나 아길리스(Euglena agilis)의 엽록소 형광 특성 또는 운동 특성을 이용한 EC 50 값 분석
페놀 독성물질 용액의 페놀 농도에 따른 유글레나 아길리스(Euglena agilis)의 엽록소 형광 특성에 해당하는 파라미터 또는 유글레나 아길리스(Euglena agilis)의 운동 특성에 해당하는 파라미터의 상관 관계를 분석하여 각각의 파라미터를 평가 지표로 한 반수 유효 농도(EC50)을 계산하였다. 이때, 반수 유효 농도(EC50) 값은 선형 보간법(Linear interpolation)을 사용하여 계산하였다. 하기 표 3은 유글레나 아길리스(Euglena agilis)의 엽록소 형광 특성인 최대광자수율, 최대전자전달율(ETRmax), 이동성, 운동 방향 및 운동 속력을 수질 독성 평가 기준으로 하였을 때의 페놀 독성 물질의 반수 유효 농도(EC50)을 나타낸 것이다.
수질독성 평가 기준 EC50 (mM)
최대광자수율 (Fv/Fm) 8.94
최대전자전달율 (ETRmax) 4.67
운동성 (Motility) 6.70
운동 방향 (Upward) 8.58
운동 속력 (Velocity) 3.17
표 3에서 보이는 바와 같이 유글레나 아길리스(Euglena agilis)의 최대광자수율, 최대전자전달율(ETRmax), 이동성, 운동 방향 또는 운동 속력을 수질 독성 평가 기준으로 하였을 때 페놀 독성물질은 매우 민감한 수준의 EC50 값을 나타내었다. 특히, 유글레나 아길리스(Euglena agilis)의 운동 속력은 가장 낮은 EC50 값을 보여 가장 민감한 수질 독성 평가지표인 것으로 나타났다.
이상에서와 같이 본 발명을 상기의 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 특정 실시 태양으로 국한되는 것이 아니며, 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 태양을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

  1. (a) 측정용 용기에 수체 샘플을 넣는 단계;
    (b) 수체 샘플을 함유하는 측정용 용기에 유글레나속 미생물을 투입하는 단계;
    (c) 측정용 용기에 투입된 유글레나속 미생물을 배양하는 단계; 및
    (d) 배양이 완료된 유글레나속 미생물의 엽록소 형광 특성을 측정하는 단계를 포함하고,
    상기 유글레나속 미생물은 유글레나 아길리스(Euglena agilis)인 것을 특징으로 하는 수질 독성 평가 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 수체 샘플은 원수 및 희석 배수가 서로 다른 적어도 2개 이상의 희석 원수로 구성되고,
    상기 희석 원수는 원수를 유글레나속 미생물 배양용 배지로 희석하여 제조된 것을 특징으로 하는 수질 독성 평가 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 희석 원수는 반수 희석법에 의해 희석되는 것을 특징으로 하는 수질 독성 평가 방법.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 수체 샘플은 원수의 대조군으로 유글레나속 미생물 배양용 배지를 더 포함하고,
    상기 배지는 유글레나속 미생물의 광합성 효율을 저해하는 독성 물질을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 수질 독성 평가 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 독성 물질은 은(Ag; Silver), 알루미늄, 비소(As; Arsenic), 카드뮴(Cd; Cadmium), 코발트(Co; Cobalt), 크롬(Cr; Chromium), 구리(Cu; Copper), 철(Fe; Iron), 수은(Hg; Mercury), 니켈(Ni; Nickel), 납(Pb; Lead), 아연(Zn; Zinc), 아세톤(acetone), 클로로포름(Chloroform), 디메틸황산화물(DMSO; Dimethyl sulfoxide), 에틸알코올(Ethylalcohol), 포르말린 (formaldehyde), 메틸알코올(methanol) 및 페놀(Phenol)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상으로 구성되는 것을 특징으로 하는 수질 독성 평가 방법.
  6. 삭제
  7. 제 1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 배양시 광 조사량은 10~50 μ㏖ photon/㎡·s 인 것을 특징으로 하는 수질 독성 평가 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 배양시 배양 온도는 15~35℃인 것을 특징으로 하는 수질 독성 평가 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 (d) 단계의 엽록소 형광 특성은 최대광자수율 또는 최대전자전달율에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 수질 독성 평가 방법.
  10. 삭제
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