KR101365719B1 - 개구리밥과 식물의 뿌리 생장을 이용한 수질 독성 평가 방법 - Google Patents

개구리밥과 식물의 뿌리 생장을 이용한 수질 독성 평가 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (a) 측정용 용기에 수체 샘플을 넣는 단계; (b) 수체 샘플을 함유하는 측정용 용기에 뿌리가 절단된 개구리밥과 식물을 투입하는 단계; (c) 측정용 용기에 투입된 개구리밥과 식물을 배양하는 단계; 및 (d) 배양이 완료된 개구리밥과 식물의 뿌리 생장 길이 또는 뿌리 길이 생장률을 측정하는 단계;를 포함하는 수질 독성 평가 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 수질 독성 평가 방법은 뿌리가 절단된 개구리밥과 식물의 뿌리 생장 특성을 수질 독성 평가의 지표로 이용하기 때문에 수질 독성 판별 시간이 약 2일 정도 소요되고, 종래의 수질 독성 평가 시간(약 7일)보다 3배 이상 단축된다. 또한, 본 발명에 따른 수질 독성 평가 방법은 잎의 수(frond number), 잎의 면적(frond area), 습중량(fresh weight), 건중량(dry weight), 군체수(population growth rate), 또는 색소 함량(pigment contents)의 변화량을 수질 독성 평가의 지표로 이용하는 종래의 수질 독성 평가 방법에 비해 측정 절차가 보다 간편하고, 아울러 수질 독성원에 대한 높은 민감성을 가진다.

Description

개구리밥과 식물의 뿌리 생장을 이용한 수질 독성 평가 방법{Method for evaluating aquatic ecotoxicity using the root growth of lemnoideae plant}
본 발명은 수질 독성 평가 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 개구리밥과 식물의 뿌리 생장을 이용한 수질 독성 평가 방법에 관한 것이다.
인류의 활동과 산업의 발달로 새롭고 잠재적인 위해성을 지닌 화학물질이 생산되고 수서 생태계로 유입되고 있다. 현대화학의 발전은 알려진 유용한 화학물의 생산량을 높이는데 기여했을 뿐만 아니라 매일 1200 여종 가량의 새로운 물질도 만들어내고 있다. 물질의 이동과 변환이 급속하게 일어나는 수서 생태계의 특성상, 이러한 독성 물질에 대한 위해성을 평가하고 법적인 대처를 취하는 노력이 이루어지지 않는다면 매년 수천 종의 화학물질을 함유한 산업폐수와 도시하수에 의해서 위기에 처하게 될 위험성에 노출되어 있다.
하천 및 호소를 오염시키는 오염물질에는 산업체에서 유래하는 중금속과 VOCs, 농업용 제초제, 살충제 그리고 인구 밀집도시에서 방출되는 방대한 생활폐수에 함유된 질소와 인 화합물 등이 있는데 이러한 오염물질들에 의한 위해성을 평가하기 위해서 전통적으로 이화학적 방법이 사용되고 있다. 이화학적 방식이란 수체 내의 용존산소량 (DO), 생물화학적 산소요구량 (BOD), 화학적 산소요구량 (COD), 탁도, 전기전도도 및 pH등과 부영양화를 유발시키는 질산염과 인산염을 정량적으로 측정하거나 중금속을 분석하여 수질 오염 정도의 기준으로 삼는 방식을 지칭한다. 그러나, 이러한 방법은 장시간, 고비용, 전문기술 등을 필요로 한다는 단점과 함께 생물학적 이용성, 복합효과(상승 또는 길항 작용 등)와 나아가 생태학적 의미에 대한 정보를 제공해줄 수 없다.
이 같은 제약점을 극복하기 위해 국제적으로 수중 미생물, 조류 (algae), 수중 무척추 동물 및 수생 관속 식물 등 지표 생물을 이용한 오염 진단 방식에 대한 관심이 고조되어 최근 국제 사회에서 제정한 환경 규약을 보면 환경 독성을 평가하는데 있어서 지표 생물에 의한 독성평가 자료를 차용하고 있음을 알 수 있다. 이러한 지표 생물을 이용한 오염 진단방식은 종래에 생물체 내의 오염물질의 농도를 직접 측정하거나 서식처의 오염 등급별 서식종의 존재 여부로 판정하는 Bioindicator식 개념에서 현재는 생물 개체 또는 그 하위의 생물학적 조직 단위의 특성을 이용하여 오염물질을 진단하는 Biomonitor식 방법으로 진화하고 있다. 후자의 방법은 생물의 다양한 생리학적 변화를 통해 환경에 존재하는 단독 혹은 혼합 물질의 위해성을 정량화하거나 그 물질의 잠재적인 영향력을 평가할 수 있으므로 환경오염이 광역화되기 이전에 그 징후를 사전에 파악할 수 있고 생태학적 의미를 찾을 수 있다는 장점을 내포하고 있다.
과거 국제적으로 독성 연구에 사용되었던 생물종은 대부분의 경우 수서 척추동물 또는 무척추 동물이었지만 최근 들어 수서 생태계 내의 수생 식물의 역할이 부각되어 수생 식물을 이용한 독성 평가 방법에 대해 관심이 증가하고 있다. 수생 식물은 수중 생태계의 1차 생산자로서 동식물 플랑크톤, 무척추동물 및 어류의 서식처가 되며, 많은 유기물질을 흡수정화하는 능력을 갖고 있다.
특히 수생 식물 중 개구리밥은 수서 독성과 광독성 테스트 모델로 권장되고 있다. 개구리밥과(Lemnoideae)에 속하는 식물은 가장 작은 단자엽의 일년생 수생 식물로 논 물, 호수, 연못 등의 정수나 유속이 느린 물에 살며 물 표면에 떠서 살기도 하고, 물에 잠겨서 사는 것도 있다. 개구리밥과 식물은 개구리밥속(Spirodela), 좀개구리밥속(Lemna), 좀분개구리밥속(Wolffia), Landoltia 및 Wolffiella 등과 같은 5개의 속으로 나뉘고, 세계적으로 약 30종이 분포하고 있는 것으로 알려져 있다.
현재까지 국제표준화기구(ISO), 미국 환경보호청(EPA), 및 경제협력개발기구(OECD)에 등록된 종래의 개구리밥을 이용한 수질 독성 평가 방법을 살펴보면 개구리밥을 수체 샘플에 배양한 후 잎의 수(frond number), 잎의 면적(frond area), 군체수(population growth rate), 습중량(fresh weight), 건중량(dry weight), 또는 색소 함량(pigment contents)의 변화량을 측정하는 것으로 구성된다. 그러나, 종래의 개구리밥을 이용한 수질 독성 평가 방법은 유효한 변화량을 확보하기 위하여 배양 시간이 약 7일 정도 소요되고 독성원에 대한 민감성이 떨어지는 등의 문제가 있으며, 이를 개선시켜야 할 필요가 있다.
본 발명은 종래의 문제점을 해결하기 위하여 도출된 것으로서, 본 발명은 뿌리가 절단된 개구리밥과 식물의 뿌리 생장 특성, 예를 들어 뿌리 생장 길이 또는 이로부터 파생된 뿌리 길이 생장률을 수질 독성 평가의 지표로 이용하여 보다 간편하고 평가시 소요되는 시간이 현저히 단축되며 동시에 민감성이 높은 수질 독성 평가 방법을 제공하는데에 그 목적이 있다.
본 발명의 발명자들은 개구리밥과 식물의 뿌리를 절단하고 이를 배양한 후 뿌리 생장 길이 또는 뿌리 길이 생장률을 통해 수질 독성을 평가하는 경우(일명 "Root Cut method") 수질 독성 평가 시간을 획기적으로 단축할 수 있고 수질 독성원에 대해 높은 민감도를 가진다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 (a) 측정용 용기에 수체 샘플을 넣는 단계; (b) 수체 샘플을 함유하는 측정용 용기에 뿌리가 절단된 개구리밥과 식물을 투입하는 단계; (c) 측정용 용기에 투입된 개구리밥과 식물을 배양하는 단계; 및 (d) 배양이 완료된 개구리밥과 식물의 뿌리 생장 길이 또는 뿌리 길이 생장률을 측정하는 단계;를 포함하는 수질 독성 평가 방법을 제공한다.
이때, 상기 (a) 단계의 수체 샘플은 바람직하게는 원수 및 희석 배수가 서로 다른 적어도 2개 이상의 희석 원수로 구성되고 상기 희석 원수는 원수를 스테인버그(Steinberg) 인공 배지로 희석하여 제조된다. 또한, 상기 수체 샘플은 더 바람직하게는 원수의 대조군으로 개구리밥과 식물의 뿌리 생장을 저해하는 독성 물질을 포함하지 않는 배양액을 더 포함한다.
또한, 상기 (a) 단계의 수체 샘플은 바람직하게는 pH가 4~10으로 조정된다.
또한, 상기 (a) 단계의 수체 샘플은 바람직하게는 염분 농도가 4‰ 이하로 조정된다.
또한, 상기 (c) 단계의 배양시 광 조사량은 바람직하게는 50~200 μ㏖ photon/㎡·s 이다.
또한, 상기 (c) 단계의 배양시 배양 온도는 바람직하게는 20~35℃이다.
본 발명에 따른 수질 독성 평가 방법은 뿌리가 절단된 개구리밥과 식물의 뿌리 생장 특성을 수질 독성 평가의 지표로 이용하기 때문에 수질 독성 판별 시간이 약 2일 정도 소요되고, 종래의 수질 독성 평가 시간(약 7일)보다 3배 이상 단축된다. 또한, 본 발명에 따른 수질 독성 평가 방법은 잎의 수(frond number), 잎의 면적(frond area), 습중량(fresh weight), 건중량(dry weight), 군체수(population growth rate), 또는 색소 함량(pigment contents)의 변화량을 수질 독성 평가의 지표로 이용하는 종래의 수질 독성 평가 방법에 비해 측정 절차가 보다 간편하고, 아울러 수질 독성원에 대한 높은 민감성을 가진다.
도 1은 개구리밥과 식물의 뿌리를 절단하기 전과 절단한 후의 모양을 나타낸 사진이다.
도 2는 뿌리가 절단된 개구리밥과 식물을 배양액에 넣고 48시간 배양하였을 때 배양액의 독성 물질 유무 및 독성 물질 함량의 고저에 따른 개구리밥과 식물의 뿌리 생장 상태를 나타낸 사진이다.
도 3은 본 발명의 수질 독성 평가 방법의 바람직한 일 예를 단계별로 나타낸 사진이다.
도 4는 광 조사량 및 배양 온도 조건별 개구리밥과 좀개구리밥속 식물의 뿌리 생장 길이를 나타낸 것이고(도 4에서 배양액의 pH는 7이고 염분 농도는 0‰이다), 도 5는 배양액의 pH 조건별 개구리밥과 좀개구리밥속 식물의 뿌리 생장 길이를 나타낸 것이고(도 5에서 배양 온도는 30℃이고, 배양액의 염분 농도는 0‰이며, 광 조사량은 Lemna minor 및 Lemna gibba의 경우 150μ㏖ photon/㎡·s 이고, Lemna paucicostata의 경우 50μ㏖ photon/㎡·s 이다), 도 6은 배양액의 염분 농도별 개구리밥과 좀개구리밥속 식물의 뿌리 생장 길이를 나타낸 것이다(도 6에서 배양 온도는 30℃이고, 배양액의 pH는 7이며, 광 조사량은 Lemna minor 및 Lemna gibba의 경우 150μ㏖ photon/㎡·s 이고, Lemna paucicostata의 경우 50μ㏖ photon/㎡·s 이다).
도 7은 단일 독성 물질로서 은(Ag)을 포함하는 독성 물질 용액의 은(Ag) 농도에 따른 개구리밥과 좀개구리밥속 식물의 뿌리 생장 길이를 나타낸 그래프이고, 도 8은 단일 독성 물질로서 카드뮴(Cd)을 포함하는 독성 물질 용액의 카드뮴(Cd) 농도에 따른 개구리밥과 좀개구리밥속 식물의 뿌리 생장 길이를 나타낸 그래프이고, 도 9는 단일 독성 물질로서 6가 크롬(Cr6 +)을 포함하는 독성 물질 용액의 6가 크롬(Cr6 +) 농도에 따른 개구리밥과 좀개구리밥속 식물의 뿌리 생장 길이를 나타낸 그래프이고, 도 10은 단일 독성 물질로서 구리(Cu)를 포함하는 독성 물질 용액의 구리(Cu) 농도에 따른 개구리밥과 좀개구리밥속 식물의 뿌리 생장 길이를 나타낸 그래프이고, 도 11은 단일 독성 물질로서 수은(Hg)을 포함하는 독성 물질 용액의 수은(Hg) 농도에 따른 개구리밥과 좀개구리밥속 식물의 뿌리 생장 길이를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 수체 샘플에 대해 간편하고, 판별 시간이 짧으며 독성 물질에 의해 발휘되는 독성을 정확하게 평가할 수 있는 수질 독성 평가 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 수질 독성 평가 방법은 측정용 용기에 수체 샘플을 넣는 단계; 수체 샘플을 함유하는 측정용 용기에 뿌리가 절단된 개구리밥과 식물을 투입하는 단계; 측정용 용기에 투입된 개구리밥과 식물을 배양하는 단계; 및 배양이 완료된 개구리밥과 식물의 뿌리 생장 길이 또는 뿌리 길이 생장률을 측정하는 단계;를 포함한다. 이하, 이하, 본 발명에 따른 수질 독성 평가 방법을 구성요소별로 나누어 설명한다.
수체 샘플
수체(water body) 샘플은 물이 주요 부피를 차지하는 샘플을 말하는 것으로서, 본 발명에 따른 수체 샘플은 해수, 하천, 호수, 폐수, 방류수, 오수, 슬러지 용출수, 토양 용출수, 퇴적토 용출수 등에서 채취한 샘플을 포함한다.
최초의 수체 샘플(이하, 원수)은 원수 이외에 원수를 인공 배지나 물과 같이 독성 물질을 포함하지 않는 액체로 희석하여 적어도 2가지 이상, 바람직하게는 4가지 이상의 농도로 구배화시킨 희석 원수들로 구성되는 것이 바람직하다. 이때, 사용되는 희석 방법은 크게 제한되지 않으며, 일 예로 반수 희석법[100%(원수 자체), 50%(원수의 1/2 농도로 희석한 것), 25%(원수의 1/4 농도로 희석한 것), 12.5%(원수의 1/8 농도로 희석한 것), 6.25%(원수의 1/16 농도로 희석한 것)]이 있다. 원수를 희석하기 위한 액체는 개구리밥과 식물의 뿌리 생장을 저해하는 독성 물질을 포함하지 않고 개구리밥과 식물의 배양과 양립할 수 있는 것이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 구체적으로 물, 스테인버그(Steinberg) 인공 배지 등이 있으며, 이 중 개구리밥과 식물의 원활한 배양을 고려할 때 스테인버그(Steinberg) 인공 배지인 것이 바람직하다.
또한, 수체 샘플은 바람직하게는 원수의 대조군으로 개구리밥과 식물의 뿌리 생장을 저해하는 독성 물질을 포함하지 않는 배양액을 더 포함하는 데, 대조군으로 는 공지의 다양한 인공 배지가 있으며, 이 중 개구리밥과 식물의 원활한 배양을 고려할 때 스테인버그(Steinberg) 인공 배지인 것이 바람직하다. 이때, 개구리밥과 식물의 뿌리 생장을 저해하는 독성 물질은 예를 들어 은(Ag; Silver), 알루미늄(Al; Aluminum), 비소(As; Arsenic), 카드뮴(Cd; Cadmium), 코발트(Co; Cobalt), 크롬(Cr; Chromium), 구리(Cu; Copper), 철(Fe; Iron), 수은(Hg; Mercury), 니켈(Ni; Nickel), 납(Pb; Lead), 및 아연(Zn; Zinc)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 금속류로 구성될 수 있다.
한편, 대조군, 원수 및 희석 원수들로 구성된 수체 샘플은 측정용 용기에 넣어지기 전에 개구리밥과 식물의 원활한 배양을 위해 pH 및 염분 농도가 조정되는 것이 바람직하다. 구체적으로 수체 샘플의 pH는 4~10으로 조정되는 것이 바람직하고, 5~10로 조정되는 것이 더 바람직하며, 6~9로 조정되는 것이 더 바람직하다. 또한, 수체 샘플의 염분 농도는 4‰ 이하로 조정되는 것이 바람직하고, 2‰ 이하로 조정되는 것이 더 바람직하며, 1‰ 이하로 조정되는 것이 더 바람직하다. 다만, 수체 샘플의 최적 pH 및 염분 농도는 사용되는 개구리밥과 식물의 종류에 따라 변경될 수 있다.
본 발명에 있어서, 염분 농도 및 pH가 조정된 수체 샘플(예를 들어 대조군, 원수, 4개 이상의 희석 원수들)을 배양액으로 하여 뿌리가 절단된 개구리밥과 식물을 배양하는 경우 원수의 희석 농도에 따른 개구리밥과 식물의 뿌리 생장 길이 또는 뿌리 길이 생장률을 구할 수 있고, 이를 기초로 수체 샘플의 수질 독성을 평가하는 경우 정확한 반수 유효 농도(독성 물질을 포함하지 않는 대조군에서의 개구리밥과 식물의 뿌리 생장 길이 또는 뿌리 길이 생장률보다 50% 감소된 뿌리 생장 길이 또는 뿌리 길이 생장률을 보이는 독성 물질의 농도로서 단일 독성 물질의 경우 특정 농도로 표시되고 미지의 원수의 경우 희석률로 표시됨; Half maximal effective concentration, EC50) 내지 무영향 농도(독성 물질을 포함하지 않는 대조군에서의 개구리밥과 식물의 뿌리 생장 길이 또는 뿌리 길이 생장률과 유의적 차이가 없는 수준으로 유지시키는 독성 물질의 농도로서 단일 독성 물질의 경우 특정 농도로 표시되고 미지의 원수의 경우 희석률로 표시됨; No Observed Effect Concentration, NOEC)를 평가할 수 있다.
측정용 용기
측정용 용기는 수체 샘플 및 뿌리가 절단된 개구리밥과 식물을 수용하고, 이후 배양기에 넣어져 개구리밥과 식물을 배양하기 것으로서, 그 형태는 크게 제한되지 않으며, 일 예로 웰 플레이트(Well plate)가 있다. 본 발명에서 웰 플레이트는 적어도 6개 이상의 웰(Well)을 포함하는 것이 바람직한데, 1개의 웰에는 대조군으로서 독성 물질을 포함하지 않는 인공 배지를 넣어 개구리밥과 식물을 배양하고, 나머지 5개의 웰에는 원수와 4개의 희석 원수들을 넣어 개구리밥과 식물을 배양한다. 또한, 본 발명에서 웰 플레이트는 다양한 원수들의 수질 독성을 한번에 평가할 수 있는 측면을 고려할 때 더 바람직하게는 12개 이상의 웰, 가장 바람직하게는 24개 이상의 웰을 포함하는 것이 바람직하다.
개구리밥과 식물
개구리밥과 식물은 천남성과의 하위 아과 식물로서, 세계에 널리 분포하며, 6속의 약 30종 가량이 알려져 있는데, 한국에는 개구리밥(Spirodela polyrhiza)과 좀개구리밥(Lemna paucicostata) 2종이 자란다. 또한, 좀개구리밥속에 속하는 종으로는 Lemna gibba, Lemna minor, Lemna minuta, Lemna trisulca, Lemna valdiviana 등이 있다. 본 발명에서는 수질 독성의 평가를 위한 바이오마커로서 수생 식물에 속하는 개구리밥과 식물, 바람직하게는 좀개구리밥속에 속하는 Lemna gibba, Lemna minor, Lemna paucicostata를 이용한다. 또한, 본 발명에서는 개구리밥과 식물을 측정용 용기에 투입하여 배양하기 전에 뿌리를 절단하는 단계를 포함한다. 이때 개구리밥과 식물의 뿌리는 뿌리생장점을 해치지 않는 범위 내에서 일정 길이로 절단된다. 도 1은 개구리밥과 식물의 뿌리를 절단하기 전과 절단한 후의 모양을 나타낸 사진이다. 또한, 본 발명에서 사용되는 개구리밥과 식물은 전처리 배양(Preculture)을 통해 본 배양에 최적화된 것이 바람직하다.
개구리밥과 식물의 배양
뿌리가 절단된 개구리밥과 식물 및 수체 샘플을 함유하는 측정용 용기는 배양기에 옮겨지고, 이후 소정 시간 동안 개구리밥과 식물이 배양된다. 이때, 배양 시간은 크게 제한되지 않으나 수질 독성 평가의 신뢰성을 확보하는 측면에서 적어도 30시간 이상인 것이 바람직하고, 40시간 이상인 것이 더 바람직하며, 48시간 이상인 것이 가장 바람직하다. 또한, 수생 식물에 속하는 개구리밥과 식물의 뿌리 생장을 위한 배양시 광 조사량은 50~200 μ㏖ photon/㎡·s 인 것이 바람직하고, 50~150 μ㏖ photon/㎡·s 인 것이 더 바람직하며, 100~150 μ㏖ photon/㎡·s 인 것이 가장 바람직하다. 또한, 수생 식물에 속하는 개구리밥과 식물의 뿌리 생장을 위한 배양시 배양 온도는 20~35℃인 것이 바람직하고, 25~35℃인 것이 더 바람직하며, 25~30℃인 것이 가장 바람직하다. 다만, 개구리밥과 식물의 뿌리 생장을 위한 배양 조건인 배양 시간, 광 조사량, 및 배양 온도는 개구리밥과 식물의 종류에 따라 변경될 수 있다.
개구리밥과 식물이 뿌리 생장 길이 또는 뿌리 길이 생장률의 측정
뿌리가 절단된 개구리밥과 식물을 수체 샘플이 담겨진 측정용 용기에 넣고 특정 배양 조건에서 약 48시간 동안 배양하면 개구리밥과 식물의 뿌리는 수체 샘플 내 독성 물질의 함량에 따라 생장 길이가 달라진다. 도 2는 뿌리가 절단된 개구리밥과 식물을 배양액에 넣고 48시간 배양하였을 때 배양액의 독성 물질 유무 및 독성 물질 함량의 고저에 따른 개구리밥과 식물의 뿌리 생장 상태를 나타낸 사진이다. 도 2에서 보이는 바와 같이 수체 샘플에 독성 물질이 포함되지 않은 경우 배양된 개구리밥과 식물의 뿌리 생장 길이가 가장 크고, 수체 샘플에 독성 물질 함량이 증가할수록 배양된 개구리밥과 식물의 뿌리 생장 길이가 줄어든다.
배양이 완료된 후 개구리밥과 식물의 뿌리 생장 길이는 눈금자를 이용하여 육안으로 측정할 수도 있고, 영상 분석 장치를 이용하여 측정할 수도 있다. 또한, 측정된 뿌리 생장 길이로부터 뿌리 길이 생장률은 다음과 같은 수학식 1로 계산될 수 있다.
Figure 112012007481412-pat00001
여기서 A는 대조군(독성원이 없는 상태)에서의 개구리밥과 식물의 뿌리 생장 길이를 나타내고, B는 실험군(독성원이 내포된 상태의 수체 샘플)에서의 개구리밥과 식물의 뿌리 생장 길이를 나타낸다.
수질 독성의 평가
수체 샘플의 수질 독성은 개구리밥과 식물의 뿌리 생장 길이 자체를 이용하여 평가될 수도 있고, 뿌리 길이 생장률을 이용하여 평가될 수도 있다.
뿌리 생장 길이 자체를 이용하여 평가하는 방법은 다음과 같다.
Figure 112012007481412-pat00002
여기서 A는 대조군(독성원이 없는 상태)에서의 개구리밥과 식물의 뿌리 생장 길이를 나타내고, B는 실험군(독성원이 내포된 상태의 수체 샘플)에서의 개구리밥과 식물의 뿌리 생장 길이를 나타낸다.
또한, 수질 독성은 원수 및 희석 원수들에서 배양된 개구리밥과 식물의 뿌리 생장 길이 또는 뿌리 길이 생장률을 독성 물질을 포함하지 않는 대조군에서 배양된 개구리밥과 식물의 뿌리 생장 길이 또는 뿌리 길이 생장률과 비교하여 평가되며, 구체적으로 반수 유효 농도(Half maximal effective concentration, EC50) 내지 무영향 농도(No Observed Effect Concentration, NOEC) 값으로 표시된다.
반수 유효 농도(Half maximal effective concentration, EC50)는 뿌리 생장 길이 또는 뿌리 길이 생장률이 독성 물질을 포함하지 않는 대조군에서의 뿌리 생장 길이 또는 뿌리 길이 생장률보다 50% 감소하는 수체 샘플의 농도를 의미하는 것으로서, 단일 독성 물질을 포함하는 수체 샘플의 경우 단일 독성 물질의 특정 농도로 표시되고 다수의 독성 물질을 포함하는 미지의 원수의 경우 원수의 희석률로 표시된다. 무영향 농도는 뿌리 생장 길이 또는 뿌리 길이 생장률이 독성 물질을 포함하지 않는 대조군에서의 뿌리 생장 길이 또는 뿌리 길이 생장률과 유의적 차이가 없는 수준으로 유지되는 수체 샘플의 농도를 의미하는 것으로서, 반수 유효 농도와 마찬가지로 단일 독성 물질을 포함하는 수체 샘플의 경우 특정 농도로 표시되고 다수의 독성 물질을 포함하는 미지의 원수의 경우 희석률로 표시된다. 한편, 반수 유효 농도의 크기와 커질수록 실제 수체 샘플의 독성은 상대적으로 작다는 것을 의미하기 때문에 반수 유효 농도를 실제 수체 샘플 독성으로 환산하기 위해 독성 단위(Toxic Unit, TU)을 다음과 같이 표시할 수 있다.
TU = 100/반수 유효 농도(%)
본 발명에 따른 수질 독성 평가 방법과 다른 수질 독성 평가 방법과의 비교
현재 수질 독성 평가에 대한 국제공인 시험법으로는 국제표준화기구(ISO), 미국 환경보호청(EPA), 및 경제협력개발기구(OECD) 등에서 제시한 방법이 있다. 일반적으로 수질 독성 평가에 대한 국제공인 시험법은 개구리밥과 식물을 배양한 후 잎의 수(frond number), 잎의 면적(frond area), 군체수(population growth rate), 습중량(fresh weight), 건중량(dry weight), 또는 색소 함량(pigment contents)의 변화량을 측정하고, 이를 통해 수질 독성을 평가하고 있다. 반면, 본 발명인 "Root cut method"는 개구리밥과 식물의 뿌리를 일정하게 절단하고 배양한 후 뿌리 생장 길이를 측정하고 이를 통해 수질 독성을 평가한다. 도 3은 본 발명의 수질 독성 평가 방법의 바람직한 일 예를 단계별로 나타낸 사진이다. 도 3에서 보이는 바와 같이 본 발명의 바람직한 일 예에 따른 수질 독성 평가 방법은 개구리밥과 식물의 전배양 단계(Pre-culture) → 원수 및 이를 희석한 희석 원수와 독성 물질을 함유하지 않는 대조군으로 구성된 수체 샘플의 준비 단계(Preparation) → 전배양된 개구리밥과 식물의 뿌리 절단 단계(Cutting off the root) → 수체 샘플을 함유하는 측정용 용기에 뿌리가 절단된 개구리밥과 식물을 투입하는 단계( Treating) → 수체 샘플에 투입된 개구리밥과 식물의 배양 단계(Incubating) → 배양된 개구리밥과 식물의 뿌리 생장 길이를 측정 및 분석하는 단계(Measuring)로 구성된다.
하기 표 1은 본 발명의 바람직한 일 예에 따른 수질 독성 평가 방법(Root cut method)과 국제적으로 공인된 수질 독성 시험법의 특징을 정리한 것이다. 표 1에서 보이는 바와 같이 본 발명의 바람직한 일 예에 따른 수질 독성 평가 방법(Root cut method)은 국제적으로 공인된 수질 독성 시험법에 비해 배양 시간이 매우 짧고 요구되는 수체 샘플 용액의 양이 매우 적다는 장점을 가진다.
Method ISO method OECD method US EPA method Root cut method
Test species L. minor ,
L. gibba 		L. minor ,
L. gibba 		L. minor ,
L. gibba 		L. minor ,
L. gibba ,
L. paucicostata
Test duration 7 days 7 days 7 days 2 days
Temperature(℃) 25±1℃ 24±2℃ 25±2℃ 30±1℃
Salinity fresh water fresh water fresh water fresh water
Light intensity 100±15 μ㏖ photons/㎡·s 6500~10000 lux 4200~6700 lux 50~150 μ㏖ photons/㎡·s
Photoperiodism continuous light continuous light continuous light continuous light
Test vessel type beaker flask, petri dish beaker 24-well plate
Test solution volume 100㎖(minumum) 150㎖ 150㎖ 3㎖
Test solution pH 5.5 6.5±0.2 7.5±0.1 7±0.2
Test organism size 10 fronds 9~12 fronds per test vessel 3~5 fronds per test vessel one plant with 2 fronds per test vessel
Endpoint frond number, total frond area, dry weight, fresh weight, pigment contents total frond area, dry weight, fresh weight frond number, population growth rate, dry weight, pigment contents root length
ISO method : ISO 20079(2005) Water quality-determination of the toxic effect of water constituents and waste water on duckweed(Lemna minor)-Duckweed growth inhibition test.
OECD method : OECD(2002) guidelines for the testing of chemicals, revised proposal for a new guideline 221, Lemna sp. Growth Inhibition Test.
US EPA method : US EPA(1996) Ecological Effects Test Guidelines, Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp.Tiers Ⅰand Ⅱ. OPPTS 850.4400, EPA 712-C-96-156.
본 발명에 따른 수질 독성 평가 방법의 용도
본 발명의 수질 독성 평가 방법으로 진단 가능한 독성 물질은 은(Ag; Silver), 알루미늄(Al; Aluminum), 비소(As; Arsenic), 카드뮴(Cd; Cadmium), 코발트(Co; Cobalt), 크롬(Cr; Chromium), 구리(Cu; Copper), 철(Fe; Iron), 수은(Hg; Mercury), 니켈(Ni; Nickel), 납(Pb; Lead), 및 아연(Zn; Zinc) 등과 같은 중금속 류가 있다.
본 발명의 수질 독성 평가 방법은 하수 및 폐수 오니를 투척하기 전에 생태계에 부정적인 영향을 끼치지 않도록 하기 위해서 취해야할 오니 희석 배수를 신속하게 결정하는데도 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 종래의 화학적 분석 방식에 의존한 수질 오염 측정법에 내재된 문제점 중 미지의 독성 물질이 수체 내에 투입되었을 때 그것을 탐지해낼 수 없고, 더 나아가 화학적 분석에 의한 결과 수치만을 가지고는 실제 생태계에 끼칠 수 있는 수질 오염의 영향에 대해 전혀 예측할 수가 없다는 단점을 보완한 실용적인 기법이라고 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 수질 독성 평가 방법을 구현할 수 있는 수질 독성 평가 키트에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 수질 독성 평가 키트는 뿌리가 절단된 개구리밥과 식물; 수체 샘플 및 뿌리가 절단된 개구리밥과 식물을 수용하고 개구리밥과 식물을 배양하기 위한 측정용 용기;및 수체 샘플을 희석하기 희석수 또는 인공배지;를 포함한다. 또한, 본 발명에 따른 수질 독성 평가 키트는 은(Ag; Silver), 알루미늄(Al; Aluminum), 비소(As; Arsenic), 카드뮴(Cd; Cadmium), 코발트(Co; Cobalt), 크롬(Cr; Chromium), 구리(Cu; Copper), 철(Fe; Iron), 수은(Hg; Mercury), 니켈(Ni; Nickel), 납(Pb; Lead), 및 아연(Zn; Zinc)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 금속류 독성 물질을 희석수 또는 인공배지에 용해시켜 제조한 표준 독성 물질 용액을 더 포함할 수 있는데, 표준 독성 물질 용액은 수체 샘플의 수질 독성을 평가하기 전에 뿌리가 절단된 개구리밥과 식물의 상태, 즉 독성 물질에 대한 반응 감응성 여부를 테스트하는데 이용될 수 있다. 구체적으로 본 발명에 따른 표준 독성 물질 용액이 구리를 독성 물질로 포함하는 용액인 경우, 다양한 구리 용액 및 대조군에서의 뿌리가 절단된 개구리밥과 식물의 뿌리 생장 길이 또는 뿌리 길이 생장률에 대한 데이터를 미리 확보하여 수질 독성 평가 키트와 함께 제공할 수 있다. 사용자는 구리 용액에 대한 뿌리가 절단된 개구리밥의 뿌리 생장 길이 또는 뿌리 길이 생장률을 측정하고 이를 미리 제공하는 데이터와 비교하여 뿌리가 절단된 개구리밥이 독성 물질에 대해 정상적으로 반응하는지 여부를 판단하고, 일정 범위(예를 들어, 본래 반응 감응성의 80% 이상)의 반응 감응성을 보이는 경우 미지의 수체 샘플에 대한 수질 독성 평가를 진행할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 명확하게 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 보호범위를 제한하는 것은 아니다.
1. 개구리밥과 식물의 최적 배양 조건 확립
(1) 개구리밥과 식물의 전처리 배양
개구리밥과 식물 중 좀개구리밥속 식물인 Lemna minor, Lemna gibba, Lemna paucicostata를 각각 1.5L의 스테인버그(Steinberg) 인공 배지를 담은 가로 25㎝, 세로 10㎝, 높이 15㎝의 수조에 넣은 뒤 배양기로 옮기고, 연속광 조건하에 20-30 μ㏖ photon/㎡·s의 광 조사량 및 15~20℃의 온도에서 정지 배양하였다. 이때 배양 pH는 약 7로 조정되었고(스테인버그 인공 배지의 pH는 7±0.2이다), 인공 배지는 7일 간격으로 전량 교체해 주었다.
표 2는 본 발명의 실시예에서 사용된 인공 배지인 스테인버그(Steinberg) 인공 배지에 포함되는 성분과 농도를 나타낸 것이다. 표 2에 나타나는 바와 같이 인공 배지는 총 5개의 스톡 용액(Stock solution)을 포함하며, 각각의 스톡 용액은 개구리밥과 식물의 배양에 필요한 무기 성분 내지 유기 성분을 포함하는 용액으로 구성된다.
스톡 용액 구분 스톡 용액을 구성하는
성분의 종류		 스톡 용액내에서의 구
성 성분의 농도(g/ℓ)		 인공 배지 1리터당 스
톡 용액이 차지하는
부피(㎖/ℓ)
Ⅰ KNO3 17.5 20
K2HPO4 4.5
KH2PO4 0.63
Ⅱ MgSO47H2O 5 20
Ⅲ Ca(NO3)24H2O 14.75 20
Ⅳ H3BO₃ 0.12 1
ZnSO47H2O 0.18
Na2MoO42H2O 0.044
MnCl24H2O 0.18
Ⅴ FeCl36H2O 0.76 1
Na2-EDTA2H2O 1.5
(2) 개구리밥과 식물의 뿌리 제거 및 배양
전처리 배양된 개구리밥과 좀개구리밥속 식물의 뿌리를 미세가위를 이용하여 완전히 잘라낸 후, 24웰 플레이트에 넣고 뚜껑을 닫아 배양기에 옮겨 넣은 후, 다양한 광 조사량, 배양액의 pH , 배양액의 염분 농도 및 배양 온도 조건하에서 배양하였다. 48시간 배양이 끝난 후 영상분석장치(Moticam 2000, Motic Instruments Inc., BC, Canada)를 사용하여 각 웰 내에서 배양된 개구리밥과 좀개구리밥속 식물의 뿌리 생장 길이를 측정하였다. 도 4는 광 조사량 및 배양 온도 조건별 개구리밥과 좀개구리밥속 식물의 뿌리 생장 길이를 나타낸 것이고(도 4에서 배양액의 pH는 7이고 염분 농도는 0‰이다), 도 5는 배양액의 pH 조건별 개구리밥과 좀개구리밥속 식물의 뿌리 생장 길이를 나타낸 것이고(도 5에서 배양 온도는 30℃이고, 배양액의 염분 농도는 0‰이며, 광 조사량은 Lemna minor 및 Lemna gibba의 경우 150μ㏖ photon/㎡·s 이고, Lemna paucicostata의 경우 50μ㏖ photon/㎡·s 이다), 도 6은 배양액의 염분 농도별 개구리밥과 좀개구리밥속 식물의 뿌리 생장 길이를 나타낸 것이다(도 6에서 배양 온도는 30℃이고, 배양액의 pH는 7이며, 광 조사량은 Lemna minor 및 Lemna gibba의 경우 150μ㏖ photon/㎡·s 이고, Lemna paucicostata의 경우 50μ㏖ photon/㎡·s 이다.).
개구리밥과에 속하는 좀개구리밥속 식물의 최적 배양 조건을 살펴보면, 도 4 내지 도 6에서 보이는 바와 같이 광 조사량은 50~200 μ㏖ photon/㎡·s, 바람직하게는 50~150 μ㏖ photon/㎡·s 이었고, 배양 온도는 25~30℃, 바람직하게는 30℃이었고, 배양액의 염분 농도는 0~2‰, 바람직하게는 0~1‰이었고, 배양액의 pH는 5~10, 바람직하게는 6~7이었다.
2. 개구리밥과 식물을 이용한 단일 금속류 독성 물질 용액의 수질 독성 평가
(1) 단일 금속류 독성 물질 용액의 준비
단일 금속류 독성 물질로 각각 은(Ag), 카드뮴(Cd), 6가 크롬(Cr6 +), 구리(Cu), 및 수은(Hg)을 포함하는 독성 물질 용액(pH는 7±0.2로 조정함) 및 Steinberg 인공 배지를 이용하여 반수 희석법으로 희석하여 초기 농도의 50%, 25%, 12.5%, 6.25%로 희석된 독성 물질 용액을 제조하고 이들 독성 물질 용액의 수질 독성을 평가하였다. 이때, 희석되기 전 단일 금속류 독성 물질 용액의 농도는 개구리밥과 좀개구리밥속 식물, 즉 Lemna minor, Lemna gibba, 및 Lemna paucicostata에 맞추어 각각 선택하였다. 또한, 대조군 용액으로는 독성 물질을 포함하지 않는 Steinberg 인공 배지(인공 배지의 pH 는 7±0.2임)를 사용하였다.
(2) 개구리밥과 식물의 뿌리 제거 및 배양
미세가위를 이용하여 개구리밥과 좀개구리밥속 식물, 즉 Lemna minor, Lemna gibba, 및 Lemna paucicostata의 뿌리를 각각 잘라내었다. 이후, 24웰 플레이트의 웰에 대조군 용액 및 독성 물질 용액을 넣고, 여기에 뿌리가 절단된 개구리밥과 좀개구리밥속 식물을 넣은 후 24웰 플레이트를 배양기에 옮겨 넣었다. 이후 30℃의 온도에서 48시간 배양하였다. 이때, 사용된 개구리밥과 좀개구리밥속 식물이 Lemna minor 및 Lemna gibba인 경우 150 μ㏖ photon/㎡·s의 광 조사량 상태를 유지하였고, 사용된 개구리밥과 좀개구리밥속 식물이 Lemna paucicostata인 경우 50 μ㏖ photon/㎡·s의 광 조사량 상태를 유지하였다.
(3) 개구리밥과 식물의 뿌리 생장 길이의 측정
영상분석장치(Moticam 2000, Motic Instruments Inc., BC, Canada)를 사용하여 48시간 배양 후 개구리밥과 식물의 뿌리 생장 길이를 측정하였다.
도 7은 단일 독성 물질로서 은(Ag)을 포함하는 독성 물질 용액의 은(Ag) 농도에 따른 개구리밥과 좀개구리밥속 식물의 뿌리 생장 길이를 나타낸 그래프이고, 도 8은 단일 독성 물질로서 카드뮴(Cd)을 포함하는 독성 물질 용액의 카드뮴(Cd) 농도에 따른 개구리밥과 좀개구리밥속 식물의 뿌리 생장 길이를 나타낸 그래프이고, 도 9는 단일 독성 물질로서 6가 크롬(Cr6 +)을 포함하는 독성 물질 용액의 6가 크롬(Cr6 +) 농도에 따른 개구리밥과 좀개구리밥속 식물의 뿌리 생장 길이를 나타낸 그래프이고, 도 10은 단일 독성 물질로서 구리(Cu)를 포함하는 독성 물질 용액의 구리(Cu) 농도에 따른 개구리밥과 좀개구리밥속 식물의 뿌리 생장 길이를 나타낸 그래프이고, 도 11은 단일 독성 물질로서 수은(Hg)을 포함하는 독성 물질 용액의 수은(Hg) 농도에 따른 개구리밥과 좀개구리밥속 식물의 뿌리 생장 길이를 나타낸 그래프이다. 도 7 내지 도 11에서 보이는 바와 같이 개구리밥과 좀개구리밥속 식물의 뿌리 생장 길이는 일정 범위에서 금속류 독성 물질의 농도와 선형 관계를 나타내었다. 또한, 도 7 내지 도 11에서는 나타내지 않았지만, 개구리밥과 좀개구리밥속 식물의 뿌리 생장 길이는 대조군 배양에서의 뿌리 생장 길이와 독성 물질을 포함하는 용액에서의 뿌리 생장 길이의 비, 즉 개구리밥과 좀개구리밥속 식물의 뿌리 길이 생장률로 대체될 수 있다.
(4) 개구리밥과 식물의 뿌리 생장 길이를 이용한 단일 금속류 독성 물질의 수질 독성 판단
도 7 내지 도 11에 표시된 개구리밥과 좀개구리밥속 식물의 뿌리 생장 길이를 기준으로 단일 금속류 독성 물질의 반수 유효 농도(EC50) 내지 무영향 농도(NOEC)를 계산하였다. 이때 EC50 값은 점예측기법(point estimation techniques)을 써서 계산하였고, NOEC 값은 Dunnett 과정과 같은 가설 검정 방법을 써서 계산하였다. 표 3은 뿌리가 절단된 개구리밥과 좀개구리밥속 식물의 뿌리 생장 길이를 수질 독성 평가 기준으로 하였을 때의 단일 금속류 독성 물질의 반수 유효 농도(EC50) 내지 무영향 농도(NOEC)를 나타낸 것이다.
금속류 독성 물질 Lemna minor 뿌리 생장 길이 기준 Lemna gibba 뿌리 생장 길이 기준 Lemna paucicostata 뿌리 생장 길이 기준
NOEC(㎎/L) EC50(㎎/L) NOEC(㎎/L) EC50(㎎/L) NOEC(㎎/L) EC50(㎎/L)
Ag < 0.0031 0.0053 < 0.025 0.0276 < 0.0625 0.2138
Cd 0.125 0.2264 0.125 0.3666 < 0.0781 0.1426
Cr6 + 0.375 0.3418 0.75 0.9558 < 0.1562 0.6430
Cu 0.125 0.2210 0.25 0.3604 < 0.1562 0.3914
Hg 0.25 0.1971 < 0.0625 0.2854 < 0.078 0.1498
(5) 본 발명의 "Root cut method"와 국제공인 시험법의 민감도 비교
하기 표 4는 본 발명의 "Root cut method"를 이용하여 수질 독성을 평가하였을 때의 반수 유효 농도(EC50; 단위는 ㎎/L) 값과, 국제 공인 시험법을 이용하여 수질 독성을 평가하였을 때의 반수 유효 농도(EC50) 값을 나타낸 것이다. 하기 표 4에서 보이는 바와 같이 본 발명의 뿌리가 절단된 개구리밥과 식물의 뿌리 생장 길이를 기준으로 수질 독성을 평가하는 "Root cut method"가 개구리밥과 식물의 잎의 수(frond number; ISO method) 또는 군체수(population growth rate; US EPA ECOTOX Database)를 기준으로 수질 독성을 평가하는 국제공인 시험법보다 현저히 향상된 민감도를 보인다.
금속류 독성 물질 개구리밥과 식물 : Lemna minor
Root cut method ISO method US EPA ECOTOX Database
Ag 0.0053 0.081 -
Cd 0.2264 0.323 0.74(4일 배양 기준)
Cr6 + 0.3418 2.3 8.5(7일 배양 기준)
Cu 0.221 0.33 0.32(14일 배양 기준)
Hg 0.1971 0.683 -
* ISO Method 반수 유효 농도(EC50) 값 출처 : B. Naumann et al., 2007, Growth rate based dose-response relationships and EC-values of ten heavy metals using the duckweed growth inhibition test (ISO 20079) with Leman minor L clone St, Journal of Plant Physiology 164 1656-1664
* US EPA ECOTOX Database 반수 유효 농도(EC50) 값 출처
1) Cd : Chouikhi, A., 1979, Choice and Set Up of the Food Chains in Freshwater in Order to Show the Bioaccumulation Character of a Pollutant, OECD-IRCHA Universite Paris-Sud, Unite d'Enseignement et de Recherche d'Hygiene et Protection de l'Homme et de son Environnement
2) Cr6 + : Ince, N.H., N. Dirilgen, I.G. Apikyan, G. Tezcanli, and B. Ustun, 1999, Assessment of Toxic Interactions of Heavy Metals in Binary Mixtures: A Statistical Approach, Arch. Environ. Contam. Toxicol.36(4): 365-372
3) Cu : Jenner, H.A., and J.P.M. Janssen-Mommen, 1993, Duckweed Lemna minor as a Tool for Testing Toxicity of Coal Residues and Polluted Sediments, Arch. Environ. Contam. Toxicol.25(1): 3-11
상기의 실시예에서는 비록 성분과 농도가 특정된 독성 물질에 의한 수질 독성을 평가하였으나, 미지의 독성 물질을 포함하는 수체 샘플에 변형되어 실시될 수 있고, 그때의 EC50 값이나, NOEC 값을 통해 미지의 독성 물질이 수질에 미치는 영향을 파악할 수 있음은 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 또한, 수질 독성 평가의 기준으로 개구리밥과 식물의 뿌리 길이 생장률을 이용하는 기술적 사상은 개구리밥과 식물의 뿌리 생장 길이를 이용하는 기술적 사상의 균등 범위에 속함은 본 발명이 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다 할 것이다.

Claims (10)

  1. (a) 측정용 용기에 pH가 4~10으로 조정된 수체 샘플을 넣는 단계;
    (b) 수체 샘플을 함유하는 측정용 용기에 뿌리 생장점을 해치지 않는 범위 내에서 뿌리가 절단된 개구리밥과 식물을 투입하는 단계;
    (c) 측정용 용기에 투입된 개구리밥과 식물을 50~200 μ㏖ photon/㎡·s 의 광 조사량 조건 및 20~35℃의 온도 조건에서 배양하는 단계; 및
    (d) 배양이 완료된 개구리밥과 식물의 뿌리 생장 길이 또는 뿌리 길이 생장률을 측정하는 단계를 포함하는 수질 독성 평가 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 수체 샘플은 원수 및 희석 배수가 서로 다른 적어도 2개 이상의 희석 원수로 구성되고
    상기 희석 원수는 원수를 스테인버그(Steinberg) 인공 배지로 희석하여 제조된 것을 특징으로 하는 수질 독성 평가 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 희석 원수는 반수 희석법에 의해 희석되는 것을 특징으로 하는 수질 독성 평가 방법.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 수체 샘플은 원수의 대조군으로 개구리밥과 식물의 뿌리 생장을 저해하는 독성 물질을 포함하지 않는 배양액을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 수질 독성 평가 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 독성 물질은 은(Ag; Silver), 알루미늄(Al; Aluminum), 비소(As; Arsenic), 카드뮴(Cd; Cadmium), 코발트(Co; Cobalt), 크롬(Cr; Chromium), 구리(Cu; Copper), 철(Fe; Iron), 수은(Hg; Mercury), 니켈(Ni; Nickel), 납(Pb; Lead), 및 아연(Zn; Zinc)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 금속류인 것을 특징으로 하는 수질 독성 평가 방법.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 대조군은 스테인버그(Steinberg) 인공 배지인 것을 특징으로 하는 수질 독성 평가 방법.
  7. 삭제
  8. 제 1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 수체 샘플은 염분 농도가 4‰ 이하로 조정되는 것을 특징으로 하는 수질 독성 평가 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
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